Djamel Drider – Ph.D Unité de Recherche Biotechnologie de la Reproduction ONIRIS - Nantes 02 51 78 55 42 ou 02 40 68 76 46 E-mail [email protected] Quimper / 18 Novembre 2010 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » La divercine V41 une bactériocine utilisable dans les domaines de la sécurité alimentaire et de «l’antibiothérapie » Les travaux présentés dans le cadre de cette présentation ont été réalisées au laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de l’ENITIAA de Nantes. Grand Merci à tous les étudiants et collègues avec qui j’ai pu travailler sur ce projet Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Problématique scientifique Recrudescence de la multirésistance bactérienne aux antibiotiques conventionnels Sécurité microbiologique des aliments Multiplication des infections bactériennes - Campylobacter jejuni - Listeria monocytogenes - Salmonella enterica Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Augmentation de l’incidence des infections à bactéries multirésistantes Figure extraite de Quadri et al. Infect Disord Drug Targets. 2007 Sep;7(3):230-237 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Diminution du nombre de nouvelles molécules antibiotiques Figure extraite de Belguesmia-Naghmouchi-Chihib-Drider In Drider and Rebuffat – Springer 2011 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Autorité européenne de sécurité des aliments (European Fodd Safety Authorithy) 250000 En 2008 2006 2007 2008 200000 3500 150000 2006 2007 3000 2008 190566 cas d’infections à Campylobacter 100000 2500 50000 2000 2006 2007 131468 cas d’infections à Salmonella 2008 1500 0 Cam pylobacter Salm onella Listeria 1000 1381 cas d’infections à Listeria 500 0 Campylobacter Campylobacter Salmonella Salmonella Listeria Listeria Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Définition des bactériocines Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont: – - synthétisées par voie ribosomique (RPS) – - secrétées dans le milieu extracellulaire… L’activité bactéricide est dirigée contre des souches taxonomiquement proches de l'organisme producteur mais …. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Principales classes des bactériocines – Classe I / modifications post-traductionnelles – Acides aminés inhabituels (Lanthionines et βmethyllanthionine) – Lantibiotiques (Nisine) / additif alimentaire EC 234 Structure 3D de la nisine (Hsu et al., 2004) Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Principales classes des bactériocines Classe III / Bactériolysines - - PM > 10kDa - - Thermolabiles - - Agissent sur la paroi bactérienne en hydrolysant le peptidoglycane Helvéticine J Lactobacillus helveticus Zoocine A Streptococcus zooepidermicus Entérolysine A Enterococcus faecalis Milléricine B Streptococcus milleri Linocine M18 Brevibacterium linens Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Principales classes des bactériocines Classe II / - - Peptides non lantibiotiques (pas d’acides aminés modifiés) - - PM < 10kDa - - Stables à la chaleur et aux pH extrêmes Classe IIa Pediocin-like - Pédiocine PA-1 - Divercine V41 - Entérocine A Classe IIb Bactériocines à deux composantes - Entérocine L50A/L50B - Lactococcine G - Lactococcine Q Classe IIc Bactériocines circulaires Classe IId - Entérocine AS-48 - Lactoccine A - Carnocycline A - Lactocycline Q Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Structure secondaire des bactériocines de classe IIa N C Feuillet β Hélices α YGNGV Pédiocine box KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC Pédiocine PA-1 Henderson et al., 1992 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Structure 3D des bactériocines de classe IIa -En région N-terminale : Structure en coude β, portant le motif YGNGVxCx4C. C N - En région C-terminale : Hélices α hydrophobes qui interagissent avec la membrane YGNGV Curvacine A Haugen et al., 2005 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Mode d’action des bactériocines de classe IIa Formation de pores Récepteur membranaire Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Modèle de Wedge Agrégation et formation du pore Milieu extracellulaire + + - Milieu intracellulaire Naghmouchi Drider and Fliss I.