Modèles Expérimentaux en Toxicologie de la Reproduction Paul

Modèles Expérimentaux en
Toxicologie de la Reproduction
Paul Barrow
SFT, Nancy, 20 octobre 2009
Plan
• Modèles pour l’évaluation de:
o Tératogénèse
o Fertilité
o Développement post-natale
• Choix d’espèce pour les études réglementaires :
o La place des rongeurs, du lapin
o Le rôle des primates :
• Produits de la biotechnologie – ICH S6
o Autres espèces (miniporc, chauve-souris, kangourou…)
• Tests alternatifs (in-vitro et in-vivo).
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Quel est le meilleur modèle
animal pour la détection de la
tératogénèse?
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
• It’s the monkey, stupid!
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Modèles pour l’évaluation de la fertilité et du
développement postnatal
• Le rat (et / ou la souris) est généralement le plus adapté.
• Les études de fertilité et de développement postnatal sont
également possibles chez le lapin (mais moins pratiques).
• Le singe est peu pratique pour ces études :
o
o
o
o
Phase d’accouplement de plusieurs mois
Maturation mâle confondue par les relations de dominance
Cyclicité des femelles
Interaction mère-petit très étroite.
• Mais l’histopathologie des organes reproducteurs chez le
singe ou le chien peut apporter beaucoup d’informations:
o A condition que les animaux soient matures.
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Choix d’espèce
• Considérations :
o
o
o
o
Pharmacologie
Métabolisme
Pharmacocinétiques
Physiologie / développement comparatif
• Choix presque imposé :
o Rat
o Lapin
o Éventuellement la souris
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Rongeurs (rat / souris)
• Avantages :
o Développement très bien étudié
o Large gamme de méthodes et dosages disponibles
• Ex. tests neurocomportementaux, dosages hormones, immuno…
o Vaste expérience en toxicologie
• Banques de données
• Réponses toxiques bien caractérisées
• Inconvénients :
o Différences hormonales
• Action lutéinique de prolactine
• Rôle de gonadotrophines dans la gestation
• Rôle de prostaglandines dans le déclenchement de la parturition
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Lapin
• Avantages :
o Développement bien étudié
o Vaste expérience en tératogénèse
• Banques de données
• Réponses toxiques bien caractérisées
• Inconvénients :
o Peu utilisé en toxicologie générale
o Très sensible aux antibiotiques
o Peu de méthodes et dosages disponibles
• Ex. tests neurocomportementaux, dosages hormones, immuno…
o Manipulation postnatale difficile
• Mais possible…
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Etude de développement chez le lapin
25 ♀ / lot
post-natale
50 ♀ / lot
L35
G28
M-14j
M-1j
G6
G29
25 ♀ / lot
césarienne
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Hébergement portées - lapin
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Inconvénients du singe
• Approvisionnement difficile
o beaucoup de singes nécessaires :
• 1 seul fœtus par femelle
• taux d’avortement élevé en laboratoire
o durée de vie très longue
• Peut-être utile pour évaluer les risques
éventuels identifiés chez le rongeur
• Mais, parfois incontournable
o Ex. produits de la biotechnologie…
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
ICH S6
• Preclinical Safety Evaluation of
Biotechnology-Derived Pharmaceuticals
oLigne directrice en cours de révision
oProposition en cours de discussion:
• Enhanced pre- and post-natal study design chez le
primate pour les mAb
• Stewart, Reproductive Toxicology 28 (2009) 220225.
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Enhanced pre- and post-natal study design
~24 ♀ par lot
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Etude pre- et postnatale améliorée
• Inconvénients :
o Peu d’animaux
• Encore moins de fœtus / petits
• Peu de puissance statistique
o Pas d’exposition avant jour 20 de gestation
(confirmation de grossesse par l’ultrason)
• Moins problématique pour les mAbs
o Pas de césarienne
• Examen des fœtus par imagerie
• Examen des petits à la naissance.
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Autres espèces ?
• ICH S5: cobaye, hamster, furet, chien…
o Pas d’utilisation sous conditions BPL
• Une alternative très pratique: le miniporc
o Avantages :
• Bon modèle pour certains aspects de développement humain:
– SNC, cardiovasculaire, tractus digestif, peau, immuno…
• Utilisation en toxicologie générale
o Inconvénients :
• Taille des truies gestantes
• Cher
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Placentation
Porc
Chien, chat
Ruminants
Rongeurs,
primates
www.vivo.colostate.edu
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Chiroptera
• Fertilisation, implantation ou développement embryonnaire
différés selon espèce.
