MEMOIRE
publicité
République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique UNIVERSITE de TLEMCEN Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de l’Univers Département de biologie Le Laboratoire de recherche LAMAB MEMOIRE Présenté par Mebarki manal En vue de l’obtention du Diplôme de MASTER En Microbiologie Appliquée Thème Traitement de biofilm bactérien par les molécules bioactives Soutenu le 14/O6/2016 Devant le jury composé de : Président Boublenza Lamia Maitre de conférences classe B Encadreur Malek Fadila Maitre de conférences classe B Co-Encadreur Benariba Nabila Maitre de conférences classe B Examinateur Bensalah Fatima Maitre de conférences classe B ملخص النىخة و, اللشَز االحمز,قمنب بذراسة مذي فعبلُة الجشَئبت الفعبلة حمض الحبنُك ح مض الغبلُك و الكبجشُن بباالضبفة للمسحخلصبت النببجُة من نىع سفشوفة ً الشائفة الشنجبرَة و الكلبسُالء و اللحٍ اظهزت النحبئج إمكبنُحهب عل,الشزَكة القىل ىنُة,كبلمكىرات العنقىدَة, الصنىبز علً مجمىعة من البكحُزَب المزجعُة أظهزت نحبئج الحزكُش السفلٍ المنبظ للشزَظ الحُىٌ اللذٌ َخحلف مع اخحالف الجشَئبت الفعبلة.1 جشكُل الشزَظ الحُىٌ بشكل جُذ و بكثبفة بصزَة جحجبوس جنبسلُب َمكن جزجُب الجشَئبت الفعبلة جنبسلُب كمب َلٍ حمض الحبنُك الكبجشُن و حمض.و المسحخلصبت و كذلك جزكُشهب و أَضب ببخحالف البكحُزَب المسحخلصبت المخحلفة المجزبة أثبحث نشبطهب ضذ جشكُل الشزَظ الحُىٌ مع.الغبلُك و المسحخلصبت النببجُ ة كمب َلٍ سفشوفة النىخة و االحمزو الصنىبز 0.0 و أكثز مقبومة هٍ الشائفة الشنجبرَة بكثبفة بصزَة0.20 جسجُل أعلً نشبط للكلبسُالء بكثبفة بصزَة الجشَئبت الفعبلة, البكحُزَب المزجعُة,المسحخلصبت النببجُة,ٌ الشزَظ الحُى: الكلمات المفتاحية Résumé L’effet de molécules bioactives, acide tannique, acide gallique et catéchine ainsi que de phyto-extraits provenant des espèces végétales Z. jujuba Mill, M. inodora, P. halpensis, A. visnaga et R. reatam, a été testé sur la croissance en biofilm de souches de références d’intérêt clinique appartenant aux espèces S. aureus, P. aeruginosa, B. cereus, K. pneumoniae et E. coli. Le potentiel de ces souches à former le biofilm s’est révélé important pour les cinq souches étudiées, les DO du biofilm étant supérieures à 1. Les résultats ont montré que les CMIB variaient en fonction des molécules et des extraits ainsi que de leurs concentrations et de l’espèce bactérienne. Par ordre d’activité décroissante, les substances testées sont classées comme suit : l’acide tannique, les catéchine, et l’acide gallique, concernant les phyto-extraits, l’espèce Z. jujuba Mill vient en premier suivi d’A. visnaga, P. halepensis. Les différentes substances testées ont exercé un effet inhibiteur sur le biofilm formé par toutes souches testées avec un effet plus marqué de la CMIB sur le biofilm et celui de K. pneumoniae avec une DO de 0.2 et la CMIB la plus importante a été obtenu pour le biofilm de P. aeruginosa avec une DO de 0.5. Mots clés : Biofilm, phyto-extraits, souches de références, CMIB, molécules bioactives. Summary The effect of bioactive molecules, acide tannique, acide gallique et catéchine and the phyto –extracts from vegetal species Z. jujuba Mill, M. inodora, P. halpensis, A. visnaga et R. reatam, where tested to the strains biofilm growth of S. aureus, P. aeruginosa, B. cereus, K. pneumoniae et E. coli. The potential of these strains to form biofilm is important for the five references strains, the OD where more than 1. The results show that he MIBC diverse in function of molecules and the extracts thus for the concentration and bacterial species. By activity order, the tested substance where classed as follow l’acide tannique, les catéchine, et l’acide gallique, and phyto-extract as follow Z. jujuba Mill, A. visnaga, and P. halepensis, the different substance tested show an nhibition on formed biofilm specialy againt , K. pneumonia by OD 0.2 and by 0.5 for P. aeruginosa which is more resistant. Keywords: Biofilm, phyto –extracts, references strains, MIBC, bioactive molecules. Dédicaces C’est avec un énorme plaisir et une immense joie, que je dédie mon travail À mes très chers parents qui m’ont soutenue tout au long de ma vie ainsi qu’à mes frères et ma sœur A toute la promotion du master microbiologie appliquée ainsi microbiologie générale 2015-2016 avec qui j’ai partagé d’agréables moments A mes chères amies : Abdesslam, Amel, Ghania ; Hicham, Ibtissem, Ismail, Mourad, Rania, Setti. A toute la famille A tous ce que j’aime et qui m’aime de prés et de loin. A tous ce qui m’ont apporté d’aide de prés ou de loin Manal. Remerciements Ce travail a été effectué au laboratoire de biologie moléculaire à l’Université Abou Bekr Belkaïd Tlemcen. Je tiens tout particulièrement à remercier chaleureusement Malek Fadila, maître de conférences classe B au Département de Biologie, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et des Sciences de la Terre et de l’Univers, qui m’a encadré tout au long de ce mémoire ainsi mademoiselle Benariba Nabila, sans elles rien ne serait là aujourd’hui. Je les remercie également de m'avoir offert l'opportunité de réaliser ce travail, pour leurs conseils précieux et leurs orientations scientifiques, Je les adresse ma profonde reconnaissance. Je voudrais adresser mes remerciements à Mme Boublenza lamia, maître de conférences classe B au Département de Biologie, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et des Sciences de la Terre et de l’Univers, pour l’honneur quelle ma fait en acceptant de présider le jury de cette soutenance. Je remercie vivement Mme Bensalah Fatima, maître de conférences classe B au Département de Biologie, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et des Sciences de la Terre et de l’Univers, pour avoir accepté de faire parti de ce jury. Merci à tous les membres du laboratoire qui ont participé à la réalisation de ce travail. J’exprime ma profonde reconnaissance qu’ils trouvent ici le témoignage de ma profonde reconnaissance. Liste des abréviations ATCC : American Type Culture Collection QS: quorum ensing DO: densité optique MEB: microscope éléctronique a balayage MES : microscope électronique à scanner PP: polyphénols CV: crystal violet TSB : tryptycase soja bouillon TSA: trypticase soja agar BHIB: bouillon Coeur cervelle Pa: Pseudomonas aeruginosa Kp: Klepseilla pneumoniae Sa : Staphylococcus aureus Ec : Escherichia coli Bc : Bacillus cereus pH : potentiel d’Hydrogene Liste des figures Figure 1: Représentation schématique des différentes étapes de formation d’un biofilm ......... 2 Figure 2 : Représentation schématique d’étapes de détachement d’un biofilm ........................ 4 Figure 3 : Aspect de biofilm de P. aeruginosa par microscopiques .......................................... 9 Figure 4: Aspect d’E.coli en microscope électronique ........................................................... 10 Figure 5: Aspect de biofilm de K.pneumoniae en MEB ......................................................... 13 Figure 6: Aspect de biofilm de S.aureus par microscope ....................................................... 14 Figure 8 : Structures chimique de quelques acides phénoliques ............................................. 19 Figure 9: Structure générale des flavonoïdes .......................................................................... 19 Figure 11 : Structure chimique de la catéchine ...................................................................... 20 Figure 12 : Structure chimique de tanin hydrolysable (a) et condencés (b) ............................ 21 Figure 13 : structure chimique d'acide gallique ...................................................................... 22 Figure 14 : Structure chimique de quelques alcaloides ........................................................... 22 Figure 15 : Structure chimique de quelques terpènoide .......................................................... 23 Figure 16 : Micromeria inodora.............................................................................................. 24 Figure 17 : Zizyphus jujuba Mill ............................................................................................ 25 Figure 19 : Ammi visnaga ...................................................................................................... 27 Figure20 : Pinus halepensis .................................................................................................... 27 Figure 21 : Détection et lecture de biofilm par méthode de CV …………………………… 30 Figure 23: Biomasse des biofilms de cinq souches de référence ............................................ 33 Figure 24 : Biomasse des biofilms en fonction du milieu de culture ..................................... 34 Figure 25 : Biomasse des biofilms après 48h d’incubation ................................................... 34 Figure 26: Effet inhibiteur de l'acide tannique sur la formation de biofilm ............................ 35 Figure 27 : Effet inhibiteur de la Catéchine sur la formation de biofilm ................................ 36 Figure 28 : Effet inhibiteur de l'acide gallique sur la formation de biofilm ............................ 37 Figure 29: L’action inhibitrice de zizyphus jujuba sur la formation de biofilm ..................... 37 Figure 30 : Effet inhibiteur d’Ammi visnaga sur la formation de biofilm ............................... 38 Figure 31: Effet inhibiteur de Pinus halpensis sur la formation de biofilm............................ 39 Liste des matières Chapitre I : Le concept du biofilm ............................................................................... 1 Introduction ................................................................................................................... 1 1. Historique .................................................................................................................. 1 2. Définition .................................................................................................................. 1 3. Processus de formation de biofilm ............................................................................ 2 3.1. L’adhérence réversible ........................................................................................... 2 3.2. L’adhérence irréversible ........................................................................................ 3 3.3. Le développement précoce du biofilm .................................................................. 3 3.4. La maturation du biofilm....................................................................................... 3 3.5. Le détachement de bactéries................................................................................... 4 4. Facteurs favorisant la formation d’un bioflm ............................................................ 4 4.1.1. Rugosité de la surface.......................................................................................... 5 4.1.2. Propriétés physico-chimiques de la surface ........................................................ 5 4.2. Présence de films protéiques sur la surface ............................................................ 5 4.3. Caractéristiques du milieu ...................................................................................... 6 4.4. Propriétés des cellules ............................................................................................ 7 5. Le quorum sensing ................................................................................................... 7 Chapitre II: études de quelques modèles de biofilm bactériens .................................... 8 1. Pseudomonas aeruginosa ........................................................................................... 8 1.2. Caractères morphologique ...................................................................................... 8 1.3. Caractères culturaux ............................................................................................... 8 1.4. Pouvoir pathogène .................................................................................................. 9 1.5. Formation de biofilm par P.aeruginosa ................................................................ 9 2. Escherichia coli ....................................................................................................... 10 2.1. Caractères bactériologiques.................................................................................. 10 2.2. Pouvoir pathogène ................................................................................................ 11 2.3. Formation de biofilm par E. coli .......................................................................... 11 3. Klebsiella pneumoniae ........................................................................................... 12 3.1. Caractères morphologiques .................................................................................. 12 3.2. Caractères culturaux ............................................................................................. 