revue - John Libbey Eurotext
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revue Virologie 2007, 11 : 135-50 Tests d’amplification génomique multiple pour le dépistage des infections virales : développement et applications 1 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. D. Candotti 2 J.-P. Allain 1 National Blood Service, Long Road <[email protected]> 2 Division of Transfusion Medicine, Department of Haematology, University of Cambridge, Cambridge CB2 2PT, Grande-Bretagne Résumé. Du fait de progrès constants des méthodes d’amplification et de détection des acides nucléiques viraux, le diagnostic moléculaire est devenu une procédure essentielle de caractérisation des infections virales. Le développement des tests moléculaires appliqués au diagnostic clinique et à la sécurité transfusionnelle reste limité essentiellement par leur coût. Cette limitation peut être atténuée par le développement de tests d’amplification génomique multiple (multiplex) détectant simultanément et, éventuellement, identifiant immédiatement plusieurs génomes viraux grâce aux récentes avancées techniques dans ce domaine. Malgré une optimisation parfois délicate, les tests multiplex, commerciaux ou non, ont été utilisés avec succès, en particulier pour le dépistage à grande échelle des infections à HBV, HCV et VIH1 dans les dons de sang, ce qui a amélioré la sécurité transfusionnelle en réduisant la fenêtre sérologique. Ces tests hautement sensibles et spécifiques ont également montré un potentiel de réduction des coûts et des délais opératoires de la détection moléculaire. Le format multiple offre la perspective d’accroître la sécurité transfusionnelle dans des régions endémiques à faibles ressources tout en maintenant un rapport coût/efficacité favorable grâce à l’association à d’autres procédés réducteurs de coût tels que la détection en pools de plasmas et le dépistage sérologique avant le don. doi: 10.1684/vir.2007.0082 Mots clés : amplification génomique multiple, génomes viraux, RT-PCR en temps réel, sécurité transfusionnelle Abstract. Advances in viral nucleic acid amplification and detection techniques have resulted in molecular diagnostics becoming key procedures in viral infection characterization. Molecular assay development applied to clinical diagnostic and transfusion safety is essentially limited by cost. To overcome this limitation, multiplex nucleic acid testing (NAT) assays allowing simultaneous detection and eventually direct identification of several viral genomes have been developed using recent technical improvements in genomic amplification technologies. Optimization may prove difficult, but commercial and in-house multiplex NAT assays have been successfully applied to large-scale screening of blood donations for HBV, HCV and HIV-1, improving transfusion safety by reducing the pre-seroconversion window period. They showed high sensitivity and specificity, and may decrease operating costs and testing turnaround time. Multiplexing has the potential to improve blood safety in highly endemic resource-limited areas in a cost-effective way when associated with other costreducing procedures such as plasma pooling and pre-donation serological screening. Key words: transfusion safety, multiplex nucleic acid testing, viral genomes, real-time RT-PCR Tirés à part : D. Candotti Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 135 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue Au cours des dix dernières années, les performances des méthodes moléculaires d’amplification et de détection des génomes viraux (ADN et ARN) n’ont cessé de progresser, non seulement en matière de sensibilité et de spécificité mais aussi de par une automatisation les rendant utilisables à grande échelle ; leur utilisation en diagnostic clinique et dans les laboratoires de recherche ne cesse de se développer. Ces méthodes moléculaires, dont la plus populaire est la PCR, associent une détection directe et extrêmement spécifique des séquences virales ciblées, avec une sensibilité analytique bien supérieure à celle des méthodes de détection sérologique des antigènes viraux ou d’isolement des virus. Un des moteurs particuliers de ce développement est la recherche de la sécurité transfusionnelle en matière d’infections virales : cela implique le dépistage à grande échelle de marqueurs sérologiques et/ou génétiques des virus présents même en faible quantité dans les dons de sang, qui constituent un risque pathogène pour les receveurs. Ce dépistage nécessite, non seulement une sensibilité maximale afin de détecter de faibles concentrations des marqueurs viraux recherchés, mais également une très grande spécificité de manière à limiter l’élimination de dons identifiés de façon erronée comme contaminés. Ces deux conditions sont nécessaires au maintien d’un rapport coût/efficacité favorable du dépistage viral systématique en transfusion. Les performances des tests actuels détectant l’antigène de surface du virus de l’hépatite B (HBV) et les anticorps dirigés contre le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH1) et le virus de l’hépatite C (HCV) permettent de réduire le risque de transmission par transfusion de ces trois virus à un niveau compris entre 1 : 50 000 et 1 : 1 500 000. Un risque transfusionnel résiduel demeure du fait de la fenêtre sérologique qui suit le contact initial avec le virus et précède l’apparition de niveaux détectables des marqueurs sérologiques (antigènes et anticorps), et de la période suivant la disparition de ces marqueurs sérologiques dans les phases tardives de l’infection dans le cas du HBV. Ce risque résiduel peut être à son tour significativement réduit grâce au développement récent de méthodes moléculaires de détection des génomes viraux. L’utilisation en diagnostic clinique et en transfusion de ces méthodes moléculaires souvent complexes est également limitée par leur coût élevé et parfois le volume d’échantillon à tester disponible. En particulier, dans le domaine transfusionnel, elle est caractérisée par un rapport coût/efficacité élevé dans les pays développés dans lesquels le risque résiduel est extrêmement faible [1]. Le rapport coût/bénéfice en année de vie de qualité (Qaly) y est de plus de 1 000 000 dollars au lieu du seuil généralement accepté de 50 000 dollars. Cependant, la volonté des pouvoirs publics et des populations elles-mêmes de payer pour un sang « sans risque » a encouragé le développement de méthodes de détection génomique, non seulement des HBV, HCV et 136 VIH1 représentant un risque majeur, mais aussi du parvovirus humain B19 (B19), du virus West Nile et du virus de l’hépatite A. Le coût considérable de ces nouvelles technologies, pour une grande part lié à des frais de brevets, a stimulé la recherche de diverses stratégies destinées à le réduire et à accroître la capacité diagnostique des méthodes de détection génomique. Une première solution, utilisée en sécurité transfusionnelle, a été de pratiquer le dépistage des génomes viraux sur des mélanges (pools) contenant de 8 à 500 échantillons de plasma mais cela s’accompagne d’une baisse de sensibilité due au facteur de dilution introduit. Cette limitation peut cependant