N° ANR : ANR-05-PNRB-006 ACRONYME : HYPAB Titre du pro

Edition 2005
Programme National de Recherche
sur les Bioénergies (PNRB)
N° ANR : ANR-05-PNRB-006
ACRONYME : HYPAB
Titre du projet :
Amélioration de l'hydrolyse enzymatique de la paille de blé par optimisation du mélange cellulolytique
et des conditions de sa mise en oeuvre
Axe thématique :
3 Conversion biologique
Coordinateur du projet :
IFP, Rueil Malmaison
Frédéric Monot- [email protected]
Résumé du projet :
Ce projet vise à diminuer le coût de l'hydrolyse enzymatique des matériaux ligno-cellulosiques en
sucres fermentescibles en éthanol en agissant sur les conditions de production et d'hydrolyse, et sur
la composition du mélange enzymatique hydrolytique mis en oeuvre. Pour ce faire, l'apport des
cellulases appartenant à des familles de glycoside hydrolases différentes de celles trouvées chez
Trichoderma reesei, et des coumaroyl estérases sera évalué. Une analyse structurale de la paille de
blé avant et après action des cellulases permettra d'identifier les étapes limitant l'hydrolyse complète
de la cellulose. Afin de les affranchir, le couplage de cellulases à d'autres domaines de liaison à la
cellulose (carbohydrate binding module, CBM) sera testé. En outre, certaines enzymes clé seront
soumises à une évolution dirigée pour améliorer leur efficacité dans les conditions de procédé. Le
nouveau mélange enzymatique sélectionné sera ensuite produit dans T. reesei et les meilleures
conditions de production en fermenteur seront définies. Les conditions optimales d'hydrolyse de la
paille de blé prétraitée avec le nouveau mélange seront également déterminées. Les gains possibles
de schémas d'hydrolyse particuliers (p. ex. procédé avec recyclage, ou en présence de ligninases)
seront évalués.
Résultats :
L’hydrolyse enzymatique des polysaccharides constitutifs de la paroi végétale, cellulose et
hémicelluloses, constitue une étape clé du procédé de production d'éthanol à partir de biomasse
lignocellulosique. Dans le présent projet, deux voies principales d'amélioration de l'efficacité du
mélange enzymatique produit par Trichoderma reesei, microorganisme industriel de référence pour la
production de cellulases, ont été explorées.
Dans la première approche, nous avons évalué le potentiel d'enzymes absentes du champignon
aérobie, T. reesei, notamment les cellulases des familles 9 et 48, présentes chez les bactéries et
champignons anaérobies, et les coumaroyl estérases, ces dernières étant susceptibles d'agir sur les
liaisons hémicellulose-lignine. Nous avons montré l'apport bénéfique et synergique de différentes
enzymes clostridiales (cellulases des familles 9 et 48, complexe xylanase/estérase Xyn10Zt)
assemblées sous forme de minicellulosome sur l'hydrolyse de paille de blé non prétraitée. Cet effet
est cependant moindre quand il est utilisé en complément de productions enzymatiques de T. reesei
enrichies en xylanase. Concernant les cellulases fongiques, de nouvelles souches de champignons
appartenant aux genres Piromyces et Neocallimastix ont été isolées de rumen. Le gène cel48 a été
isolé et cloné, mais la protéine produite chez E. coli n’est pas active. Une coumaroyl estérase, EstA,
de Piromyces equi a pu être clonée chez T. reesei et caractérisée. Elle permet une libération efficace
d'acide férulique à partir de sons de blé et maïs mais n'apporte pas de gain en saccharification de
paille prétraitée.
Dans la seconde approche, une enzyme clé du mélange enzymatique de T. reesei a été améliorée
par évolution dirigée. Les trois tours successifs de ShufflingTM ont donné lieu à l'obtention de
variants ayant des vitesses de réaction (kcat) 8,5 fois (premier tour), 120 fois (second tour) et enfin
240 fois supérieures (dernier tour) à celles du mélange enzymatique initial. Les gènes issus du
second tour de shuffling ont été clonés chez T. reesei et un clone a été sélectionné pour une
production en réacteur de laboratoire. L'activité spécifique de l'enzyme cible dans le mélange
enzymatique produit par le mutant était 10 fois supérieure à celle du mélange de référence. Avec
cette production enzymatique, l'hydrolyse de paille prétraitée a été nettement plus rapide puisqu'en
utilisant la même quantité d'enzyme, le taux d'hydrolyse a atteint 90% en seulement 24 heures pour
un rendement d'hydrolyse de 85% en 72 heures avec le mélange enzymatique produit par la souche
initiale.
En support à ces travaux, des outils génétiques pour la transformation de T. reesei ont été
developpés ainsi que différents tests d'hydrolyse permettant de définir des conditions d'essai
représentatives et être en mesure d'évaluer et classer les enzymes. En outre, de nouveaux substrats
chromogéniques des feruloyl estérases ont été synthétisés et validés pour des mises en oeuvre en
microplaques. De nouvelles méthodes de mesure d'activité cellulase basées sur des cellotétraosides
bifonctionnels ont été mises au point.
Nous nous sommes également intéressés à l'évolution de la structure du végétal lors des étapes du
procédé. Les analyses de la structure des lignines de paille ont montré que plus de 60% de celles-ci
étaient éliminées dans les effluents aqueux lors de l’explosion à la vapeur ainsi que l’essentiel des
esters p-coumariques et féruliques. Les lignines résiduelles ont une structure profondément
bouleversée avec une hydrolyse des liaisons labiles de type -O-4 qui provoque la néoformation de
nombreuses liaisons résistantes. Ces lignines sont en outre appauvries en groupes phénoliques
libres et la cellulolyse ne modifie pas davantage leur structure.
D'une façon générale, ce projet a permis des progrès significatifs d'un point de vue méthodologique
avec la définition de nouveaux outils génétiques ou analytiques, cognitif avec des avancées sur les
champignons anaérobies cellulolytiques ou la synergie de cellulases bactériennes, et appliqué avec
le développement d'une nouvelle souche de Trichoderma reesei particulièrement performante.
Partenaires :
INRA UMR 1163, Marseille
INRA Unité de Microbiologie, Clermont-Ferrand
CNRS-UPR9036, UNIVERSITE AIX-MARSEILLE 1
INRA-UMR 206, INAPG, Grignon
CNRS-UPR 5301, CERMAV, Grenoble
Partenaires industriels
Durée du projet : 36 mois