12 3.3. Pouvoir pathogène ................................................................................................ 13 3.4. Formation de biofilm par Klebseilla pneumoniae ................................................ 13 Staphylococcus aureus ................................................................................................ 14 4.1 Caractères morphologiques et culturaux ............................................................... 14 4.2. Pouvoir pathogène ................................................................................................ 14 4.3. Formation de biofilm par S. aureus ...................................................................... 15 5. Bacillus cereus........................................................................................................ 15 5.1. Caractères morphologiques .................................................................................. 15 5.2. Habitat et pouvoir pathogène .............................................................................. 16 5.3. Formation de biofilm de Bacillus cereus ............................................................. 16 Chapitre III: Les agents antibiofilm ............................................................................ 17 1. Les métabolites secondaires .................................................................................... 18 1.1. Classification des métabolites secondaires........................................................... 18 2. Les polyphénols ....................................................................................................... 18 2.1. Classification et structure des composés phénoliques.......................................... 19 2.2. Les flavonoïdes .................................................................................................... 20 2.2.1. Les catéchines.................................................................................................... 22 2.2.2. Les tannins......................................................................................................... 22 2.2.3. L’acide gallique ................................................................................................. 23 3. Les alcaloides .......................................................................................................... 24 4. Les terpénoïdes ........................................................................................................ 24 5.Etude de quelques extraits végétaux ........................................................................ 25 5.1 Micromeria inodora ............................................................................................... 25 5.2. Zizyphus jujuba Mill ............................................................................................ 26 5.3. Retama raetam ..................................................................................................... 27 5.4. Ammi visnaga ..................................................................................................... 28 5.5. Pinus halepensis ................................................................................................... 29 Matériel et méthodes ................................................................................................... 30 1. Souches étudiées ..................................................................................................... 30 2. Revivification et Enrichissement............................................................................. 31 3. Formation de biofilm ............................................................................................... 31 4. Coloration au le cristal violet .................................................................................. 32 5. Variation des conditions de culture ......................................................................... 32 6. Détermination de la concentration minimale inhibitrice de biofilm ....................... 33 Résultats ...................................................................................................................... 34 1. Evaluation de potentiel de formation du biofilm .................................................... 34 2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice du biofilm ....................... 37 Discussion ................................................................................................................... 41 Conclusion ................................................................................................................... 43 Références……..……………………………………………………………………..44 Liste des tableaux Tableau 1 : Caractéristiques des souches testées ……………………………………………34 Tableau 2 : les principales caractéristiques des molécules et des extraits végétales…….36 Introduction Introduction Les bactéries peuvent adopter deux modes de vie différents : elles sont soit libres et isolées dans un milieu (état planctonique), soit attachées à une surface où elles vivent en communauté au sein d’un biofilm (état sessile). Les biofilms ont un impact considérable dans des secteurs très variés : dans le domaine agro-alimentaire où ils posent des problèmes de contamination des aliments, dans l’industrie en raison de leur capacité de recouvrir et corroder les matériaux comme les canalisations ou les coques de bateaux, mais également dans le domaine médical, puisque 65 % des infections bactériennes chez l’homme impliquent des biofilms (Filloux & Vallet, 2003). À l’hôpital, les surfaces susceptibles d’entrer en contact avec le patient soit directement, soit indirectement par l’intermédiaire de dispositifs médicaux ou les mains des personnes, peuvent constituer des réservoirs microbiens. Ces surfaces sont régulièrement colonisées par des microorganismes qui sont d’origines diverses et peuvent être issus de patients, du personnels soignant ou des visiteurs. Elles sont le siège de la formation des biofilms et constituent une niche écologique protectrice des bactéries multirésistantes pouvant être un réservoir à partir duquel différentes infections peuvent se développer (Méité et al., 2010). Les microorganismes organisées en biofilm acquièrent de nouvelles propriétés physiologiques notamment une résistance accrue aux agents antimicrobiens (antibiotiques, biocides). Les espèces bactériennes telles que Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E.coli, Klepseilla pneumoniae et Bacilus cereus constituent l’une des causes majeures des infections communautaires et nosocomiales. Ces germes sont responsables des infections aiguës et chroniques dont la plupart sont dues à leurs capacités à adhérer sur des surfaces abiotiques telles que les implants médicaux et à former un biofilm. En outre, les infections associées aux biofilms constituent un problème majeur en clinique car elles sont résistantes au traitement antibiotique et sont responsable des échecs thérapeutiques et par suite des complications et sont la cause de l’augmentation de la mortalité et du coût de traitement. L’objectif de ce travail est de contribuer à la recherche de molécules bioactives d’origine végétale en particulier les plantes médicinales dotées de pouvoir antibiofilm, selon une approche visant la détermination de la CMIB (concentration minimale inhibitrice de la croissance en biofilm). Le plan expérimental comprend les étapes suivantes: 1 Introduction - L’évaluation du potentiel de formation du biofilm par des souches de références d’intérêt clinique, appartenant aux espèces précédemment citées dans des conditions expérimentales particulières. - L’étude de l’effet de molécules de polyphénols: acide tannique, gallique, et catéchine ainsi que des extraits de plantes : Zizyphus jujuba Mill, Microméria inodora, Pinus halpensis, Ammi visnaga et Retama reatam, sur la formation des biofilms par les souches testées. La croissance en biofilm et la détermination des CMIB a été réalisée par la technique au cristal violet utilisant les microplaques de titration à 96 puits. 2 Chapitre I Chapitre I : Le concept du biofilm 1. Historique On attribue la découverte des biofilms à l’inventeur du microscope, Antoni Van Leeuwenhoek (1632-1723), qui observa vers 1683 avec cet appareil des communautés de micro-organismes à la surface des dents. En 1933, lors d’expériences visant à observer la croissance d’algues sur des lames de verre placées dans un aquarium, Henrici observa, fixées sur ces lames, des communautés bactériennes. Il émit alors l’hypothèse que la plupart des bactéries vivant en milieux aqueux sont organisées sous forme de communautés sessiles fixées à une surface, et non pas sous forme planctonique (Henrici, 1933).Le concept de « biofilm » est né, mais le terme en luimême n’est pas encore utilisé. Claude E. Zobell (1904-1989), considéré comme le père de la microbiologie marine, démontra vers 1936 que les surfaces solides sont bénéfiques au développement des bactéries lors de leur conservation dans un milieu nutritif dilué. En 1943, il montra que de très faibles quantités de nutriments organiques s'adsorbent sur le verre et que cette concentration de matière organique favorise la formation de communautés bactériennes fixées sur les surfaces (Costerton, 2004). 2. Définition Le biofilm est une communauté structurée de micro-organismes, se fixant à une surface inerte ou vivante et réunis au sein d’une matrice d’exo-polysaccharides adhésives et protectrice qu’ils secrètent. C’est une structure vivante en perpétuel remaniement. Il constitue le mode de vie majoritairement des micro-organismes, par opposition a l’état planctonique libre et isolé dans l’environnement (Costerton et al., 1999 ; Espinasse et al., 2010). Un biofilm peut être constitué d’une ou plusieurs espèces de micro-organismes (Behlau et Gilmore, 2008). 3. Processus de formation de biofilm Les biofilms peuvent se développer sur une grande variété de surfaces, incluant les tissus vivants, les dispositifs médicaux, les canalisations des systèmes d’eau potable ou industriels, ou sur tout autre support retrouvé dans le sol ou dans les milieux aquatiques. Alors, La formation de biofilm est un processus qui se déroule en cinq étapes (Talaro, 2008) (figure 1). 3 Chapitre I Figure 1: Représentation schématique des différentes étapes de formation d’un biofilm (Van Houdt & Michiels, 2005) 3.1. L’adhérence réversible En milieu liquide ou exposé à l’humidité, les bactéries planctoniques s’approchent d’une surface solide par mouvement brownien, par sédimentation ou par mobilité active (présence de flagelles). Elles s’y attachent de manière réversible par des interactions non spécifiques, électrostatiques et électrodynamiques. Cette étape est influencée par des conditions environnementales impliquant le pH, l’osmolarité du milieu, la température, la concentration en oxygène et en nutriments et l’hydrodynamique du fluide (Beloin et al., 2008). L’adhérence des bactéries est également influencée par la nature de la surface, notamment sa rugosité et son hydrophobicité. Les bactéries adhèrent plus facilement sur une surface rugueuse, hydrophobe et non polaire (Beloin et al., 2008). 3.2. L’adhérence irréversible La fixation à la surface solide devient irréversible en raison de la production d’exopolysaccharides par les bactéries et surtout grâce à des structures d’adhérence variables selon les espèces bactériennes, par exemple pour les bactéries Gramnégatives, il s’agit des pili des fimbriae et des curli, qui interagissent avec des récepteurs spécifiques présents sur la surface (Beloin et al., 2008; Van Houdt & Michiels, 2005), et pour les bactéries Gram-positives, ce sont les acides teichoïques, l’acide mycolique, la capsule et le glycocalix. Ces molécules d’adhésions permettent d’établir des contacts cellule- surface et des contacts cellule-cellule (Lemon, 2008). 4 Chapitre I 3.3. Le développement précoce du biofilm Les bactéries se multiplient lentement et continuent de produire des exopolysaccharides. Elles s’agrègent entres elles et forment des microcolonies, qui sont protégées par la matrice exopolysaccharidique. 3.4. La maturation du biofilm L’architecture complexe du biofilm se met en place avec la formation des canaux aqueux et de pores entre les microcolonies, permettant l’acheminement d’oxygène et de nutriments nécessaires à la croissance des micro-organismes, ainsi que l’élimination des déchets (Filloux & Vallet, 2003; Tenke et al., 2006). La production et la sécrétion d’enzymes ou de toxines provoque la dégradation des tissus environnants de l’hôte et permet ainsi la libération de nutriments (Jacobsen et al., 2008). Un biofilm est approximativement constitué de 85 % de matrice extracellulaire et de 15 % de micro-organismes (Behlau & Gilmore, 2008). La matrice extracellulaire est principalement constituée d’eau (97 %) et inclue également des polymères d’exopolysaccharides, des protéines, des acides nucléiques, des phospholipides, des nutriments et des métabolites (Beloin et al., 2008). 