L`évolution du pouvoir pathogène de la bactérie

Institut Supérieur d’Agriculture
48 Boulevard Vauban
59046 Lille Cedex
Institut National de Recherche Agronomique
Unité de Pathologie Végétale – BP 94
Domaine Saint Maurice
84143 Montfavet Cedex
L’évolution du pouvoir pathogène de la bactérie
Pseudomonas syringae en présence de microalgues
Rapport de Stage Assistant Ingénieur
DEBREYNE Valentin
4ème année
Promotion 45
Novembre 2010
L’évolution du pouvoir pathogène de la bactérie Pseudomonas syringae en présence de
microalgues by DEBREYNE Valentin est mis à disposition selon les termes de la licence
Creative Commons Paternité - Pas d'Utilisation Commerciale - Pas de Modification 2.0 France.
RÉSUMÉ
Résumé :
Située au cœur du bassin français le plus productif de melons, l’équipe de
bactériologie de l’INRA d’Avignon a découvert, que le cycle de vie de Pseudomonas
syringae, bactérie responsable d’une sévère bactériose sur cette plante, se déroulait aussi en
dehors des agro-systèmes. Ces études ont montré que les populations de P. syringae se
retrouvent tout au long du cycle de l’eau douce, y compris dans les biofilms se développant
dans les cours d’eau. Or, les microalgues dont certaines sont relativement proches des plantes,
sont l’une des composantes majoritaires de ces biofilms : P. syringae étant une bactérie
phytopathogène au large spectre d’hôte, il pourrait exister des interactions entre les deux types
de microorganismes, bactéries/microalgues. Ces interactions pourraient jouer un rôle dans
l’épidémiologie des maladies causées par cette bactérie.
Mais y a t-il réellement des interactions entre P. syringae et certaines microalgues au
sein des biofilms ? Si c’est le cas, les caractères pathogènes de ces bactéries jouent-ils un rôle
dans ces interactions ?
La présente étude a eu pour but d’apporter une première réponse à ces interrogations
en postulant que, si les interactions existent, elles se traduiront par une modification de la
croissance microbienne en présence du partenaire d’interaction. Pour cela, un protocole a été
mis en place afin de suivre puis de comparer les évolutions des populations de bactéries et de
microalgues au sein de culture pure et de co-culture : les populations microbiennes sont
dénombrées au début puis à la fin de la culture grâce à la technique de suspension-dilutionétalement pour les bactéries et, grâce à un compteur de cellules pour les microalgues. Ce
protocole a ensuite été testé sur une trentaine de souches de P. syringae et sur la souche
modèle 137 de Chlamydomonas reinhardtii. Un accroissement des populations bactériennes
plus important au sein des co-cultures qu’au sein des cultures pures a été observé.
Inversement, au contact des bactéries, les populations de microalgues n’ont pas atteint les
niveaux des cultures pures. Pour finir, les caractères pathogènes étudiés ne semblent pas jouer
un rôle dans ces interactions.
Mots clés : Pseudomonas syringae, biofilm, microalgue, Chlamydomonas reinhardtii,
interaction, phytopathogène.
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REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier tout particulièrement Odile Berge qui m’a consacré beaucoup de
temps durant ce stage et avec qui j’ai énormément appris tant d’un point de vue technique que
d’un point de vue humain.
Je remercie également Catherine Glaux ainsi que Caroline Monteil pour leur
disponibilité ainsi que pour toutes les explications qu’elles m’ont fournies sur leur travail.
Merci également à Caroline Guilbaud pour l’aide qu’elle m’a apportée tant au niveau
de la préparation du matériel que du nettoyage de celui-ci.
De manière plus générale, merci à toute l’équipe de pathologie végétale pour leur
accueil, leur gentillesse et leur disponibilité qui ont permis de rendre ce stage aussi bien
intéressant qu’enrichissant.
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SOMMAIRE
INTRODUCTION..................................................................................................................................1
LE CADRE DE L’ETUDE ................................................................................................................................ 2
1.
a)
b)
c)
2.
3.
4.
L’INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA)............................................................... 2
Historique.................................................................................................................................................................................................2
Missions actuellement menées................................................................................................................ 2
Quelques chiffres .................................................................................................................................... 3
LE CENTRE INRA D’AVIGNON ..................................................................................................................... 3
L’UNITE DE PATHOLOGIE VEGETALE ............................................................................................................ 4
L’EQUIPE DE BACTERIOLOGIE ....................................................................................................................... 4
LE CONTEXTE ET LA PROBLEMATIQUE................................................................................................ 5
1.
2.
3.
PSEUDOMONAS SYRINGAE : UNE BACTERIE PHYTOPATHOGENE .................................................................. 6
PSEUDOMONAS SYRINGAE : UNE BACTERIE DE L’ENVIRONNEMENT ........................................................... 7
LES INTERACTIONS DANS LES BIOFILMS ....................................................................................................... 8
MATERIELS ET METHODES ....................................................................................................................... 10
1.
CHOIX DES SOUCHES ..................................................................................................................................... 10
Les souches bactériennes ........................................................................................................................ 10
La souche de microalgue ........................................................................................................................ 11
2.
LA CULTURE ET LE DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES .................................................................. 11
a)
Milieux de culture.................................................................................................................................... 11
b)
Dénombrements « classiques » des microorganismes .......................................................................... 12
c)
Dénombrement des microorganismes au compteur de cellules............................................................ 13
3.
DETERMINATION DU PROTOCOLE DE CO-CULTURE BACTERIES / MICROALGUES ........................................ 14
a)
Détermination des paramètres de croissance ........................................................................................................................................14
b)
Protocole du test de co-culture............................................................................................................... 15
c)
Plan d’expérience 16
4.
TRAITEMENT DES DONNEES .....................................................................................................................16
a)
b)
PRESENTATION ET ANALYSE DES RESULTATS................................................................................... 17
1.
MISE AU POINT D’UN PROTOCOLE D’UTILISATION DU COMPTEUR DE CELLULES ........................................ 17
Le dénombrement des microalgues ........................................................................................................ 17
Le dénombrement des bactéries.............................................................................................................. 18
Protocole retenu ...................................................................................................................................... 18
2.
L’INFLUENCE DES BACTERIES SUR LES POPULATIONS D’ALGUES ................................................................ 20
a)
Au niveau du nombre de microalgues ..............................................................................................................................20
b)
Au niveau du diamètre des microalgues...........................................................................................................................................21
3.
L’INFLUENCE DES MICROALGUES SUR LE NIVEAU DES POPULATIONS BACTERIENNES .............................. 22
4.
COMPARAISON DES SOUCHES BACTERIENNES.............................................................................................. 25
a)
Homogénéité des manipulations ........................................................................................................................................................................25
b)
Variations de la vitesse de croissance des bactéries.......................................................................... 26
a)
b)
c)
DISCUSSION ..................................................................................................................................................... 36
CONCLUSION ET PERSPECTIVES.............................................................................................................. 38
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ......................................................................................................... 39
GLOSSAIRE ...................................................................................................................................................... 41
LISTE DES ANNEXES ..................................................................................................................................... 42
TABLE DES FIGURES..................................................................................................................................... 47
TABLE DES TABLEAUX ................................................................................................................................ 48
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INTRODUCTION
En agriculture, les pertes de récolte dues aux ravageurs ont toujours été importantes :
globalement en 2009, l’organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture
(FAO) les estime à plus de cinquante pour cent de la production agricole potentielle. Toujours
selon ce même organisme, les insectes nuisibles seraient responsables de la destruction de
quinze pour cent des cultures, les agents pathogènes et les adventices de treize pour cent
chacun, et les infestations après récolte de dix pour cent.
Causant ainsi près du quart des pertes, les agents pathogènes (virus, champignons et
bactéries) ont été fortement étudiés afin de contrôler voir d’éviter certaines épidémies. Jusqu’à
très récemment, les études portant sur ces agents pathogènes ont été le plus souvent focalisées
sur un contexte agricole alors qu’en ce qui concerne les pathogènes humains, les biologistes
ont depuis longtemps reconnu que certains agents pouvaient vivre et prospérer dans des
habitats non hôtes. Ces « pathogènes environnementaux » évoluent et se diversifient dans des
milieux très divers indépendamment de leurs activités de pathogènes chez l’homme. Ceci a
conduit à des pratiques telles que l’assainissement des eaux, la surveillance des populations
d’animaux sauvages ou le nettoyage des systèmes de ventilation… Ce n’est que depuis
quelques années qu’il a été montré que des agents phytopathogènes peuvent aussi résider et
donc évoluer dans des niches écologiques en dehors de l’agriculture.
Pseudomonas syringae, une bactérie phytopathogène, représente bien cette situation.
En effet, elle a été très étudiée en agriculture puisqu’elle cause des maladies sur une grande
gamme de plantes : des arbres fruitiers (le chancre du marronnier ou du cerisier), des plantes
maraîchères (tomate, concombre, haricot, melon…) et également des cultures de céréales. Les
études concernant la biologie, l’écologie et la génétique de cette bactérie sont donc
nombreuses mais pour la plupart en relation avec les plantes cultivées malades alors que
Pseudomonas syringae est présente dans des habitats divers : le sol, l’air, les eaux douces et
même dans les nuages.
Cette bactérie se retrouve donc dans de nombreux habitats naturels du cycle de l’eau
et, en particulier, dans les biofilms de rivière. Un biofilm est une communauté de
microorganismes qui se développe à la surface d’un solide dans une matrice. Ces biofilms
sont le lieu d’importantes interactions entre les différents organismes présents et, notamment
entre Pseudomonas syringae et des microorganismes qui se retrouvent très fréquemment dans
les biofilms de rivière : les microalgues.
Mais y a-t-il réellement des interactions entre les bactéries Pseudomonas syringae et
certaines microalgues au sein des biofilms ? Et si c’est le cas, les caractères pathogènes de ces
bactéries jouent-ils un rôle dans ces interactions ?
Pour répondre à ces interrogations, nous verrons tout d’abord le lieu où s’est déroulée
cette étude. Puis, nous expliciterons clairement la problématique et le contexte dans lequel ce
travail a été initié. Nous passerons ensuite à une présentation du matériel et des méthodes
utilisés avant d’exposer les résultats obtenus ainsi que leur analyse. Dans un dernier temps,
nous verrons comment ces résultats peuvent être utilisés dans un cadre plus large que celui de
l’étude.
