Physiopathologie des candidoses invasives I. II. III. IV. Rappels sur les candidoses Biologie de Candida albicans Physiopathologie des candidoses invasives Conclusion Microbiologie Médicale V. Letscher-Bru 1 I. Candidoses : Règne des champignons 70 000 espèces connues Micromycètes 2 Champignons filamenteux Levures Aspergillus Dermatophytes Nbses moisissures saprophytes Candida Cryptococcus, Malassezia Saccharomyces … I. Candidoses : • Définition : infections superficielles ou profondes provoquées par des levures du genre Candida • Genre Candida : > 200 espèces - Candida albicans : 80 % - Candida non-albicans : 20 % C. glabrata C. tropicalis C. parapsilosis C. krusei • Ecologie - Saprophytes du milieu extérieur - Commensaux associés à la flore des muqueuses et de la peau - Industrie agroalimentaire 3 I. Candidoses : • Rappel des principaux aspects cliniques - Candidoses superficielles muqueuses, peau, ongles C. albicans > 95 % Fréquentes, localisées, bénignes Immunocompétent et immunodéprimé 4 Acquisition communautaire ou nosocomiale Candidoses superficielles Facteurs de risque • Facteurs locaux Humidité, transpiration, macération Traumatismes Candidose orale • Facteurs généraux - Physiologiques : âges extrêmes, grossesse - Médicaments : Onyxis et intertrigo anticancéreux, immunosuppresseurs, corticoïdes, radiothérapie, antibiotiques - Pathologies : VIH, hémopathies, diabète 5 Candidose vaginale I. Candidoses : • Rappel des principaux aspects cliniques - Candidoses superficielles muqueuses, peau, ongles C. albicans > 95 % Fréquentes, localisées, bénignes Immunocompétent et immunodéprimé - Candidoses profondes sang et organes profonds C. albicans = 50 % Surviennent sur terrains très particuliers Diagnostic et traitement difficiles 4ème cause de septicémie Mortalité 40 % 6 Acquisition communautaire ou nosocomiale Acquisition nosocomiale ++ Candidoses profondes Facteurs de risque • Neutropénie +++ - Hémopathies, chimiothérapie anticancéreuse. Risque si association avec antibiotiques, corticoïdes ou colonisation avancée • Chirurgie - Chirurgie digestive surtout • Voies veineuses (Matériel étranger) • Toxicomanie i.v. 7 Candidoses profondes • Septicémie = fongémie +++ = candidémie • Nosocomiales • Patients à risque : onco-hématologie, chirurgie, réanimation • Portes d'entrée : levures digestives (endogène), cathéter colonisé (endo- ou exogène) • Diversité des levures : C. albicans 50%, et C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei … • Mortalité 40 % Candidoses profondes Localisations secondaires Septicémie +++ = fongémie = candidémie 9 Physiopathologie des candidoses invasives I. Rappels sur les candidoses II. Biologie de Candida albicans 1. Ecologie 2. Morphologie et croissance 3. Ultrastructure 4. Génome 5. Paroi III. Physiopathologie des candidoses invasives IV. Conclusion 10 II. Biologie de C. albicans 1. Ecologie • C. albicans = commensal obligatoire et exclusif des muqueuses • Chez le sujet sain : - Intestin +++ : levure la plus abondante de la flore fongique intestinale (60-70%) - Muqueuses buccale, respiratoire, vaginale : +/- 11 II. Biologie de C. albicans 2. Morphologie – Croissance et multiplication Reproduction asexuée par mitose. Forme levure : bourgeonnement 12 Filamentation vraie filamentation pseudo-filamentation germination et croissance apicale bourgeonnement 13 II. Biologie de C. albicans 3. Ultrastructure 14 II. Biologie de C. albicans 4. Génome Séquençage terminé http://www-sequence.stanford.edu/group/candida