être partiellement atténuée par l’introduction de procédures, souvent compliquées, permettant de concentrer les virus recherchés. Une telle approche est essentiellement applicable au dépistage à grande échelle mais semble peu adaptée au diagnostic clinique. Une seconde approche consiste à développer des méthodes capables de détecter simultanément plusieurs génomes différents dans une même réaction. Elle réduit le coût en réactifs, le volume d’échantillon à tester, le temps nécessaire à l’obtention des résultats, mais rend encore plus complexe un procédé qui nécessite déjà plusieurs étapes pour la détection d’un seul génome viral. La présente revue a pour objectif de donner un aperçu non exhaustif des méthodes de détection génomique en format multiple (multiplex) actuellement disponibles en tant que tests commerciaux manufacturés ou tests « maison » développés dans un but de recherche ou de diagnostic, en particulier dans le domaine de la sécurité transfusionnelle ; à cette occasion, seront discutés les problèmes techniques liés à ces nouvelles méthodes et donnés des exemples de leurs applications cliniques. Tests d’amplification génomique en format multiple (multiplex) pour le dépistage des génomes viraux Au cours de dix dernières années, plusieurs études ont démontré la faisabilité et l’efficacité de la détection des génomes viraux en multiplex dans différentes situations cliniques et épidémiologiques (tableaux 1 et 2) [2-28]. Ces méthodes de détection mutiple peuvent constituer une réponse pratique au besoin d’un dépistage rapide, simultané et à grande échelle de plusieurs virus. Elles sont suffisamment sensibles pour détecter des infections virales, telles que les infections à VIH1, HCV, HBV et virus humain T-lymphotrope (HTLV), en l’absence de toute réponse sérologique (fenêtre de préséroconversion). Le multiplexage s’applique également au typage/sous-typage de souches virales dans des études épidémiologiques. La plupart de ces tests multiplex sont des tests « maison » à but diagnostique ou de recherche. Seuls quelques-uns ont été développés commercialement, en particulier dans le but d’être appliVirologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 revue Tableau 1. Exemples de tests multiplex pour le diagnostic virologique Auteurs Système Virus Témoin interne Origine(s) des échantillons Equipement Tucker, 2001 RT-PCR en temps réel Non Sécrétions vaginales ABI Prism 7700 Klein, 2001 Del Mar Mosquera, 2002 Druce, 2002 RT-PCR en temps réel RT-PCR HPV6, HPV11, HPV16, HPV18 Sous-types de FIV MeV, RUBV, B19V Non Non Plasma Diverses ABI Prism 7700 - Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. O’Neill, 2003 Safronetz, 2003 PCR nichée PCR en temps réel PCR en temps réel Beuret, 2004 RT-PCR en temps réel Boivin, 2004 RT-PCR en temps réel Kirschberg, 2004 Templeton, 2004 PCR PCR en temps réel Scheltinga, 2005 Gunson, 2005 PCR en temps réel RT-PCR en temps réel Rolfe, 2005 RT-PCR en temps réel Li, 2006 Candotti, 2006 RT-PCR en temps réel RT-PCR en temps réel HSV1, HSV 2, VZV, CMV HSV1, HSV2, VZV HHV6A, HHV6B, HHV7 NV1, NV2, entérovirus, astrovirus influenza A, influenza B, HRSV HBV génotypes A-F Influenza A, Influenza B, HRSV PIV1, PIV2, PIV3, PIV4 HMPV, RRSV Influenza (A, B), HRSV (A, B), rhinovirus, PIV (1-3), coronavirus (229E, OC43, NL63) Genotypes 1-6 de HCV GBV-C, WNV, dengue HBV, B19V, HHV-8 Non - Non Non Diverses Tissus Lightcycler Lightcycler Non Diverses Lightcycler Non Voies respiratoires Lightcycler Non Non Sérum Voies respiratoires iCycler IQ Oui Non Voies respiratoires Voies respiratoires iCycler IQ ABI 7500 SDS Non Serum Rotor-Gene 3000 Non Oui Plasma Plasma Mx3000P Mx3000P HPV : papillomavirus humain ; FIV : virus de l’immunodéficience féline ; MeV : virus de la rougeole ; RUBV : virus de la rubéole ; B19V : parvovirus B19 ; HSV : virus herpes simplex ; VZV : virus de la varicelle et du zona ; CMV : cytomegalovirus ; HHV : herpèsvirus humain ; NV : norovirus ; HRSV : virus respiratoire syncytial ; HBV : virus de l’hépatite B ; PIV : virus parainfluenza ; HCV : virus de l’hépatite C ; WNV : virus West Nile ; GBV-C : virus dit de l’hépatite G. qués au dépistage à grande échelle des dons de sang (tableau 1). Dans ce cas, les virus recherchés sont essentiellement le HBV, le HCV et le VIH1M, N, O ainsi que, dans une moindre mesure, le VIH2, le virus dit de l’hépatite G (GBV-C) et les HTLV-I et II [17-28]. Ces différents tests sont capables de détecter simultanément de deux à quatre génomes viraux (ADN et/ou ARN) mais peu d’entre eux contiennent un témoin interne d’amplification. Le multiplexage a été appliqué avec succès aux différentes méthodes les plus utilisées d’amplification des ADN et ARN viraux et de détection des séquences amplifiées (tableau 2). Les méthodes d’amplification regroupent la réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction, PCR) de type conventionnel ou niché (nested PCR) et associée ou non a une transcription inverse préalable des ARN (RT-PCR) [17, 20, 25, 29], la PCR en temps réel (real-time PCR) [18, 19, 21, 23, 26, 28], l’amplification isothermique de séquences nucléiques (isothermal nucleic acid sequence-based amplification, Nasba) [22] et l’amplification par transcription (transcription-mediated amplification, TMA) [24, 27]. Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 Caractéristiques générales des tests d’amplification génomique multiplex Dans les tests multiplex utilisant une réaction conventionnelle de type (RT)-PCR, les produits amplifiés sont détectés et identifiés selon leur taille après migration par électrophorèse dans un gel d’agarose [17, 29]. La PCR nichée apporte un gain de sensibilité et de spécificité mais introduit cependant un risque accru de contamination croisée du fait de la manipulation de produits déjà amplifiés [29]. Afin d’éviter cette deuxième étape d’amplification, la détection des produits d’une première amplification a été rendue plus efficace par l’utilisation de sondes oligonucléotidiques d’hybridation associées à différentes méthodes de marquage et de détection des produits d’hybridation. Les tests utilisant cette méthodologie sont classés en deux groupes en fonction du type de signal d’amplification produit. Le premier groupe comprend les tests multiplex générant un signal unique, tels que les tests utilisant des sondes oligonucléotidiques marquées à la biotine à leur extrémité 5’ et un système de détection de type PCR Elisa DIG [25], 137 revue Tableau 2. Amplification génomique multiplex pour le dépistage des dons de sang Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Auteurs Année Virus Système d’amplification Système de détection Témoin interne Caudai 1998 RT-PCR Gel Non Plasma 100 780 copies Vet 1999 PCR en temps réel Sondes fluorescentes multiples Non Whole blood 200 1999 RT-PCR en temps réel Non Plasma 200 Defoort 2000 Sondes fluorescentes multiples Cytométrie de flux 10 copies VIH1 VIH2 VHTL-II 50 copies A-G A, D, SD A, B Mercier HCV, GBV-C VIH1, VIH2 HTLV-I, HTLV-II HCV, HBV Non Plasma 100 - - Meng 2001 RT-PCR en temps réel Fluorescence unique Oui Plasma 200 A-E 1-5 A-G De Baar 2001 VIH1 NASBA Non Plasma 200 Abravaya 2001 VIH1 M, O, VIH2 PCR