Source : www.paca.inra.fr
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LE CADRE DE L’ETUDE
1. L’Institut National de Recherche Agronomique (INRA)
a) Historique
Créé en 1946, dans le contexte de pénurie alimentaire de l’après-guerre, l’INRA avait
pour mission initiale de favoriser l’essor de l’agriculture française afin que notre pays
devienne autosuffisant d’un point de vue alimentaire. Pour cela,
l’INRA a participé à la révolution agricole française : en
mettant la science et la technologie au service de l’agriculture,
l’Institut National de Recherche Agronomique a permis, parmi
d’autres organismes de recherche, d’améliorer les techniques de
production ainsi que la sélection animale et végétale. Ceci a
aboutit à une hausse de la productivité : la France est devenue
Source : www.INRA.fr
autosuffisante à la fin des années 1960.
Dans les années 70, notre pays devient excédentaire et va donc exporter des produits
issus de l’agriculture y compris des aliments. Les recherches de l’INRA vont donc s’élargir à
la transformation des matières premières agricoles en aliments. Celles-ci vont aboutir à
l’élaboration de différents procédés agroalimentaires comme l’ultrafiltration du lait par
exemple. Grâce à ces recherches, la France deviendra le premier pays exportateur de produits
agroalimentaires.
Les années 1980-1990 voient émerger de nouvelles demandes. On passe d’un système
où l’on veut produire en quantité à un système où l’on veut des produits de qualité. Dans cette
perspective, la santé humaine entre au cœur des enjeux : les problématiques de recherche
concernent désormais l’alimentation et non plus uniquement les aliments eux-mêmes.
L’INRA participe alors à la recherche sur des variétés adaptées aux demandes des
consommateurs mais aussi à des techniques de lutte contre
certaines contaminations microbiennes. De plus, avec le
développement du mouvement écologiste, l’environnement
devient un nouvel enjeu : on veut continuer à produire mais en
préservant l’environnement c’est-à-dire en ayant le minimum
d’impacts sur celui-ci. C’est pourquoi des problématiques de
recherche environnementales voient le jour dans ces années là.
Source : www.INRA.fr
Durant les années 2000, l’INRA développe des
recherches interdisciplinaires qui permettent d’intégrer des critères de durabilité. Les enjeux
sont de produire une alimentation saine et équilibrée tout en préservant l’environnement.
Mais quelles sont les missions actuelles de l’Institut National de Recherche
Agronomique ?
b) Missions actuellement menées
Certaines missions menées actuellement par l’INRA restent les mêmes que lors de sa
création au lendemain de la seconde guerre mondiale, d’autres ont émergé plus récemment.
En tant qu’établissement de recherche public, la mission principale de l’INRA est de
produire et diffuser des connaissances scientifiques. Dans cette perspective, l’institut doit
innover et proposer de nouveaux savoir-faire afin de répondre à de nouvelles problématiques
sociétales concernant l’agriculture, l’environnement, l’agroalimentaire et le développement
durable.
L’INRA tente actuellement de répondre à cinq questions majeures :
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-
la sécurité alimentaire mondiale : mettre fin aux problèmes de crises
alimentaires
- la sûreté sanitaire des aliments : produire des aliments sains pour l’homme
- la localisation des activités agricoles face à la mobilité économique
- la gestion des ressources naturelles et la préservation de l’environnement
- les projets et les modèles de développement économique et social.
Pour cela, l’institut souhaite continuer à participer à l’évolution et au renforcement du
dispositif de recherche français et européen qui permet d’harmoniser la recherche entre les
différents pays.
c) Quelques chiffres
La stratégie menée au fil des années par l’INRA lui a permis d’aboutir à des résultats
concrets :
En 2009, l’Institut National de Recherche Agronomique (INRA) est :
• 1er institut de recherche européen dans les domaines de l’agriculture, de l’alimentation
et de l’environnement
• 2ème institut mondial pour ses publications scientifiques en sciences agricoles, sciences
des plantes et de l’animal
• 2ème institut de recherche publique française
Parallèlement aux missions menées depuis sa création, l’INRA s’est développé dans
toute la France. On compte aujourd’hui 21 centres régionaux et plus de 150 sites répartis en
France métropolitaine et outre-mer. Ce développement a permis à chaque centre de se
préoccuper de problématiques régionales, donc d’être au cœur des enjeux et au plus près des
personnes concernées par les recherches. Par exemple, l’un des axes de recherche de l’INRA
Bordeaux concerne la vigne et le vin, l’INRA Nancy se préoccupe des forêts, l’INRA
Avignon axe ses recherches sur le maraîchage…
C’est d’ailleurs dans ce dernier centre, au cœur de la région Provence-Alpes Côte
d’Azur, que l’étude qui sera décrite dans la suite de ce rapport a été effectuée.
2. Le centre INRA d’Avignon
Fondé en 1953, ce centre compte actuellement 580 agents permanents et 400 agents
temporaires par an (dont 100 doctorants) répartis en 27 unités. Les moyens financiers
s’élèvent à 35 millions d’euros salaires compris.
Les recherches du centre d’Avignon s’effectuent au sein de trois pôles :
- la production horticole intégrée
- l’adaptation aux changements climatiques
- la santé des plantes.
C’est sur cette dernière thématique que nous nous intéresserons plus particulièrement
dans ce rapport, les recherches ayant été faites au sein de l’unité de pathologie végétale.
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3. L’unité de pathologie végétale
L’unité de recherche de pathologie végétale (UR 407) est implantée dans le domaine
de Saint-Maurice à Montfavet (en bordure d’Avignon). Elle comprend 42 agents permanents
organisés en trois équipes de recherche : bactériologie, mycologie et virologie.
Tout comme le centre INRA d’Avignon, l’unité a développé ses compétences autour
des principales productions de la région puisqu’elle s’intéresse aux maladies des cultures
maraîchères méditerranéennes. Le principal objectif de cette unité est de développer des
méthodes de luttes raisonnées et efficaces dans un contexte de production agronomique
durable et de qualité. Les méthodes de lutte préventives définies par l’unité s’appuient sur :
- un diagnostic rapide, simple et fiable
- la gestion durable des résistances variétales
- l’utilisation d’agents de lutte biologique
- la prévision des maladies par la compréhension de la biologie et l’évolution des
pathogènes ainsi que de l’épidémiologie des maladies.
C’est principalement sur cette dernière thématique que travaille l’une des trois équipes
de l’unité : l’équipe de bactériologie dans laquelle des recherches permettant de répondre à la
problématique de ce rapport ont été effectuées.
4. L’équipe de bactériologie
Après de sévères épidémies bactériennes sur le melon, un groupe de travail national
est créé en 1997. L’équipe de bactériologie de l’INRA d’Avignon en fait partie, elle va
s’intéresser à cette maladie et identifier Pseudomonas syringae comme l’agent responsable de
la bactériose. Depuis, l’équipe étudie exclusivement cette bactérie : elle propose un cycle de
vie de ce microorganisme phytopathogène en interaction avec le cycle de l’eau et cela, aussi
bien dans des écosystèmes agricoles que non agricoles. L’objectif à long terme est de
connaître toute la gamme de résistance au stress de la bactérie étudiée, ceci afin de lutter
contre des maladies telles que la bactériose du melon.
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LE CONTEXTE ET LA PROBLEMATIQUE
En 2009, 301 724 tonnes de melon ont été produites en France. Cette production est
répartie sur 14 749 hectares en 2010 et provient principalement de trois secteurs : le Centreouest (Pays de la Loire et Poitou-Charentes), le Sud-ouest (Aquitaine et Midi-Pyrénées) et le
Sud-est (Languedoc-Roussillon et Provence-Côte d’Azur) qui représentaient à eux seuls
93,1% de la production française en 2009 (données Agreste 2009-2010).
Or depuis le début des années 1990, ces différentes régions de production sont
régulièrement touchées par une épidémie plus ou moins sévère selon les années. La maladie a
d’abord touché les régions de production du Centre-ouest et du Sud-ouest, notamment lors des
campagnes 1995, 1996 et 1997, si bien qu’en 1997, les conseils régionaux du Tarn-etGaronne et du Lot ont déclaré officiellement l’état de catastrophe naturelle pour les parcelles
malades. L’épidémie s’est ensuite propagée dans tous les bassins de production français sans
exception (Mention et al., 2004).
Situé au cœur du bassin de production de melons le plus productif au niveau national
(le Sud-Est représentait plus de 40% de la production française en 2009), l’INRA Avignon
s’est intéressé à cette maladie. En collaboration avec le Service Régional de la Protection des
Végétaux (S.R.P.V.), l’INRA a identifié l’agent pathogène de cette bactériose comme étant
Pseudomonas syringae.
Dans un premier temps, les recherches ont porté sur la bactérie présente sur les plants
de culture malades mais l’étude des pathogènes dans cet unique contexte permet d’aborder
seulement une partie du cycle de vie de ces organismes. Ces études ont toutefois permis
d’avancer dans la compréhension des maladies et de ce qui les détermine mais des inconnues
demeurent. Pour P. syringae, l’étude des souches pathogènes isolées de plantes malades ne
suffit pas à expliquer ce qui détermine qu’une souche va attaquer une plante donnée. Il reste
donc des facteurs à élucider (Guttman et al., 2006).
Pour la plupart des pathogènes humains, les études ont déjà porté sur leur écologie en
milieu naturel. Ceci afin de comprendre certains de leurs caractères utiles à la pathologie
humaine (Cangelosi et al., 2004). Les études sur Vibrio cholerae, par exemple, ont montré
que les protéines en jeu dans l’interaction avec la chitine support et source de nutriments
principal de cette bactérie dans les océans sont les mêmes que celles qui lui permettent
d’adhérer aux parois intestinales chez l’homme (Pruzzo et al., 2008). D’autre part, les
épidémies causées par cette bactérie sont reliées directement aux changements climatiques,
vents et courants à l’échelle de la planète (Mourino-Pérez, 1998).
Dans le domaine de la pathologie végétale, cette nouvelle dimension est à peine
naissante.
Que nous ont appris les études essentiellement agronomiques sur le pouvoir pathogène
de Pseudomonas Syringae ?