(2007) J. Applied Microbiology. 102:1508-17. - K+, Acide aminés, phosphate inorganique, ATP Mort cellulaire Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Récepteur membranaire Héchard et al., 2001. Microbiology 147, 1575-80 Drider et al., 2006. Microbiol Mol Biol Rev. 70, 564-82. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Différences entre bactériocines et antibiotiques ! Voie de synthèse Spectre d’action Concentration requise pour l’activité Ingolf Nes in Drider and Rebuffat. (2011) Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Divercine V41 / modèle d’investigation Bactériocine de classe IIa Carnobacterium divergens V41 (bactérie lactique isolée de viscères de poisson) La divercine V41 possède: - une activité anti-Listeria très élevée - deux ponts disulfure importants pour l’activité antibactérienne - des acides aminés essentiels : tyrosine (Y) et tryptophane (W) TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Etude structure fonction C-term hydrophobe N-term hydrophile Pas d’activité anti-Listeria Activité anti-Listeria Clivage par une endoprotéase Asp-N Réduction chimique des ponts disulfures perte de l’activité anti-Listeria Rôle important des acides aminés aromatiques 1 Trp 3 Tyr une perte totale de l’activité Bhugaloo-Vial et al., 1999 (Appl. Environ. Microbiol.) Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Synthèse des variants structuraux de DvnRV41 1 10 20 30 40 DvnRV41 W19F Q21S A22G S23Y V30F L35F A38V P40V AMDPTKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVD F GQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGSASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQGSGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQAYGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTFVGGWLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWFGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGVIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIVGKC Aa / Divercine V41 Aa / bactériocines de classe IIa Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Drider D. (2009) Appl Environ Microbiol.75:1811-1819 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » DvnRV41 et variants structuraux / CMIs (µg/ml) de Peptides Acide aminé Changé L. monocytogenes EGDe DvnRV41 None 0.1 ± 0.01 variant 1 W19F 21.1 ± 0.9 variant 2 Q21S 18.3 ± 0.9 variant 3 A22G 8.6 ± 0.01 variant 4 S23Y 0.1 ± 0.01 variant 5 V30F 1.3 ± 0.4 variant 6 L35F 0.7 ± 0.2 variant 7 A38V 1.5 ± 0.4 variant 8 P40V 2.5 ± 0.9 Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Drider D. (2009) Appl Environ Microbiol.75:1811-1819 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Consommation de saumon Produit de consommation quotidienne ! En France la consommation [20,000,000 kgs/an] (augmentation de la consommation nationale d’un facteur de 6 depuis 1980 Production UE est leader dans le monde [80%] Production Française (40 entreprises / 300,000,000 €) Sources bibliographiques variées et à actualiser Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Contamination des aliments et infection L. monocytogenes 100 bactéries Gramme d’aliment Tirer Production de DvnV41 Risque Infection Listérioses Traitement Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Cb. divergens V41 La microbiologie du saumon Microflore du saumon fumé A la sortie de l’usine / La contamination des produits peut atteindre 102 à 106 UFC/g (Unités formant colonies) Les Bactéries à Gram Négatif Les Bactéries à Gram Positif Sources bibliographiques variées et à actualiser Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Les bactéries à Gram Négatif Après le fumage et au moment du conditionnement Les bactéries à Gram Négatif Photobacterium phosphoreum Shewanella putrefaciens Vibrio spp. Serratia liquefaciens Acetinobacter spp. Hafnia alvi Enterobacter agglomerans Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas spp. Moraxella spp. Aeromonas spp Sources bibliographiques