Progrès en Urologie (1996), 6, 907-912 Intérêt clinique de l’étude d’antigènes de prolifération et d’activation cellulaire par cytométrie en flux dans le cancer de la vessie Louis LACOMBE, Johanne GAUTHIER, Louis LAFLEUR, Yves FRADET Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, Québec, Canada RESUME Le but de la présente étude était de déterminer la corrélation entre l’expression de trois antigènes associés au taux prolifératif et le stade et la ploïdie des tumeurs vésicales. La réactivité d’anticorps monoclonaux contre l’antigène nucléaire Ki-67 et les antigènes membranaires T43 et le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) a été testée en cytométrie en flux sur 35 échantillons cliniques de tumeurs vésicales superficielles et infiltrantes et 5 échantillons de cellules urothéliales normales. Nous avons observé une expression préférentielle de T43 sur les tumeurs infiltrantes. EGFR était beaucoup moins fréquemment exprimé mais 7 des 9 tumeurs positives étaient infiltrantes. En comparant l’expression de Ki-67 et T43 pour chaque tumeur analysée on note une corrélation négative en ce sens qu’aucune tumeur n’exprime fortement les deux marqueurs simultanément. Les résultats de cette étude suggèrent que les marqueurs de prolifération et d’activation ne mesurent pas tous les mêmes propriétés des tumeurs. Ensemble, ils pourraient apporter une information pronostique utile pour le suivi clinique des cancers de la vessie. Mots clés : Cytométrie en flux, cancer de la vessie, prolifération, Ki-67, T43, EGFR. Progrès en Urologie (1996), 6, 907-912. Le cancer de la vessie est cinquième en fréquence chez l’homme et un peu moins fréquent chez la femme. Au diagnostic initial, 75% des tumeurs sont de type papillaire superficiel, limitées à la muqueuse ou infiltrant seulement le chorion de la muqueuse vésicale (Ta et T1) [21] Le quart des patients se présenteront d’emblée avec une tumeur plus agressive, infiltrant plus profondément la paroi vésicale (T2). La détermination du pronostic de récidive et de progression des tumeurs vésicales est un problème clinique d’importance. Le taux de récidive, d’environ 50% après résection transurétrale de tumeurs superficielles, oblige à un suivi régulier de ces patients. De plus, le comportement biologique de ces tumeurs demeure incertain. En effet, chez 10 à 15% des patients ayant une tumeur initiale superficiel- le, la maladie progressera avec les récidives vers une tumeur infiltrante. Quant aux tumeurs infiltrantes, leur potentiel métastatique est variable. Malgré la chirurgie radicale, un échec thérapeutique sera observé chez près de 50% des malades, suggérant l’existence de micrométastases au diagnostic. Les données cliniques et pathologiques actuelles ne permettent pas de prédire de façon précise le potentiel biologique des tumeurs vésicales. L’explosion des connaissances sur la biologie des cellules normales et cancéreuses ainsi que le développement de technologies sophistiquées rendent maintenant possible la quantification des propriétés biologiques de tumeurs au niveau moléculaire. Une des caractéristiques fondamentales des cellules néoplasiques est la perte du contrôle de la prolifération cellulaire résultant de l’inactivation de gènes suppresseurs dont l’identification fait l’objet de recherches intenses [12]. P53 est un exemple de ce phénomène et il est reconnu qu’une expression augmentée de la protéine anormale dans les tumeurs de stade T1 est en corrélation avec un risque accru de progression dans la cancer de la vessie [23]. Un taux prolifératif accru peut être en partie responsable du comportement plus agressif d’une tumeur et peut être observé sur l’ensemble des cellules ou plus fréquemment sur une sous-population cellulaire de taille variable à l’intérieur d’une tumeur donnée. L’étude des oncogènes, bien qu’elle n’ait pas encore permis d’identifier de gènes spécifiques au cancer, nous a fait découvrir un grande diversité de régulateurs de la prolifération et de l’activation cellulaire. La technique des hybridomes a permis la production d’anticorps monoclonaux spécifiques pour des molécules nucléaires associées à l’état prolifératif. Ki-67 [1, 7, 9] est un des systèmes antigéniques nucléaires connus à ce jour. Une autre série d’antigènes membranaires a également été identifiée, représentant un ensemble de récepteurs pour des facteurs de croissance connus ou non encore caractérisés, qui sont en partie responsables d’un état d’activation cellulaire plus ou moins important. Parmi ceux-ci on peut reconnaître le récepteur pour le facteur de croissance épidermique (EGFR) [10, Manuscrit reçu : mars 1995, accepté : juillet 1996. Adresse pour correspondance : Dr. Yves Fradet, Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval, L’Hôtel-Dieu de Québec, 11 côte du Palais, Québec, Québec G1R 2J6, Canada. 