La « vie sauvage » de cette bactérie influence-t-elle l’évolution de ce pouvoir
pathogène ?
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1. Pseudomonas syringae : une bactérie phytopathogène
P. syringae est un bacille Gram négatif d’une grande importance agronomique car il
est capable d’attaquer une gamme très étendue de plantes. Il est retrouvé seul, en petits
groupements ou en biofilms. La bactérie est aérobie stricte, chimio-hétérotrophe. Certains
caractères biochimiques permettent son identification : production d’un pigment fluorescent
aux UV (pyoverdine) sur le milieu B. de King, test oxydase négatif, absence de cytochrome
C.
Cette bactérie est capable de survivre à la surface des feuilles (c’est une bactérie
épiphyte) sans provoquer de maladies. Durant cette phase, P. syringae est capable de se
développer en biofilm, ce qui représente 15 à 40% de la population totale (Morris et al.,
1998). Quand les conditions sont plus favorables pour elle, la bactérie pénètre dans la plante
via les stomates ou des blessures et prolifère dans les espaces intercellulaires (Hirano &
Hupper, 2000). P. syringae est un agent nécrogène qui se développe lentement et qui s’attaque
aux tissus parenchymateux des plantes. Les feuilles, les tiges et les fruits ainsi attaqués
prennent un aspect huileux et sont gorgés d’eau, ils brunissent rapidement et peuvent être
confondus avec des dégâts ayant une autre origine (fongique, par exemple). Seuls des tests
d’identification peuvent confirmer la présence de la bactérie.
Cinquante deux pathovars (sous-groupes) de cette espèce ont été recensés sur la base
de la spécificité d’hôte. Trois groupes monophylétiques ont été dégagés (Sawada et al., 1999).
En effet, alors que P. syringae possède collectivement une large gamme d’hôte, les souches
individuellement ne sont virulentes que sur un panel très restreint de plantes (Gaignard et al.,
1993).
Les recherches portant sur les mécanismes de virulence de la bactérie sont
nombreuses. On sait maintenant que P. syringae injecte directement des « protéines
effectrices » à l’intérieur du cytoplasme des cellules eucaryotes. Pour cela, ces bactéries
possèdent le système de sécrétion de type III qui est comparable à une seringue moléculaire.
Les gènes codant pour ce système de type III sont situés à l’intérieur d’un îlot de
pathogénicité et ont été acquis par divers transferts entre pathogènes de plantes, d’animaux et
de symbiotes appartenant aux espèces telles que Shigella, Salmonella, Yersinia,
Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, et Rhizobium (He et al., 2004 ; Journet et al., 2005).
Actuellement, plus de 300 gènes bactériens associés à la virulence ont été identifiés chez P.
syringae dont plus de 50 codent pour des protéines effectrices transmises à la plante par le
système de sécrétion de type III (Sarkar et al., 2006).
Cependant ce système à lui seul ne permet pas une attaque efficace. D’autres facteurs
sont entrent en jeu notamment ceux relatifs à l’acquisition du fer ou de nutriments, à
l’osmoprotection, à la tolérance aux UV et au stress oxydant ou à la formation de biofilm
(Morris & Monier, 2003). La production de toxines est aussi considérée comme un facteur de
virulence important.
Pour finir, P. syringae est dotée d’une activité glaçogène. Elle produit sur sa
membrane externe une protéine permettant la fixation de molécules d’eau et leur orientation
en cristaux de glace et est utilisée dans la production commerciale de neige (Rixen et al.,
2003). Cette propriété n’est pas un facteur de virulence même si elle entraîne de graves dégâts
sur les plantes (dégâts dus au gel).
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2. Pseudomonas syringae : une bactérie de l’environnement
Cette bactérie est très présente dans les zones agricoles (Morris et al., 2007) :
notamment dans les tissus et les débris végétaux, les équipements et structures agricoles, les
eaux d’irrigation… Suite au labour, les populations de P. syringae décroissent rapidement
dans le sol. Cependant, elle semble être capable de coloniser les graines et les racines
(Tornero & Dangl, 2001) notamment les racines d’A. thaliana (Bais et al., 2004).
Des souches de P. syringae ont aussi été isolées dans des régions éloignées des zones
agricoles (Morris et al., 2007), cet aspect n’ayant pendant longtemps pas été pris en compte.
Récemment, l’équipe de Cindy E. Morris a montré la présence de cette bactérie au sein de
substrats variés : dans des biofilms épilithes (situés à la surface des roches), ainsi que dans des
réservoirs alpins tels que : neige, pluies, torrents, lacs mais aussi sur des plantes sauvages
(Morris et al., 2007). Dans ces réservoirs, les souches de P. syringae retrouvées peuvent être
virulentes pour différentes cultures ou totalement avirulentes. Les propriétés liés à la virulence
semblent dépendre du substrat dans lequel on retrouve la bactérie : la production de toxine ou
le pouvoir glaçogène semblent, par exemple, moins fréquents dans les populations des
biofilms épilithes (Morris et al., 2008).
Depuis quelques années, la présence de P. syringae au sein des nuages a été montrée (Sands et
al., 1982). Ceci rattaché au fait que P. syringae est dotée d’une activité glaçogène suggère que
la bactérie joue un rôle dans les processus liés à la formation des précipitations (Morris et al.
2004, Morris et al., 2008). Cet élément permettrait à la bactérie de coloniser une large gamme
de substrats non agricoles et de trouver des niches écologiques dans lesquelles elle peut
survivre.
Les connaissances actuelles sur P. syringae montrent que cette bactérie a la capacité
de survivre à la dissémination à grande distance et de s’adapter à divers habitats. La nature de
ces habitats suggère un parcours en milieu aquatique qui suit le cycle des eaux douces. Ce
cycle de vie en liaison avec celui de l’eau est représenté sur le schéma de la figure 1 :
Figure 1 : Schéma des
habitats et des flux
possibles de P. syringae
dans l’environnement.
Chute de neige ou de
pluie contenant P.
syringae (1). La neige
habitat potentiel de
prolifération ou de stress
(2). La neige et la pluie
contribuent aux eaux de
montagnes, vecteurs et
habitats de P. syringae
(3). La bactérie est
entraînée vers les plantes
sauvages où elle va
proliférer. Survie et
multiplication de variants
de P. syringae (4). Le
ruissellement et la
percolation des eaux
souterraines sélectionnent
des variants de P.
syringae qui alimentent
les rivières (5). L’irrigation porte la bactérie vers les plantes cultivées et vers les équipements agricoles (6).
Apport direct aux cultures de P. syringae par la pluie, la dissémination aérienne et des sources du système
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agricole. Certains variants de P. syringae sont mieux adaptés à l’agro-écosystème (7). La bactérie en phase épiphyte sur les
plantes devient un composant des aérosols et elle est transportée vers les nuages (8). Les nuages pourraient porter P. syringae
vers d’autres bassins versants (9). Morris et al. (2008).
3. Les interactions dans les biofilms
Comme il a été dit précédemment, P. syringae est capable de se développer en biofilm,
ce qui représente 15 à 40% de la population totale (Morris et al., 1998). Cet élément, ajouté au
fait que le cycle de vie de la bactérie est rattaché au cycle de l’eau, offre la possibilité
d’étudier P. syringae en dehors des zones agricoles : au sein de biofilms en milieu aquatique.
L’ensemble des milieux aquatiques naturels sont concernés par la formation de
biofilms. La plupart du temps cette formation se fait au fond des cours d’eau à la surface des
galets : on parle de biofilms épilithes. Ces derniers représentent un habitat important pour P.
syringae : il serait intéressant d’y connaître la biologie des populations de cette bactérie ainsi
que leur pouvoir pathogène ce qui serait un plus pour lutter contre ce microorganisme en
milieu agricole. En effet, les biofilms abritent un ensemble de communautés diverses qui
cohabitent, interagissent et évoluent ensemble : ils y subissent une diversification
phénotypique afin de s’adapter y compris P. syringae (Little et al., 2008).
Ces communautés sont diverses. Elles sont constituées d’un mélange d’espèces
microbiennes, procaryotes et eucaryotes, le tout étant dans une matrice constituée de
polysaccharides, protéines, acides nucléiques, lipides et autres molécules. Les biofilms
épilithes sont composés d’algues (unicellulaires ou pluricellulaires), de bactéries, de
champignons, de nématodes, de protozoaires, de petits invertébrés et de détritus organiques ou
inorganiques, le tout englobé là encore dans une matrice de polysaccharides.
Les microalgues sont une des composantes importantes des biofilms épilithes. Ce
terme de « microalgues » désigne l’ensemble des microorganismes photosynthétiques y
compris les cyanobactéries. Les interactions algues-bactéries ont jusqu’à présent été assez peu
étudiées. Certaines algues auraient un effet positif sur la croissance des populations
bactériennes, d’autres un effet négatif. A l’inverse, des bactéries favoriseraient la croissance
des populations algales tandis que d’autres influeraient négativement sur ces mêmes
populations. Les mécanismes peuvent être directs : production de toxines, d’antibiotiques ou
interactions trophiques (Giroldo et al., 2007), mais aussi indirects comme l’effet de protection
en biofilm bactérien, ou l’effet sur d’autres populations.
Dans le cas de P. syringae, rien n’était connu sur cette interaction avant une étude
préliminaire effectuée par le laboratoire de Cindy E. Morris montrant clairement l’effet de
trois souches de P. syringae sur la croissance de la diatomée Nitzschia palea (Laussel, 2007).
Quelle que soit la souche bactérienne testée, la croissance de l’algue est retardée quand elle
est co-cultivée avec P. syringae (Laussel, 2007). Cette interaction est donc à explorer
davantage et constitue une première étape dans la connaissance des relations entre organismes
vivants dans les biofilms épilithes.
L’hypothèse principale est donc qu’il existe une interaction entre les populations de P.
syringae et les microalgues aquatiques Cette interaction exercerait une pression de sélection
pour la population bactérienne et son pouvoir pathogène. En d’autres termes, nous voulons
montrer que le contact des populations de P. syringae avec les microalgues d’eaux douces
affecte les caractères pathogènes de ces populations.
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Ces hypothèses soulèvent certaines questions :
Y a-t-il réellement des interactions entre les bactéries P. syringae et certaines
microalgues au sein des biofilms ?