3.5. Le détachement de bactéries Comme pour les autres étapes, le détachement des bactéries est un processus complexe qui implique des signaux environnementaux et une communication entre les bactéries, notamment par le quorum sensing. Lorsque la densité bactérienne sur une surface devient très élevé (107 cellules/cm), des bactéries se détachent du biofilm et se dispersent dans le milieu environnant après un retour à l’état planctonique. Traditionnellement, le détachement de bactéries est considéré comme un phénomène passif, dépendant notamment des forces du flux du milieu dans lequel le biofilm se trouve. Cependant, le détachement de bactéries peut aussi être une stratégie active, initiée par les bactéries elles-mêmes, leur permettant de coloniser de nouvelles surfaces et de survivre lorsque l’espace et les nutriments deviennent limités. Les bactéries peuvent se détacher seules ou par petits ou gros amas ou fragments selon les mécanismes impliqués (Kaplan, 2010). Ainsi, un biofilm établi constitue un réservoir de bactéries viables, capables d’aller coloniser d’autres surfaces (figure 2). 5 Chapitre I Figure 2 : Représentation schématique d’étapes de détachement d’un biofilm (Briandet, 2012) 4. Facteurs favorisant la formation d’un bioflm La formation d’un biofilm est un phénomène complexe, sous l’influence de nombreux facteurs : caractéristiques du substrat sur lequel les bactéries vont se fixer, forces s’exerçant dans le milieu aqueux (hydrodynamique du fluide), caractéristiques du milieu et propriétés de la surface des cellules (Donlan, 2002). 4.1. Caractéristiques de la surface N’importe quel biomatériau en contact avec un fluide contenant des bactéries est un support potentiel pour la formation d’un biofilm. La rugosité, les propriétés chimiques d’une surface et la présence préalable de films protéiques jouent un rôle sur l’attachement des bactéries à cette surface et la formation d’un biofilm. 4.1.1. Rugosité de la surface Plus une surface est rugueuse, plus la colonisation de cette surface par des microcolonies est importante (Characklis, 1990). Les surfaces rugueuses sont colonisées de façon préférentielle car les forces répulsives sont moindres et la surface de fixation est augmentée, grâce à la présence d’aspérités (Donlan, 2002). Néanmoins, certaines bactéries colonisent aussi des surfaces lisses (Donlan & Costerton, 2002). Les biofilms auront ainsi tendance à se former au niveau des aspérités des biomatériaux, formant des recoins propices aux proliférations bactériennes les rendant moins sensibles aux agents désinfectants ou antiseptiques. 6 Chapitre I 4.1.2. Propriétés physico-chimiques de la surface Les propriétés physico-chimiques de la surface peuvent exercer une influence sur le taux d’attachement et sur son ampleur. Les micro-organismes se fixent plus facilement à des surfaces hydrophobes et non polarisées comme le plastique (sonde urinaire), que sur des matériaux hydrophiles comme le verre ou les métaux. Les cellules sont capables d’outrepasser les forces répulsives que peuvent exercer sur elles le substrat, via l’action de liaisons hydrophobes (Bendinger, 1993). 4.2. Présence de films protéiques sur la surface. La présence de polymères sur un matériau modifie les propriétés physico-chimiques de sa surface, et a une influence directe sur l’attachement de bactéries à cette dernière. En effet, la présence préalable sur un biomatériau d’un film protéique comme le sang, les larmes, l’urine, la salive, le liquide interstitiel et les sécrétions respiratoires influence l’attachement de bactéries à sa surface, et favorise la formation de biofilms (Mittelman, 1996). La nature de ces films protéiques est différente selon les milieux. Prenons l’exemple des bactéries formant le biofilm de la plaque dentaire. Elles se fixent sur un film protéique, présent à la surface de l’émail dentaire et composé d’albumine, de lysosymes, de glycoprotéines, de phosphoprotéines et de lipides (Donlan, 2002). La présence de films protéiques sur des implants médicaux en contact direct avec un fluide favorisent la formation de biofilms. Par exemple, les cathéters veineux centraux, en contact direct avec le sang, sont recouverts de plaquettes, de plasma et de protéines: albumine, fibrinogène, fibronectine, laminine (Goller, 2008). 4.3. Caractéristiques du milieu Le milieu dans dequel le biofilm se forme ou milieu environnant, conditionne également le processus. Parmi les facteurs les plus importants on peut citer les facteurs suivants : Température, pH : conditions optimales de formation de biofilms en situation de neutralité Concentration en oxygène, Osmolarité, Sources de carbone disponibles : elles ont une influence sur la formation d’un biofilm et sur sa maturation. 7 Chapitre I Concentrations en nutriments : dans un milieu statique, la concentration en nutriments doit être élevée pour qu’il puisse y avoir formation d’un biofilm ; ce n’est pas le cas pour un milieu hydrodynamique. Concentrations en certains cations : l’augmentation de la concentration de Plusieurs cations (sodium Na+, Calcium Ca2+, ion ferrique Fe3+) influence l’attachement de Pseudomonas sur des surfaces en verre, en réduisant les forces répulsives s’exerçant entre les bactéries chargées négativement et la surface de verre (Fletcher, 1988 ; O’Toole, 2000 ; Donlan, 2002 ; Martinez, 2007 ; Goller, 2008). Hydrodynamique du fluide : selon la position du matériau dans un fluide, il sera plus ou moins exposé à des turbulences. La zone de moindres turbulences, à l’écart des flux laminaires, est appelée zone de fixation. C’est précisément dans cette zone qu’il est plus facile pour les micro-organismes de se fixer sur une surface, puisqu’ils sont moins soumis aux forces exercées par le fluide (Donlan, 2002). 4.4. Propriétés des cellules L’hydrophobicité de la surface de la cellule, la présence de fimbriae et de flagelles, et la production d’exopolysaccharides influencent l’attachement des bactéries sur une surface. La plupart des bactéries sont chargées négativement et présentent à leur surface des zones hydrophobes. Plusieurs éléments structuraux des bactéries interviennent dans leur attachement à une surface : flagelles, fimbriae, polysaccharide. Il peut y voir des compétitions ou des coopérations entre cellules lorsque plusieurs espèces de bactéries sont concernées. Les polymères apolaires situés à la surface des cellules comme les fimbriae, certaines protéines, et les acides mycoliques (composants de certaines bactéries Gram positives) semblent s’attacher de façon prédominante à des surfaces hydrophobes. Les exoploysacchardies et les lipopolysaccharides sont plus importants dans les mécanismes d’attachement à des surfaces hydrophiles (Donlan, 2002). 5. Le quorum sensing La formation d’un biofilm est contrôlée par des mécanismes de régulation tels que le Quorum-Sensing (QS). Il s’agit de mécanismes de contrôle au sein des cellules, matérialisés par des signaux de cellules à cellules, via des médiateurs chimiques, et dépendant de la quantité de cellules présentes : on parle de mécanismes de perception de densité cellulaire. Ces mécanismes sont basés sur le principe de masse critique (Costerton 1999, Tomlin et al., 2005). Une fois que les concentrations en molécules signaux atteignent une valeur seuil, des régulateurs transcriptionnels sont activés et 8 Chapitre I exercent un contrôle sur des gènes spécifiques (Costerton et al., 1999; Irie et Parsek, 2008) Le QS régule la physiologie du biofilm en modulant la taille de la population du biofilm, et en prenant en compte les conditions environnementales. Il initie les phénomènes de dispersion et d’essaimage de bactéries planctoniques à partir du biofilm (Irie et Parsek, 2008). Le QS aurait aussi un rôle dans l’épaisseur du biofilm il peut réprimer ou stimuler l’expression de certains caractères, comme par exemple la motilité ou certains facteurs de virulence extracellulaires, comme des protéases (Tomlin et al., 2005 ; Clutterbuck et al., 2007; Irie et Parsek, 2008). Les molécules du QS jouent aussi un rôle dans la lutte contre l’attaque d’autres organismes vivants, comme des protozoaires tels que Serratia marcescens (Queck et al., 2006). 9 Chapitre II Chapitre II: études de quelques modèles de biofilm bactériens De nombreuses espèces bactériennes d’intérêt médical sont caractérisées par leur capacité de former des biofilms impliqués dans leur virulence et notamment leur résistance aux agents antimicrobiens. 1. Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa est une bactérie ubiquitaire, comme tous les espèces du genre Pseudomonas ou apparenté, mais également un représentant de la flore normale de l’homme. En outre, P. aeruginosa est un pathogène opportuniste impliquée dans de nombreuses pathologies infectieuses, notamment les infections nosocomiales. Ainsi la principale source de contamination des patients hospitalisés est leur flore endogène mais l’environnement est également incriminé (Talon et al., 1995 ; Minchella et al., 2010). La transmission croisée est la plus souvent manuportée par le personnel soignants, soit directement de patient à patient, soit indirectement à partir des surfaces inertes préalablement contaminées (Talon et al., 1995; Bergmans et al., 1998; Lister et al., 2009). P. aeruginosa est également responsable de la pneumopathie secondaire chronique des malades atteint de la mucoviscidose, en raison de son organisation en biofilm récalcitrant à l’antibiothérapie. 1.2. Caractères morphologique Ce sont des bacilles fins a Gram négatif (0,5x3μm), non capsulés, mobiles, avec une ciliature polaire en générale monotriche, ils possèdent souvent des granulations plus fortement colores (Hafiane et Ravaoarinora, 2008). 1.3. Caractères culturaux Pseudomonas aeruginosa n’a pas d’exigence nutritive particulière, peut se développer sur des milieux non enrichis. Certaines souches peuvent présenter des caractères différents, leurs colonies sont non pigmentées ou colorées en brun ou en rouge (dû à la production de la pyomélanine ou pyorubrine). Certaines souches se caractérisent par leurs aspects mucoide (souches isolées dans certaines pathologies chroniques comme mucoviscidose). D’autres souches peuvent apparaitre sous forme de colonies naines et sont plus difficiles a cultiver (Amazian et al., 2010) . 10 Chapitre II 1.4. Pouvoir pathogène Dans les infections communautaires, Pseudomonas aeruginosa est responsable principalement de broncho-pneumopathies évoluant sur un mode chronique dans la mucoviscidose et les affections respiratoires dues à la dilatation des bronches, d’otites externes, d’endophtalmies après traumatisme et d’infections cutanées dans les ulcères (Japoni et al., 2009). Dans les infections nosocomiales, elle est impliquée dans les pneumopathies chez les malades sous respirateur, les infections urinaires chez les malades sondés, les infections cutanées secondaires à des brûlures, les infections ostéo-articulaires sur matériel (Fuentefria et al., 2011). 1.5. Formation de biofilm par P.aeruginosa Les biofilms formés par P. aeruginosa caractérisés par un complexe bactérien très structuré, leur structure des biofilms étant variable d’une espèce à une autre, certains forment un biofilm plats homogène ou troués d’autres sous forme de ruban (Romain, 2012). Ils sont initiés par l’attachement d’une cellule planctonique unique sur une surface (Vallet et al., 2001). Sa croissance commence sous la forme de microcolonies, qui fusionnent ensuite pour former des biofilms (Mittal et al., 2009). Sa capacité de former un biofilm lui confère plusieurs caractéristiques, dont une augmentation importante de la résistance aux antibiotiques (Brooun et al., 2000), ainsi qu’aux mécanismes de défense de l’hôte et par conséquent sont difficiles à éradiquer. Les biofilms contribuent à la pathogénicité de P. aeruginosa et conduisent souvent à des infections persistantes et récurrentes et souvent mortel dans le cas de la mucoviscidose, les infections chronique a biofilm sont responsable de prés de 100% de l’issue fatale de la maladie. Le plus souvent un biofilm prend le contrôle des tissus pulmonaires, jusqu’au point de non retour où les traitements antibiotiques ne permettent plus de juguler l’infection (Romain et al., 2012). Ainsi ils produisent et libèrent en grand quantité des rhamnolipides capable de détruire nos globule blancs (Romain et al., 2012) (figure 3). 11 Chapitre II Figure 3 : Aspect de biofilm de P. aeruginosa par microscopiques (sage journal, 2014) 2. Escherichia coli 2.1. Caractères bactériologiques Escherichia coli est l'espèce type du genre Escherichia des entérobactéries. Appelée communément "colibacille" c.