variées et à actualiser Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Impact de la Flore à Gram Négatif Shewanella putrefaciens -Altération des qualités organoleptiques du poisson Poissons frais: Le Cabillaud, Lee Hareng, Le Bar Poissons fumés: Le Saumon -Production de TMA (Triméthylamine) -Production d’H2S et odeurs putrides dans le saumon fumé Photobacterium phosphoreum -Altération des qualités organoleptiques du poisson* Emballé sous atmosphère modifiée et calamar -Production de TMA (Triméthylamine) -Production d’amines biogènes (histamine) Sources bibliographiques variées et à actualiser Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Les Bactéries à Gram Positif Les bactéries lactiques Carnobacterium piscicola Carnobacterium divergens Lactobacillus alimentarius Lactobacillus bavaricus Lactobacillus curvatus Lactobacillus homohiochii Lactobacillus casei subsp. tolerans Lactobacillus coryneformis Lactobacillus farciminis Lactobacillus plantarum Lactobacillus sakei Lactococcus sp. Leuconostoc carnosum Leuconostoc mesenteroides Brochotrix thermosphacta Sources bibliographiques variées et à actualiser Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » La listériose • Maladie à déclaration obligatoire depuis 1998 • 17 décès au Canada (Eté 2008) • Taux de mortalité avoisinant les 30 % chez la femme enceinte • 220 cas sporadiques de listériose recensés par an en France. Informations génériques disponibles en ligne Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Systématique et bactériologie Colonies typiques sur gélose sélective http://en.wikipedia.org/wiki/Listeria_monocytogenes Listeria monocytogenes Bactérie à Gram positif, distribution ubiquitaire Températures de développement 4 à 45°C. Concentrations en NaCl tolérées 10 à 20%. Cette bactérie à des capacités d’adaptation extraordinaires Gandhi M, Chikindas ML. Int J Food Microbiol. 2007 Jan 1;113(1):1-15. Epub 2006 Sep 28. Review. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Relation listériose et consommation de saumon ou de truite fumés Suède 9 personnes touchées dont 2 décès Finlande: 23 cas de listériose ont été recensés en Finlande entre juin 1999 et Février 2000, probablement liés à l’ingestion de poisson fumé ou salé à froid. Normes ! Pas d’accord international sur le niveau acceptable de L. monocytogenes Remarque / En France et dans d’autres pays Européens, la législation tolère jusqu’à 100 UFC/g dans le saumon fumé à la DLC à condition que les entreprises ait effectué des études vieillissement de leurs produits prouvant que le seuil de 100 UFC/g n’est jamais dépassé à la DLC. (AFSSA, 2000; DGAL N98/N°8088, 1998). Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » log 10 (UFC/ g saumon) Inhibition de L. monocytogenes dans le saumon fumé 1 UFC/g 6 5 4 3 2 1 L. monocytogenes Cb. divergens V41 0 0 7 14 Temps (jours) (BRILLET et al, 2004. JAM. 97: 1029-1037) 21 28 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Origine de cette inhibition ? Action inhibitrice de DvnV41 (in situ)? Compétition nutritionnelle entre L. monocytogenes et Cb. divergens V41 ? Isolement et caractérisation d’une souche mutante déficiente dans la production de la divercine V41 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Antagonisme microbien par production de peptide Test de diffusion sur boite Souche cible = Listeria monocytogenes 1 Souche 1 Cb. divergens NCDO2763 (contrôle) 2 Souche 2 Cb. divergens V41 (souche sauvage) 3 Souche 3 Cb. divergens V41C9 (souche mutante) Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003 Lett Appl Microbiol. 36:288-292. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 2,5 DO 405 nm 2 1,5 1 0,5 0 1 Souche 1 Cb. divergens NCDO2763 (contrôle) 2 Souche 2 Cb. divergens V41 (souche sauvage) 3 Souche 3 Cb. divergens V41C9 (souche mutante) Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003 Lett Appl Microbiol. 36:288-292. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Approche moléculaire (Amplification et séquençage du gène dvnV41 1 2 3 400 pb 300 pb 200 pb Souche 1 Cb. divergens NCDO2763 (contrôle) Souche 2 Cb. divergens V41 (souche sauvage) Souche 3 Cb. divergens V41C9 (souche mutante) Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003 Lett Appl Microbiol. 36:288-292. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » L. monocytogenes 9 9 L. 8monocytogenes + C.b divergens V41C9 8 log (UFC/g salmon) 7 6 5 4 3 6 5 4 3 2 2 1 1 0 Souche mutante 0 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 Time (days) 20 25 30 35 Time (days) 9 L. monocytogenes + Cb. divergens V41 8 7 log (UFC/g salmon) Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003 Lett Appl Microbiol. 36:288-292. log (UFC/g salmon) 7 6 5 Souche sauvage 4 3 2 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » 1 0 0 5 10 15 20 Time (days) 25 30 35 Suivi de l’implantation de C. divergens V41, parmi la flore lactique du saumon fumé inoculé, par la technique de PCR-Multiplex Sur colonies de la flore lactique 100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 C. divergens V41 autres Carnobacterium ssp J0 J13 J20 J27 Connil N, Prévost H, Dousset X. 2002. J Appl Microbiol.92:611-617. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Activité In-vivo de la divercine recombinante Expériences sur les animaux (souris, Balb/c) ont été réalisées dans le respect des principes éthiques fondamentaux. Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Stratégie expérimentale sur modèle murin « in vivo » Utilisation DvnRV41 et peptides altérés (W19, Q21, A22, P40) Protocole expérimental (Ingham et al. 2003; modifié) Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Groupes 1 à 5 / (Post challenge test) T= 0: Injection iv. de L. monocytogenes EGDe 1,5 x 103 UFC/ml T= 30 min : Injection iv de peptides (2 µg/50 µl) Peptides injectés (DvnRV41; W19F; Q21S, A22G, P40V) Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Groupes 6 – 10 / (Pré challenge test) T= - 15 min: Injection iv de peptides (2 µg/50 µl) T= 0 min : Injection iv de L. monocytogenes 1,5 x 103 UFC/ml Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » OBSERVATION des souris pendant 72 heures - Diarrhée - Vomissement - Dépression Euthanasie par dislocation cervicale - Extraction organe (rate) - Isolement et dénombrement de L. monocytogenes Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Résultats Groupes 1-5 / (Post- challenge test) Groupe Peptide Nombre de souris infectées EGDe introduite Quantité de peptide µg /temps (min) Nombre des souris avec la culture négative / totale ; exprimé en (%) Quantité de L. monocytogenes nombre UFC (Log10)/rate) 1 DvnRV41 5 1.5 x 103 2 / (30) 4/5 (80) 0.97±2.17 2 W19F 5 1.5 x 103 2 / (30) 1/5 (20) 4.41 ± 2.46 3 Q21S 5 1.5 x 103 2 / (30) 2/5 (40) 3.10 ± 2.93 4 A22G 5 1.5 x 103 2 / (30) 2/5 (40) 3.14 ± 2.93 5 P40V 5 1.5 x 103 2 / (30) 1/5 (20) 3.23 ±1.88 11 NC 5 1.5 x 103 0/5 (0) 6.25 ± 0.19 NC = contrôle négatif Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Résultats Groupes 6-10 / (Pré challenge test) Groupe Peptide Nombre de souris infectée s Quantité de L. monocytogenes EGDe introduite Quantité de peptide µg /temps (min) Nombre des souris avec la culture négative / totale ; exprimé en (%) nombre CFU (Log10)/rate) 6 DvnR V41 5 1.5 x 103 2/ (15) 2/5 (40) 3.13 ±2.86 7 W19F 5 1.5 x 103 2 / (15) 1/5 (20) 3.92 ± 2.32 8 Q21S 5 1.5 x 103 2 / (15) 2/5 (40) 2.83 ± 2.75 9 A22G 5 1.5 x 103 2 / (15) 1/5 (20) 4.43 ± 2.50 10 P40V 5 1.5 x 103 2/ (15) 1/5 (20) 4.25 ±2.38 11 CN 5 1.5 x 103 0/5 (0) 6.25 ± 0.19 CN = contrôle négatif Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564. Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun » Publicité et bonnes œuvres Société Française des Peptides Antimicrobiens [email protected] ou [email protected] Third International Symposium on Food, Veterinary and Medical Applications (Lille 2012) [email protected] ou [email protected] Procaryotic antimicrobial peptides: from genes to biotechnologies. Edited by D. Drider and S. Rebuffat. (Springer, NY-USA. 2011) Cofinancé avec l’appui de l’Union européenne FEDER Programme Espace Atlantique « Investir dans notre futur commun »