907 11, 16], et une autre glycoprotéine de membrane de 85,000 de masse moléculaire dont la fonction est inconnue, le T43 (gp85,000) [3, 5], mais dont l’expression a été associée au degré d’activation et de prolifération cellulaire (6). Tableau 1. Caractéristiques des anticorps monoclonaux. Antigènes Ki-67 EGFR Les cellules ont été obtenues par barbotage vigoureux de la vessie vide avec 150 à 200 ml d’une solution isotonique de chlorure de sodium acheminée à travers un cystoscope 21 French. Les échantillons d’irrigation ont été centrifugés et le culot cellulaire lavé 2 fois dans du PBS (1,200 tours par minute pour 10 minutes). Après un décompte cellulaire, les échantillons ont été congelés à 80°C dans un milieu de congélation (MEM, 10% DMSO et 20% sérum de veau fétal). Les biopsies de tumeur ont été dissociées mécaniquement à l’aide d’un bistouri pour obtenir une suspension monocellulaire. Les cellules sont lavées deux fois avec du PBS, remises en suspension et filtrées avec un filtre nylon de 50 µm, puis préparées pour le double marquage. [7] IgG1 Antigène nucléaire présent sur les cellules au repos [16] IgG2A Récepteur du facteur de croissance épidermique [4] T43 Population étudiée Les 5 échantillons de cellules urothéliales normales ont été obtenus en grattant, à l’aide d’un bistouri, l’urothélium de vessies provenant de donneur d’organes cadavériques. Les cellules ainsi détachées ont été lavées, comptées puis congelées ou utilisées fraîches pour l’analyse au cytomètre en flux. Référence membranaires MATERIEL ET METHODES Prélèvements et préparation des échantillons Caractéristiques nucléaire Dans la présente étude, nous avons mesuré par cytométrie en flux l’expression de l’antigène nucléaire Ki67 et des récepteurs membranaires T43 et EGFR sur une série d’échantillons de tumeurs vésicales, superficielles et infiltrantes, et de cellules normales afin de déterminer le potentiel clinique de ces marqueurs. L’étude porte sur 40 échantillons différents de cellules urothéliales; 5 spécimens proviennent de vessies normales et 35 de tumeurs vésicales de type carcinome transitionnel. Les cellules tumorales de 9 des 35 échantillons ont été obtenues par irrigation vésicale alors que les 26 autres proviennent de la dissociation de biopsies de tumeurs. Les stades pour les échantillons tumoraux se distribuent comme suit; 10 stade Ta, 11 stade T1 et 14 stade T2 et plus. La stratification en grade donne 5 grade 1, 16 grade 2 et 14 grade 3. Classe d’anticorps IgG1 Glycoprotéine de 85 Kd exprimée par de rares cellules normales et sur plusieurs types de cancers, mais non sur les tumeurs bénignes correspondantes tion T43 a été décrit précédemment [4, 6]. L’AcM EGFR528 contre le récepteur de l’EGF [16] nous a été donné par le Dr. MENDELSOHN du Memorial Sloan Kettering Cancer Center, N.Y. L’AcM Ki-67 [7] de Dakopatts a été acheté chez Dimension Lab. Double coloration antigène - ADN L’analyse de l’expression antigénique et du contenu en ADN des cellules a été possible grâce à une technique de double marquage et l’utilisation du cytomètre en flux. La technique de double marquage a été décrite pour les marqueurs de surface [6]. En bref, les suspensions monocellulaires sont incubées 1 heure à 4°C avec un premier anticorps spécifique. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois avec du tampon phosphate et incubées 30 minutes à 4°C avec 200 µl d’une solution 1/40 d’anticorps de chèvre anti-souris couplés à la fluorescéine (GAM-FITC). Après perméabilisation par deux lavages dans une solution PBS - 0.5% Tween 20 (Anachemia Inc, Canada), les cellules sont incubées avec 200 µl d’une solution de RNAse A (Sigma Chemical Co.) 100 U/ml pendant 20 minutes à 37 °C. Un volume égal d’une solution 50 mg/ml d’iodure de propidium (PI) (Sigma Chemical Co.) est ensuite ajouté et incubé un minimum de 30 minutes avant toute mesure. Tous les échantillons cellulaires sont filtrés avec un filtre de nylon de 50 µm avant leur analyse au cytomètre en flux. Anticorps monoclonaux Pour l’antigène nucléaire Ki-67, la technique de double marquage utilisée est celle du groupe du Prof. J.C. BENSA du Centre de transfusions sanguines de Grenoble (communication personnelle). Les