-à-d. "bacille du côlon", commensale du tube digestif (présente à raison de 107 à 109 corps bactériens/g de selle des anaérobies) cette espèce qui a fait l'objet d'un très grand nombre d'études constitue le modèle des bacilles à Gram- aérobies. La plupart des E. coli se multiplient rapidement (18 à 24 h) sur les milieux habituels. Les colonies ont en moyenne 2 mm de diamètre, elles sont rondes, plastes et à bords réguliers (Joly, 2002). Figure 4: Aspect d’E.coli en microscope électronique (www.cbs.dtudk) 1.2. Pouvoir pathogène C'est l'une des espèces bactériennes les plus souvent rencontrées en pathologie humaine (Berche, 2003). Cette bactérie est connue comme pathogène pour l'appareil 12 Chapitre II urinaire et qui se transmet par voie orofécale. Certaines souches d’E. coli sont capables de causer des dommages au niveau de la muqueuse digestive se traduisant par un syndrome infectieux. Les aliments incriminés sont: l'eau (dans certains pays), les viandes et le lait cru. La durée d'incubation est de 3 à 9 jours pour provoquer des gastro-entérites peu graves, diarrhées abondantes et liquides (Joly et Reynaud, 2002). C’est aussi le premier germe responsable d’infections communautaires et nosocomiales. Les infections à E. coli sont de deux types : les infections intestinales et les infections extra-intestinales (infections urinaires, bactériémies et méningites). Les méthodes d’analyse génomique ont montré que l’espèce E. coli pouvait être divisée en plusieurs groupes phylogénétiques, les principaux étant les groupes A, B1, B2 et D. Les souches commensales et celles responsables de diarrhées appartiennent majoritairement aux groupes A et B1, alors que celles responsables de pathologies extra-intestinales appartiennent majoritairement aux groupes B2 et D (Denis et al., 2007). 1.3. Formation de biofilm par E. coli Parmi les nombreux facteurs de virulence décrits chez E. coli, un certain nombre sont connus pour être impliqués à des degrés divers dans la formation du biofilm. On peut citer les flagelles. Ces derniers leur permettent d’entrer en contact avec une surface puis de s’y fixer (Goller, 2008). Cependant, la motilité flagellaire n’est pas essentielle pour l’attachement initial et la formation d’un biofilm. L’absence de flagelle est compensée par l’existence d’autres molécules adhésives, comme les curli, permettant l’attachement de la bactérie à la surface (Beloin, 2008). Certaines bactéries sont capables d’établir un contact avec une surface par des mécanismes de signalisation et d’exprimer par la suite des adhésines à leur surface (Wang, 2004). Ce mécanisme est appelé « surface sensing ». Il existe chez Escherichia coli, (système de signalisation Cpx) mais les modes de fonctionnement ne sont pas encore connus (Goller, 2008). La pathologie des infections des voix urinaire est associée au biofilm d’E. coli (Romain et al., 2012). 13 Chapitre II 3. Klebsiella pneumoniae 3.1. Caractères morphologiques Les klebsiella sont des bacilles à Gram négatif de 0.5 μm sur 3 μm environ, à extrémités arrondies, se présente de manière isolée, groupées diplobacilles ou en courtes chaînettes souvent enrobés dans la même capsule, cette dernière mais cette dernière peut être absente chez 5% des souches Cette bactérie se distingue par son immobilité constante, elle est asporogène (Le Minor, 1989). 3.2. Caractères culturaux K.pneumoniae se développe en aéro-anaérobiose. Sur les milieux classiques d'isolement pour entérobactéries (Hektoen, Mac Conkey) après une incubation de 18 à 24 h à 30 ou à 37°C, les colonies sont d'un diamètre de 3 à 4 mm, lisses, lactose positives, bombées, brillantes, muqueuses, parfois filantes à l'anse de platine (Le Minor, 1989. À la différence des autres espèces de Klebsiella, plus de 90% des souches de K. pneumoniae croissent à 44 °C en bouillon lactosé bilié vert brillant et plus de 80% en fermentant le lactose avec production de gaz (Le Minor, 1989). 3.3. Pouvoir pathogène K. pneumoniae est un pathogène opportuniste responsable d'infections communautaires et d'infections nosocomiales. Parmi les infections communautaires, K. pneumoniae est responsable d'infections broncho-pulmonaires incluant les pneumonies lobaires nécrosantes, les abcès pulmonaires, les pleurésies purulentes (Carpenter, 1990).Cette espèce est également responsable d'infections intraabdominales et est isolée de mal perforant plantaire (Carpenter, J. L.1990). 3.4. Formation de biofilm par Klebseilla pneumoniae Klebseilla a une capacité importante à former des biofilms surtout sur du plastique tel le cathéter urinaire, elle est considérée comme un des majeur agents responsable d’infection nosocomiale ce qui rend le traitement par les antibiotiques inefficace (Sanjary et al., 2013). La formation de biofilm est modulé par le Q.S a travers une synthèse d’autoinducteurs (AL-2) et possédant des gènes homologue a ceux de E.coli. L’expression des fimbria de type 1 et 3 de Klebseilla augmente sa capacité a former des biofilm puissant, a noté aussi qu’un des types de fimbria peut compensé le rôle de 14 Chapitre II l’autre durant la formation mais ils sont plus puissant à deux (Sleen et al., 2012). (Figure 5). Figure 5: Aspect de biofilm de K.pneumoniae en MEB (Rozyne 2013). 2. Staphylococcus aureus Les staphylocoques sont des bactéries ubiquistes commensales de la peau et des muqueuses de l’homme et de l’animal. L’homme est le principal réservoir naturel de Staphylococcus, il présente un portage sain, principalement au niveau des cavités nasales. Chez l’homme, les staphylocoques en particulier les espèces S. aureus et S. epidermidis font partie de la flore résidente cutanée de nombreux individus qui sont des « porteurs asymptomatiques » (Wylie, 2005). Ils sont des opportunistes, dotés d’une grande multi résistance vis-à-vis des antibiotiques (couture, 1990). 4.1 Caractères morphologiques et culturaux La coloration de Gram, la morphologie des colonies sur milieux gélosés et différents tests biochimiques permettent d’identifier le genre Staphylococcus et l’espèce S. aureus. Les staphylocoques sont des cocci à Gram positif, isolés ou groupés en amas, immobiles non sporulés, parfois encapsulés, catalase-positive et oxydase-négative. La production d’une coagulase, d’un pigment caroténoïde jaune doré et la présence d’une protéine A de paroi caractérisent Staphylococcus aureus (El Kouir, 2003 ; MeeMarquet et al., 2004). 15 Chapitre II 4.2. Pouvoir pathogène Les infections par les staphylocoques sont caractérisées d’une part par les caractères destructif, profond et suppuré de la porte d’entrée ou des foyers métastatiques, la rapide dissémination des métastases septiques et l’existence de signes généraux marqués, et d’autre part, la possibilité d’une persistance prolongée pendant plusieurs dizaines d’années (Proctor et al., 1998) . Les constituants de la paroi des staphylocoques, les substances enzymatiques et toxiques produites, hydrolysant différents constituants cellulaires contribuent à la pathogénie des staphylocoques (Arvidson, 2000 ; Fauchere, 2002). 4.3. Formation de biofilm par S. aureus La formation de biofilm par S. aureus est un processus qui se déroule en deux phases la première phase consiste en l’attachement initial des cellules sur une surface, exprimant à leur surface des molécules, les MSCRAMM11, capables de se lier aux molécules adhésives des matrices protéiques, comme le fibrinogène ou la fibronectine (Patti, 1994). Ces interactions spécifiques entre matrice protéique de l’hôte et MSCRAMM sont très importantes pour l’établissement de la colonisation bactérienne, et la seconde à la multiplication et à la formation d’une communauté structurée, mature et multicouche. Ces deux phases sont physiologiquement différentes l’une de l’autre et requièrent chacune des facteurs spécifiques. Le détachement des cellules du biofilm mature permet la dissémination des bactéries et la colonisation de nouveaux sites d’infection chez l’homme (Otto, 2008). La pathologie des rhinosinusites chronique est associée au biofilm produit par S. aureus (Romain et al., 2012) (figure 6). Figure 6: Aspect de biofilm de S.aureus par microscope 16 Chapitre II 5. Bacillus cereus 5.1. Caractères morphologiques Les Bacillus sont des bacilles Gram+ sporulées, appartenantt à la famille de Bacillaceae. La spore peut être terminale, subterminale ou centrale possédant une thermorésistantes (résistant à 100 °C et donc à la pasteurisation). Ils sont aéroanaérobies facultatifs ou parfois aérobies stricts catalase+ généralement non pathogènes (Larpent, 1997). Au sein de ce genre, le groupe Bacillus cereus renferme des espèces très pathogènes ou potentiellent pathogènes. Sur le plan morphologique, il s’agit de bacilles, aux extrémités arrondies, généralement mobiles grâce à une ciliature péritriche, d'une longueur supérieure à 3 um et d'un diamètre moyen de 1,4 um, souvent groupés en chaînes (Euzeby, 2008). B. cereus est un fort producteur d'enzymes, il possède une phospholipase très active. Il peut réduire le nitrate en nitrite. Il peut métaboliser l'arabinose et le mannitol (Peiffer, 2000), sont mannitol négatif hémolyse positive sur gélose au sang et possède une lécithinase qui le différencie des autres espèces de Bacillus. Aucune croissance n'est obtenue à pH 4,5 et pour des températures de 50 °C sauf la novelle espèce B. cytotoxicus. Les colonies ont un diamètre compris entre 2 et 7 mm, elles sont soit circulaires soit de forme irrégulière avec des bords ondulés, crénelés ou filamenteux, leur aspect est crémeux et lisse ou mat ou granuleux (Euzeby, 2008). 5.2. Habitat et pouvoir pathogène B. cereus est un germe ubiquiste. Bactérie vivant dans les sols et dans les eaux, peut survivre dans l'environnement sous forme de spores. Elle peut contaminer surtout des aliments d'origine végétale (riz, épices) et de nombreux plats cuisinés. B. cereus se comporte comme un pathogène opportuniste et cette espèce est également responsable de toxi-infections alimentaires (PEIFFER, 2000). La présence de spores de B. cereus pose de sérieux problèmes dans les industries agroalimentaires (notamment les industries laitières). B. cereus est également un contaminant des drogues (héroïne) et de médicaments tels que les topiques qui peuvent alors contaminer des plaies (EUZEBY, 2008). 17 Chapitre II 5.3. Formation de biofilm de Bacillus cereus Le pouvoir d’adhésion aux surfaces et la formation de biofilm de B. cereus sont attribués aussi bien aux propriétés physico-chimiques de surface des spores (Peng et al., 2001; Lequette et al., 2011), qu’à son potentiel génétique (Oosthuizen et al., 2002; Sauer, 2003). Le rôle de la mobilité et la présence du flagelle dans la formation du biofilm de B. cereus à également été rapporté (Houry et al., 2010). Cette propriété est mise à profit pour permettre à la bactérie d’atteindre des sites favorables à son développement (figure 7). Figure 7: Aspect de biofilm de B.cereus en MES (Simoes, 2010) 18 Chapitre II 19 Chapitre III Chapitre III: Les agents antibiofilm Aujourd'hui les principes actifs des plantes sont des composants essentiels d'une grande partie de nos médicaments et produits de soins (Hans, 2007). Malgré les multiples progrès de la médecine moderne, il y 'a un nette regain d'intérêt vis-à-vis de la phytothérapie. Selon OMS (Organisation Mondiale de la Santé) plus de 80% de la population mondiale ont recours à la pharmacopée traditionnelle pour faire face aux problèmes de la santé (Farnsworth et al, 1986). En effet sur les 300 000 espèces végétales recensées sur la planète plus de 200 000 espèces vivent dans les pays tropicaux d'Afrique ont des vertus médicinales (Millogo et al, 2005) La Phytothérapie considérée comme traitement ou prévention des maladies par l'usage des plantes, elle fait partie des médecines douces qui utilise des produits naturels d'origines végétales. Ces extraits sont dosés en quantités suffisantes pour avoir une action soutenue et rapide. Ils sont présentés sous forme de sirop, de gouttes, de gélules, de lyophilisats (Strang, 2006). Les plantes médicinales sont des drogues végétales dont au moins une partie possède des propriétés médicamenteuses (Farnsworth et al, 1986). Environ 35 000 espèces de plantes sont employées par le monde à des fins médicinales, ce qui constitue le plus large éventail de biodiversité utilisé par les êtres humains. Les plantes médicinales continuent de répondre à un besoin important malgré l'influence croissante du système sanitaire moderne (Elqaj et al, 2007), prenant l’exemple de Thymus vulgaris qui inhibe la croissance de Mycobacterium tuberculosis (bactérie qui cause la tuberculose) (Jiminez-Arellanes et al, 2006) et de Rosmarinus officinalis qui est un anti-inflamatoire. Les molécules que constitue le principe actif des plantes médicinales appartiennent majoritairement aux métabolites secondaires tels que les polyphénols, les huiles essentiels et les alcaloïdes. 