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Macropodidae
• Nouveau né joey
équivalent à l’embryon
humain de 7 semaines
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Méthodes alternatives préconisées par ILSI / HESI
• Cellules de souche embryonnaires (EST)
• Embryon entier (WEC)
o Rat, souris, lapin
• Poisson zèbre (Danio rerio) / Xenopus
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Embryonic Stem Cell Test (EST)
• Cellules de souche pluripotentes, ex. souris D3
o Evaluation de différentiation en cardiomyocytes
• Modèle de prédiction mathématique
o Comparaison des courbes de différentiation et de mortalité cellulaire
évaluée avec des cultures d’ES et 3T3 (fibroblaste).
• Perspectives :
o Différentiation vers d’autres phenotypes, ex. neurones, ostéoclastes…
o Utilisation de ES d’origine humaine (hES)
o High throughput screening par cytométrie de flux avec coloration
fluorescent
o Génomiques (microarray)
•
Cartographie de la génome disponible
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
EST - cardiomyocytes
• J0 Gouttelettes
suspendues de culture de
cellules uniques
• J3 Corps embryoide mis
en culture
• J5 Distribué en plaques 24
puits
• J10 Indentification de foci
de contractivité
Van Dartel et al. Reproductive Toxicology 28 (2009) 254-261
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Whole Embryo Culture (WEC)
G0
G6
fertilisation
G10 à G12
G16
implantation
Développement précoce
non évalué:
Formation du tube
neural…
G22
mise bas
Développement tardif non
évalué:
Cerveau, face,
palais, extrémités…
PCR temps réel?
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
WEC
• Avantage :
o Permet l’évaluation détaillée de processus
dysmorphologiques déjà identifié in-vivo à la
concentration plasmatique réelle
• Ex. malformation cardiovasculaire
• Inconvénients :
o N’économise pas d’animaux
• Besoin de femelles gestantes
• Besoin de sérum
o Durée de développement très limitée
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Poisson zèbre (Danio rerio)
•
•
•
•
•
0h fertilisation
0 à 5h exposition
24h battement du cœur
48h fin d’organogenèse
5j larve
Yang et al. Reproductive Toxicology 28 (2009) 245-253
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
ZF (Danio rerio)
• Avantages :
o
o
o
o
o
o
Organisme complexe
Développement rapide
Elevage facile – 1000 œufs / j
Développement embryonnaire hors de la mère
Transparence
Automatisation / screening à haut débit possible
• Souche transgénique avec marquage fluorescent
o Profil toxico génomique relativement similaire aux mammifères
• Inconvénients :
o Différences physiologiques et morphologiques v l’humain
o Différences de métabolisme / activation
o Pharmacocinétiques - ex. aspirine et amoxycilline non absorbés
• Bioanalyse nécessaire
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
FETAX (Xenopus)
120h après fertilisation
Control
Phocomelia (thalidomide)
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Validation ECVAM (et autres)
• EST, WEC et ZF ont correctement classifié 80% de
produits chimiques :
o tératogène fort, tératogène faible et non tératogène.
• Mais, la liste de produits testés n’inclut pas de
molécules rendues tératogène par l’activation
métabolique.
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Limitation des tests in-vitro
• Système fermé
o pas d’activation métabolique
• pré incubation avec S9 possible
• Pas d'influences maternelles
o métaboliques
o physiologiques
• ex. nifedine – action hypotensive chez la mère
• Durée de développement limitée
• Faux positifs assez nombreux
o 10% EST et ZF, 20% WEC
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Le futur
Knudsen, 2009, ETS Education Course
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Résumé
• Les rongeurs et le lapin sont toujours les espèces de choix
pour l’évaluation de la tératogenèse et de la reproduction en
général
o Le miniporc est une espèce intéressante pour l’évaluation de la
tératogenèse
• Les primates sont peu pratiques, mais parfois incontournables
o Ex. produits de la biotechnologie
• Le rôle du lapin est en train d’être élargi, grâce en partie à de
nouvelles études réglementaires sur les vaccins
• Les tests alternatifs (EST, WEC, ZF) sont intéressants pour le
screening très préliminaire des produits chimiques
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés
Paul Barrow – Congrès de la SFT, 19-20 octobre 2009 - Copyright © SFT – Tous droits réservés