Sondes fluorescentes multiples Fluorescence unique VHB 22-60 UI VHC 61-112 UI VIH 33-66 UI 10 copies Oui Plasma 1000 Candotti 2003 TMA Plasma 500 2004 Non Plasma 200 Candotti 2004 Non Plasma 200 Koppelman 2005 Fluorescence unique Fluorescence unique Sondes fluorescentes multiples Fluorescence unique Oui Adami Oui Plasma 500 Dineva 2005 VIH1, HCV VIH1, HCV VIH1, HCV, HBV VIH1, HCV, HBV VIH1, VIH2, HBV Non Plasma 200 VIH1, HCV, HBV VIH1, HCV, HBV RT-PCR RT-PCR RT-PCR en temps réel TMA RT-PCR en temps réel Bandes spécifique Type Sensibilité/ml d’échantillon et volume (ll) VIH1 50 copies VIH2 10 copies VIH1 15-20 UI VHC 16-18 UI VIH-1 100 UI VHC 200 UI VIH1 680 UI VHC 167 UI VHB 30 UI VIH1 26 UI VHC 4.6 UI VHB 11 UI VIH1 500 UI VHC 125 UI VHB 50 UI Génotypes ou soustypes - M, N, O A-G, O A-E 1-4 B 3 A-G 1-6 A-F B 1 A-G A-F 1-6 A-G HPV : papillomavirus humain ; FIV : virus de l’immunodéficience féline ; MeV : virus de la rougeole ; RUBV : virus de la rubéole ; B19V : parvovirus B19 ; HSV : virus herpes simplex ; VZV : virus de la varicelle et du zona ; CMV : cytomegalovirus ; HHV : herpèsvirus humain ; NV : norovirus ; HRSV : virus respiratoire syncytial ; HBV : virus de l’hépatite B ; PIV : virus parainfluenza ; HCV : virus de l’hépatite C ; WNV : virus West Nile ; GBV-C : virus dit de l’hépatite G. une détection fluorométrique LCx [23], des sondes chimioluminescentes pour la détection de produits amplifiés par transcription [24, 27], et des sondes fluorescentes de type TaqMan® (sondes doublement marquées par un rapporteur en 5’ et un bloqueur en 3’) associées à une PCR en temps réel utilisant une ADN polymérase ayant une activité nucléasique [21]. Ces différents tests sont incapables de différencier les uns des autres les génomes viraux détectés dans l’échantillon analysé. Il faut alors avoir recours à des amplifications secondaires individuelles spécifiques de chaque virus afin d’identifier le génome viral à l’origine du signal. Le second groupe est constitué de tests permettant la détection simultanée et l’identification immédiate d’ADN/ARN 138 viraux amplifiés dans une réaction multiple. Ces tests utilisent les techniques de (RT)-PCR conventionnelle, de Nasba et plus communément de (RT)-PCR en temps réel. Les produits amplifiés peuvent être directement identifiés par une technique d’hybridation sur microsphères utilisant un cytomètre de flux [20]. Ce procédé implique des étapes d’amplification et de détection séparées qui s’avèrent compliquées et longues. Récemment, Dineva et al. [28] ont décrit une méthode rapide, simple et ne nécessitant que peu d’équipement pour la détection visuelle et l’identification de plusieurs produits d’amplification par hybridation à l’aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques immobilisées sur bandelette ou dipstick. Les tests utilisant la (RT)Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 revue PCR en temps réel ou le Nasba cumulent les avantages d’être des systèmes fermés combinant amplification et détection en une seule réaction, de limiter les risques de contamination en ne nécessitant pas de manipulation postamplification, d’avoir des temps de réaction réduits du fait de cycles d’amplification courts et d’utiliser des sondes fluorescentes associées à des systèmes de détection optique particulièrement sensibles [18, 19, 22, 26]. Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. RT-PCR multiplex en temps réel : principe et développement La majorité des tests multiplex pour la détection des génomes viraux décrits dans la littérature utilisent la (RT)-PCR en temps réel (tableau 1). L’amplification en temps réel semble être largement acceptée du fait de sa sensibilité, de sa capacité à produire des résultats rapidement et du risque de contamination réduit mentionné plus haut. La rapidité de ce type de méthode est essentiellement due à des cycles d’amplification courts suffisants pour amplifier des produits de petite taille (60-120 paires de bases), à l’absence d’étape de détection post-amplification et à l’utilisation des marquages fluorescents fondés sur le transfert d’énergie de fluorescence par résonance (fluorescence resonance energy transfert, Fret) (figure 1A) et de systèmes sensibles de détection de la lumière. Cinq techniques chimiques de détection des produits amplifiés sont majoritairement utilisées en PCR en temps réel : 1) molécules fluorescentes se fixant non spécifiquement sur l’ADN double brin (Sybr® Green 1, Yo-Pro1), 2) sondes oligonucléotidiques fluorescentes adjacentes (HybProbes), 3) sondes oligonucléotidiques doublement marquées sensibles aux 5’ nucléases (oligosondes TaqMan®, oligosondes minor groove binding), 4) sondes oligonucléotidiques en épingle doublement marquées (sonde beacon), 5) amorces fluorescentes de type sunrise (AmpifluorTM) et scorpion [30]. Une des technologies la plus communément utilisée est la méthode TaqMan® fondée sur l’activité 5’exonucléasique de la Taq polymérase dégradant un oligonucléotide sonde [30] (figure 1B). Elle est largement employée pour la détection individuelle qualitative et quantitative de divers génomes viraux [2, 3, 6-9, 11-16]. Son application à un format multiple peut cependant s’avérer problématique. L’adaptation de la technologie d’amplification en temps réel à un format multiple a initialement été limitée par le nombre de molécules fluorescentes disponibles avec l’utilisation d’une source d’énergie lumineuse monochromatique, généralement de type laser. Un spectre de longueurs d’onde réduit limite le nombre de molécules fluorescentes qui peuvent être incluses dans une réaction sans interférence et donc la possibilité de distinguer clairement différents signaux de fluorescence dus à la présence simultanée de différents génomes viraux [2, 21]. Cependant, le déveVirologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 A 5’ Rapporteur 3’ Bloqueur B Site de clivage Brin néosynthétisé 3’ Brin ADN matrice ADN polymérase 5’ Figure 1. Principe de détection des produits d’amplification par PCR utilisant la méthode Taqman®. Lorsque, sur une sonde oligonucléotidique doublement marquée, le fluorophore rapporteur en 5’ est proche du bloqueur en 3’, ce dernier absorbe les longueurs d’onde d’émission du rapporteur résultant de l’excitation par la source lumineuse de l’instrument (flèche rouge) comme illustré en (A). Le bloqueur restitue alors cette énergie sous forme de lumière ou de chaleur. Lorsque rapporteur et bloqueur sont séparés par une certaine distance après hydrolyse de la sonde par l’activité exonucléasique de la Taq polymérase comme indiqué en (B), le bloqueur n’exerce plus aucune influence et le rapporteur émet à une longueur d’onde distincte (flèches noires) enregistrée par l’instrument. loppement de tests PCR multiples en temps réel, capables en une seule étape de détecter et d’identifier jusqu’à quatre génomes viraux distincts a été rendu possible grâce à deux avancées technologiques récentes. Premièrement, le développement de nouveaux bloqueurs tels que les black hole quenchers ou le 4-(4’diméthylamino-phénylazo)-benzène (Dabcyl) capables d’absorber un spectre plus large d’énergie fluorescente libérée par les rapporteurs et de