anticorps monoclonaux utilisés dans cette étude sont décrits dans le Tableau 1. Le marqueur d’activa- Les étapes diffèrent sensiblement de la précédente; ainsi, la suspension cellulaire est incubée simultané908 Figure 1a et 1b. Expression des antigènes Ki-67 et T43 sur des cellules urothéliales normales et tumorales. Les échantillons tumo raux sont subdivisés selon le stade pathologique de la tumeur d’origine. Le stade T2+ réfère aux tumeurs de stade T2, T3 et T4. L’expression de l’antigène Ki-67 est donnée en pourcentage de cellules d’une population exprimant l’antigène. Quant à l’expres sion de T43, elle est fournie selon l’intensité d’expression. Analyse de l’ADN et de l’expression antigénique par cytométrie en flux Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre en flux EPICS V (Coulter Electronics), équipé d’un laser à l’argon. A une longueur d’onde d’excitation de 488 nm, l’émission de la fluorescence verte du FITC (515 nm) et de la fluorescence rouge du PI (610 nm) de chaque cellule est mesurée simultanément. Les données sont accumulées pour un minimum de 2,000 cellules sélectionnées selon leur taille et leur fluorescence pour exclure les doublets et les débris. Les données sont sauvegardées pour analyse subséquente. Figure 2. Corrélation entre l’expression de Ki-67 (% de cel lules positives) et T43 (intensité) sur 40 échantillons de cel lules urothéliale s. Le s données e xactes sotn fournies au Tableau 2. Noter la répartition des échantillons selon quatre phénotypes. Le phénotype «a» représente les échantillons qui sont négatifs ou faiblement positifs pour les deux antigènes; le phénotype «b» une faible expression de T43 et une bonne expression de Ki-67; le phénotype «c» contient les échantillons qui ont une forte expression de T43 mais une faible expression de Ki-67 et enfin le phénotype «d» referme les échantillons qui expriment fortement les deux antigènes. ment dans des volumes égaux (200 µl) d’une solution 1% saponine - 2% sérum de veau nouveau-né (SVNN) dans du PBS et d’anticorps spécifique. Cette préparation permet de perméabiliser et colorer les cellules en une seule étape. Par la suite, les cellules sont lavées dans une solution 2% SVNN- 0.1% saponine dans du PBS. Le reste de la technique est similaire à la méthode décrite ci-haut. Pour une meilleure comparaison des profils de coloration obtenus lors de jours différents, l’instrument a été calibré chaque jour avec des microbilles «full bright» (EPICS Division of Coulter Corporation, Hialeah, Florida). Pour l’analyse de l’ADN, des lymphocytes humains normaux isolés du sang périphérique sur un gradient de Ficoll (Pharmacia) et marqués à l’iodure de propidium dans les mêmes conditions que les échantillons cliniques sont utilisés comme standard diploïde. La ploïdie est déterminée en divisant la valeur du canal au pic moyen de l’échantillon par la valeur des lymphocytes normaux selon la convention internationale [8]. L’analyse de l'intensité de la fluorescence membranaire a déjà été décrite en détail et est illustrée dans les Figures l et 3 de la référence [6]. En résumé, l’intensité de fluorescence est exprimée sous forme de rapport entre la valeur du canal au pic pour les cellules colorées avec l’AcM test et la valeur du canal au pic de cellules colorées avec un surnageant de l’hybridome non sécréteur Sp2/0. Le nombre de cellules positives est obtenu en soustrayant avec un utilitaire du système EPICS la distribution obtenue avec un anticorps test de celle 909 Le pourcentage de cellules exprimant Ki-67 est très faible (< 5%) sur les cellules urothéliales normales alors que ce pourcentage s’élève fréquemment au-dessus de 10% dans les tumeurs de divers stades (Figure 1 a). La différence entre les normaux et les tumeurs est significative (p < 0.05) sauf pour le groupe de tumeurs TA (p = 0.074). Il ne semble toutefois pas y avoir de différence dans le pourcentage de positivité selon le stade des tumeurs analysées. Dans le cas de l’antigène T43, la mesure de l’intensité de fluorescence semble plus informative que l’étude du nombre de cellules positives puisqu’en général dans les échantillons positifs, la réactivité est observée avec l’ensemble des cellules. Pour ce marqueur, l’intensité moyenne de fluorescence s’accroît avec l’augmentation du stade tumoral alors que les cellules normales sont négatives (Figure 1b). La différence d’intensité n’est cependant significative qu’entre les tumeurs de stade T2+ et les normaux (p<0.03). Tableau 2. Comparaison de la réactivité