http://genolist.pasteur.fr/CandidaDB 8000 gènes 7 chromosomes Grande variabilité 15 Electrophorèse en champs pulsé II. Biologie de C. albicans 5. Paroi 16 Structure de la paroi fongique Enzymes extracellulaires Mannoprotéines fibrillaires Mannoprotéines enzymatiques Mannoprotéines structurales 25 % 1-6 -glucane 70 % 1-3 Chitine Membrane plasmique 17 Rôles de la paroi -"squelette" du champignon - interaction avec l'environnement . perception . adaptation . interactions cellulaires . libération de molécules structure dynamique et évolutive 18 Physiopathologie des candidoses invasives I. Rappels sur les candidoses II. Biologie de Candida albicans III. Physiopathologie des candidoses invasives 1. Chronologie de l'infection 2. Facteurs de virulence du champignon 3. Facteurs de défense de l'hôte IV. Conclusion 19 III. Physiopathologie 1. Chronologie de l'infection • Levure opportuniste • 3 niveaux de relation entre C. albicans et son hôte, déterminés par des facteurs liés à l'hôte (facteurs de risque) et des facteurs liés au champignon (facteurs de virulence) COMMENSALISME Facteurs liés à l'hôte = facteurs de risque COLONISATION ETENDUE Facteurs liés à l'hôte + facteurs liés au champignon INFECTION 20 Chronologie de l'infection Commensalisme Colonisation étendue Invasion (Infection) épithélium digestif Passage systémique (fongémie) Extravasion Localisations secondaires 21 Commensalisme : Formes bourgeonnantes Colonisation étendue : Formes bourgeonnantes et formes filamenteuses Formes filamenteuses +++ Adhérence aux tissus Invasion tissus Infection 22 III. Physiopathologie 2. Facteurs de virulence du champignon • La pathogénicité de C. albicans vient de son adaptabilité à son environnement. grande variabilité génétique morphologique et fonctionnelle 23 2.1. Variabilité génotypique 17 souches isolées de 17 patients N souche 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Empreinte génétique sur séquence répétée (http://alces.med.umn.edu/candida) 24 Souches isolées de différents sites chez un même patient site 1 2 3 Typage RAPD (http://alces.med.umn.edu/candida) 25 III. Physiopathologie 2. Facteurs de virulence du champignon • La pathogénicité de C. albicans vient de son adaptabilité à son environnement. grande variabilité génétique, morphologique et fonctionnelle • Les facteurs de virulence s'expriment sous l'effet de facteurs déclenchants (facteurs de risque) - Morphogenèse (filamentation) - Capacité d'adhérence - Sécrétion de molécules actives 26 2.2. Variabilité morphologique = morphogenèse • Morphogenèse de C. albicans Pseudofilaments Levure ? Tubes germinatifs Filaments Vrais • Induite par certains facteurs environnementaux - température > 30 C - pH > 6, glucose, sérum - interaction avec tissus • Filamentation associée au pouvoir pathogène - In vivo, formes filamenteuses dans les tissus profonds infectés - In vitro, les conditions qui miment l'environnement de l'organisme déclenchent la filamentation 27 • Régulation de la morphogenèse SIGNAL Récepteur TRANSDUCTION DU SIGNAL Gènes de régulation REPONSE TRANSFORMATION MORPHOLOGIQUE 28 Gènes de réponse Signaux et récepteurs impliqués dans la morphogenèse FEMS Microbiol Letters 2009 Transduction du signal Signal Voie des Voie de la MAP kinases protéine kinase A / AMPc Cph1 Tup1 + - Efg1 -+ Rbf1 Gènes de régulation positive de la filamentation - facteurs de transcription Cph1 et Efg1 - molécules de transduction du signal Gènes de régulation négative de la filamentation - gènes répresseurs Tup1 et Rbf1 Trends in Microbiology 