expression de fragments scfv anti-cytokine par des vitroplants de

P. EHSANI1, A. MEUNIER2, F. NATO2, I. OLD2, A. JAFARI1, S.
DARTEVELLE2, J.-C. MAZIE2, G. DUCREUX3, P. LAFAYE2, A. NATO3
EXPRESSION DE FRAGMENTS SCFV
ANTI-CYTOKINE PAR DES
VITROPLANTS DE NICOTIANA
TABACUM CV XANTHI
1
Molecular Biology Unit, Institut Pasteur, Avenue Pasteur, 13164 Téhéran (Iran)
2
Laboratoire Ingénierie des Anticorps, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724
Paris Cedex 15 (France)
3
Laboratoire Morphogenèse Végétale Expérimentale, Bât. 360, Université Paris XI, 91405
Orsay Cedex (France)
Le groupe de travail
Objectif du projet
Produire des fragments d’anticorps de type scFv anticytokine humaine (IL-4 ou IL-6) chez Nicotiana tabacum cv
Xanthi
 Elaborer un test ELISA permettant de déterminer la
concentration en cytokines des fluides corporels pour le
diagnostic de nombreuses pathologies humaines (réaction
inflammatoire, allergies…).
Structure générale d’une immunoglobuline
CDR
VH
Fv
CH1
Fab
VL
S-S
S-S
CL
CH2
Fc
CH3
Structure des fragments d’anticorps
Papaïne
Pepsine Génie génétique
Pourquoi un végétal comme bioréacteur ?
Les plantes transgéniques constituent un système alternatif à
la production de protéines eucaryotes et notamment
d’anticorps grâce :
 au faible coût de production de la biomasse
végétale,
 à l’absence de risque de contamination par des
pathogènes humains,
 à une plus grande conformité de la protéine
recombinée avec la protéine naturelle,
 à l ’existence d’infrastructures de récolte, de
stockage et d’extraction.
Quelle construction génétique a été réalisée ?
LB
R
P
scFv
C-myc tag T RB
RB : Extrémité droite
droite ;
VL ; RB : Extrémité
VH
LB : Extrémité gauche
RB : Extrémité droite
R : Gène sélectif de résistance (nptII)
P : Promoteur (CaMV 35S)
scFv : Fragment variable simple chaîne
c-myc-tag : peptide tag
T : Terminateur (3 ’ocs)
La transformation végétale
Régénération d’une plantule entière
Plantule
Début d’organogenèse
de
tabac transformée
sur des
disques
partirend’un
foliaires
disque
defoliaire,
tabac, 48
Disques
foliaires
de àtabac
pré-culture
semaines
semaines après
après la
la transformation
transformation par
par Agrobacterium
Agrobacterium
Résultats (1)
Plantule non
transformée
Plantes IL-4
(5 clones)
Plantes IL-6
(5 clones)
µg de protéines
solubles totales/g de
Matière Fraîche
Pourcentage de protéines solubles
totales par comparaison avec la
plantule non transformée
3800
100%
2080
55%
Dégradation des protéines et accélération de la sénescence
1970
52%
foliaire.
Quantification des protéines solubles totales de vitroplants de
Nicotiana
tabacum âgésphysiologiques
de 45 jours. des vitroplants
Caractéristiques
Tabac
Expression
sur les
Vitroplantd’un processus de floraison hâtive
transgénique
vitroplants
3
de tabacet plantes acclimatées en serres (En
aprèsserres,
3
semaines
au lieu de 8, pour la plante non transformée).
transformé
semaines en
serres
IL-6 Témoin IL-4
Résultats (2)
Fragments scFv
anti-cytokine
Nombre de disques foliaires de Nombre de plantules de
Nombre de plantules de
tabac transformés par
tabac transformées
tabac produisant le fragment
Agrobacterium tumefaciens
régénérées
scFv anti-cytokine
129
68
8%
122
131
76%
Faible proportion de plantules produisant le scFv anti-IL-4 en
comparaison
des anti-IL-6.
Anti-IL-4
Anti-IL-6
Présence d’une double bande aux environs de 30 kDa, taille
Tableau récapitulatif des résultats obtenus pour l’expression
correspondant à celle attendue du scFv anti-cytokine.
des fragments scFv anti-cytokine chez Nicotiana tabacum.
kDa PMPM 1 T 2 F3
kDa
R4
F5
6R
7F 8 R T
50
47,5
Caractéristiques
biochimiques des vitroplants
35
Accumulation beaucoup plus importante des fragments
32,529
d’anticorps de type scFv anti IL-6 dans les racines que dans
25
les feuilles.
21
16,5
6,5
Immuno-transfert d’extraits protéiques foliaires (F) et
Immuno-transfert
protéiques(3declones
tabacsanti
transformés
racinaires (R) de d’extraits
tabacs transformés
IL-6) et
(IL-6 : 1, 2, 3 ,4 ; IL-4
: 5, 6, 7, 8) et(T).
non transformés (T).
non transformés
Discussion et perspectives (1)
10 fois moins de plantules IL-4 que d’IL-6 avec des
différences
morphologiques
importantes
(fragilité,
jaunissement des feuilles...).
 Hypothèse : les scFv interfèrent sur le métabolisme
général de la plante.
Tests ELISA :
 Conformation correcte des scFv anti IL-4 et anti IL-6.
Estimation quantitative, par Western Blot :
 Les scFv représentent environ 1% des Protéines Solubles
Totales ce qui correspond aux résultats (entre 1 à 2% des
PST) obtenus par de nombreuses équipes (Conrad et Fiedler,
1998 ; Ma et al., 1995...).
Discussion et perspectives (2)
Immuno-transferts :
 L’accumulation au niveau des racines laisse présager un
pourcentage d ’expression supérieur à ceux déjà observés.
Travaux en cours :
purification par chromatographie d’affinité des scFv
anti-cytokine, présents dans les extraits végétaux,

réalisation d’une nouvelle construction génétique
avec la séquence KDEL (Conrad et Fiedler, 1998),

transformation d’autres espèces végétales : la
pomme de terre, Solanum tuberosum et l ’aubergine,
Solanum melongena.