Si c’est le cas, les caractères pathogènes de ces bactéries jouent-ils un rôle dans ces
interactions ?
Pour répondre à ces interrogations, les objectifs du stage sont :
- de mettre en place un test simple de co-culture microalgues / bactéries. Ceci
afin de montrer si la croissance bactérienne est affectée par la présence d’une
microalgue ou si la présence de la bactérie modifie la croissance de la
microalgue
- de cribler la diversité des souches de P. syringae présentes dans la collection
du laboratoire. Ceci afin d’apporter une première réponse sur le rôle des
caractères pathogènes des bactéries dans les interactions avec les microalgues.
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MATERIELS ET METHODES
1. Choix des souches
a) Les souches bactériennes
La collection de souches de P. syringae du laboratoire de pathologie végétale est
unique au monde, car elle contient non seulement des souches issues de plantes malades
comme dans la plupart des autres collections, mais aussi des souches issues de
l’environnement (Morris et al., 2008). Le laboratoire possède donc une très grande diversité
de souches de P. syringae qui peuvent avoir des propriétés différentes selon les pressions de
sélection qu’elles ont rencontrées (Morris et al., 2010). L’objectif général de cette étude est de
balayer cette diversité en choisissant des souches différentes, afin de les tester dans leurs
relations aux microalgues d’eau douce, habitat partagé puisque les populations de P. syringae
suivent le cycle de l’eau. Pour cette étude, il fallait mettre au point un test de co-culture
destiné à mesurer l’effet de souches de P. syringae sur la croissance d’une microalgue, et
réciproquement, l’effet de la microalgue sur la croissance bactérienne. Parmi les différentes
propriétés des souches bactériennes susceptibles d’avoir un effet sur les microalgues, celles
qui intéressent le plus le laboratoire sont celles qui sont liées au pouvoir pathogène. Une série
de souches récemment bien caractérisées génétiquement au laboratoire (Demba Diallo, 2010)
a été choisie pour la mise au point de ce test. Elles figurent dans l’annexe 1 (annexe 1 : les
différentes souches bactériennes étudiées et certaines de leurs propriétés, p.43) et ont été
choisies pour leur variabilité pour les critères suivants :
- la réaction d’hypersensibilité du tabac qui détermine si la souche est pathogène
ou non
- la présence de certains gènes codant pour des protéines effectrices (injectées
dans les cellules eucaryotes lors de l’interaction avec la plante) : avrE, hrpW,
hrpL
- la présence de certains gènes de structure du système de sécrétion de type III,
sorte de seringue moléculaire qui sert à l’injection des effecteurs : hrpK, hrcC,
hopl1
- la présence d’un phage proche de l’îlot de pathogénicité dans le génome
bactérien. Cet îlot est une région physique qui contient les gènes principaux
impliqués dans le pouvoir pathogène dont ceux cités au-dessus.
- la production de toxine qui est un auxiliaire au pouvoir pathogène
- la présence de la protéine permettant l’activité glaçogène (test INA : ice
nucleation activity).
L’intérêt étant ici de voir si un ou plusieurs de ces critères engendrent un effet lors de
la co-culture bactéries/algues, il convient de cribler un maximum de souches bactériennes
ayant des combinaisons différentes de ces différents critères. Cependant, le temps étant limité,
28 souches de P. syringae ont été choisies, chacune étant différente pour au moins un des
critères décrits précédemment. Par ailleurs, trois autres souches de bactéries (phytopathogènes
ou non) autres que des P. syringae ont aussi été sélectionnées comme des « témoins » afin de
vérifier si les effets observés sont spécifiques à l’espèce ou peuvent être communs à d’autres
bactéries, même éloignées.
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b) La souche de microalgue
Dans le projet global d’étude des interactions entre les populations de P. syringae et
celles des microalgues des biofilms d’eau douce, le choix des microalgues est orienté vers
plusieurs groupes d’organismes et en particulier le groupe des diatomées très abondant dans
ces biofilms, et le groupe des microalgues vertes, plus proche des plantes au niveau du
fonctionnement de la photosynthèse.
La microalgue sélectionnée dans la présente étude est la souche modèle
Chlamydomonas reinhardtii 137. Il s’agit d’une microalgue verte, bien connue par les
scientifiques : son génome entier a été décrypté récemment. Elle a été sélectionnée pour sa
facilité de culture au laboratoire, pour l’absence d’agrégats de cellules qui gênent les
dénombrements, et pour le fait qu’elle existe en culture pure, ce qui n’est que rarement le cas
des microalgues. En effet la plupart des cultures de microalgues en laboratoire contiennent
des bactéries associées qu’il est difficile voire impossible d’éliminer : ces dernières pourraient
interagir avec P. syringae dans les tests ce qui n’est pas souhaitable dans notre cas. De plus,
C. reinhardtii possède 35% de ses gènes en commun avec les plantes à fleur (Merchant et al.,
2007), or, s’il existe des interactions entre P. syringae et des microalgues, on peut s’attendre à
ce qu’il y en ait d’autant plus que les microalgues sont proches de la cible « habituelle » des
bactéries, c’est-à-dire proches des plantes : d’où le choix de C. reinhardtii.
Remarque : Par la suite, il est prévu que l’équipe de bactériologie fasse les expériences
menées ici avec d’autres microalgues et d’autres souches bactériennes. Cette étude
préliminaire a pour but de mieux cerner les conditions de ces tests de croissance avec une
microalgue et une première série de souches, pour ensuite les effectuer en batterie sur un
grand nombre de souches.
2. La culture et le dénombrement des microorganismes
a) Milieux de culture
Différents types de milieu ont été utilisés pour cultiver les microorganismes :
- le TSB/10e (voir l’annexe 2 : la composition des milieux de culture utilisés,
p.44): les souches bactériennes sont cultivées en routine sur ce bouillon nutritif
courant et riche (même s’il est dilué). Les souches de P . syringae atteignent
108 à 109 cellules par mL en 48 h à 20 °C dans ce type de milieu. Ce milieu
peut être gélosé (15g/L d’agar) pour les cultures en boite de Petri (il est alors
appelé TSA/10e).
- le TAT (voir l’annexe 2 : la composition des milieux de culture utilisés, p.44) :
ce milieu est utilisé pour les cultures de C. reinhardtii et peut être utilisé avec
une source de carbone comme l’acétate (il est alors appelé milieu TAP) ou sans
source de carbone. Dans ce dernier cas, seule la photosynthèse fourni le
carbone et l’énergie aux cellules de microalgues qui peuvent atteindre une
densité autour de 106 cellules/mL.
Le milieu choisi pour les co-cultures est le milieu TAT, sans source de carbone, qui
convient à la croissance de l’algue et dans lequel P. syringae survit et peut même avoir une
croissance toutefois limitée. La source de carbone pour les bactéries sera, (en dehors des
traces de carbone organique présentes dans le milieu TAT) issue du métabolisme des algues et
donc indirectement du dioxyde de carbone fixé par la photosynthèse de C. reinhardtii 137.
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b) Dénombrements « classiques » des microorganismes
• Les microalgues
La méthode classique de dénombrement des microalgues consiste à compter
directement les cellules au microscope à l’aide d’une lame de comptage spéciale : la cellule de
Malassez. Il s’agit d’une lame en verre avec un quadrillage correspondant à un volume
donné : en remplissant la chambre de comptage, on peut compter le nombre de cellules sur ce
quadrillage. On obtient la concentration en cellules de la suspension.
Remarque : Cette méthode est adaptée aux cellules ayant un volume important (microalgues,
levures…). Un autre type de lame (lame Thoma) est adapté au dénombrement des bactéries,
mais n’a pas été utilisé dans cette étude.
• Les bactéries
Pour dénombrer approximativement et directement le nombre de bactéries au sein
d’une suspension, on peut utiliser un spectrophotomètre. En effet, une culture bactérienne
absorbe et réfléchit la lumière passant à travers elle. Or, dans une certaine gamme de
concentrations bactériennes (5.107 à 5.109 cellules / mL), la lumière absorbée ou réfléchie par
la suspension bactérienne est directement proportionnelle à la concentration de cellules dans
la culture pour une longueur d’onde donnée. Ainsi, en mesurant l’absorbance d’une
suspension bactérienne, on peut estimer le nombre de cellules au sein de cette suspension
après calibrage.
Pour dénombrer plus précisément le nombre de bactéries au sein d’une suspension, il
existe une autre technique : la dilution puis l’étalement sur milieu solide. Le principe est le
suivant : au laboratoire, le niveau de la population bactérienne dans les suspensions est déjà
connu approximativement (grâce à l’absorbance ou en prédisant l’évolution de la culture en
un temps donné). Après deux jours de pré-culture en milieu TSB/10e, la population est située
autour de 108 cellules / mL et, au bout de six jours de culture en milieu TAT, elle se situe
autour de 106 cellules / mL.
Le comptage sur milieu solide TSA/10e nécessite de diluer les suspensions de départ pour
avoir entre 5 et 50 colonies par goutte de 10 µ L ensemencée afin de pouvoir dénombrer. Pour
les bactéries issues d’une suspension évaluée à 108 cellules / mL par exemple, nous diluerons
jusqu’à 10-6 et nous ensemencerons trois gouttes de 10 µ L de la dilution 10-6, 10-5 et 10-4
comme indiqué figure 2.
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Une goutte de 10 µ L de solution
Dilution 10-6
Boîte de
Petri
Dilution 10-5
Dilution 10-4
Milieu TSA/10e
Figure 2 : Schéma représentant un exemple de dénombrement bactérien sur milieu solide en boîte de Petri
Après avoir ensemencé les bactéries sur milieu solide, les boîtes de Petri sont placées à
l’étuve à 20°C pendant deux jours, puis les colonies sont dénombrées et la concentration
bactérienne dans la solution initiale est calculée en tenant compte des différentes dilutions
utilisées. Par exemple, pour la dilution 10-6, si on trouve 12 colonies dans les 3 gouttes, soit en
moyenne 4 colonies/10 µL, soit 400 colonies/mL alors le nombre de bactéries par mL dans la
suspension de départ est de 400 x 106 = 4,0.108 bactéries par mL. En faisant la moyenne du
nombre de bactéries trouvées pour les dilutions où le comptage est possible, on obtient le
nombre de bactéries/mL pour un tube donné.
