Etat des connaissances actuelles (1)
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Biologie des ostéosarcomes pédiatriques Natacha ENTZ-WERLE CHRU Hautepierre / Pédiatrie Onco-hématologie - Strasbourg EA3430 – Progression tumorale et microenvironnement. Approches translationnelles et épidémiologie – UdS Université de Strasbourg Présentation Françoise REDINI 1 Etat des connaissances actuelles (1) • Existe-t-il des mutations congénitales à l’origine du développement d’un ostéosarcome ? – syndrome de Rothmund-Thomson : mutation des hélicases (RecQ helicases) : anomalies dermatologiques (Hicks et al., 2007) – Syndrome de Li et Fraumeni : gène p53 (Savage et al., 2007) – Mutation congénitale du gène Rb (Potepan et al, 1999; Chauveinc et al., 2001) – Syndrome de Bloom : gène BLM codant pour une hélicase (Wang et al., 2003) – Syndrome de Werner : gène WRN (Goto et al., 1996) => ce sont des gènes de la réparation de l’ADN et du cycle cellulaire 2 Etat des connaissances actuelles (2) • Existe-t-il une susceptibilité ou des facteurs de risque à l’origine d’un ostéosarcome ? – – – – – irradiation (dans le champ) / gène Rb maladie de Paget chez adulte (gènes RANK, NFkB) ostéochondromes ? pas de forme dite pré-cancéreuse forme de bas grades (anomalie de CDK4 et CDKN2A) => ce sont des gènes de la réparation, du cycle cellulaire et du métabolisme osseux 3 Etat des connaissances actuelles (3) L’épidémiologie peut-elle nous aider ? – tumeur rare : 70 à 100 nouveaux cas/an en France – période de l’adolescence et de croissance / os longs – absence de lésion « pré-maligne » – ostéosarcome de bas grade chez l’adulte : atteinte de MDM2 – pas d’évolution d’une tumeur de bas grade à un haut grade (pas de mécanismes de dégénérescence !) – chez l’adulte, maladie de Paget (activation des ostéoclastes, TNFRSFF11, SQSTM1 ou TNFRSF11D) Savage et al., 2012 4 Etat des connaissances actuelles (4) • Aspect « macroscopique » / caractéristiques histologique développement d’ostéoblastes malins produisant de la substance ostéoïde ⇒ développement osseux et son remodelage ? 3 sous-types ostéoblastique chondroblastique fibroblastique 5 Etat des connaissances actuelles (5) • Localisations particulières : – os longs / très rarement os plats – surtout sur les os des MI : plus de 75% des localisations – proche des cartilages de croissance • Âge particulier : AJA ⇒ Développement et croissance osseuse ? 6 Savage et al., 2012 Principe du processus multifactoriel ! 7 Etat des connaissances actuelles (6) Pourquoi faire de la recherche sur les ostéosarcomes ? • Pas de marqueurs pronostiques au diagnostic en dehors du statut métastatique • Stabilité des courbes de survie actuelles (70-75% OS) • Marqueur tardif après 4 mois de chimiothérapie : réponse au traitement néo-adjuvant (BR/MR) • Impact du traitement sur la réponse à la chimiothérapie • Problème des BRs qui rechutent • Progrès thérapeutiques mais peu de nouveaux traitements dans cette tumeur : nouvelles cibles thérapeutiques ? • Marqueurs de rechute et/ou de progression pour intensifier les patients à haut risque de rechute 8 • Complexité du génome de l’ostéosarcome Moyens moléculaires à disposition • Collections tumorales avec annotations cliniques : contrôle qualité (qualité de la congélation, %age de cellules tumorales), données cliniques patients, traitements ou notion de population homogène (BR/MR, pédiatrie) • Qualité du matériel : ADN/ARN/protéines • Études possibles : – Whole genome ou exome / CGHarray / allèlotypage / copies de gènes – Méthylome – RNAseq / microarray / puces à ARN / étude de expression de gènes – tisse microarray / IHC / Western