1. Les métabolites secondaires Les métabolites secondaires des végétaux peuvent être définis comme des molécules indirectement essentielles à la vie des plantes. Ils dérivent, de métabolites primaires et interviennent dans la structure des plantes, beaucoup de métabolites secondaires sont toxiques, ils sont alors stockés dans des vésicules spécifiques ou dans la vacuole (Gravot, 2008; Thomas, 2009). 19 Chapitre III 1.1. Classification des métabolites secondaires Les métabolites secondaires sont produits en très faible quantité, et plus de 200000 molécules ont été identifiées, classés selon leur appartenance chimique en composés phénoliques, alcaloïdes et terpénoïdes (Cuendet, 1999 ; Vermerris, 2006). 2. Les polyphénols Les polyphénols (PP) sont des métabolites secondaires des végétaux. Ils constituent un des groupes les plus nombreux et largement distribués des substances dans le royaume des végétaux, avec plus de 8000 structures phénoliques connues (Bravo et al, 1994; Hennebelle et al, 2004). L’élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d’au moins un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groupe hydroxyle libre ou engagé dans une autre fonction (Bravo et al, 1994; Visioli et hagen, 2007). 2.1. Classification et structure des composés phénoliques Selon le nombre d’unités phénoliques présentes, on les classe en composés phénoliques simples et polyphénols. Par abus, on les appelle indifféremment composés phénoliques qui comprennent essentiellement les phénols simples, les acides phénoliques, les stilbènes, les flavonoïdes, les tanins hydrolysables et condensés, les coumarines, les lignanes les lignines et les xanthones (Stalikas, 2007) (figure 8 et 9). Selon (Harborne, 1989 et Macheix et al, 2005). Les composés phénoliques peuvent être regroupés en de nombreuses classes qui se différencient d’abord par la complexité de leur squelette de base (allant d’un simple C6 à des formes très polymérisées), ensuite par leur degré de modification de ce squelette (degré d’oxydation, d’hydroxylation et de méthylation). 20 Chapitre III Lignane stilbène coumarine Figure 8: Structure chimique de quelques composés phénoliques Acide cafeique acide férulique acide gallique Figure 9: Structures chimique de quelques acides phénoliques 2.2. Les flavonoïdes Les flavonoïdes sont des composés polyphénoliques composés de quinze carbones avec un squelette de base formé par deux cycles en C6 reliés entre eux par une chaîne en C3 qui peut évoluer en un hétérocycle (figure 10). Ce sont les polyphénols les plus abondants de notre alimentation et plus de 4000 composés ont pu être identifiés (D'Archivio et al., 2007) (figure 11). Leur activité pharmacologique a été prouvée grâce à leur action inhibitrice de certaines enzymes et leur réactivité antioxydante. L'objectif des tests biologiques in vivo et in vitro faits sur des produits isolée des plantes et de justifier l'utilisation de ces plantes en médecine traditionnelle par la découverte de nouvelles molécules biologiquement actives. Par ailleurs, il a été signalé que les flavonoïdes ont une activité antihypertensive, antiallergique, antiinflammatoire, antihépatotoxique, antivirale, antitumorale Cytotoxique, antimicrobien antibactériens antifongique et hepatoprotective. 21 Chapitre III Figure 10: Structure générale des flavonoïdes (Dacosta, 2003) Flavan-3ols Flavonone Isoflavone Figure 11 : Structure chimique de quelques flavonoide 2.2.1. Les catéchines La catéchine est un polyphénol, caractérisé par la présence sa structure de noyaux phénoliques. Elle appartient au groupe des flavonoïdes particulièrement les flavonols ou elle représente un pourcentage de70% (KABOUCHE, 2010) (figure 12). Il possède trois noyaux phénoliques, deux noyaux benzéniques dénommé A- et B et un hétérocycle dihydropyranne (cycle C) qui a un groupe hydroxyle sur le carbone 3. La quantité de catéchine est influencée par différents facteurs, car elle diffère pour la même espèce végétale (KABOUCHE, 2010), ils jouent un rôle particulièrement important dans la prévention du photovieillissement, du cancer et des maladies cardiovasculaires (MATTIAS, 2010).Cet effet préventif est attribué a leur activité antioxydante puissante qui joue un rôle important dans le piégeage des radicaux libres ; Ainsi qu’une grande activité antimicrobienne (ZHAO et al 1989). Figure 12 : Structure chimique de la catéchine 2.2.2. Les tannins Le terme tanin provient d’une pratique ancienne qui utilisait des extraits des plantes pour tanner les peaux d’animaux, autrement dit pour transformer une peau en cuir 22 Chapitre III (Hopkins, 2003). Les tanins sont des polyphénols que l'on trouve dans de nombreux végétaux tels que les écorces d'arbre et les fruits (raisin, datte, café, cacao...). Ce sont des molécules hydrosolubles, de saveur astringente ayant la propriété de tanner la peau et de se combiner aux protéines animales par des liaisons hydrogènes (Pousset, 1989 ; Peronny, 2005). La structure chimique des tannins est complexe, formée d'unités répétitives monomériques qui varient par leurs centres asymétriques, leur degré d’oxydation. On distingue habituellement chez les végétaux supérieurs deux groupes de tanins, basés sur des différences structurales : les tanins hydrolysables et les tanins non hydrolysables ou tanins condensés (Ghestem, 2001) (figure 13). Hydrolysables s’hydrolysent aisément par de acides et des bases, par l’intermédiaire d’enzymes. Ils sont composés d'un noyau central de glucide auquel des acides carboxyliques phénoliques sont liés par liaison ester. On distingue les tanins galliques dans le cas d’acide gallique et les tanins ellagiques dans le cas d’acide ellagique. Par contre, les entièrement. Leur structure est tanins condensés ou pro-anthocyanidine voisine de celle des flavonoïdes, mais possède pas de sucre dans leurs molécules. Ils sont des monomères) ou polymères (plus de 10 monomères) de majoritairement par des liaisons de diffèrent ne oligomères (2 - 10 flavan-3-ols reliés type Carbone-Carbone, ce qui les rend difficilement hydrolysables (Ghestem, 2001). (a) (b) Figure 13 : Structure chimique de tanin hydrolysable (a) et condencés (b) 2.2.3. L’acide gallique L’acide gallique, appartient aux acides phénoliques, est largement distribué dans diverses plantes, fruits et aliments, où il est présent sous forme libre ou, plus communément, comme ingrédient de tanins, à savoir les gallotannins (Niemetz et Gross, 2005). Les noix de galle, le sumac, l'écorce de chêne, le thé vert, raisins, 23 Chapitre III fraises, ananas, bananes, citrons, hamamélis et l’épluchure de pomme sont riches en acide gallique (Wolfe et al, 2003) (Figure 14). L’acide gallique ou acide 3, 4, 5trihydroxy-benzoïque (C6H2(OH)3 COOH) issus de la voie de l’acide shikimique est un membre de la classe des acides hydroxy-benzoïques (DE Beer et al, 2003). L'acide gallique est considéré comme un antioxydant potentiel, il est ainsi donc utilisé comme additif dans les aliments, les médicaments et les cosmétiques. En outre, l'acide gallique possède des activités anti-allergique, anti-inflammatoire, anti-mutagène et anticancéreuse (Fukumoto et Mazza, 2000; Kroes et al, 1992; Shahrzad et al, 2001). Des recherches récentes ont étudié ses effets anti-tumoral, pro-apoptotique et anti-inflammatoire. L’acide gallique est agent antibactérien important (Borges et al., 2013). Figure 14 : structure chimique d'acide gallique 3. Les alcaloides Un alcaloïde est une substance organique azotée d’origine végétale a caractère alcalin et présentant une structure moléculaire hétérocyclique complexe (Badiaga; 2011) (figure 15). La plupart des alcaloïdes sont dérivés d’acide aminés tels que le tryptophane, L’ornithine, la lysine, l’asparate, la phénylalanine et la tyrosine. Ces acides aminés sont décarboxylés en amines et couplées à d’autres squelettes carbonés. On divise les alcaloïdes en trois genres: les alcaloïdes vrais, pseudo et protoalcaloïdes, possédant une grande activité antimicrobienne (Cyril, 2001). Atropine Cocaine Figure 15 : Structure chimique de quelques alcaloides 24 Chapitre III 4. Les terpénoïdes Le terme de terpénoïde est attribué à tous les composés possédant une structure moléculaire construite d’un monomère à 5 carbones appelé isoprène, ces composés sont majoritairement d’origine végétale (figure 16), synthétisés par les plantes, organismes marins, les champignons et même les animaux (Benaissa, 2011). L’exploitation de ces composés s’effectuait sous forme d’huiles essentielles récupérées par hydrodisstillation (Malecky, 2005). Structure sous forme de terpène désigne un ensemble de substances présentant le squelette des terpènes avec une ou plusieurs fonctions chimiques (alcool, aldéhyde, cétone, acide, lactone) (Malecky, 2005 ; Benaissa, 2011). En site parmi les terpénoïde les diterpénes, sesquiterpéne, hemiterpéne et polyterpéne. Le limonene le menthol Figure 16 : Structure chimique de quelques terpènoide Les huiles essentielles Sont des composants liquides et hautement volatiles des plantes, marqués par une forte et caractéristique odeur les terpènes, principalement les monoterpènes représentent la majeure partie des ces composants (environ 90%) (Hamdani, 2012). Toutefois, les parfums émis jouent un rôle attractif pour les insectes pollinisateurs. Les huiles essentielles caractérisées par leurs propriétés antitoxiques, antivenimeuses, antivirales et antiparasitaires. Dû leurs vaste utilisation dans les domaines pharmaceutique, alimentaire, cosmétique. Néanmoins, une seule huile peut avoir plusieurs utilisations à la fois (Laib, 2011). 5. Etude de quelques plantes Dans le but d’affirmer l’action des molécules précédente on va tester quelques extraits de plantes qui les contiennent et qui sont présenté par la suite. 5.1 Micromeria inodora Le genre Micromeria (les microméries) réunit des plantes de la famille des Lamiaceae, comprenant environ 90 espèces des régions tempérées d'Afrique, d'Amérique, d'Asie et d'Europe. Dans la famille des labiées, comme les menthes, les 25 Chapitre III origans, les romarins, les thyms, il se situe dans la sous-famille des népétoïdées et la tribu des menthes. Le genre Micromeria est répandu dans les régions tempérées : Afrique, Canaries, Europe, Asie, Amérique du Nord et jusqu'aux Antilles. Micromeria inodora, est une plante sans odeur, très ramifié, très feuillé; ne dépassant pas plus de 50 cm de haut. Les tiges sont ligneuses, tortueuses, à écorce crevassée; les rameaux courts et les fleurs rose axillaires (figure 17). La floraison est entre mois d’Octobre et Janvier. Certaines espèces sont utilisées comme plantes ornementales de rocailles. D'autres, sont bues en infusion. . Figure 17 : Micromeria inodora (gereon.es/plantes/micromeria) 5.2. Zizyphus jujuba Mill Zizyphus jujuba Mill Le genre botanique Zizyphus dont l'orthographe complexe d'origine latine est parfois simplifiée en Ziziphus est représenté dans la majorité des continents par une quarantaine d'espèces d'arbres ou d'arbustes très souvent épineux, particulièrement résistants à la sécheresse et à la pauvreté des sols, et qui portent des fruits comestibles appréciés dans les zones géographiques aux conditions climatiques difficiles, zones sahéliennes et semi- désertique (figure 18). Le jujubier de Chine ou Zizyphus jujuba Mill d'utilisation très ancienne en alimentation et en médecine traditionnelle Arabe et Chinoise que l'on trouve dans les climats tempérés ou méditerranéens. Les parties intéressantes des JUJUBIERS sur le plan diététique ou médicinal sont le fruit (le jujube), la graine et dans une moindre mesure les feuilles et les racines. La pulpe de jujube est agréablement acidulée, parfois un peu acre si elle n'est pas mûre les fruits se compose de: 65 à 70 % d'eau, 20 à 30 % de sucres (glucides), 1 à 2 % de protides, entre 300 et 600 mg de vitamine C pour 100g de fruit, des flavonoïdes aux propriétés anti-oxydantes, des tannins, des acides organiques, ainsi que de la vitamine A et une quantité intéressante de fer, calcium et potassium. 