1999 FEMS Microbiol Letters 2009 30 Nonfilamentous C. albicans Mutants Are Avirulent Hsiu-Jung Lo, Julia R. Köhler, Beth DiDomenico, David Loebenberg, Anthony Cacciapuoti, and Gerald R. Fink Cell, Vol 90, 939-949, 5 September 1997 Gènes CPH1 et EFG1 mutants délétés Souche sauvage cph1/cph1 efg1/efg1 cph1/cph1 efg1/efg1 Pseudofilaments Filaments Virulence ++ + +/- ++ +/- +++ ++ + - survie 104 104 105 106 107 105 106 souche sauvage + sérum 31 souche mutée + sérum In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion C. Dieterich, M. Schandar, M. Noll,ã F.-J. Johannes, H. Brunner, T. Graeve and S. Rupp Microbiology (2002), 148, 497–506 Souche sauvage CPH1/EFG1 32 Souche mutée cph1/efg1 2.3. Capacité d'adhérence • L'adhérence est un prérequis à l'invasion. • Elle se fait par des adhésines pariétales (mannoprotéines +++) - les épithéliums colonisation - les endothéliums angioinvasion - les protéines plasmatiques - les protéines de la matrice extracellulaire (fibrinogène, laminine, fibronectine) invasion tissulaire - les cathéters et les prothèses biofilm • Elle varie selon - l'environnement - l'état morphologique : les formes filamenteuses adhèrent plus que les formes levures. • Le pouvoir pathogène augmente avec l'adhérence de la souche. 33 Relationship Between Cell Surface Composition, Adherence, and Virulence of Candida albicans Jane Mc COURTIE and L. Julia DOUGLAS, Infection and Immunity 1984, 45, 6-12 Souches isolées de candidose ou de portage asymptomatique Adhérence Virulence sur cellules épithéliales en présence de différents sucres portage candidose mortalité chez la souris après inoculation i.v * * * * ** glc sac gal 34 * * Oral Microbiol Immunol 2001 - + L'adhérence de C. albicans est augmentée par un prétraitement par des cytostatiques (PLM peblomycin, 5FU 5-fluorouracil, CDDP cisplatin) ou par irradiation (137 Cs). 35 Biofilms • Définition Un biofilm mature est constitué d'une communauté de microorganismes fixée de manière irréversible sur un support. Les microorganismes sont inclus dans une matrice (polymères) et présentent un phénotype différent (résistance aux antimicrobiens) de celui des mêmes microorganismes sous forme libre (planctonique). • Supports et origine de la contamination - Cathéter +++ (levures cutanées ou fongémie) - Prothèse, valve cardiaque, pacemaker (contamination chirurgicale ou fongémie) - Sonde endotrachéale, sonde urinaire… (levures commensales) • Biofilms mixtes possibles (bactéries + levures) 36 Formation d'un biofilm à Candida (a) Support vierge (b) Adhérence des levures (c) Multiplication des levures Adhérence +++ (d) Filamentation Fabrication de la matrice Biofilm mature Formation d'un biofilm mature en 48 heures 37 Structure d'un biofilm mature à Candida albicans 38 Biofilms • Modèles d'étude des biofilms - Cathéters de patients étudiés en microscopie - Modèles animaux de cathétérisation - Etudes in vitro sur "biofilms artificiels" Support "infecté" puis placé dans un milieu de croissance • Paramètres étudiés - Formation du biofilm (vitesse de croissance, structure) - Influence de la nature du support - Phénotype des levures du biofilm par rapport aux levures libres 39 Modification du phénotype des levures dans le biofilm -Augmentation de la résistance aux antifongiques- • La sensibilité d'une souche à un AF est évaluée par la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) = la plus faible concentration d'AF capable d'inhiber la croissance de la souche testée • La CMI est augmentée de 30 à 2000 fois