unique ou combinée des anticorps monoclonaux T43 et Ki-67 selon le stade et la ploïdie. Réactivité des anticorps Urothélium normal Ki-67 T43 A-- Tumeurs Ploïdie Superf. Infilt. Dipl. Aneupl. (Ta, T1) (≥ T2) 5* 7 3 10 5 B + - 0 5 2 2 5 C + - 0 2 2 3 1 D + + 0 7 7 5 9 5 21 14 20 20 Total * Nombre d’échantillons. L’analyse multiparamétrique des marquages avec les anticorps T43, EGFR et KI-67 a été faite pour les combinaisons T43-KI-67 et T43-EGFR. Les résultats de la réactivité de chaque échantillon d’urothélium normal ou de tumeur sont illustrés dans la Figure 2 et font ressortir une dichotomie d’expression de T43 et de KI-67. En effet aucune tumeur n’exprime fortement les deux antigènes simultanément et le coefficient de corrélation est nul (C.R.= -0.06). Ceci permet de diviser les échantillons selon 4 phénotypes: phénotype «a», complètement négatifs, «b et c», fortement positifs avec un ou l’autre des 2 marqueurs, et «d», faiblement positifs avec les deux marqueurs. Le résumé de cette distribution, en fonction du stade des tumeurs et de la ploïdie est présenté dans le Tableau 2. On note que la majorité des échantillons diploïdes, de tumeurs ou de tissus normaux est négative avec les deux anticorps alors que la majorité des échantillons aneuploïdes est positive avec Ki-67 et T43. On note également qu’un pourcentage plus élevé des tumeurs de stade avancé réagit avec les deux anticorps. Tableau 3. Comparaison de la réactivité unique ou combinée des anticorps monoclonaux T43 et EGFR selon le stade et la ploïdie. Réactivité des anticorps Urothélium normal EGFR T43 Tumeurs Ploïdie Superf. Infilt. (Ta, T1) (≥ T2) Dipl. Aneupl. A-- 5* 12 4 11 10 B +- 0 0 1 1 0 C- + 0 7 3 5 5 D+ + 0 2 6 3 5 Total 5 21 14 20 20 * Nombre d’échantillons. obtenue en utilisant un surnageant de Sp2/0 comme premier anticorps. La probabilité de différence entre les échantillons de vessie normale et de tumeurs est calculée en comparant la différence des moyennes avec le test t de Student. Le Tableau 3 présente les résultats d’une analyse similaire comparant T43 et EGFR. On observe qu’une seule tumeur n’était positive qu’avec le récepteur de l’EGF. Inversement, 10 tumeurs négatives pour EGFR étaient positives avec l’anticorps T43. Ces tumeurs se retrouvent surtout dans le groupe des tumeurs superficielles représentant 30% de celles-ci. Une telle analyse en fonction du grade ne révèle aucune tendance d’association ou d’exclusion de l’immunomarquage. RESULTATS L’analyse des marqueurs prolifératifs et d’activation a été faite sur 5 échantillons d’urothélium normal et 35 échantillons provenant de tumeurs vésicales superficielles ou infiltrantes. Dans ces études, l’attention s’est portée à la mesure de l’expression de Ki-67 et T43. L’expression de ces deux antigènes ainsi que du récepteur de l’EGF varie beaucoup selon les échantillons cliniques particulièrement lorsque ceux-ci sont stratifiés en normaux ou selon le stade tumoral. DISCUSSION Peu d’études se sont intéressées aux marqueurs prolifératifs dans le cancer de la vessie. Des études immunopathologiques ont montré une corrélation entre un 910 pourcentage élevé de cellules positives avec l’antigène Ki-67 et un stade plus avancé des cancers de la vessie (15,20). L’existence d’anticorps réactifs contre Ki-67 sur coupe en paraffine rend l’évaluation de ce marqueur plus pratique en clinique [14]. Le récepteur de l’EGF a également été étudié et des résultats un peu controversés ont été obtenus [2, 11, 17, 18]. Cependant, quelques études faites avec des méthodes semi-quantitatives immunopathologiques suggèrent qu’une forte expression du récepteur de l’EGF peut prédire la récidive et la progression des tumeurs superficielles [2, 18, 19, 22]. Dans la présente étude, une comparaison de l’expression d’un groupe de marqueurs nucléaires et membranaires sur les cellules urothéliales normales fraîches et sur des tumeurs urothéliales a été faite en utilisant une méthode quantitative précise, la cytométrie en flux. Cette méthode permet non seulement d’évaluer le pourcentage de cellules positives mais également l’intensité moyenne d’expression qui peut être un reflet plus précis de l’état d’activation cellulaire. Cette étude quantitative permet aussi de combiner l’analyse de plusieurs paramètres dont notamment le contenu en ADN des cellules. La mesure de l’expression des marqueurs T43 et KI-67 sur une série d’échantillons cliniques de tumeurs vésicales superficielles et infiltrantes suggère qu’il est possible d’obtenir de ces marqueurs une