26 Chapitre III La pulpe de jujube est légèrement laxative mais le fruit complet peut produire l'effet inverse (constipation) à cause probablement de la présence de tanins dans la peau du fruit. C'est une plante médicinale très employée pour favoriser le sommeil et diminuer le nervosisme. Le jujube ne présente pas de toxicité importante et n'entraîne ni accoutumance ni addiction. Il contiendrait une substance (enzyme) qui empêche la synthèse du glucane à partir du saccharose. Le glucane se forme dans la bouche sous l'action de bactéries et participe à la formation de la "plaque dentaire" prélude aux caries dentaires. La consommation de jujube limiterait la formation des caries dentaires. La pulpe bien mur favorise le transit intestinal mais il faut utiliser des fruits arrivés à maturité et si possible sans la peau. Son huile essentielle est également antibactérienne et comme antalgique dans les affections buccales et/ou pharyngiennes (phytomania.). Figure 18 : Zizyphus jujuba Mill (phytomania.com/jujubier) 5.3. Retama raetam Retama raetam, Arbuste saharien de 1à 3,5 m de hauteur à rameaux veloutés, les fleurs blanches, grandes (8-10mm), en grappes pauciflores de 5 à10 fleurs; gousses ovoïdes, aiguës, terminées en bec. Les rameaux fortement sillonnés en long. Elle se trouve dans les dunes et lits des oueds (Ozenda, 1991) (figure 19). La partie aérienne de Retama raetam est utilisée, en infusion, en poudre ou en compresse, pour le traitement du rhumatisme, les blessures et les piqûres de scorpion, elle est utilisée aussi contre les morsures de serpent (Chehma, 2006). En outre, des études expérimentales ont révélé que Retama raetam possède une activité antioxydante (Saadaoui et al., 2007), antimicrobienne et cytotoxique. Elle possède aussi un effet diurétique, antihypertenseur, et une activité hypoglycémiante (Eddouks et al., 2007 ; Maghrani et al., 2005). Selon des études phytochimiques Retama raetam est riche en 27 Chapitre III flavonoïdes, alcaloïdes et en polysaccharides (Kassem et al, 2000) Figure 19 : Retama reatama gauche partie aérienne et a droite graine et fleure (www.saharanature.com) 5.4. Ammi visnaga Ammi visnaga (khella) est une plante médicinale commerciale d'origine méditerranéenne. Les extraits des semences de cette plante sont employés dans la médecine pour le traitement des maladies coronarienne et de l'asthme bronchiale. La khelline, la visnagine et la visnadine sont les principes actifs des fruits. ils sont ainsi utilisées dans l'industrie pharmaceutique (Sittig, 1988; Grayna et al., 1998; Kleeman et al., 1999) (figure 20). Une décoction des fruits de la plante soulage les diabétiques, traite les abcès, lutte contre les maladies affectant les intestins et apaise différentes douleurs, notamment la migraine (Mouslih, 2001). Cette plante présente des particularités thérapeutiques et olfactives qui intéressent les industriels. Une première ébauche sur l’étude de la bioactivité d'Ammi visnaga a mis en exergue son effet inhibiteur sur une mycobacterie (Mouslih, 2001 ). Les tannins d’Ammi visnaga est caractérisé par sa teneur en quinones libres, les terpenoïdes, les alcaloïdes, et pauvre en coumarines et les anthraquinones (Bercisse, 2015). Figure 20 : Ammi visnaga (www.legrainier.com) 28 Chapitre III 5.5. Pinus halepensis Les Pinus appartiennent à la famille des pinaceae, répartie dans le monde entier et essentiellement autour des côtes méditerranéennes (Ching P et al., 2010). Ce sont des arbres ou plus rarement des arbustes persistants, monoïques, aux rameaux régulièrement verticillés, ont des feuilles enforme d'aiguilles qui sont persistantes (Farjon, 1990 et Mathilde, 2002) Les pinacées sont des conifères c’est-à-dire des plantes portant des cônes (Ching et al., 2010) (figure 24). Le bois est recherché tant pour les usages industriels et aussi médicinaux (Mathilde, 2002). Les tests phytochimiques réalisés par Ghanmi, des extraits préparés, ont permis de mettre en évidence les flavonoïdes, les tanins, les saponosides, les sucres réducteurs dans l’ensemble des extraits. L’huile essentielle de la partie aérienne du P. halepensis obtenue par hydrodistillation dont quarante neuf composés ont été identifiés montre une composition en 26 monoterpènes, 16 sesquiterpènes, 4 diterpènes et 3 nonterpéniques (Antolovich et al., 2002). Cette plante est caractérise par ses propriétés antimicrobiennes, anti-oxydantes et antifongiques (Badr et al., 2003) (figure 21). Figure21 : Pinus halepensis (nature.jardin.free.fr) 29 Chapitre III 30 Matériel et Méthodes Ce travail a été réalisé au laboratoire de microbiologie et de biologie moléculaire de l’université Abou bekr Belkaid de Tlemcen, porte sur l’évaluation de l’effet d’agents antimicrobiens d’origine végétale sur la formation de biofilms par des souches de référence d’intérêt clinique. 1. Souches étudiées Les souches de référence suivantes :Staphylococcus aureus, utilisées appartiennent Pseudomonas aeruginosa ; aux espèces E.coli, Klebseilla pneumoniae et Bacillus cereus, telles que montrées dans le tableau 1. Tableau 1 : Caractéristiques des souches testées Les souches Gram Les codes de Origine références Pseudomonas Négatif ATCC 27853 MNHN Négatif IBMC MNHN aeruginosa Klebseilla pneumoniae Strasbourg E.coli Négatif ATCC 8739 MNHN Staphylococcus Positif ATCC 6538 MNHN Positif ATCC 11778 LMB aureus Bacillus cereus 2. Revivification et Enrichissement Les souches conservées sur des géloses inclinées sont revivifiées par repiquage sur gélose tryptone-soja (TSA), et incubées 24 h à la température optimale du germe. L’enrichissement des cultures était réalisé en ensemençant ces souches dans des tubes de bouillon BHIB et en les incubant pendant 24 h.Les souches sont ensuite repiquées sur gélose nutritive. 3. Formation de biofilm Le potentiel de formation du biofilm chez les souches testées est déterminé par la technique au cristal violet, utilisant des microplaques de titration à 96 puits. A partir 30 Matériel et Méthodes des souches incubées sur les boites, nous avons préparé une préculture de 20 h dans du bouillon nutritif. La concentration cellulaire doit avoir une DO comprise entre 0.60.8 à 630 nm (106 et 108 cellule/ml). Ensuite 50 μl de suspension sont déposés dans chaque puits d’une plaque de microtitration inoculé déjà de 100 μl de bouillon nutritif, La plaque est ensuite placée dans une étuve à 370 C pendant 24 h. 4. Coloration au cristal violet La technique de coloration au cristal violet mesure la quantité de biomasse à l’intérieur du biofilm (Christensen et al., 1985). Le cristal violet se lie aux molécules extracellulaires chargées négativement, tel que les molécules de la surface cellulaire ou les polysaccharides de la matrice exopolymérique des biofilms (Li et al., 2003).Après la formation du biofilm, le milieu est aspiré et les puits sont lavés 03 fois avec du l’eau distillée pour éliminer les cellules planctoniques et /ou les cellules faiblement adhérées. Les puits sont remplis par 200 μL d’une solution de cristal violet (1%). Les plaques sont incubées pendant 15 minutes à température ambiante. Les plaques sont rincées trois fois à l’eau distillées, laisser séchées en position renversée et remplies de 200 μL d’acide acétique (33%). Le Crystal violet lié au biofilms est libéré par addition de l’acide acétique (33%). La densité optique est ensuite lue à 600nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (ELISA) (Figure 22) Figure 22 : Détection et lecture de biofilm par méthode de CV (à gauche la plaque contenant de CV et à droite le lecteur ELISA) 5. Variation des conditions de culture La formation de biofilm a été testée dans différentes conditions expérimentales afin d’optimiser les paramètres de la technique du cristal violet aux espèces bactériennes étudiées. Les modifications ont porté sur : 31 Matériel et Méthodes - La durée d’incubation : croissance en bouillon nutritif incubé en aérobiose pendant 24 heures et 48 heures. - Le milieu de culture : croissance en bouillon nutritif et en bouillon TSB 6. Détermination de la concentration minimale inhibitrice de biofilm Pour réaliser cette partie de travail, nous avons testées l’effet de quelques extraits de plantes, qui ont été préparé et récupéré sous forme solide au niveau de laboratoire antibiotique, antifongique: Physico-chimie-synthèse et activité biologie, les extraits récupérées sont : -Extraits aqueux de fruit de Ziziphus jujuba -Extraits aqueux de feuilles de Retama raetam -Extraits aqueux de feuilles de Micromeria inodora -Extraits aqueux des ombelles séches d’Ammi visnaga -Extraits aqueux de feuilles de Pinus halpensis Nous avons également récupéré certaines molécules de polyphenols (sigma-aldrich, Fluka), il s’agit de l’acide gallique, acide tannique et catéchine La concentration minimale inhibitrice des biofilms par les extraits de plantes : et les molécules de polyohénols (sigma-aldrich, Fluka) testé à différentes concentration à été déterminée par la méthode de microplaque en suivant le guide de The clinical and laboratory standards Institute (2006). Préparation des extraits végétaux Les différents extrait de plantes ainsi que les molécules synthétiques ont été solubilisé dans l’eau distillée stérile à des concentrations variable allant de 20 à 175 mg/ml, pour les molécules solubles dans l’eau et, pour les molécules insoluble sont mélangées avec le tween 80 à 1%(v/v). Tableau 2 :Caractéristiques des molécules polyphénoliques et les extraits de plantes. Molécules Aspect Couleur Solubilité Acide tannique Poudre Orange Eau Acide gallique Poudre Blanche Eau Catéchine Poudre Orange Eau Extraits Aspect Couleur Solubilité Zizyphus jujuba Hygroscopique Brune foncé Eau 32 Matériel et Méthodes Pinus halpensis Poudre Verte Tween 80 Micromeria Poudre Verte Eau Retama reatam Pate hygroscopique Brune Eau Ammi visnaga Poudre Brune Eau inodora Inoculation des microplaques Les puits sont remplis de 100μl de bouillon supplémenté de 30 μl de la préparation végétales à des concentrations comprises entre (20-175 mg/ml), inoculés ensuite avec 20 μl de suspension bactérienne avec une DO entre (0,6-0,8) et incuber a 370 C pendant 24 h (figure 23) .Apres incubation la densité optique des puits est mesurée à une longueur d’onde de 630 nm. Les puits sans extraits serviront de contrôle et le bouillon seul servira de contrôle négatif. La concentration minimale pour laquelle aucune croissance n’est observée est considérée comme la concentration inhibitrice de la formation du biofilm (Bakkiyarajet al. ,2012) Figure 23: Une microplaque avec à gauche la catéchine et à droite le Pinus halpensis avant incubation. Lecture des microplaques Après coloration parla méthode au cristal violet et comparaison à l’œil nu des puits colorés, les souches ont été classées en trois catégories selon l’intensité de la coloration qui correspond à leur degré de formation de biofilm: - Non productrice de biofilm DO≤DO témoin 33 Matériel et Méthodes - Modérément productrice de biofilm (0,50 ≤DO < 1) - Fortement productrice de biofilm (DO ≥1) 34 Résultats Résultats 1. Evaluation de potentiel de formation du biofilm Dans un premier temps le potentiel des souches à former les biofilms par la technique au cristal violet à été évalué par la mesure de la DO à 630 nm au spectrophotomètre et les résultats correspondants sont présentés dans la figure 24. 2,5 DO du biofilm 2 1,5 DO 1 0,5 0 pa E.c K.p B.C S.a Souches Figure 24: Biomasse des biofilms de cinq souches de référence On remarque que toutes les souches que nous avons utilisées sont de très bonne formatrice de biofilms (DO > 1). Néanmoins, le potentiel de formation varie légèrement entre les espèces. Nous signalons que S. aureus montrent la plus grande valeur avec une DO égale à 1,67 suivi B. cereus, Pseudomonas aeruginosa, E. coli Klepseilla pneumoniae avec des DO respective de 1,62, 1,43, 1,42 et 1,38. 2. Influence des conditions de culture sur la formation de biofilms Influence du milieu de culture : les résultats montrant l’influence des milieux sur la formation de biofilm sont représenté par la (figure 24) 34 Résultats 2,5 DO du biofilm 2 1,5 TSB 1 BN 0,5 0 pa E.c K.p B.C S.a Souches Figure 25 : Biomasse des biofilms en fonction du milieu de culture La méthode au cristal violet a révélé qu’en bouillon nutritif incubé à 370 C, les cinq souches étaient retrouvées fortement productrices de biofilm en comparaison avec le bouillon TSB, une exception est noté pour B. cereus qui qui a enregistrer la valeur de DO la plus élevé (1,6) sur le milieu TSB Pour chaque expérience, chaque souche a été testée dans 8 puits. Le bouillon nutritif s’étant avéré plus favorable au développement du biofilm que le bouillon TSB, il a été retenu pour le reste de l’expérimentation. Influence de la durée d’incubation Les résultats des essais de l’influence de la durée d’incubation des microplaques sur la formation de biofilm sont représentés par la figure 29 2,5 2 DO du biofilm 1,5 48 h 1 24 h 0,5 0 pa E.c K.p B.C S.a Souches Figure 26 : Biomasse des biofilms après 48h d’incubation 35 Résultats Une augmentation des DO de formation de biofilm est observée pour chaque souche lorsque la durée d’incubation est prolongée. Cependant, selon les seuils choisis, la souche de P. aeruginosa était encore la seule considérée comme fortement productrice de biofilm après 48 heures d’incubation avec une DO de 2, et une très faible valeur remarqué chez Klebseilla pneumoniae avec une DO de 0,2. La suite des expériences a été réalisée avec une incubation de 24 heures, durée d’incubation utilisée par ailleurs dans la majorité des études publiées 4. Détermination de la concentration minimale inhibitrice du biofilm Nous avons déterminé les concentrations minimales inhibitrices des biofilms extraits de plantes de zizyphus vulgaris, micromeria inodora et retama reatam Pinus halepensis et Ammi visnaga. Les résultats obtenus (figure 27 à 31) ont permis de mettre en valeurs l’effet des extraits et des molécules polyphénoliques sur l’inhibition des souches qui ont montré u n potentiel de formation du biofilm élevé. 