dans le biofilm • Mécanismes - de l'entrée de l'AF dans le biofilm (rôle de la matrice ?) - expression de gènes de résistance aux AF induite par le contact avec le support et la filamentation 40 2.4. Sécrétion de molécules actives • Enzymes hydrolytiques - aspartyl protéinases - phospholipases B - lipases • Mannanes 41 Phospholipases B • Candidose invasive expérimentale par infection orale • Marquage de la phospholipase B sur une coupe tissulaire (intestin) • Clivage des phospholipides membranaires déstabilisation des membranes lyse cellules et tissus invasion 42 Ghannoum, Clin Microbio Rev 2000, 13 : 122-143 Mannanes • Polymères de mannose. • Localisés dans la paroi sous forme de mannoprotéines. 25 % des composants de la paroi. • Sécrétés par le champignon. 43 -mannanes -mannanes Libérés dans l'environnement. Rôle dans l’adhérence. Reconnus par le SI. • activent le complément opsonisation • reconnaissance et stimulation des macrophages • rôle dans l’orientation de la RI spécifique • induisent la production d’AC Jouault, Clin Diagn Lab Immunol 1997, 4: 328-333. Netea, Nature Reviews, 2008, 6: 67-78 44 III. Physiopathologie 3. Facteurs de défense de l'hôte Chez l'individu sain, les levures sont contrôlées par : • Facteurs locaux non immunologiques - Barrière cutanéomuqueuse - Flore bactérienne - Clairance mucociliaire et desquamation • Réponse immunitaire muqueuse et systémique - Non spécifique - Spécifique 45 3.1. Réponse immunitaire non spécifique Activation de la RI non spécifique via la reconnaissance de C. albicans par les cellules immunitaires : •PAMPs de C. albicans (pathogen-associated molecular patterns) mannanes, mannoprotéines, b-glucane •PRRs des cell. immunitaires (pattern-recognition receptors) 2 classes majeures pour la reconnaissance de C. albicans -TLRs (Toll like receptors) : TLR2 et TLR4 -CLRs (C-type lectine receptors) : MR et DC-SIGN 46 Nat Rev Microbiol 2008 3.1. Réponse immunitaire non spécifique a) Polynucléaires neutrophiles Rôle majeur +++ - neutropénie = facteur de risque majeur chez l'homme - confirmé par les modèles animaux Table I. Effect of neutrophil depletion on the outcome of disseminated candidiasis development. Treatment with anti-GR-1 mAb (a) + MST (b) > 60 (déplétées PNN) 4 (souris normales) CFU(X 103) (c) Kidneys Brain 414 72 1512 162 75 8 234 41 a) CD2F1 mice were trated with 100 µg of the neutrophil-depleting mAb, anti-GR1, 4h before intravenous challenge with low virulence PCA-2 cells. b) MST, median survival time (days). c) Colony-forming units were recovered 3 days after challenge. 47 Romani, Res Immunol 1996, 512-518 3.1. Réponse immunitaire non spécifique a) Polynucléaires neutrophiles Rôle majeur +++ • Effecteurs fongicides sur les formes levures et filamenteuses Caesar, Infect Immun 1997, 65 : 5354-5357 48 3.1. Réponse immunitaire non spécifique a) Polynucléaires neutrophiles Rôle majeur +++ • Effecteurs fongicides sur les formes levures et filamenteuses • Activité immunomodulatrice (cytokines) - cytokines inflammatoires (TNF- , IL-6) qui activent en retour les macrophages - IL-12 ou IL-10 qui orientent l'immunité spécifique. cellules sentinelles 49 Activité immunomodulatrice des PNN Table II. Production of cytokines by neutrophils in response to different stimuli in vitro. Cytokine levels (b) In vitro stimuli (a) IL4 IL-6 IL10 IL12p70 TNF None IFN + LPS C. albicans (PCA-2) C. albicans (CA-6) < 0.5 < 0.5 < 0.5 < 0.5 < 40 154 15 90 17 120 22 <2 49 8 <2 40 11 < 100 240 24 297 30 < 100 < 0.5 256 47 284 41 177 