Remarque : Cette méthode a l’avantage de nous indiquer quand il y a eu contamination de la
suspension lorsque l’on observe des colonies de types différents.
c) Dénombrement des microorganismes au compteur de cellules
Dans nos expériences comprenant beaucoup de traitements (nous voulions tester de
nombreuses souches), il fallait allier la rapidité de la technique et la possibilité de compter
dans la même suspension des cellules de deux types différents. C’est pourquoi l’unité a
récemment eu accès à un compteur de cellules de type MS3 (de marque Beckman). Cet
appareil permet quasi instantanément (< 1 minute) de compter et de mesurer la taille (le
volume) de toutes sortes de particules en suspension dans un liquide suivant le principe de
Coulter expliqué en annexe 3 (annexe 3 : principe de fonctionnement du compteur de
particules Beckman Coulter Multisizer 3, p.45)
L’une des missions du stage était de comparer les résultats des techniques
« classiques » de dénombrement des microorganismes avec les mesures effectuées par le
compteur de cellules, ceci afin de fixer les différents paramètres permettant d’effectuer les
mesures grâce à la machine. Ces éléments étant issus de résultats de manipulations, ils seront
détaillés dans la partie « Présentation et analyse des résultats ».
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3. Détermination du protocole de co-culture bactéries / microalgues
a) Détermination des paramètres de croissance
La croissance d’une population microbienne dans un milieu de culture adapté suit une
cinétique bien connue et décrite en quatre phases :
- une phase de latence durant laquelle la population ne croît pas ou très peu, elle
s’adapte
- une phase exponentielle : les cellules se divisent activement, il y a
augmentation exponentielle du nombre de cellules au cours du temps
- une phase stationnaire au cours de laquelle la population se stabilise autour
d’une valeur donnée car un des facteurs de croissance devient limitant
- une phase de déclin : les cellules ne se divisent plus et meurent, il y a alors
diminution de la population au cours du temps.
Dans notre cas, nous voulons comparer l’effet de la présence d’une population
bactérienne (respectivement la population algale) sur la croissance de la souche de microalgue
(respectivement de bactéries). Pour cela, nous choisissons d’utiliser comme variable, le
niveau de la phase stationnaire atteint par les populations de manière à ce que les valeurs
soient plus facilement comparables.
Dans une expérience pilote, nous avons déterminé en combien de temps cette phase
stationnaire est atteinte par un suivi la croissance d’une souche représentative des P. syringae
(CC094) avec et sans microalgues ainsi que la croissance de C. reinhardtii 137 avec et sans
bactéries.
Les conditions de l’expérience avaient été fixées par des essais antérieurs du
laboratoire énumérés plus bas Pour réduire la phase stationnaire, les ensemencements sont
faits avec des cultures jeunes à t0 à partir de pré-cultures en phase exponentielle. Nos mesures
montrent que pour les deux types d’organismes, la phase stationnaire est atteinte au bout du
sixième jour (figure 3) ce qui nous a permis d’élaborer le protocole définitif du test.
A
B
8
7
6
6
5
CC94 seules
4
CC94 avec 137
3
2
log (nombre de microalgues / mL)
log (nombre de bactéries / mL)
7
1
5
4
137 seules
137 avec cc94
3
2
1
0
0
0
2
4
6
8
10
0
Nombre de jours en culture
2
4
6
8
10
12
14
Nom bre de jours e n cult ure
Figure 3 : Evolution des populations microbiennes en fonction du temps.
A : population de P. syringae CC94 en présence ou en absence de C. reinhardtii 137
B : population de C. reinhardtii 137 en présence ou en absence de P. syringae CC94
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b) Protocole du test de co-culture
Toutes les cultures sont effectuées dans des tubes à essai en verre contenant 5 ml de
milieu, fermés avec des bouchons non étanches aux gaz, inclinés de façon à exposer le liquide
à la lumière, et placés en chambre de culture en
conditions contrôlées (figure 4), sans agitation continue, à
des températures et une photopériode spécifique : 14
heures de jour à 22 °C et 10 heures de nuit à 20 °C.
- Pré-culture : t0-2j
Les souches bactériennes de la collection du laboratoire
sont fournies sur milieu solide. Une colonie est prélevée à
l’öse et ensemencée sur milieu liquide TSB/10e. C.
reinahrdtii 137 est maintenue sur milieu TAT liquide au
laboratoire. Du milieu TAT frais est ensemencé avec 50
µ L de culture. Les bouillons sont incubés dans la
chambre de culture.
Mise en culture : t0
À t0, les populations d’algues et de bactéries sont
dénombrées et environ 103 cellules/mL (valeurs proches
de ce que l’on retrouve dans les cours d’eau à l’état
Figure 4 : Intérieur de la chambre de culture naturel) sont inoculées à du milieu TAT stérile.
où les co-cultures sont effectuées en
conditions contrôlées
- Incubation : de t0 à t0+6j
Les tubes sont placés dans la chambre de culture sans agitation, excepté une agitation
quotidienne à la main, pour assurer une homogénéisation des cultures, et un renouvellement
des gaz.
- Dénombrements : t0+6j
Les microorganismes sont dénombrés grâce à l’une des techniques décrites précédemment.
Les différentes étapes sont résumées sur la figure 5 :
t0-2 : pré-culture
- Prélèvement d’une colonie à l’öse
- Ensemencement en milieu liquide
(TAT ou TSB/10e) dans un tube à
essai
- Mise en culture à 22°C avec
alternances jour/nuit
t0 : culture
- Comptage des populations de la
pré-culture
- Dilution
- Ensemencement de 103 cellules
/ mL de TAT dans 4 tubes
- Mise en culture à 22°C avec
alternances jour/nuit
t0+6 : mesure
- dénombrement des populations
algales et bactériennes dans chaque
tube
Figure 5: Procédure de contrôle de croissance
microbienne en co-culture
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c) Plan d’expérience
Selon le temps restant après la détermination des paramètres liés au compteur de
cellules, un plan d’expérience a été construit, basé sur une série de neuf manipulations avec
dans chacune, 3 à 6 souches bactériennes et pour chaque traitement deux répétitions (le nom
des souches correspondant à chaque manipulation se trouvent en annexe 4 : correspondance
souches/manipulations, p.46).
Dans chaque expérience il y a:
- deux tubes de C. reinhardtii 137 seules
- deux tubes de chaque souche bactérienne
- deux tubes de chaque souche bactérienne en co-culture avec C. reinhardtii 137
4. Traitement des données
Un test de Student a été utilisé pour comparer deux à deux les populations
microbiennes seules ou en co-culture ainsi que la taille des microalgues, seule ou en coculture pour chaque souche bactérienne. L’ANOVA à un facteur a permis de comparer les
populations d’algues dans les différentes expériences et l’ANOVA à deux facteurs de
comparer les effets de la co-culture et de la souche bactérienne sur la croissance de l’algue.
Ces tests ont été appliqués grâce au logiciel Statistica.
Les boîtes à moustaches, les histogrammes et autres courbes ont été obtenus grâce à ce
même logiciel ainsi que grâce à Excel.
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PRESENTATION ET ANALYSE DES RESULTATS
1. Mise au point d’un protocole d’utilisation du compteur de cellules
La taille des bactéries étant bien distincte de celle des microalgues, le comptage
simultané des deux types d’organismes est théoriquement possible avec cette technologie qui
a l’avantage d’être bien plus rapide que les dénombrements classiques de microorganismes.
a) Le dénombrement des microalgues
log(valeurs relevées au compteur de
cellules)
Pour mettre au point un protocole d’utilisation du compteur de cellules, il faut tout
d’abord vérifier que celui-ci compte de manière exacte. Pour cela, nous avons comparé les
valeurs obtenues par le dénombrement classique (cellules de Malassez) aux valeurs obtenues
grâce à l’appareil. Les résultats sont donnés dans la figure 6 (les écarts-types des différentes
valeurs ne sont pas visibles ici car très faibles).
8
7
6
5
Courbe théorique
attendue
4
Courbe
expérimentalement
obtenue
3
2
1
0
0
2
4
6
8
log(valeurs attendues)
Figure 6 : Dénombrements de C. reinhardtii 137 au compteur de cellules en fonction des valeurs attendues
calculées à partir d’une estimation par cellule de Malassez sur la suspension dense
On remarque que la courbe obtenue est différente de la courbe attendue pour les
valeurs les plus faibles. Le compteur de cellules n’est donc pas fiable pour des populations
basses : son seuil de sensibilité est approximativement de 105 cellules/mL. Cela signifie qu’en
deçà de cette valeur, les mesures effectuées par l’appareil ne sont pas utilisables.
Or que ce soit en fin de pré-culture ou au bout de six jours d’expérimentation, les
populations de microalgues devraient toutes atteindre et dépasser les 105 cellules/mL : il sera
donc possible de dénombrer les C. reinhardtii grâce au compteur de cellules.
Dans la suite de ce rapport, nous garderons toujours en tête que si des populations de
microalgues sont inférieures au seuil de sensibilité de la machine, il ne faudra pas prendre en
compte les valeurs trouvées. De même, si des valeurs supérieures à celles testées ici (donc
supérieures à un logarithme de 6,6) sont trouvées, nous ne les prendrons pas en compte dans
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la suite de l’analyse car nous ne savons pas si le compteur de cellules reste fiable au-delà d’un
logarithme de 6,6.
b) Le dénombrement des bactéries
La même manipulation a été effectuée avec des suspensions bactériennes. Le
dénombrement de la solution mère a cette fois été réalisé par suspension-dilution-étalement :
les valeurs attendues sont donc les valeurs correspondant aux calculs liés aux dilutions de
cette solution mère. Les résultats sont donnés figure 7 (encore une fois les écarts-types sont
trop faibles pour être visibles).
log (valeurs relevées au
compteur de cellules)
E. Coli
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Courbe
expérimentalement
obtenue
Courbe théorique
attendue
0
2
4
6
8
10
log (valeurs attendues)
Figure 7 : Dénombrements d’E. coli au compteur de cellules en fonction des valeurs attendues calculées à partir
d’une estimation par suspension-dilution-étalement
Cette fois à aucun moment les courbes ne se confondent. Il n’y a donc pas de seuil de
sensibilité du compteur de cellules à E. Coli, et plus généralement, aux bactéries (l’expérience
ayant été réalisée avec d’autres bactéries et n’étant pas plus concluante). En d’autres termes, il
ne sera pas possible de dénombrer les bactéries grâce à l’appareil. Ceci est sans doute dû au
fait que le compteur de cellules utilisé durant les manipulations est doté d’un tube ayant un
orifice de 100 µm, non adapté pour de petites particules (inférieures à 3 µm).