blot – Métabolome / phosphoprotéome / protéomique • Interprétation dépend de ces données 9 CGHarray allèlotypage microarray IHC 10 Goh, 2012 wikipedia whole exome sequencing 11 Collections tumorales • homogénéité des populations (adultes/enfant/protocoles-traitements) • consentement des patients/tuteurs • bases de données cliniques annotées • organisation dans les CRB (Centres de Ressources Biologiques) : stockage des prélèvements / contrôle qualité / pourcentage de cellules tumorales / extractions • collections nationales (Italie, Canada, Allemagne, France) • inclusion de ces études dans les protocoles de traitements : OS94 (étude rétrospective) et OS2006 (étude prospective) 12 Modèles d’étude in vitro et in vivo Quelles sont les possibilités de « recréer » l’ostéosarcome pédiatrique ? • lignées cellulaires : type : – lignées commerciales : SaOS-2, U2OS, KRIB, HOS, MG63) – lignées dérivées de tumeur patients conditions de culture • peu de modèles animaux relevants : – quelques modèles murins ou de rats avec anomalie congénitale : p53-/-, anomalie de Fos, anomalie Twist+/-/Apc+/– souvent modèles de xénogreffes sous-cutanées ou modèles orthotopiques avec des cellules tumorales (commerciales/patients) • modèles canins Études dans les ostéosarcomes pédiatriques : généralités (1) • problème des cohortes adulte-enfant publiées • peu d’équipes impliquées • principalement des études en IHC, développement de nouvelles techniques - utilisation de plus en plus de techniques complexes (exomes et RNAseq): résultats peu comparables en fonction des cohortes, problèmes liés à l’extrême instabilité génétique de cette tumeur • Problème de la nécrose tumorale majeure dans ces tumeurs => comparabilité entre les études ? Comment organiser les études dans ces cohortes (question dans l’OS2006) 14 Études dans les ostéosarcomes pédiatriques : généralités (2) • Aspect « macroscopique moléculaire » Caryotype et CGHarray : prédominance de régions génomiques délétées / pas d’anomalies récurrentes caractéristiques / extrêmement remaniés : chaos génomique 15 Osaka et al, 2004 Études dans les ostéosarcomes pédiatriques : généralités (3) • Malgré les nouvelles approches : complexité et chaos restent identiques ! Une tumeur un chaos ! Lorentz et al., déc 2015 RNA seq 16 Études dans les ostéosarcomes pédiatriques : généralités (4) Quelles sont les questions que l’on peut se poser pour avancer dans ces études pangénomes dans un monde idéal ? – Essayer de comprendre le développement de cette tumeur maligne – Trouver des marqueurs caractérisant spécifiquement les BR versus MR – Trouver des marqueurs pronostiques au diagnostic – Trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la survie en cas de rechute 17 Exemples de résultats (1) Étude en CGHarray sur 67 pts de OS94 Moving Average (Genome view): Window = 1MB Rouge: Mauvais répondeurs Vert: Bons répondeurs Différence significative ?? 18 Exemples de résultats (2) clustering non hiérarchisé Exemples de résultats (3) whole exome Aberrations chromosomiques avec des voies spécifiques impliquées mais différentes en fonction des études 20 Chen et al., 2014 Quelles sont ces voies de signalisations principalement impliquées dans les ostésoarcomes ? • Gènes du cycle cellulaire : RB, P53, MDM2 • Gènes de différenciation : différenciation mésenchymateuse et ostéogenèse • Voies de l’angiogenèse • Voie de l’hypoxie : mTor/HIF-1alpha • Gène du micro-environnement et ostéoclastogenèse Prolifération, absence de différenciation, développement vasculaire et adaptation métabolique à l’hypoxie = classique 21 Biologie osseuse: est-ce la clé ? De multiples gènes impliqués dans la differenciation ostéoblastique: APC, pRB, TWIST, MET, TOP2A et……. 