restituer cette énergie non pas sous forme de fluorescence potentiellement interférente, mais sous forme de chaleur. Cela élargit l’éventail des molécules de marquage disponibles et permet de sélectionner ces rapporteurs de façon à minimiser le risque d’interférence entre leurs longueurs d’onde d’émission. La seconde innovation a été la mise sur le marché de plateformes de PCR en temps réel équipées soit de plusieurs diodes lumineuses couvrant le spectre visible entier, soit d’une lampe au tungstène ou halogène comme source de lumière d’excitation couvrant un large spectre de longueurs d’onde (350-750 nm) et associée à des cellules photomultiplicatrices ayant un spectre de détection de 350 à 830 nm [31]. En associant ces innovations technologiques, il devenait possible d’inclure dans une réaction 139 revue A Spectre d’excitation d’une lampe halogène quartz-tungstène (350-750 nm) FAM HEX ROX Cy5 500 550 650 600 700 750 Oligonucléotides sondes B 5’ rapporteur Spécificité FAM HEX ROX Cy5 HCV HIV1 HTLV-I HBV Amplification plots FAM 30000 ROX Fluorescence (dR) Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. 450 20000 Cy5 HEX 10000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 Cycles Figure 2. RT-PCR multiplex en temps réel appliquée à la détection et à l’identification simultanée de quatre génomes viraux. A) Sélection de quatre molécules fluorescentes (rapporteurs) spectralement distinctes pour le marquage en 5’ de sondes oligonucléotidiques spécifiques. B) Amplification simultanée de l’ADN-HBV, de l’ARN-HCV, de l’ARN-VIH1 et de l’ARN-HTLV-I, et identification directe des produits amplifiés à l’aide de sondes spécifiques marquées avec les fluorophores Cy5, FAM, HEX et ROX, respectivement. L’axe x représente le nombre de cycles d’amplification, l’axe y représente l’augmentation du niveau de fluorescence détecté ; le seuil de fluorescence est indiqué par la ligne horizontale. jusqu’à quatre, voire cinq, sondes fluorescentes spectralement distinctes, permettant ainsi d’identifier directement les différents génomes amplifiés (figure 2) [18, 22, 26]. Grâce aux progrès continuels dans l’élaboration et la chimie des sondes oligonucléotidiques marquées, il est théoriquement possible de distinguer un nombre croissant de cibles génomiques. Au total, en associant analyse du spectre de fluorescence et analyse des courbes de température de dissociation (TD) sonde-ADN cible, le nombre de produits amplifiés pouvant être différenciés est en théorie égal 140 au nombre de molécules fluorescentes distinctes multiplié par le nombre d’oligonucléotides ayant des TD distincts [32]. Idéalement, dans une réaction multiple, chaque génome cible doit être amplifié avec la même efficacité. Pour obtenir ce résultat, le choix et la synthèse des amorces et des sondes, la sélection des marqueurs fluorescents, l’utilisation d’ADN polymérases hot-start et l’optimisation des tests sont des facteurs importants à considérer. Au final, seule une approche empirique par essais successifs permet d’optimiser les différents paramètres impliqués dans le développement d’un test d’amplification multiple. La présence de plusieurs paires d’amorces et de sondes augmente le risque d’amplification non spécifique pouvant résulter d’appariements non spécifiques ou d’interactions entre oligonucléotides (amorces et sondes) avec pour résultat une perte de sensibilité ou de spécificité. Certaines séquences peuvent être également préférentiellement amplifiées. Pour limiter ce risque, amorces et sondes doivent être sélectionnées de façon à éviter toute complémentarité avec elles-mêmes, la présence de structures en épingle et toute homologie significative entre elles. Cependant, ces oligonucléotides doivent conserver des températures d’appariement similaires (59-68°C) avec une différence d’environ 10°C entre les amorces et la sonde, être constituées de 18 à 30 nucléotides avec 30-60 % de bases G et C. Ces exigences physicochimiques sont parfois difficiles à concilier avec la nécessité de sélectionner ces amorces et sondes dans les régions conservées limitées de certains virus à ARN tels que les rétrovirus et les flavivirus. Malgré le nombre croissant de programmes informatiques permettant de sélectionner amorces et sondes sur une séquence donnée, il n’existe aucune méthode vraiment fiable pour prévoir les performances des combinaisons proposées si ce n’est de les tester expérimentalement. De plus, il est souvent nécessaire d’ajuster les concentrations de chaque combinaison amorce/sonde afin d’atténuer des différences d’efficacité d’appariement durant les premiers cycles d’amplification, cycles critiques pouvant aboutir à une amplification préférentielle d’une séquence particulière qui épuise les réactifs au détriment des autres amplifications. Le choix des molécules fluorescentes pour le marquage des sondes est également important pour limiter le risque d’interférence dans la détection. Chaque spectre d’émission doit être clairement discernable des autres en minimisant le chevauchement des longueurs d’onde comme indiqué plus haut (figure 2A). L’utilisation d’ADN polymérases de type hot-start, qui sont activées par un chauffage préalable à 95°C, a permis d’éliminer les appariements non spécifiques à basse température des amorces avant la première étape de dénaturation. Augmenter la quantité d’enzyme peut améliorer significativement l’efficacité de l’amplification multiple [33]. Il est Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 revue A. PCR multiplex HBV-HHV8-B19 22000 22000 20000 20000 18000 18000 Cy5 14000 12000 10000 8000 6000 4000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 FAM, HEX 2000 2000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 Cycles Cycles C. PCR individuelle HHV8 D. PCR individuelle B19 Fluorescence (dRn) 400 Fluorescence (dR) Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Cy5 16000 Fluorescence (dR) 16000 Fluorescence (dR) B. PCR individuelle HBV 300 200 100 0.2 HEX 0.1 0 FAM -100 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 Cycles 0.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycles Figure 3. Exemple de compétition dans un test PCR multiplex HBV-HHV8-B19 en temps réel. Un test PCR multiplex a été utilisé pour la détection simultanée des ADN-HBV (rapporteur Cy5), HHV8 (rapporteur FAM) et B19 (rapporteur HEX) ; un résultat positif d’amplification a été obtenu pour l’ADN-HBV (A). Lorsque le même plasma a été testé à l’aide de trois PCR individuelles, un résultat d’amplification a été trouvé positif avec la PCR-HBV (B), négatif avec la PCR-HHV8 (C) et faiblement positif avec la PCR-B19 (D). aussi parfois nécessaire d’optimiser d’autres paramètres essentiels de la PCR tels que la concentration en déoxyribonucléosides triphosphates, ions divalents (Mg2+) et les composants du tampon d’amplification. L’effet de l’optimisation de ces derniers paramètres sur les performances de l’amplification multiple reste cependant controversé [34]. Malgré le soin apporté à l’optimisation de ces différents paramètres, un compromis doit parfois être trouvé entre détection multiple simultanée et performance d’une ou plusieurs des réactions d’amplification incluses dans