En l’absence de tube à orifice plus petit (50 ou 30 µm), les méthodes de
dénombrements bactériens adoptés par la suite seront donc les méthodes classiques
(absorbance et suspension-dilution-étalement).
c) Protocole retenu
Les résultats exposés précédemment ont permis de déterminer les techniques de
comptage des microorganismes. Pour les bactéries, les méthodes classiques seront
privilégiées. Elles ont l’inconvénient d’être plus lourde que le comptage de cellules au MS3,
de donner les résultats après deux jours d’incubation et non pas instantanément, mais elles
sont moins délicates (présence de poussières gênantes au MS3) et permettent de repérer des
contaminants éventuels. Ceci a d’ailleurs été le cas dans ces expériences. En effet, sur les
boîtes de comptage des deux dernières manipulations (15 et 16 septembre), un contaminant
bactérien est apparu très tardivement (après plus d’une semaine sur milieu solide). Après
contrôle, il s’avère que le milieu TAT était contaminé. Cette contamination ne semble pas
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avoir perturbé les mesures que nous avons faites (voir analyses statistiques) et nous avons
considéré que ces résultats sont fiables. Toutefois, il sera plus prudent de les vérifier dans une
nouvelle expérience.
Pour les microalgues, nous utiliserons le compteur de cellules. Il s’agit d’une
technologie très robuste avec laquelle il faut toutefois faire extrêmement attention à ne pas
avoir de contaminants (particules de même taille que les microalgues) dans la verrerie utilisée.
Dans les premiers essais sans rinçages de la verrerie nous comptions plus de 70 000 particules
par mL dans de l’eau distillée représentant les poussières et autres contaminants
atmosphériques. Un processus spécial de nettoyage du matériel utilisé a donc été instauré :
toute la verrerie est rincée deux fois à l’eau osmosée, une fois à l’eau distillée puis rebouchée
soigneusement pour éviter les contaminants atmosphériques. Par ailleurs, les acuvettes (petits
béchers en plastique) dans lesquelles les mesures sont effectuées sont rincées avant chaque
mesure à l’eau distillée filtrée (filtres en nitrocellulose de porosité 0,22 µm). La solution de
NaCl (0,9 %) utilisée dans l’appareil et lors des mesures est, elle aussi filtrée (0,22 µm).
Lors de la mesure (voir annexe 3 : principe de fonctionnement du compteur de
particules Beckman Coulter Multisizer 3, p.45), 400 µ L de la suspension à analyser sont
ajoutés dans l’acuvette contenant 15 mL de NaCl (0,9 %) filtré, fermée par un bouchon
étanche, Après agitation la mesure est effectuée sur un volume que nous avons fixé à 500 µ L
(volume ni trop élevé pour privilégier des mesures rapides, ni trop faible pour assurer la
fiabilité des mesures). Nous obtenons en moins de 12 secondes une courbe de répartition des
effectifs en fonction de leur taille illustré figure 8.
Figure 8 : Nombre de particules dans 500 µ L de suspension en fonction de leur « diamètre équivalent » qui
indique celui de la sphère de même volume que celui de la particule quelle que soit la forme de la particule.
En rouge, témoin TAT dans du NaCl 0,9 % filtré (0,22 µ M), en vert, suspension de C. reinhardtii 137 dans le
même soluté.
On remarque que malgré les précautions prises, des poussières restent présentes à de
faibles diamètres (inférieurs à 3,5 µm) puisqu’un pic de particules est observé pour les deux
courbes autour de 2 µm. Ceci est d’ailleurs une autre difficulté rencontrée lors du
dénombrement des bactéries par le compteur de cellules.
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Dans cet exemple représentatif de nos conditions, la population de C. reinhardtii 137
contient donc des cellules dans une fourchette de tailles entre 3,5 et 12 µm. Le nombre de
particules totales situées dans cet intervalle dans le témoin est très faible (<50) : le nombre
obtenu lors de la mesure entre 3,5 et 12 µm sera donc assimilé à des algues. La conversion de
ce nombre de particules comptées en concentration dans la suspension de départ se fait par
simple calcul.
Par exemple si le résultat donné par le compteur est de 32 573 particules. Cela signifie
que nous avons 32 573 particules dans 500 µ L de la suspension de l’acuvette donc 65 146
particules / mL dans l’acuvette. Soit en tout 65 146 x 15,4, (1,0.106 particules) dans les 15,4
mL de l’acuvette. Nous avions donc apporté 1,0.106 cellules dans 400 µL provenant de la
suspension de départ, qui était à une concentration de 1,0.106 x 1000 / 400 = 2,5.106 cellules /
mL. Pour chaque suspension, un ensemble de trois mesures sont réalisées dans la même
acuvette. La moyenne de ces trois mesures est utilisée pour calculer la concentration initiale.
2. L’influence des bactéries sur les populations d’algues
a) Au niveau du nombre de microalgues
Au terme des expériences menées, nous sommes arrivés à différents résultats
bruts concernant le niveau des populations algales : le nombre de cellules à t0, le nombre de
cellules à t0+6 en présence et en absence de bactéries.
Grâce à ces résultats, on a pu remarquer que dans tous les cas (cultures simples et cocultures), la population d’algues atteint et dépasse 106 cellules/mL au bout de six jours
d’expérimentation. De plus, dans 27 cas sur les 32 testés, le niveau des populations d’algues
en co-culture est inférieur au niveau de ces mêmes populations en culture pure.
L’effet de la souche P. syringae 728 sur C. reinhardtii 137, représenté figure 9, est
représentatif de l’effet de la plupart des autres souches bactériennes.
Comptage de Chlamydomonas 137
log (nombre de cellules / mL)
7
6
5
4
3
2
1
0
137 à 0j
137 à 6j en l'absence de 728
137 à 6j en présence de 728
Figure 9 : Evolution de la population de C. reinhardtii 137 en fonction de la présence ou de l’absence de P.
syringae B728a dans le milieu de culture
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Que les algues soient cultivées avec ou sans bactéries, la population inoculée à t0 reste
la même (autour de 103 cellules/mL) : c’est pourquoi une seule barre est représentée à t0. Par
ailleurs, au bout de six jours, la population atteint un logarithme supérieur à 6,3, ceci qu’il y
ait ou non des bactéries Ps. 728 dans le milieu.
Pour finir, les niveaux des populations à t0+6j (en présence ou non de bactéries), bien
que très proches, ne sont pas égaux. Ceci est valable pour toutes les souches. Pour savoir, si la
différence entre les algues cultivées seules ou en compagnie de bactéries est significative,
nous avons appliqué un test de Student pour chaque souche bactérienne. Ce dernier montre
une différence significative avec un risque d’erreur de 5% (p<5%) pour sept souches. Grâce
au tableau 1, voyons si les différences observées chez ces dernières peuvent être reliées à l’un
des caractères étudiés.
Tableau 1 : Les caractères pathogènes des souches bactériennes ayant un effet significatif négatif sur les
populations de C. reinhardtii 137
Tout d’abord, on remarque que quelle que soit la souche bactérienne, on a toujours un
effet négatif sur le nombre d’algues présents dans le milieu. De plus, les souches bactériennes
qui engendrent un effet significatif sur l’algue ne partagent pas un caractère étudié en
commun. Il n’y a donc pas de corrélation entre les effets des bactéries sur la croissance de C.
reinhardtii et les propriétés testées.
b) Au niveau du diamètre des microalgues
Comme il a été expliqué précédemment, le compteur de cellules est capable de donner,
pour chaque particule, un « diamètre équivalent » qui indique celui de la sphère de même
volume que celui de la particule quelle que soit la forme de cette dernière. Ainsi, pour chaque
mesure effectuée à t0+6j, nous avons relevé le diamètre moyen de la sphère équivalente aux
algues.
L’ensemble des résultats montre des diamètres moyens variant de 5,45 µm à 6,64 µm.
Mais les valeurs ne permettent pas de conclure quant à un effet global particulier des bactéries
sur le diamètre des algues.
Là encore un test de Student a été appliqué sur les valeurs pour chaque souche afin de
voir si le diamètre trouvé à t0+6 est significativement différent selon que l’algue est en
présence ou non de bactéries. Les résultats de ce test montrent des valeurs significativement
différentes avec un risque d’erreur de 5% entre les algues en culture pure et celles en coculture pour cinq souches.
Les diamètres des algues cultivées seules ou en présence de P. syringae Psy642,
représentés sur la figure 10, sont représentatifs de ces cinq valeurs.
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Diamètre des C. reinhardtii 137 après 6j
de culture (en µm)
6,6
6,5
6,4
6,3
6,2
6,1
6
5,9
5,8
137
Psy642+137
Figure 10 : Evolution du diamètre de C. reinhardtii 137 en fonction de la présence ou de l’absence de P.
syringae Psy642 dans le milieu de culture
On remarque que les algues cultivées seules ont un diamètre moyen qui est supérieur à
celui des algues en co-culture avec des P. syringae Psy642. Cette observation peut être
généralisée à l’ensemble des résultats pour lesquels la différence de diamètre entre la culture
pure et la co-culture est significative avec un risque d’erreur de 5%.
Grâce au tableau 2, voyons si ces différences peuvent être reliées à l’un des caractères
étudiés.
Tableau 2 : les caractères pathogènes des souches bactériennes ayant un effet significatif sur le diamètre de C.
reinhardtii 137
Dans le tableau 2, on observe que les microalgues pour lesquelles la différence est
significative étaient en présence de bactéries issues de plantes ou de biofilms mais jamais de
bactéries provenant d’eau de rivière. Par ailleurs, les P. syringae engendrant un effet sur le
diamètre des C. reinhardtii sont toutes des souches négatives au test d’hyperréactivité sur
tabac.