22 Étude des gènes de la biologie osseuse dans les ostéosarcomes pédiatriques • APC (5q21): 58% de réarrangements (délétion) • TWIST (7p21): 56% de réarrangements (4/5 de délétions et 1/5 d’amplification) • MET (7q31): 42% de réarrangements (2/3 de délétions et 1/3 d’amplifications) EFS p=0.005 EFS 1,1 p=0.017 EFS 1,2 1,0 1,0 1,0 ,9 ,9 ,8 ,8 ,8 ,7 ,7 QPCR MET ,6 ,2 normal ,1 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 ,4 deletion ,2 normal 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 amplification Cumulative survival amplif /deletion ,3 Cumulative survival MET ,4 QPCR TWIST ,6 amplification ,6 ,5 Survie cumulative p=0.037 1,1 ,5 ,4 deletion ,3 ,2 normal ,1 0,0 0 temps (mois) time (months) 20 40 60 80 100 120 time (months) 23 Entz-Werlé et al., Br J Cancer 2003, Neoplasia 2007, AACR 2009, EMSOS 2009, Cancers 2013 140 Modèle oncogénique développé basé sur ces résultats prevue par la souris ! determination in pediatric osteosarcomas association APC deletion x TWIST deletion Entz-Werlé et al. Br J Cancer 2003, Neoplasia 2007, Transl Oncol 2010 collaboration : Dr Perrin-Schmitt F. EA3949 mice Apc +/- Twist +/- 24 25 Forme fibroblastique Forme ostéoblastique Forme fibroblastique Forme 26 chondroblastique radiological aspect correlated with osteolytic and/or osteocondensant En conclusion, la perte concomitante d’APC et de TWIST permet le développement d’ostéosarcomes localisés : la dérégulation du développement osseux est probablement 27 impliqué dans la tumorigenèse de ces tumeurs 28 Entz-Werlé, Osteosarcoma book, 2012 Concept actuel prolifération et développement de l’ostéoblaste malin associé à une progression loco-régionale et métastatique 29 Entz-Werlé, Osteosarcomas, 2012 Autres voies et portes ouvertes en cours d’exploration • Poursuite des études pangénomes (N GASPAR) • Étude du microenvironnement osseux (présentation F.REDINI) • Environnement angiogénique : peu d’implication au diagnostic (MD Tabone) • Hypoxie intra-tumorale : nombreux papiers la souligne / travail en cours N ENTZ-WERLE – F. REDINI • Immunité anti-tumorale 30 Actuel protocole OS2006 Intégration des ETUDES BIOLOGIQUES Note d’information et de consentement : patient participant à l’étude randomisée prélèvements intégré à celui de l’étude. : consentement pour les patient participant seulement aux études biologiques : consentement à part. Equipes : Allélotypages des tumeurs (N. Entz-Werle – Strasbourg) Etude génomique (L. Brugières, V. Lazar – Villejuif) Tissue Array (J.M. Guinebretière – Saint Cloud, C. Bouvier – Marseille) Facteurs angiogéniques (M.D. Tabone – Paris) Explorations immunologiques (O. Lantz, S. Piperno-Neumann – Paris) Paramètres de la résorption osseuse et ostéosarcome (F. Rédini – F. Gouin – D. Heymann – EA 3822 – Inserm ERI 7 – Nantes) Pharmacogénétique du Méthotrexate (F. Pichon – Lille, J.M. Treluyer – Paris) Rapatriement des échantillons : études immunologiques (seulement pour les centres parisiens) : centralisation à Curie (Paris) – envoi à 4°C dans les 12 heures toutes les autres études : centralisation à l’IGR (Villejuif) – envoi, selon le choix 31 du centre, à 4°C dans les 24 heures ou congelé 32 Concept OS2006 • réflexion en amont sur nos données pré-existantes de OS94 • intégration des différentes techniques et optimisation des tumeurs congelées au diagnostic • programme complet permettant d’explorer de façon optimisée les données • difficultés: récupération des échantillons, sélection des échantillons pour une étude « transversale » • analyses finalisées des échantillons en cours 33