2,5 DO du biofilm 2 temoin 1,5 20mg 30mg 1 50mg 100mg 0,5 125mg 0 Pa Kp Sa Ec Bc Souches Figure 27: Effet inhibiteur de l'acide tannique sur la formation de biofilm La figure 27 représente L’effet de l’acide tannique sur la formation de biofilm, dans cette figure on remarque que l’acide tannique à la concentration maximales de 125mg/ml inhibe fortement S. aureus (DO=0,24) et K. pneumoniae (DO=0,28) et une faible inhibition est constaté chez P. aeruginosa avec une DO de 0,51. 36 Résultats 2,5 DO du biofilm 2 1,5 temoin 20mg 1 60mg 0,5 0 Pa Kp Sa Bc Souches Figure 28 : Effet inhibiteur de la catéchine sur la formation de biofilm La figure 28 représente L’effet de la catéchine sur la formation de biofilm, dans cette figure on remarque que L’effet inhibiteur le plus important de la catéchine à la concentration maximale de 60 mg/ml est pour la souche de B. cereus et S. aureus avec une DO de 0,53 suivi de K. pneumoniae et P. aeruginosa qui sont moins sensibles à la catéchine avec une DO de 0,71. 2,5 DO du biofilm 2 témoin 1,5 20mg 30mg 1 50mg 100mg 0,5 125mg 0 Pa Kp Sa Ec Souches Figure 29 : Effet inhibiteur de l'acide gallique sur la formation de biofilm La figure 29 représente L’effet de l'acide gallique sur la formation de biofilm, dans cette figure on remarque que L’effet inhibiteur le plus important de l’acide gallique à 37 Résultats la concentration maximale de 125 mg/ml est constaté chez K. pneumoniae (DO=0,23) tandis que la plus faible inhibition est constaté chez S. aureus (DO=0,77). 2,5 2 témoin 40mg 1,5 75mg 80mg 1 120mg 130mg 0,5 175mg 0 Pa Kp Sa Ec Bc Figure 30: L’effet inhibiteur d’extrait de fruit de zizyphus jujuba sur la formation de biofilm La figure 30 représente L’effet de zizyphus jujuba sur la formation de biofilm, dans cette figure on remarque que L’effet inhibiteur le plus important de l’extrait aqueux zizyphus jujuba à la concentration maximale de 175 mg/ml est constaté chez, K. pneumoniae et E.coli (DO=0,19) par contre la plus faible inhibition est constaté chez P. aeruginosa et S. aureus avec une DO de 0,23 et 0,27 respectivement. 2,5 DO du biofilm 2 1,5 témoin 1 60mg 0,5 0 Pa Kp Sa Bc Souches Figure 31 : Effet inhibiteur de l’extrait aqueux d’ombelle séches d’Ammi visnaga sur la formation de biofilm 38 Résultats La figure 30 représente L’effet d’Ammi visnaga sur la formation de biofilm, dans cette figure on remarque que L’effet inhibiteur le plus important d’Ammi visnaga à la concentration maximale de 60 mg/ml et constaté chez S. aureus et B. cereus avec des DO respectives de 0,5 et O,56 et la plus faible inhibition est constaté chez P. aeruginosa avec une DO de 0,97. 2,5 DO du biofilm 2 1,5 témoin 60mg 1 100mg 150mg 0,5 0 Pa Kp Sa Ec Bc Souches Figure 32: Effet inhibiteur de l’extrait aqueux des feuilles de Pinus halpensis sur la formation de biofilm La figure 32 représente L’effet de Pinus halpensis sur la formation de biofilm, dans cette figure on remarque que L’effet inhibiteur le plus de Pinus halpensis à la concentration maximale de 150 mg/ml est constaté chez et K. pneumoniae et B. cereus avec une valeur de DO de 0,4 et la plus faible inhibition est constaté chez E. coli avec une DO de 0,67. On ce qui concerne l’extrait aqueux des feuilles de Micromeria inodora et Retama reatam on ne remarque pas un effet inhibiteur sur le biofilm. On conclusion les résultats obtenus sont nous ont permis de constaté, que les extraits de plante, notamment l’extraits aqueux des fruits de Zizyphus jujuba, des obelles d’Ammi visnaga et les feuilles de Pinus halpensis, présentent un effet inhibiteur important sur la formation de biofilm de même les molécules de polyphénols en particulier l’acide tannique et la catéchine qui inhibe fortement la formation de 39 Résultats biofilm par rapport a l’acide gallique. De ce fait on suggère que l’effet inhibiteur des extraits de plantes est probablement lié à leur richesse en composés phénoliques comme l’acide tannique, gallique et la catéchine. 40 Discussion Discussion D’après les résultats obtenus par les tests réalisés avec les molécules polyphénoliques (flavonoïdes) et selon leurs efficacités vis-à-vis des microorganismes sélectionnés on peut les classer par ordre décroissant : l’acide tannique, la catéchine et ensuite l’acide gallique. Ces dernières ont été testées comme étant des molécules de polyphenols par rapport à l’action des extraits de plantes (Zizyphus jujuba, Micromeria inodora, Pinus halpensis, Ammi vinaga et Retama reatam). D’après certains travaux Daglia, en (2011), l’effet des flavonols et des tannins sur la formation du biofilm est dû à la suppression des facteurs de virulences par réduction des ligands d’adhésion, et par neutralisation des toxines bactériennes. En outre, une synergie de l’effet de ces molécules avec les antibiotiques a été démontrée. Vu le manque de données concernant l’utilisation de ces extraits pour l’inhibition de la formation du biofilm, les résultats de cette étude seront comparés à ceux de la littérature concernant des études réalisées sur des cellules planctoniques. L’effet de l’acide tannique sur la croissance des bactéries pathogènes comme E. coli et S. aureus résistantes à l’oxacilline a été démontré. Cette molécule agit par déstabilisation de la membrane cytoplasmique, inhibition des enzymes extracellulaires microbiennes et par privation des bactéries des substances nécessaires pour leur croissance comme le fer et le zinc (Daglia, 2011). Il a été également démontré que la catéchine est efficaces contre les bactéries gram positives et négatives. Parmi ces molécules, l’épicatéchine, la gallocatéchine et l’épigalloctéchine sont très actives contre les pathogènes alimentaires comme, B. cereus. Elles se sont révélées même plus efficaces que certains antibiotiques (tétracycline, vancomycine) et agissent par endommagement de la membrane bactérienne (Cushnie, 2005). Concernant l’acide gallique et l’acide férulique des travaux ont montré une activité antimicrobienne contre P. aeruginosa et S. aureus et E. coli a des concentrations respectives de l’ordre de 500 μg, 1500 μg, 1750 μg. Leur mécanisme d’action réside dans leur pouvoir de changer les propriétés de la membrane microbiennes comme la charge électronique intra et extracellulaire, la perméabilité ainsi que les propriétés physico-chimique par le changement de l’hydrophobicité (Borges, 2013). En ce qui concerne l’effet des extraits de plantes peu de travaux voir aucun travail scientifique n’est publié sur le pouvoir antimicrobien et antibiofilm des extraits de ces 40 Discussion plantes, Zizyphus jujuba, Microméria inodora, Pinus halpensis, Ammi vinaga et Retama reatam, la majorité des travaux concerne les huiles essentielles ; L’étude phytochimique a révélé la richesse des extraits de cette gamme de plantes en polyphenols (flavonoïdes et tannins), terpénoïdes et alcaloïdes. Selon les résultats obtenus pour Zizyphus jujuba nous avons constaté que l’extrait aqueux et organique présente une meilleure inhibition de la formation du biofilm. D’après les résultats de Ghanmi et al. (2013) les huiles essentielles de P. halepensis, montrent une activité antimicrobienne contre E. coli et S. aureus ainsi qu’une activité antifongique, dû à la présence abondante des terpènoïdes connus par leurs pouvoirs antimicrobiens. De ce fait nos résultats obtenus de l’effet inhibiteur sur le biofilm est probablement liés à la richesse de cette plante on polyphenols et terpénoïdes sont notamment des tannins et des flavonoïdes. Les travaux de Satrani et al. (2013) sur l’action antibactérienne et antifongique d’A. visnaga ont montré son efficacité contre S. aureus et E. coli ainsi que sur des espèces fongiques. En tenant compte de sa composition riche en tannins et terpènes l’effet inhibiteur des extraits d’ombelles sèches est probablement lié à la présence des terpénoïdes. Les résultats obtenus dans ce travail sur l’effet inhibiteur du biofilm peut s’expliqué par la richesse de cette plante en terpénoïdes. Concernant les extraits aqueux des feuilles de: M. inodora et R. reatam, on ne constate pas un effet inhibiteur de biofilm important malgré que ces dernières sont riches en flavonoïdes et alcaloïdes. Ceci est probablement dû à la faible concentration utiliées. 41 Conclusion Conclusion La recherche de substances naturelles douées de pouvoir antimicrobiens ou avec l’activité de prévention contre l’installation d’agents pathogènes est un thème d’actualité dont l’importance est justifiée par l’émergence de la résistance aux agents antimicrobiens, en particulier les antibiotiques. L’organisation en biofilm complique les problèmes de résistance et accroit la virulence des germes. Dans ce travail, un panel de molécules phénoliques pure et des extraits de plantes de zizyphus jujuba, pinus halpensis, micromeria inodora, Ammi visnaga et raetama reatam ont été testées sur la croissance en biofilm de quelques souches de référence qui représentent un ensemble de microorganismes connus par leur pathogénicité au niveau du milieu hospitalier. Cette étude a permis de montrer que l’effet inhibiteur sur la formation du biofilm le plus important est obtenu pour l’acide tannique vis-à-vis de l’ensemble des souches testées par rapport à l’acide gallique et la catéchine. Concernant les extraits de plantes, c’est l’espèce zizyphus qui donne la plus grande inhibition vis à vis de la majorité des souches étudiées par rapport aux extraits Pinus. halpensis et Ammi visnaga. L’ensemble de ces résultats obtenus ne constituent qu’une première étape dans la recherche des substances naturelle d'origine végétale biologiquement active, ce qui nécessite d’autres études qui s’intéressent à l’exploitation des extraits d’autres plantes médicinales en choisissant d’autres méthodes d’extraction et d’autres partie de plantes (feuilles, racines, fleurs) ainsi qu’à l’études de leurs activité antimicrobienne et antifongiques. 40 Références bibliographique A Abdel Halim, O.B.; Abdel Fattah, H.; Halim, A.F.; Murakoshi, I., (1997). Comparative chemical and biological studies of the alkaloidal content of Lygos species and varieties growing in Egypt. Acta Pharm. Hung. 67 (6), 241–247. ALAN, 2014 Ionic Liquids Shown to Combat Bacterial Biofilms Anabela Borges,Carla Ferreira,1Maria J. Saavedra,2and Manuel Simoes 2013 Antibacterial Activity and Mode of Action of Ferulicand Gallic Acids Against Pathogenic Bacteria ANSOLE M., 2009. Etude ethnobotanique, phytocuimique et activités biologiques de quelques lamiaceae du Burkina Faso: cas de Leucas martinicansis (Jacquin) R. Brown, Hoslundia oppossta vahl et Orthosiphon pallidus royle ex benth. Mémoire pour obtenir un diplôme Diplôme d’Etudes Approfondies (D.E.A) en Sciences Biologiques Appliquées, Burkina Faso. Antolovich. M. ; Prenzler P.D.; Patsalides E.; McDonald S.; Robards K., Methods fortesting antioxidant activity. Analyst, 2002 ; 127 :83-198. Appl. Environ. Microbiol., 5208- 5218] B Badr Satrani ; Abdellah Farah ; Mohammed Fechtal ; Mohammed Talbi &Mouna Latifa Bouamrani Composition chimique et activité anti bactérienne et antifongique de l'huile essentielle d'Ammi visnaga (L.) Lam. du Maroc Behlau, I. & Gilmore, M. S. (2008). Microbial biofilms in ophthalmology and infectious diseases. Arch Ophthalmol126, 1572-1581. Beloin, C.; Roux. A. & Ghigo; J. M. (2008). Escherichia coli biofilms. Curr Top Microbiol Immunol322, 249-289. 84 Bendinger B.; Rijnaarts HHM, Altendorrf K et al. (1993) Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain lenght of mycolic acids. Appl. Environ. Microbiol.,59: 3973-3977] Bergmans,D.C., Bonten,M.J., van Tiel,F.H., Gaillard,C.A., van der Geest,S., Wilting ,R.M et al.(1998) Cross-colonisation with Pseudomonas aeruginosa of patients in an intensive care unit. Thorax 53:1053-1058 BRUNETON J., 1999. Pharmacognosie et phytochimie des plantes médicinales. 3ème Ed Tec & Doc. Paris pp 101-120. Bruneton, J., (1999). Pharmacognosie, Phytochimie – Plantes médicinales – 3èmeEd Techniques et documentations. Paris. pp: 227-310-312-313-314.494. 42 Références bibliographique C Characklis WG (1973), Attached microbioal growths-II. Frictional resistance due to microbial slimes. Water Res.7, 1249-1258] Chehma Abdelmadjid, (2006 a). Catalogue des plantes spontanées du Sahara septentrional algérien. Dar Elhouda. Ching P.L.; Jen P.H.; Chung-S W.; Chih Y.H.; Chaw S.M. Comparative ChloroplastGenomics reveals the evolution of Pinaceae Genera and Subfamilies. Genome Biology 2010,504–517. Clutterbuck AL.; Woods EJ.; Knottenbelt D.; Clegg PD.; Cochrane CA.;Percival SL. 2007. Biofilms and their relevance to veterinary medicine. Veterinary Microbiology, 121:1-2, pp 1-17 Costerton JW (2004) A short history of the development of the biofilm concept. Methods of studying biofilms. Ghannoum M & O’Toole GA Editors.Microbial biofilms, ASM Press, 4Costerton JW, Stewart PS et al.