3. L’influence des microalgues sur le niveau des populations bactériennes
Les résultats bruts obtenus concernant les bactéries sont de trois types :
nombre de bactéries par millilitre de solution à t0 (ce résultat est identique que
la bactérie soit en co-culture ou pas)
- nombre de bactéries cultivées seules par millilitre de solution à t0+6
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-
nombre de bactéries cultivées en présence de C. reinhardtii par millilitre de
solution à t0+6.
Ces résultats ont permis de montrer que les valeurs à t0 sont situées pour la plupart
autour de 103 bactéries par mL, mais celles-ci sont parfois assez éloignées de cette population
théorique. Ceci est dû au fait que lorsqu’on inocule les bactéries dans le tube à t0, on estime la
population de bactéries grâce à l’absorbance de la pré-culture : une courbe d’étalonnage nous
permet ensuite de calculer le nombre de bactéries par mL. Cependant, cette méthode est assez
peu précise dans certains cas. Ceci est dû au fait que l’on ne possède que la courbe
d’étalonnage pour la souche CC94 et, pour une population donnée, l’absorbance peut varier
d’une souche à l’autre. Nous avions fait l’hypothèse que les courbes d’étalonnage des P.
syringae de manière générale étaient plus ou moins proches de la courbe d’étalonnage de la
souche CC94. Cette hypothèse semble se confirmer dans la plupart des cas mais pas pour des
souches comme TA043, UB184, SZ131, SZ035…
Au niveau des populations bactériennes à t0+6, on remarque que dans tous les cas (sauf
pour la SZ122), on a une population supérieure en présence de microalgues qu’en l’absence
de ces dernières. Cette différence va de 0,03 pour les valeurs les plus proches (UB197) à 1,64
pour les valeurs les plus éloignées (Erwinia).
L’effet de la bactérie P. syringae B728a représenté graphiquement en figure 11, est
représentatif de cette situation globale.
Dénombrement bactérien : P. syringae , souche B728a
8
log (nombre de cellules / mL)
7
6
5
4
3
2
1
0
728 à 0j
728 à 6j en l'absence de 137
728 à 6j en présence de 137
Figure 11 : Evolution de la population de P. syringae B728a en fonction de la présence ou de l’absence de C.
reinhardtii 137 dans le milieu de culture
En l’absence de microalgues dans le milieu de culture, la population de P. syringae
B728a passe de 103 à 5,9.106 bactéries / mL. Lorsqu’il y a présence de C. reinhardtii 137 dans
le milieu, la population bactérienne dépasse cette valeur et atteint 8,3.106 bactéries / mL.
De manière plus générale, on remarque qu’il y a croissance à un niveau supérieur à 106
bactéries / mL, des bactéries en culture pure sur TAT, bien que ce soit un milieu sans carbone.
Ces microorganismes parviennent donc à exploiter le carbone présent sous forme de traces
dans le milieu. Toutefois, la population bactérienne est plus importante dans la co-culture que
dans la culture pure. Un test de Student permet là-aussi de montrer si ces différences sont
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significatives et, si tel est le cas, de relier les souches engendrant une différence significative
aux caractères pathogènes étudiés. Les résultats sont exposés dans le tableau 3.
Tableau 3 : Les caractères pathogènes des souches bactériennes significativement sensibles à la présence de C.
reinhardtii 137 dans le milieu de culture
Pour près de la moitié des souches de P. syringae (14 cas sur 32), la présence de
microalgues augmentent significativement la croissance. Pour les algues, cette différence
n’était significative que dans 7 cas sur 32 : les bactéries sont donc beaucoup plus sensibles
que les algues au fait d’être au sein d’une co-culture ou non.
Parmi toutes les souches qui sont significativement sensibles à C. reinhardtii 137, on
ne retrouve pas uniquement des P. syringae puisque Erwinia en fait partie. De plus, aucun des
critères observés ne semblent jouer un rôle dans l’interaction puisque les souches sensibles ne
partagent aucun caractère étudié en commun.
Au final, en regroupant, les observations faites ici ainsi que celles faites sur les algues,
on a quatre cas différents représentés dans le tableau 4 : (= signifie pas de différences
significatives)
Cas 1
Cas 2
Cas 3
Cas 4
Population bactérienne en
co-culture par rapport à celle
en culture pure
Augmentation
Augmentation
=
=
Population algale en coculture par rapport à celle en
culture pure
Diminution
=
Diminution
=
Tableau 4 : Les effets induits par les souches bactériennes et leur sensibilité à C. reinhardtii 137
Le cas 1 représente cinq souches : CC0655, CC1418, Psy Cit 7, SZ035 et TA043. Ces
dernières ont une influence significative sur C. reinhardtii 137, et réciproquement, les
microalgues ont une influence significative sur ces souches. Quatre souches sur ces cinq
proviennent des groupes phylogénétiques 2A et TA002, elles ne partagent pas de caractère
commun.
Le cas 2 représente les souches SZ030, SZ131, UB246, UB313, CC1582, UB295,
CC0654, CC94, Erwinia. Ces souches (pour 6 sur 7) ne possèdent pas trois gènes codants
pour des protéines effectrices.
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Le cas 3 représente les souches Psy 508 et UB330. Ces souches ne proviennent pas de
biofilms, elles sont toutes deux issues du groupe phylogénétique 2C, sont négatives au test
d’hyperréactivité sur tabac et ne possèdent ni les gènes codant pour des protéines effectrices,
ni les gènes de structure du système de sécrétion de type III.
Le cas 4 représente les seize souches qui n’ont pas été énumérées précédemment. Le
caractère qu’elles ont toutes en commun est l’absence de phage proche de l’îlot de
pathogénicité.
Le résultat le plus marquant que l’on peut tirer de ces quatre cas est le fait que
lorsqu’une souche possède le phage proche de l’îlot de pathogénicité, il y a un effet
significatif observé soit sur les populations bactériennes, soit sur les microalgues.
4. Comparaison des souches bactériennes
Pour les cultures pures, on remarque que l’on a des variations de la vitesse de
croissance selon les souches. En six jours de culture, la population de la souche SZ122 atteint
un logarithme de 7,2 alors que dans le même laps de temps des populations n’atteignent pas
un logarithme de 5 (CC1504 par exemple). Il est donc intéressant de voir dans un premier
temps comment varie la vitesse de croissance des bactéries au sein d’une culture pure pour
voir, dans un second temps, si la présence de microalgues n’affecte pas cette vitesse de
croissance. Mais tout d’abord, voyons s’il est possible de comparer toutes les souches entre
elles.
a) Homogénéité des manipulations
Pour commencer, si l’on veut comparer les souches entre-elles, il convient de savoir si
toutes les manipulations effectuées sont bien équivalentes. Pour cela, il faut savoir si le
témoin de chaque manipulation évolue de la même manière, c’est-à-dire si l’évolution des C.
reinhardtii cultivées seules se fait de la même manière dans chacune des manipulations
(populations équivalentes à t0+6j). Dans cette perspective, nous avons réalisé une ANOVA à
un facteur (variables descriptives : numéros de manipulation ; variables dépendantes : log
(nombre d’algues seules à t0+6)) dont les résultats sont dans le tableau 5.
Chlamy. seules
Erreur
Somme des
carrés des écarts
à la moyenne
0,0863
0,0097
Degré de liberté
F
p
8
10
11,1
0,000455
Tableau 5 : Résultats de l’ANOVA à un facteur sur les populations de C. reinhardtii 137 à t0+6j
La valeur de p est inférieure à 0,05. Cela signifie qu’on peut affirmer au risque de 5%
qu’il y a des valeurs entre certaines manipulations qui sont significativement différentes : on
ne pourra donc pas comparer toutes les souches entre-elles, il faut regrouper les manipulations
équivalentes.
Pour cela, les différentes manipulations ont été représentées sous forme de boîtes à
moustaches sur la figure 12 (pour voir la correspondance souches/date de manipulation, voir
l’annexe 4 : correspondance souches/manipulations, p.46).
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6,58
6,56
6,54
6,52
log (nb d'algues seules à t0+6)
6,50
6,48
6,46
6,44
6,42
6,40
6,38
6,36
6,34
6,32
6,30
6,28
Moyenne
14/09/2010
16/09/2010
15/09/2010
08/09/2010
10/09/2010
03/09/2010
09/09/2010
02/09/2010
01/09/2010
6,26
Moyenne±Erreur-Type
Moyenne±1,96*Erreur-Type
(intervalle de conf iance à 95%)
Figure 12 : Evolution du logarithme des populations de microalgues en fonction des manipulations
(un contaminant bactérien mineur était présent dans les expériences du 15 et 16 septembre)
Sur la figure 12, il est possible de rassembler les manipulations équivalentes. En effet,
celles-ci ont des intervalles de confiance qui se chevauchent. Les groupes de manipulation
ainsi formés sont les suivants :
- groupe 1 : manipulations du 1er et du 2 septembre
- groupe 2 : manipulations du 2, 3, 8, 9 et 10 septembre
- groupe 3 : manipulations du 3, 8, 10, 15 et 16 septembre
- groupe 4 : manipulations du 8, 14, 15 et 16 septembre.
A l’intérieur de ces groupes, une ANOVA à un facteur montre que les manipulations
sont équivalentes, la valeur de p étant à chaque fois supérieure à 5%.
b) Variations de la vitesse de croissance des bactéries
Il est donc possible de comparer les vitesses de croissance des souches au sein d’un
même groupe de manipulations. Cependant, nous avons vu (partie 3) que les populations à t0
sont différentes pour les bactéries (ce qui n’est pas le cas pour les microalgues). Si l’on veut
comparer les souches entre elles, il faudra donc faire en sorte que les différences d’inoculation
n’influent pas les résultats à t0+6 : on retranchera donc le logarithme de la population
bactérienne à t0 du logarithme de cette même population à t0+6 (il est possible de faire cela car
les populations bactériennes à t0, bien que différentes, restent dans le même ordre de
grandeur).
• Groupe 1 : manipulations du 1er et du 2 septembre
Ces deux manipulations correspondent à quatre souches de P. syringae : CC0094, DC
3000, B 728a, 1448A. Pour percevoir s’il y a un effet « souche », un effet « algue » ou une
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interaction entre ces deux effets, nous avons appliqué une ANOVA à deux facteurs (variables
de classement : avec ou sans algues (var1) / souches (var2) ; variables à analyser : log(t0+6j) –
log(t0)). Les résultats de cette ANOVA sont exposés dans le tableau 6.