60 a) Neutrophils from the peritoneal cavity of mice injected 18 h earlier with 1 ml of thioglycollate were purified using mmunomagnetic beads. Cells (5x106) were cultured in vitro with IFN (400 U/ml) and LPS (40 ng/ml) or C. albicans cells cell-to-cell ratio of 1:1) in the presence of protease inhibitors for 24 h before measurement of cytokine contents in the supernatants. b) pg/ml (except for IL6, U/ml) as measured by specific ELISA or, for IL12p70, antibody capture bioassay. Negative cultures are indicated by cytokine titres below the determination. PCA-2 : souche avirulente, pas de filamentation CA-6 : souche virulente, filamentation +++ 50 Romani, Res Immunol 1996, 512-518 3.1. Réponse immunitaire non spécifique a) Polynucléaires neutrophiles Rôle majeur +++ • Effecteurs fongicides sur les formes levures et filamenteuses • Activité immunomodulatrice (cytokines) - cytokines inflammatoires (TNF- , IL-6) qui activent en retour les macrophages - IL-12 ou IL-10 qui orientent l'immunité spécifique. cellules sentinelles b) Macrophages, cellules dendritiques • Fongicides, production de cytokines inflammatoires (moins efficaces que PNN) • Cellules dendritiques : production IL-12 ou IL-10 51 3.2. Réponse immunitaire spécifique a) Immunité humorale Panel complexe d'anticorps ayant des rôles divers et mal connus AC utiles mais non indispensables b) Immunité cellulaire Encore mal élucidée. Rôle effecteur ? Production de cytokines +++ c) Cytokines rôle protecteur des cytokines Th1 et Th17 Microbes Infect 2010 52 Orientation de la réponse immunitaire X CPAG macrophages C. dendritiques (PNN) CPAG Ag IL-12 IL-4 + + NK IFN- LTH1 IL-2 IFN- Immunité Th1 LTH0 + TGF LTH17muq IL-17 IL-22 IL-26 Immunité Th17 + LTH2 IL-4 IL-5 IL-10 Immunité Th2 Prolifération lymphocytaire Peptides antimicrobiens Prolifération lymphocytaire Production d'IgG2a Chemokines Production d'IgG1 Activation phagocytes Recrutement des PNN IMMUNITE CELLULAIRE 53 IMMUNITE MUQUEUSES IMMUNITE HUMORALE Interactions C. albicans et cellules immunitaires 54 Nat Rev Microbiol 2008 Modèles animaux de candidose invasive Modèle RESISTANT Modèle SENSIBLE C. albicans i.v. Souche PCA-2 avirulente DBA/2 BALB/c Th1 (IFN , IL-2) Survie Résistance à réinfection anti-IFN anti-IL4 ou anti-IL10 55 Th2 (IL-4, IL-10) Décès Chez l'homme Portage commensal digestif Candidose invasive 56 Th1 / TH17 Th2 Physiopathologie des candidoses invasives I. II. III. IV. 57 Rappels sur les candidoses Biologie de Candida albicans Physiopathologie des candidoses invasives Conclusion IV. Conclusion 3 facteurs de virulence majeurs - Variabilité morphologique (filamentation) - Capacité d'adhérence - Production d'enzymes hydrolytiques Rôle primordial des PNN dans le contrôle des candidoses invasives - Effecteurs fongicides des levures et des filaments - Production de cytokines immunomodulatrices essentielles (IL10 et IL12) qui orientent l'immunité spécfique vers un profil protecteur Th1 ou délétère Th2 Rôle conjoint de l'immunité cellulaire Th17, Th1 et des cellules phagocytaires (PNN) dans la lutte contre les candidoses invasives 58 CONTAMINATION Réponse immune spécifique Th17/Th1 protectrice COMMENSALISME (état non pathogène) FACTEURS DE RISQUE Th17/Th1 ? Virulence de C. albicans COLONISATION ETENDUE (état pathogène) LT Th2 > Th1 CANDIDOSE SUPERFICIELLE Pas de dissémination phagocytes (PNN, MO) Th2 > Th1 CANDIDOSE SYSTEMIQUE AIGUE = disséminée phagocytes normaux Th2 > Th1 CANDIDOSE CHRONIQUE TISSULAIRE 59 phagocytes normaux Th1 > Th2 GUERISON