(1999) Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, 284: 1318-1322] Costerton JW.; Geesey GG.; Cheng KJ., (1978), How bacteria stick. Cote J.; Caillet S.; Doyon G. ; Sylvain JF.; Lacroix M 2010: Bioactive compounds incranberries and their biological properties Crit Rev Food SciNutr,50:666-679.34. Couture B. (1990). Bactériologie médicale <Etude et méthodes d’identification des bactéries aérobies et facultatives d’intérêt médical<Vigot , paris.15-32 Cuendet M., 1999. Recherche de nouveaux composés capteurs de radicaux libres et antioxydants à partir d’une plante d’Indonésie : « Fagraea blumei » (Loganiaceae) et de trois plantesd’altitude : « Bartsia alpina » (Scrophulariaceae), « Loiseleuria procumbens » (Ericaceae) et Camp, Thèse de doctorat, p 24. D De beer D., JOUBERT E. and GELDERBLOM W.C. (2003). Antioxidant activity of South African red and white cultivar wines: free radical scavenging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(4), 902-9. Denis, F., Ploy, M.-C., Martin, C., Bingen, E. & Quentin, R. (2007a). Enterobacteriaceae, Genre Escherichia coli. In Bactériologie Médicale, Techniques usuelles, pp. 299-304. Edited by E. Masson. 43 Références bibliographique Dhamodharan Bakkiyaraj;Janarthanam Rathna Nandhini; Balakumar Malathy; Shunmugiah Karutha Pandian (2013, The anti-biofilm potential of pomegranate (Punicagranatum L.) extract against human bacterial andfungal pathogens Donlan, R. M. & Costerton, J. W. (2002) Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev15, 167-193. Donlan, R. M. (2008). Biofilms on central venous catheters: is eradication possible? Curr Top Microbiol Immunol E Eddouks M, Ouahidi M.L, Farid O, Moufid A, Khalidi A, Lemhadri A. (2007). L’utilisation des plantes médicinales dans le traitement du diabète au Maroc. Springer Phytothérapie 5: 194–203. El Kouir, D. P (2003). Infections à staphylocoques : aspects cliniques et bactériologiques. EMC, maladies infectieuses, [8-007-A-10]. Elqaj M., Ahami A., Belghyti D., (2007).La phytothérapie comme alternative à la résistance des parasites intestinaux aux antiparasitaires. Journée scientifique "ressources naturelles et antibiotiques". Maroc. Espinasse, F., Page, B. & Cottard-Boulle, B. (2010). Risques infectieux associés aux dispositifs médicaux invasifs. Revue Francophone des Laboratoires426, 51-63. Extremina, C. I., Costa, L., Aguiar, A. I., Peixe, L. & Fonseca, A. P. (2011).Optimization of processing conditions for the quantification of enterococci biofilms using microtitre-plates. J Microbiol Methods 84, 167-173 F Farjon A., 1990 Pinaceae konigstein (Germany): Koeltz Scientific Book,. Fauchere, J. L.(2002). Bacteriologie générale et médicale.Paris: ellipses. Filloux, A. & Vallet, I. (2003). Risques infectieux associés aux dispositifs médicaux invasifs. Med Sci (Paris)19, 77-83. Fletcher M (1988),Attachment of Pseudomonas fluorescens to glass and influence of electrolytes on bacterium- substratum separation distance. J. Bacteriol., 170: 20272030] FriedmanM, HenikaPR, LevinCE, Mandre RE, KozukueN: Antimicrobial activitieso tea Catechin and thea flavins and tea extracts against Bacillus cereus JFoodProt2006, 69:354-361 44 Références bibliographique Fuentefria DB,Ferreira AE,Cocao G. 2011 Antibiotic-resistant Pseudomanas aeruginosa from hospitale wastewater and superficial water. Are they genetically related? J Environ manage; 92:250-5. G gereon.es/plantes/micromeria Ghestema; Seguine; Paris m; Orec chioniam., 2001. Le préparateur en pharmacie. Dossier 2, Botanique-Pharmacognosie-Phytotherapie-homeopathie. Tec et Doc (Ed), p 272. Goller, C., Wang, X., Itoh, Y. & Romeo, T. (2006).The cation-responsive protein NhaR of Escherichia coliactivates pgaABCD transcription, required for production of the biofilm adhesin poly-beta-1,6-N-acetyl-D-glucosamine. J Bacteriol188, 80228032. Gravot A., 2008. Introduction au métabolisme secondaire chez les végétaux. Equipe pédagogique Physiologie Végétale, UMR 118 APBV. Université de Rennes 1 Grayna Z., Dragan T., Gourniak K., Basiura E., (1998). Determination of furanochromones and pyranocoumarins in drugs and Ammi visnaga fruits by combined solid-phase extraction-high-performance liquid chromatographyd thin-layer chromatography-high-performance liquid chromatography. Journal ofChromatgraphy A, 797 (1-2), 305-309. H Heinonen M, 2005: Antioxidant activity andantimicrobial effect of berry phenolicsaFinnish perspective.MolNutrFoodRes2007,51:684691.35 Henrici AT (1933), Studies of Freshwater Bacteria: A Direct Microscopic Technique. J. Bacteriol. 25: 277-286 Lemon KP, Earl AM, Vlamakis HC et al.(2008) Biofilm development with an emphasis on Bacillus subtilis. Curr Top Microbiol Immuno, 322: 1- 16] Hodek P., Trefil P., Stiborova M., (2002), Flavonoids-potent and versatile biologically active compounds interacting with cytochromes P450.Chemico- Biological Interactions,139:1-21. http://www.futura-science.com/fr/news/t/medcine/ 45 Références bibliographique I Irie Y, Parsek MR (2008) Quorum sensing and microbial biofilms. Curr. Top. Microbiol. Immunol.,322: 67- 84] J Jaboni A, Farshad S, Albozi A. (2009). Pseudomonas aeruginosa: Brun infection, Treatment and Antibacterial Resistance.IRCMJ; 11:244-53 Jacobsen, S. M., Stickler, D. J., Mobley, H. L. & Shirtliff, M. E. (2008).Complicated catheter-associated urinary tract infections due toEscherichia coliand Proteus mirabilis. Clin Microbiol Rev21, 26-59. K Kabouches (2010). Etude de la relation du thé vert, maladies cardiovasculaires et stress oxydant. Mémoire de magister de l’université Mentouri de Constantine. Kaplan, J. B. (2010).Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. J Dent Res89, 205-218. Kassem M., Mosharrafa S.A., Saleh N.A.M., Abdel-Wahab S.M., (2000), Two flavonoids from Retama raetam.Fitoterapia,71: 649-654. Kleeman A., Engel J., Kutcher B., Reichert D., (1999). Pharmaceutical Substances, Synthèses, Patents, Applications.AM, 4th ed., Thieme, New York, 1 380 p. Laboratoire Symbiotec ZA Les Pousses 31270 Villeneuve- Tolosane,email:[email protected]. L Le Minor L and Véron M. 1989. Bactériologie médicale, 2éme édition , Flammarion Médecine-Sciences, Paris.2:428-432 Lemon KP, Earl AM, Vlamakis HC, aguilar C, Kolter R. 2008. Biofilm development with an emphasis on Bacillus subtilis. Current Topics in Microbiology and Immunology,322, pp 1-16 Les sites internet: M Maghrani, M., Lemhadri, A., Jouad, H., Michel, J.B., Eddouks, M., (2003). Effect of the desert plant Retama raetamon glycaemia in normal and streptozotocin-induced diabetic rats. J. Ethnopharmacol; 87,21–25. Maghrani, M., Michel, J.B., Eddouks, M., (2005b). Hypoglycemic activity of Retama raetam in rats. Phytother. Res; 19, 125–128 46 Références bibliographique Maghrani, M., Michel, J.B., Eddouks, M., (2005b).Hypoglycemic activity of Retama raetam in rats.Phytother. Res; 19, 125–128. Maghrani, M., Zeggwagh, N.A., Haloui, M., Eddouks, M.(2005a). Acute diuretic effect of aqueous extract of Retama raetamin normal rats. J. Ethnopharmacol; 99, 31– 35. Maria Daglia, 2011 Polyphenolsasantimicrobialagents Martinez LR, Casadevall A. 2007.Cryptococcus neoformans biofilm formation depends on surface support and carbone source and reduces fungal cells susceptibility to heat, cold and UV light. Applied and Environmental Microbiology, 73:14, pp 45924601 Martini A., Katerere D.R., Eloff J.N., (2004) , Seven flavonoïds with antibacterial activity isolated from Combretum erythrophyllum. J. Ethnopharmacol, 93 (2-3): 207 12. Mathilde M., 2002 Larousse Agricole (le monde agricole au XXIe siècle), , p. 480481. MATTIAS R(2010).Lettred’information sur la santésubstances phytobiologiques (phytobiologicals) .5ème partie : l’epigallocatéchine gallate (EGCG). MATTIAS R(2010).Lettred’information sur la santésubstances phytobiologiques (phytobiologicals) .5ème partie : l’epigallocatéchine gallate (EGCG Méité S. Boni-Cissé C. Monemo P. Mlan Tanoa Ap.Faye-Ketté H. Dosso H. (2010). Surveillance microbiologique des surfaces au niveau d’un établissement hospitalier de niveau tertiaire : exemple du chu de yopougon, abidjan , cote d’ivoire . J.sci.pharm. biol., Vol.11, n°1 – 2010, pp.73-81. Mittelman MW (1996) Adhesion to biomaterials. Bacterial Adhesion : molecular and ecological diversity, 89- 127] Mol. Microbio., 48: 97 N nature.jardin.free.fr NIEMETZ R. and GROSS G.G. (2005).Enzymology of gallotannin and ellagitannin biosynthesis. Phytochemistry, 66, 2001-2011. Nowitz T., Bottet J., 2000.Encyclopédie des plantes médicinales : identification, préparation, soins. Edition Larousse. 47 Références bibliographique O Otto, M. (2008).Staphylococcal biofilms. Curr Top Microbiol Immunol322, 207-228. Oosthuizen M. C., B. Steyn, J. Theron, P. Cosette, D. Lindsay, A. von Holy, V. S. Brözel. 2002. Proteomic Analysis Reveals Differential Protein Expression by Bacillus cereus during Biofilm Formation. Applied and environmental microbiology, 68: 2770 Ozenda Paul (1991). Flore et végétation du Sahara. 3 ème édition Paris : CNRS EDITION. P Parsek MR, Greenberg EP. 2005. Sociomicrobiology: the connections between quorum sensing and biofilms. Trends in Microbiology, 13:1, pp 27-33. Patti JM, Allen BL, McGavin MJ et al.(1994) MSCRAMM-mediated adherence of microorganisms to host tissues. Annu. Rev. Microbiol.,48: 585-617] Peeters.E., Nelis, H. J. & Coenye, T.(2008). Compaaison of multiple méthods for quantification of microbial biofilm grown in microtiter plates.J Microbiol Methods 72,157-165. Peng J.S., W. C. Tsai, and C.C. Chou. 2001. Surface characteristics of Bacillus cereusand its adhesion to stainless steel. International journal of food microbiology 65: 105-111 PERONNY S., 2005. La perception gustative et la consommation des tannins chez le maki (Lemur catta). Thèse de doctorat, p 151. Pousset JL., 1989 Plantes médicinales africaines. Edition Ellipses. Q Queck S-Y, Weitere M, Moreno AM et al.(2006) The role of quorum sensing mediated developmental traits in the resistance of Serratia marcescensbiofilms against protozoan grazing. Environ. Microbiol.,8: 1017- 1025] Quezel et Santa ; (1962).Nouvelle flore de l’Algérie. Tome I.p 156-162. R Rozyne, 2013, Activités anti-biofilm des bactéries probiotiques,. S Saadaoui.B et al., (2007). Etude de la composition et du pouvoir antioxydant des composés phénoliques de quelques espèces végétales de l'aride tunisien. Revue des régions arides. pp.316-321[6 page(s) (article)]. Édition. : Institut des régions arides, Médenine, Tunisie. 48 Références bibliographique Sanjary; Chhibber; Deepika Nag† and Shruti Bansal† (2013) Inhibiting biofilm formation by Klebsiella pneumoniae B5055 using an iron antagonizing molecule and a bacteriophage Sauer K.2003.The genomics and proteomics of biofilm formation. Genome Biology, 4:219 Simoes, M.; Simoes, L. C.; Vieira, M. J., A review of current and emergent biofilm control strategies. Lwt-Food Science and Technology 2010, 43 (4), 573-583. Sittig M., (1988). Pharmaceutical Manufacturing Encyclopedia. Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and Carcinogens. Noyes Publications. 2nded., 707 p. Steen G Stahlhut,1 Carsten Struve,1 Karen A Krogfelt,1 and Andreas Reisner2Biofilm formation of Klebsiella pneumoniae on urethral catheters requires either type 1 or type 3 fimbriae T Tenke, P., Kovacs, B., Jackel, M. & Nagy, E. (2006).The role of biofilm infection in urology. World J Urol24, 13-20. Thomas; O.P., 2009.Métabolisme secondaire et Biosynthèse. Master 2 VEM. Univesité Nice Sophia Antipolis. Tomlin KL, Malott RJ et al.(2005) Quorum-sensing mutations affect attachment and stability of Burkholderia cenocepacia biofilms. Trautner, B. W. & Darouiche, R. O. (2004a).Catheter-associated infections: pathogenesis affects prevention. Arch Intern Med164, 842-850. Trautner, B. W. & Darouiche, R. O. (2004b).Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Am J Infect Control V Van Houdt, R. & Michiels, C. W. (2005).Role of bacterial cell surface structures in Escherichia colibiofilm formation. Res Microbiol156, 626-633. Vermerris W., 2006.Phenolic compound biochemistry, Springer, Dordrecht. ISBN-10 1-4020-5163-8 (HB). W Wolfe AJ, Chang DE, Walker JD et al. (2003), Evidence that acetyl phosphate functions as a global signal during biofilm development. 49 Références bibliographique WOLFE K., WU X. and LIU R.H. (2003). Antioxidant activity of apple peels. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 609-614 www.legrainier.com www.phytomania.com www.saharanature.com Z Zhao B , Li X , He R , Cheng S , Wenjuan X (1989).Scavenging effect of extracts of green tea and natural antioxidants on active oxygen radicals. Cell Biophysics Vol 14 zobell CE. 1946. Action of microorganisms on hydrocarbons. Bacteriological Reviews, 10, pp 1-49. 50