le test par comparaison à des amplifications individuelles. Par ailleurs, la détection d’une faible quantité d’un génome viral peut être affectée par l’amplification simultanée d’autres virus présents en grande quantité. Une étude utilisant une RT-PCR multiple HBV-HCV-VIH1 en temps réel a Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 montré que la détection d’une faible quantité d’ADN-HBV n’était pas affectée par la co-amplification de quantités plus élevées d’ARN-HCV et VIH1, et vice-versa [26]. Une compétition dans l’amplification des deux ARN viraux a été observée avec un impact négatif essentiellement sur l’amplification du VIH1, la détection de l’ARN-VIH1 étant retardée plutôt que véritablement inhibée. Cependant, la compétition au sein d’un test multiplex peut également produire des résultats faussement négatifs comme illustré dans la figure 3. Dans le cas présenté ici, un test d’amplification PCR multiple a été utilisé pour détecter simultanément les ADN du HBV, du parvovirus B19 et de l’herpèsvirus humain 8 (HHV8) dans le plasma d’une femme enceinte [16]. Le test multiplex a mis en évidence une infection à HBV avec une charge virale élevée (107 UI/ml) et a donné un résultat négatif pour le parvovirus B19 et 141 revue HCV (rapporteur FAM) HBV (rapporteur Cy5) 2.0 1.8 1.6 0.4 Fluorescence (dRn) Fluorescence (dRn) 0.5 0.3 0.2 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 Cycles Cycles GBV-C (rapporteur Cy5) B19 (rapporteur HEX) 2.0 1.8 3000 1.6 1.4 Fluorescence (dR) Fluorescence (dRn) Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. 0.1 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 2000 1000 0.4 0.2 0 0.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 Cycles 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycles Figure 4. Exemples de détection à l’aide de différents tests (RT)-PCR multiplex des ADN-HBV et B19 et des ARN-HCV et GBV-C. Les produits amplifiés HBV et GBV-C sont détectés avec des sondes marquées avec un rapporteur Cy5. Les sondes spécifiques du HCV et du B19 sont marquées avec un rapporteur FAM et HEX, respectivement. Les signaux d’amplification ambigus obtenus après 38 ou 40 cycles d’amplification sont indiqués par une barre horizontale rouge. l’HHV8. Cependant, lorsque ce même plasma a été testé en parallèle à l’aide de PCR individuelles, non seulement la présence d’ADN-HBV a été confirmée mais de l’ADN B19 a été détecté à un faible niveau (103 UI/ml). La PCR-HHV8 individuelle a donné, elle, un résultat négatif. Ce résultat montre que l’amplification d’un ADN viral peut être inhibée par la co-amplification rapide et particulièrement efficace d’un autre ADN viral présent en quantité significativement plus élevée. En présence d’une forte charge virale, il est recommandé de tester la présence d’autres agents infectieux à l’aide de tests individuels. La PCR en temps réel fondée sur la dégradation d’une sonde par l’activité nucléasique de la Taq polymérase peut générer des signaux de fluorescence de niveau bas et non reproductibles, sans que généralement la présence de produits amplifiés spécifiques puisse être confirmée [26]. Ces 142 faibles signaux de fluorescence ont été observés dans différentes (RT)-PCR en temps réel en format multiple ou individuel. Ils apparaissent de manière aléatoire au-delà d’environ 38 cycles d’amplification et ne sont associés ni à une combinaison rapporteur-bloqueur particulière, ni à une séquence virale spécifique comme illustré dans la figure 4. Ce type de signal semble être dû à une dégradation non spécifique de la sonde. La spécificité de la PCR en temps réel décroît donc au-delà de 38-40 cycles d’amplification en fonction du test considéré [26, 35, 36]. Afin de limiter les résultats faussement positifs, un cycle d’amplification seuil, spécifique du virus recherché et donnant une valeur prédictive à 95 %, peut être défini expérimentalement en analysant le rapport entre résultats positifs confirmés et non confirmés au-delà d’un certain nombre de cycles [26]. Il est donc nécessaire d’utiliser un test moléculaire de confirmaVirologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 revue Tableau 3. Détection de l’ARN GBV-C à l’aide d’un test RT-PCR multiplex en temps réel GBV-C/WNV/Dengue et confirmation par RT-PCR nichée Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Echantillona D18 D20 D28 D27 D04 D03 D06 D01 D30 D08 a b Charge viraleb RT-PCR multiplex en temps réel RT-PCR Interprétation (copies/mL) Ct Résultat nichée finale 36000 9500 6600 1100 390 140 < 10 < 10 < 10 < 10 26,7 28,6 29,0 31,7 33,0 34,5 38,5 38,8 38,8 42,5 Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Indéterminé Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. Neg. Neg. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. Neg. Neg. Plasmas de donneurs de sang africains. Charge virale GBV-C déterminée par RT-PCR quantitative [15]. tion de sensibilité équivalente pour différencier faux et vrais résultats positifs obtenus avec le test en temps réel comme indiqué dans le tableau 3. Cet exemple montre que, dans la majorité des cas, un signal ARN-GBV-C faiblement positif (> 38 cycles) n’est pas confirmé par un second test moléculaire. Témoin interne Lors du développement d’un test multiplex, la question de l’inclusion d’un témoin interne se pose. Cela implique l’introduction d’une réaction d’amplification et de détection supplémentaire au détriment du nombre de virus recherchés. Cependant, un résultat d’amplification négatif n’indique pas nécessairement l’absence du virus recherché si chaque étape du processus n’a pas été contrôlée. Il existe des procédés commerciaux relativement simples permettant de purifier les ADN et ARN viraux simultanément à partir du plasma, du sérum, du sang total et autres tissus. Ces procédés utilisent les propriétés d’attachement spécifique des acides nucléiques sur des surfaces de fibres de verre, des membranes de gel de silice en présence de sels chaotropiques ou bien des microparticules magnétiques recouvertes de sondes de capture spécifiques. Le matériel ainsi purifié peut toujours contenir des impuretés résiduelles potentiellement inhibitrices des réactions de transcription inverse et/ou d’amplification. L’introduction d’un témoin interne est donc indispensable pour valider un résultat négatif. Ce témoin interne doit être ajouté avant traitement de l’échantillon de façon à contrôler l’extraction des acides nucléiques, la présence d’inhibiteurs dans les extraits et les erreurs techniques. Un témoin interne est inclus dans tous les tests d’amplification génomique multiplex commerciaux [24, 27, 37] mais dans très peu de tests non commerciaux [23, 29]. Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 L’approche la plus fréquente consiste à utiliser de petites quantités d’ADN cloné ou d’ARN transcrit in vitro. Les témoins internes ADN sont généralement les plus utilisés du fait de leur plus grande stabilité dans le plasma comparés aux ARN exogènes. Cependant, ils ne permettent pas de valider l’étape de transcription inverse lors de l’amplification des ARN viraux. Les ARN sont difficiles à quantifier et il est difficile d’éliminer l’ADN contaminant à partir duquel ils ont été transcrits. La présence ubiquitaire de ribonucléases rend aussi problématique leur stockage à long terme et peut affecter la reproductibilité des tests. La technologie dite de l’ARN « en armure » (armoured RNA) a été développée avec succès afin de produire des ARN viraux témoins homogènes, non infectieux et résistants aux ribonucléases [38]. La séquence nucléotidique de la plupart des témoins internes est similaire à la séquence virale recherchée et peut parfois être amplifiée avec les mêmes amorces. Les produits amplifiés caractéristiques du virus et du témoin interne sont ensuite différenciés par hybridation avec des sondes spécifiques [27]. Cependant, l’amplification des témoins internes homologues peut entrer en compétition avec celle du virus et finalement affecter la sensibilité du test. Une approche plus pertinente est d’utiliser un virus à ADN ou ARN hétérologue. Des virions humains ou non humains, ayant un pouvoir infectieux limité, peuvent être ainsi sélectionnés de façon à avoir des propriétés physicochimiques semblables à celles des virus cibles tout en évitant des similitudes de séquences. De plus, les virions peuvent être aisément produits en culture et quantifiés précisément. Cette stratégie a été appliquée avec succès à l’aide du virus de la diarrhée bovine [39], du bactériophage lambda [40], d’un virus chimère de la fièvre porcine [41] et du HTLV-I [16]. Les virions rétroviraux présentent l’avantage de contenir majoritairement de l’ARN mais aussi de l’ADN due à une transcription inverse intravirionique et 143 revue Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. peuvent ainsi être utilisés comme témoins dans des tests ADN ou ARN [42]. La figure 5 montre un exemple d’utilisation d’un surnageant de culture HTLV-I comme témoin interne dans un test multiplex HBV-HHV8-B19. Le signal d’amplification supplémentaire HTLV-I n’interférait pas avec la détection des autres signaux d’amplifications (figure 5B) et n’affectait pas significativement l’efficacité d’amplification des virus HBV, HHV8 et B19 comme indiqué en testant des séries de dilutions d’un mélange des trois virus cibles dans lesquelles la même quantité de virions HTLV-I était introduite (figure 5C). Amplification génomique multiple appliquée au dépistage des dons de sang dans les pays développés : quelques données Les infections à HBV, HCV et VIH1 constituent le principal risque résiduel de transmission par transfusion d’une infection virale du fait de la fenêtre de préséroconversion, de l’existence de variants échappant aux tests sérologiques, de porteurs infectés sans réponse immunitaire ou d’infection occulte dans le cas du HBV [43]. Les méthodes de détection des génomes viraux ont été développées afin de réduire ces risques et ont été appliquées avec succès sous forme de tests individuels au dépistage des dons de sang. Le dépistage à grande échelle des génomes viraux en transfusion s’étend dans les pays développés occidentaux malgré le fait que cette stratégie reste controversée du fait d’un rapport élevé coût/efficacité lié à une très faible prévalence de ces virus parmi les donneurs de sang de ces pays [1]. Comme indiqué précédemment, les tests d’amplification génomique multiple peuvent théoriquement réduire ce coût et économiser du temps et des efforts sans compromettre l’efficacité et la faisabilité du dépistage moléculaire [34]. Cependant, seul un petit nombre d’études ont décrit l’utilisation en routine de tests d’amplification multiple, commerciaux ou non, pour la détection des infections à HBV, HCV et VIH1 dans les dons de sang [24, 27, 37, 44-49]. Le test commercial semi-automatique Duplex HIV1/HCVTMA Procleix (Chiron-GenProbe) est actuellement utilisé en routine, en parallèle des tests individuels, pour le dépistage des dons dans plusieurs pays européens (Allemagne, Angleterre, Belgique, Espagne, France, Grèce et Italie), aux États-Unis, en Australie, à Hong Kong et en Afrique du Sud [47] ; il est en cours d’évaluation en Chine [49]. Les évaluations cliniques ont montré une spécificité optimale (> 99 %), une très grande sensibilité pour le VIH1M (~ 30 UI/ml) et les génotypes 1 à 6 du HCV (~10 UI/ml), une fréquence d’échec du test variant entre < 1 et 4,7 % liée à des erreurs humaines, des contaminations mineures et des dysfonctions de certains équipements de purification des 144 acides nucléiques viraux [24, 44-47, 49]. Une version entièrement automatisée des tests Procleix (système Tigris) est en cours d’évaluation dans différents pays. Récemment, une nouvelle génération de test multiplex utilisant un système d’amplification par transcription a été mise sur le marché (test Procleix Ultrio, Chiron-GenProbe). Il s’agit d’une version du test HIV1-HCV Procleix auquel ont été ajoutées l’amplification et la détection du HBV. Ses limites de détection 95 % vis-à-vis des étalons internationaux de l’OMS ont été évaluées à 16-58 UI/ml pour l’ARN-VIH1, à 3,7-6,5 UI/ml pour l’ARN-HCV et à 7,3-22 UI/ml pour l’ADN-HBV [27]. En comparant ces données à celles des études précédentes sur le test Procleix VIH1-HCV, les limites de détection pour le VIH1 et le HCV n’ont pas été affectées par l’addition de la détection du HBV ; une spécificité initiale et un taux de résultats invalides de 99,8 et 0,48 % ont été observés, respectivement [27]. Depuis février 2000, le dépistage HBV-HCV-VIH1 par RTPCR multiple en temps réel sur des pools de 500 puis 50 plasmas séronégatifs a été mis en place par les services de transfusion sanguine de la Croix-Rouge japonaise avec des résultats disponibles dans les 24 heures suivant le don [37]. Le test Amplinat MPX employé consiste en une étape d’extraction et de purification des génomes viraux à l’aide de sondes de capture spécifiques, suivie d’une amplification et d’une détection utilisant une méthodologie de type TaqMan incluant un témoin interne. Sa limite de détection 95 % est de 20-60 copies/ml pour l’ADN-HBV, 61112 copies/ml pour l’ARN-HCV et 33-66 copies/ml pour l’ARN-VIH1. Il détecte les différents génotypes et soustypes des trois virus avec une spécificité de 99,6 % ainsi que l’ADN-HBV 24 jours avant détection de l’antigène HBs, l’ARN-HCV 31 jours avant les anticorps anti-HCV et l’ARN-VIH1 14 jours avant les anticorps anti-VIH1 et 9 jours avant l’antigène p24 [21]. L’analyse de ses performances a montré une fréquence de 2 % de séries de résultats non validées, 0,2 % de résultats faussement positifs et 0,17 % d’échecs d’amplification du témoin interne. Ces différentes études ont permis de démontrer la faisabilité et l’efficacité du dépistage HBV-HCV-VIH1 à grande échelle dans les dons de sang à l’aide d’un test d’amplification génomique multiple. Par ailleurs, la mise en place du dépistage génomique (multiple ou individuel) systématique a réduit à 0,5 par million le risque résiduel de transmission du VIH1 et du HCV ; le dépistage de l’ADN-HBV doit pouvoir réduire d’un facteur 2 à 5 le risque résiduel de transmission par transfusion du HBV dans les pays développés [50, 51]. Cependant, le développement de ces tests de détection moléculaire est caractérisé par le paradoxe suivant : ces tests sont essentiellement développés pour être