information pronostique indépendante du stade, du grade et de la ploïdie. Tous les échantillons de tissus normaux ont été négatifs pour les deux marqueurs. Par contre une fraction importante des tumeurs a réagi à des degrés divers avec un ou l’autre des anticorps. La stratification selon le stade démontre une réactivité préférentielle de T43 avec les tumeurs de stade élevé, comme observé précédemment [5, 22]. Le patron de réactivité de Ki-67 n’est pas si simple; dans l’ensemble des tumeurs analysées, on n’a observé aucune corrélation entre le stade et le nombre de cellules de la tumeur exprimant Ki-67. ficielles expriment T43 et sont négatives avec l’EGFR. Il sera intéressant de vérifier s’il existe une corrélation entre le comportement clinique des tumeurs et le phénotype prolifératif mesuré par T43 et EGFR. Les résultats sont également particulièrement intéressants lorsque l’expression de Ki-67 est étudiée en fonction du taux d’expression de T43 pour chaque échantillon clinique analysé (Figure 2). On observe une division presque parfaite des échantillons en quatre groupes: totalement négatifs, faiblement positifs pour les deux marqueurs, nettement positifs seulement pour Ki-67 ou pour T43, mais jamais fortement positifs pour les deux marqueurs. Il semble peu probable que l’anti-corrélation mesurée soit l’effet du hasard, mais il sera cependant essentiel de répéter cette analyse sur un plus grand nombre de tumeurs. Il sera aussi vital de suivre l’évolution des patients selon le type d’expression de leur tumeur. On peut imaginer par exemple que les tumeurs exprimant T43 ont un potentiel métastatique plus élevé et que les tumeurs portant ce marqueur ont déjà des micrométastases. Toutefois, deux études indépendantes suggèrent qu’un autre antigène membranaire, le T138, est un marqueur pronostic plus puissant dans les cancers vésicaux [5, 22]. De même, comme Ki-67 semble associé au degré d’activation des cellules et qu’il est aussi déjà exprimé sur certaines tumeurs superficielles, on peut supposer que ces tumeurs ont un potentiel de récidive plus élevé et une tendance à évoluer vers un phénotype plus malin. Ces marqueurs semblent ainsi différer du TPA qui semble aussi avoir une valeur pronostique mais qui est en premier associé à la taille des tumeurs [13]. Il serait maintenant important de déterminer si ces marqueurs se complètent et permettent ensemble de détecter un plus fort pourcentage de tumeurs à potentiel malin. Remerciements L’addition de la ploïdie à l’analyse des deux marqueurs confirme le résultat précédent. On note qu’une majorité des tumeurs est diploïde dans le groupe négatif pour les deux marqueurs (Tableau 2). La proportion de tumeurs aneuploïdes augmente proportionnellement selon que la tumeur est positive pour Ki-67 seul ou pour les deux marqueurs. Ce résultat suggère que l’expression de Ki-67 ne reflète pas seulement le fait que les cellules tumorales sont en phase proliférative, mais possiblement un paramètre associé au potentiel malin plus élevé de certaines tumeurs. Elle peut également être un reflet de l’instabilité génétique des cancers plus agressifs. Les auteurs remercient Madame Elisabeth Lemay pour son excellent travail de secrétariat. REFERENCES 1. BAISCH H., GERDES J. : Simultaneous staining of exponentially growing versus plateau phase cells with the proliferation-associated antibody Ki-67 and propodium iodide: analysis by flow cytometry. 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The reactivity of antibodies against the nuclear antigen Ki-67 and mem brane antigens T43 and the epidermal growth factor recep tor (EGFR) was studied by flow cytometry on a series of 35 clinical samples of superficial and infiltrating bladder can cer and as well as on 5 specimens of normal urothelial cells. A preferential expression of the T43 antigen was observed on invasive cancer. EGFR was less frequently expressed; however, seven of the nine positive samples were from inva sive cancers. Ki67 on the other hand did not show any selec tive expression according to tumor stage. When comparing Ki-67 and T43 expression on individual tumor samples, a negative corrélation was found in that no tumor strongly expressed both markers simultaneously. These results sug gest that markers of proliferation and activation do not all measure the same tumor parameters. Together, they may provide prognostic information that may be useful in the fol low-up of patients with bladder cancer. 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