utilisés dans des contrées riches où leur utilité est controversée du fait du rapport coût/efficacité élevé évoqué plus haut. En contrepartie, ils seraient d’une grande utilité dans Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 revue A Purification des acides nucléiques viraux (RT)-PCR multiplex en temps réel B Absence de témoin interne Présence d’un témoin interne 11000 12000 Cy5 11000 9000 8000 8000 FAM 7000 6000 5000 4000 Fluorescence (dR) 9000 Fluorescence (dR) Cy5 10000 10000 FAM 7000 6000 5000 4000 3000 3000 HEX 2000 ROX 2000 1000 1000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 HEX 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycles C Cycles 38 36 32 HEX 30 28 FAM 26 24 Cy5 22 100 1000 Quantité initiale (copies) 10000 ct (dR) 34 ct (dR) Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. - tampon de lyse - échantillon (plasma) - témoin HTLV-I (ADN proviral/ARN viral) 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 HEX FAM Cy5 100 1000 Quantité initiale (copies) 10000 Virus R2 Pente Efficacité Virus R2 Pente Efficacité HBV HHV8 B19 0,99 0,99 0,98 -3,44 -3,81 -3,34 95,5% 83,0% 99,4% HBV HHV8 B19 1,00 0,97 0,98 -3,40 -3,76 -3,21 96,7% 84,6% 105,1% Figure 5. Inclusion d’un témoin interne (virion HTLV-I) dans une réaction de PCR multiplex HBV-HHV8-B19 en temps réel. Une quantité définie de virions HTLV-I est introduite dans l’échantillon à tester avant purification des acides nucléiques viraux afin de contrôler chaque étape du processus jusqu’à la détection finale des produits amplifiés (A). Les ADN-HBV (signal Cy5), HHV8 (signal FAM) et B19 (signal HEX) présents dans un même échantillon sont détectés en présence ou non du témoin HTLV-I amplifié simultanément (signal ROX) (B). Des séries de dilutions (1 : 10) d’un mélange équimolaire d’ADN-HBV, HHV8 et B19 sont testées en parallèle après ajout ou non de la même quantité de virus HTLV-I dans chaque dilution (C). L’axe x représente la quantité d’ADN viral (UI/mL, échelle logarithmique) ; l’axe y représente le nombre de cycles d’amplification seuil ; les coefficients de corrélation R2, les pentes des courbes obtenues et les efficacités de réaction sont indiqués. Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 145 revue des régions à forte endémie mais qui ont le plus souvent des ressources limitées interdisant l’accès à des technologies de pointe nécessitant des infrastructures et équipements lourds et compliqués, un stockage à basse température et un personnel bien formé. Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Amplification génomique multiple appliquée au dépistage des dons de sang en milieu à ressources limitées : l’expérience ghanéenne Afin de palier ces limitations technologiques et économiques, un test non commercial d’amplification génomique multiple HBV-HCV-VIH1 par RT-PCR en temps réel (technologie TaqMan®) a été développé [26]. Il présente l’avantage de détecter et d’identifier simultanément les trois virus et un témoin interne (ARN-HTLV-I) en une seule réaction, chaque ADN-ARN viral amplifié étant détecté à l’aide d’une sonde spécifique marquée par un rapporteur différent (figure 2B). Il détecte avec la même efficacité les souches de HBV de génotypes A-F, de HCV de génotypes 1-6 et de VIH1 de sous-types A-G ainsi que les principales formes recombinantes circulantes. Ses limites de détection à 95 % sont respectivement de 30, 167 et 680 UI/ml pour l’ADNHBV, l’ARN-HCV et l’ARN-VIH1. Comparé aux tests Procleix Ultrio et Amplinat MPX, ce test RT-PCR multiple en temps réel présente une sensibilité analytique plus faible, en particulier pour la détection du VIH1. Cette différence de sensibilité peut être en partie liée à la différence de volume de plasma utilisé pour purifier les acides nucléiques et à la quantité finale de molécules cibles introduites dans la réaction d’amplification. Les tests Procleix Ultrio et Amplinat MPX sont effectués à partir de 500 et 200 ll de plasma respectivement, et la totalité des acides nucléiques extraits sont utilisés dans la réaction d’amplification. Dans le test RT-PCR en temps réel, les acides nucléiques sont également extraits à partir de 200 ll de plasma mais seulement un cinquième des acides nucléiques purifiés sont utilisés dans la réaction d’amplification. En conséquence, la quantité de génomes viraux cibles introduite dans chaque réaction d’amplification est respectivement 12,5 et 5 fois plus élevée dans les tests Procleix Ultrio et Amplinat MPX que dans le test RT-PCR en temps réel. Ce test a ensuite été évalué pour le dépistage des unités de sang sérologiquement négatives de la banque du sang de l’hôpital Komfo Anokye de Kumasi au Ghana dans le cadre d’une stratégie nouvelle visant à assurer la sécurité virale transfusionnelle dans un contexte de forte endémie des infections à HBV, VIH1 et HCV associée à des ressources limitées. Cette stratégie associe un dépistage sérologique à l’aide de tests rapides des candidats donneurs avant prélèvement du sang et un dépistage moléculaire par amplifica146 tion génomique multiple sur des mélanges (pools) de 10 plasmas provenant des dons de donneurs préalablement testés séronégatifs avec des tests rapides (figure 6). Le choix d’un dépistage sur mini-pools de 10 plasmas opposé à un dépistage sur plasmas individuels a été initialement guidé par des contraintes économiques et visait à maintenir au plus bas le coût de la procédure dans son ensemble. En testant sur mini-pools, les limites de détection sont théoriquement réduites d’un facteur équivalent au nombre de plasmas inclus dans le mélange. Cependant, la comparaison entre le dépistage sur mini-pools et unitaire à l’aide du test HIV1-HCV Procleix n’a montré que des différences mineures sans impact significatif sur l’efficacité générale du dépistage par test d’amplification multiple, ni sur le délai de mise à disposition des produits sanguins [45]. Cela est sans doute dû au fait que les infections détectées correspondaient presque exclusivement à des préséroconversions. Dans le cas du VIH1 et du HCV, la charge virale durant cette période varie entre 104 et 107 UI/ml représentant un niveau détectable dans des pools de 24 plasmas ou plus (limite de détection : 5 x 103 UI/ml). Elle augmente rapidement d’un niveau indétectable à un plateau (temps de doublement de 24 heures), la période durant laquelle le dépistage unitaire est plus sensible que sur mini-pools se réduit à 1 ou 2 jours [52]. Par ailleurs, les résultats obtenus avec le Donneurs de sang potentiels Dépistage de l’antigène HBs et des anticorps anti-HCV et anti-VIH à l’aide de tests sérologiques rapides Résultat négatif Résultat positif Prélèvement du don Rejet Information/conseil Mélange de 10 plasmas RT-PCR multiplex en temps réel VHB-VHC-VIH1/témoin interne Résultat négatif Distribution des produits sanguins Résolution du pool: (RT)-PCR individuelle en temps réel spécifique du/des virus détecté(s) avec le test multiplex Résultat positif Résultat négatif Résultat positif Confirmation sérologique: Tests immuno-enzymatiques Tests rapides Figure 6. Stratégie de dépistage des infections virales dans les dons de sang en phase d’évaluation au Ghana. Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue test Procleix Ultrio ont montré que la réduction de la fenêtre de détection de l’antigène HBs (AgHBs) diminuait proportionnellement avec le niveau de dilution des échantillons. Une réduction de cette fenêtre de 14,6 et 3 jours a été observée lorsque les échantillons étaient testés non dilués, dilués 8 et 16 fois respectivement. Ces résultats étaient concordants avec ceux d’une étude précédente ayant utilisé des méthodes fondées sur des amplifications individuelles par PCR et par transcription [53]. Une première évaluation des performances du test RT-PCR multiple en temps réel a été effectuée en testant rétrospectivement des plasmas de donneurs de sang ghanéens préalablement testés sérologiquement négatifs pour l’AgHBs et les anticorps anti-HCV et anti-VIH à la banque du sang de Kumasi. Ces plasmas séronégatifs ont été inclus dans des pools de 10 échantillons qui ont ensuite été expédiés ainsi que les plasmas individuels au laboratoire de virologie moléculaire, division de médecine transfusionnelle du département d’hématologie de l’Université de Cambridge (Royaume-Uni) pour dépistage moléculaire. Le dépistage moléculaire de 517 pools contenant 5 109 plasmas individuels sérologiquement négatifs a montré qu’aucun plasma contenant de l’ARN-VIH1 ou HCV n’avait échappé aux tests sérologiques rapides et n’était inclus dans les pools à moins d’une erreur humaine. Au contraire, 1,7 % des plasmas étaient infectés par le HBV sans que la totalité de ces infections occultes (absence d’AgHBs détectable en présence d’ADN viral) ne soient détectées par des tests immunoenzymatiques plus sensibles. De plus, la moitié des dons contenant de l’ADN-HBV n’étaient pas identifiés dans les pools de 10 plasmas mais l’étaient lorsque le dépistage était effectué sur plasmas individuels. La plupart des plasmas ADN-HBV positifs non détectés dans les pools (81,3 %) contenaient moins de 100 UI d’ADN-HBV par ml [48]. Ces résultats indiquent clairement une réduction de l’efficacité du dépistage de l’ADN-HBV dans des pools de 10 ou plus conformément à d’autres études [27, 53]. Deux questions se posent. Premièrement, quel est le potentiel infectieux de ces unités contenant de faibles quantités d’ADN-HBV pour des receveurs immunocompétents et immunodéprimés ? Deuxièmement, doit-on reconsidérer la stratégie du dépistage en pools, en particulier si le pouvoir infectieux des infections à HBV occultes est avéré et varie en fonction de la réponse immune présente chez le donneur et du statut immunitaire du receveur ? Ces résultats expérimentaux préliminaires apportent des arguments en faveur de cette nouvelle stratégie associant dépistage sérologique avant prélèvement du don à l’aide de tests rapides et amplification génomique multiple après prélèvement, et qui procure une sécurité transfusionnelle dans des régions à faibles ressources et de forte endémie équivalente à celle existant dans les régions riches et de faible endémie [54]. Cependant, cette stratégie nécessite Virologie, Vol. 11, n° 2, mars-avril 2007 encore d’être évaluée sur le terrain sur le plan technique et économique. Une telle évaluation en temps réel est actuellement en cours au Ghana depuis février 2005 en tant qu’étude pilote collaborative. Une fois les difficultés initiales d’acheminement des équipements et des réactifs résolues, les résultats préliminaires apparaissent encourageants en ce qui concerne les performances du test moléculaire dont le principal point faible reste le facteur humain. Ces performances dépendent ainsi directement du soin continuel apporté à la réalisation du test par le personnel du laboratoire dûment formé. Les premiers résultats montrent que 1 : 250 à 1 : 500 des dons testés négatifs avec des tests sérologiques rapides performants ont été testés positifs avec le test moléculaire multiple et, après résolution des pools, seuls des dons contenant de l’ADN-HBV ou de l’ARN-HCV ont été identifiés comme illustré dans la figure 7. De plus, la détection de trois génomes viraux sur pools de 10 échantillons à l’aide d’un test moléculaire multiple était possible pour un coût inférieur à 4 $ par don de sang [55]. Conclusion Les récentes avancées techniques dans le domaine de l’amplification génomique ont permis le développement de tests d’amplification multiple pour la détection et éventuellement l’identification immédiate des génomes viraux. L’optimisation de ces tests peut s’avérer difficile et un soin particulier doit être apporté à la sélection des combinaisons d’amorces utilisées dans un format multiple. Les principales difficultés à résoudre sont le risque de résultats faussement négatifs dus à des phénomènes de compétition entre les différentes amplifications et des problèmes de spécificité selon la méthode utilisée. En conséquence, l’utilisation d’un test moléculaire de confirmation peut s’avérer nécessaire. Malgré ces réserves, des tests d’amplification génomique multiple, commerciaux ou non, ont été utilisés avec succès, en particulier pour le dépistage à grande échelle des infections à HBV, HCV et VIH1 dans les dons de sang. Ces tests ont montré une grande sensibilité et spécificité tout en ayant le potentiel de réduire les coûts et délais opératoires de la détection moléculaire. De plus, le format multiple offre la perspective d’accroître la sécurité transfusionnelle dans des régions endémiques à faibles ressources tout en maintenant un rapport coût/efficacité favorable en étant associé avec d’autres procédés réducteurs de coût tels que la détection en pools de plasmas et le dépistage sérologique avant prélèvement du don. Considérant les avantages des tests d’amplification multiple déjà mis en évidence et les récents progrès techniques dans ce domaine, il faut s’attendre dans le futur au développement commercial de systèmes de détection multiple pour les virus ayant un intérêt clinique et épidémiologique. 147 revue A. Témoin positif B. 12 pools testés HCV/FAM Témoin interne/ROX HCV/FAM HBV/Cy5 Témoin interne/ROX Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. VIH1/HEX C. Pool positif HCV/FAM D. Test des plasmas individuels HCV/FAM Témoin interne/ROX Figure 7. Dépistage HBV, HCV, VIH1 par RT-PCR multiplex en temps réel incluant un témoin interne dans des pools de 10 plasmas. A) Témoin positif inclus dans chaque série de tests constitué d’un mélange HBV (500 IU/mL), HCV (1 000 IU/mL), VIH1 (1 000 IU/mL) ; les sondes HBV, HCV et VIH1 sont marquées respectivement avec Cy5, FAM et HEX ; un témoin interne HTLV-I (sonde marquée ROX) est inclus dans chaque réaction. B) Résultats du dépistage d’une série de 12 pools de 10 plasmas montrant un signal FAM caractérisant un pool HCV positif distinct des signaux ROX des 12 témoins internes. C) Détail du pool détecté HCV positif. D) Résolution du pool positif en testant la présence d’ARN-HCV par RT-PCR en temps réel dans les 10 plasmas individuels inclus dans le pool positif et identification du don infecté. Références 1. Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The costeffectiveness of NAT for HIV, HCV, and HBV in whole-blood donations. Transfusion 2003 ; 43 : 721-9. 2. 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