Somme des
carrés des écarts
à la moyenne
Degré de
liberté
F
p
Var1 : présence ou
absence de C.
reinhardtii 137
0,1855
1
24,67
0,000000
Var 2 : souches
bactériennes
0,1442
3
6,39
0,0130667
Var1xVar2
(interaction)
0,1593
3
7,06
0,009704
Erreur
0,0677
9
Tableau 6 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 1
L’ANOVA montre que l’algue et le type de souche ont un effet significatif avec une
marge d’erreur de 5% sur la croissance bactérienne (la valeur de p étant inférieure à 5%).
L’interaction entre ces deux facteurs est également significative.
Pour mieux visualiser ces effets, des graphiques ont été tracés. Ils sont exposés en
figures 13, 14 et 15. Les lettres sur les graphiques sont les résultats du test de NewmanKeuls : lorsqu’il y a une lettre en commun entre deux valeurs, la différence n’est pas
significative avec un risque d’erreur de 5%. Inversement, lorsqu’il n’y a aucune lettre en
commun entre deux valeurs : elles sont significativement différentes avec un risque d’erreur
de 5%.
On remarque qu’il y a une
différence significative entre les
bactéries cultivées seules et celles
qui étaient au sein d’une coculture. Il y a donc un effet positif
de C. reinhardtii sur l’ensemble
des souches du groupe 1.
Figure 13 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 1, toutes souches confondues
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En ne prenant pas en
compte le fait que les bactéries
aient été au sein d’une culture
pure ou d’une co-culture, on
remarque qu’il y a des différences
de vitesses de croissance entre les
souches. La souche B 728a croît
significativement plus rapidement
que les souches DC 3000 et
CC0094.
Figure 14 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 1 à t0+6j, tous traitements confondus
Figure 15 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 1 en fonction de la présence ou de l’absence
de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls.
Le test de Newman-Keuls vient confirmer le test de Student pour dire qu’il y a une
différence significative entre les CC94 cultivées seules et celles cultivées en co-culture.
Par ailleurs, on observe une différence significative en l’absence de C. reinhardtii dans
le milieu entre les souches B 728a et 1448A d’un côté et la souche CC94 d’un autre côté.
Cette différence n’est plus significative en présence de la microalgue : il y a aurait donc un
effet plus important de C. reinhardtii sur la souche CC94 que sur les autres souches du groupe
1.
28
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• Groupe 2 : manipulations du 2, 3, 8, 9 et 10 septembre
Ces manipulations correspondent aux souches suivantes de P. syringae : DC 3000, B
728a, 1448A, UB246, SZ131, UB184, SZ030, CC1504, UB313, UB295, TA043 et CC655
ainsi qu’à E. coli, Erwinia et P. fluorescens.
Les résultats de l’ANOVA à deux facteurs (variables de classement : avec ou sans
algues (var1) / souches (var2) ; variables à analyser : log(t0+6j) – log(t0)) sont dans le tableau
7.
Somme des
carrés des écarts
à la moyenne
Degré de
liberté
F
p
Var1 : présence ou
absence de C.
reinhardtii 137
4,1528
1
130,29
0,000000
Var 2 : souches
bactériennes
10,5861
14
23,72
0,000000
Var1xVar2
(interaction)
2,8655
14
6,42
0,000013
Erreur
0,9244
29
Tableau 7 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 2
Comme pour le groupe 1, l’ANOVA montre que l’algue et le type de souche ont un
effet significatif avec une marge d’erreur de 5% sur la croissance bactérienne (la valeur de p
étant inférieure à 5%). L’interaction entre ces deux facteurs est également significative.
Des graphiques permettent là encore de mieux visualiser ces différents effets. Ils sont
exposés en figures 16, 17 et 18.
Même
remarque
que
précédemment : il y a un
effet positif des microalgues
sur la croissance bactérienne
des souches du groupe 2.
Figure 16 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 2, toutes souches confondues
29
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Figure 17 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 2 à t0+6j., tous traitements confondus
Grâce au test de Newman-Keuls, on remarque que TA043 et UB295 poussent
significativement plus vite que les autres souches du groupe. Les souches dont la population
croît plus lentement sont Erwinia, CC1504 et UB184.
Figure 18 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 2 en fonction de la présence ou de l’absence
de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls.
Ce test vient confirmer l’effet global de l’algue sur la croissance bactérienne. Il est
significatif pour certaines souches dont celles qui l’étaient déjà pour le test de Student, mais il
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l’est aussi pour d’autres car le test de Newman-Keuls est moins restrictif : il prend en compte
l’ensemble des valeurs du groupe et non uniquement quatre tubes. Cependant, il ne permet
pas de comparer l’ensemble des valeurs de toutes les manipulations.
On remarque qu’Erwinia et CC1504 croient faiblement en l’absence de C. reinhardtii
dans le milieu ce qui n’est plus le cas en présence des microalgues, la différence n’étant plus
significative avec la plupart des autres souches. L’effet de l’algue serait donc plus important
sur ces deux souches que sur les autres du groupe. Pour finir, les souches du groupe
phylogénétique UB313 (UB313, UB295 et TA043) sont celles qui semblent avoir le taux de
croissance le plus élevé.
• Groupe 3 : manipulations du 3, 8, 10, 15 et 16 septembre
Ce groupe correspond aux souches et aux bactéries suivantes : E. Coli, Erwinia, P.
fluorescens, UB246, SZ131, UB184, UB295, TA043, CC655, Psy508, UB330, Psy642,
CC1419, Psy Cit 7, SZ122, UB368, UB407, UB197 et CC1418.
Remarque : un contaminant bactérien mineur était présent dans les expériences du 15 et 16
septembre.
Les résultats de l’ANOVA à deux facteurs (variables de classement : avec ou sans
algues (var1) / souches (var2) ; variables à analyser : log(t0+6j) – log(t0)) sont dans le tableau
8.
Somme des
carrés des écarts
à la moyenne
Degré de
liberté
F
p
Var1 : présence ou
absence de C.
reinhardtii 137
2,8582
1
175,26
0,000000
Var 2 : souches
bactériennes
8,1068
18
27,62
0,000000
Var1xVar2
(interaction)
2,8527
18
9,72
0,000000
Erreur
0,6197
38
Tableau 8 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 3
L’ANOVA montre que l’algue, le type de souche et que l’interaction entre ces deux
facteurs ont un effet significatif avec une marge d’erreur de 5% sur la croissance bactérienne
(la valeur de p étant inférieure à 5%).
Les graphiques 19, 20 et 21 permettent de visualiser ces résultats.
31
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Il y a un effet positif
des microalgues sur
les bactéries.
Figure 19 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 3, toutes souches confondues
Figure 20 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 3 à t0+6j., tous traitements confondus.
Dans ce groupe-ci, les bactéries qui croient significativement le moins rapidement sont
Erwinia et UB184. Tandis que UB295 et TA043 sont les souches dont la population
augmente la plus vite du groupe. On ne voit pas d’effet particulier de la contamination sur les
souches testées dans les expériences du 15 et 16 septembre.
32
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Figure 21 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 3 en fonction de la présence ou de l’absence
de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls.
L’algue a un effet important sur la vitesse de croissance d’Erwinia puisque c’est pour
cette bactérie que l’on observe une différence conséquente entre le taux de croissance en
l’absence d’algues et celui en présence de ces dernières. L’algue semble aussi avoir un effet
du même type pour E. coli ainsi que pour les souches de P. syringae suivantes : UB295,
TA043 et CC0655. Mais il ne semble pas y avoir de corrélations entre ces observations et les
caractères bactériens étudiés.
• Groupe 4 : manipulations du 8, 14, 15 et 16 septembre
Il s’agit des P. syringae suivantes : UB246, SZ131, UB184, USA046, SZ046,
CC1582, SZ035, CC654, SZ145, Psy508, UB330, Psy642, CC1419, Psy Cit 7, SZ122,
UB368, UB407, UB197 et CC1418.
Remarque : un contaminant bactérien mineur était présent dans les expériences du 15 et 16
septembre.
Les résultats de l’ANOVA à deux facteurs (variables de classement : avec ou sans
algues (var1) / souches (var2) ; variables à analyser : log(t0+6j) – log(t0)) sont dans le tableau
9.
33
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Somme des
carrés des écarts
à la moyenne
Degré de
liberté
F
p
Var1 : présence ou
absence de C.
reinhardtii 137
0,869
1
0,869
0,000000
Var 2 : souches
bactériennes
3,673
18
0,204
0,000000
Var1xVar2
(interaction)
0,410
18
0,023
0,375917
Erreur
0,776
38
0,020
Tableau 9 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 4
L’ANOVA montre que l’algue et le type de souche ont un effet significatif avec une
marge d’erreur de 5% sur la croissance bactérienne (la valeur de p étant inférieure à 5%).
Cependant, cette fois l’interaction entre les deux facteurs n’est pas significative.
Les graphiques des figures 22 et 23 permettent de visualiser les résultats.
Il y a un effet positif
des microalgues sur
les bactéries.
Figure 22 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 4, toutes souches confondues.
Figure 23 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 4 à t0+6j., tous traitements confondus.
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La souche UB184 pousse significativement moins rapidement que les autres P.
syringae du groupe 4. Pour les autres souches, il y a très peu de différences significatives. A
nouveau, on ne voit pas d’effet particulier de la contamination sur les souches testées dans les
expériences du 15 et 16 septembre.
35
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DISCUSSION
Globalement, on observe des tendances générales en co-culture. Tout d’abord, on a
une diminution des populations de microalgues en co-culture avec des bactéries par rapport à
la culture pure. A l’inverse, on a une augmentation des populations bactériennes en culture
avec des C. reinhardtii 137 par rapport aux bactéries cultivées seules.
Ces résultats suggèrent un effet de transfert d’azote au sein des deux types de
populations : l’azote (sous forme de NH4Cl) est utilisé pour la croissance des microalgues
mais les bactéries que nous avons testées sont aussi capables d’utiliser ce dernier à leur profit.
Ceci expliquerait qu’il y ait plus de microalgues en culture pure : il n’y aurait pas de
compétition vis-à-vis de l’azote alors qu’en co-culture, les bactéries seraient plus compétitives
que les microalgues d’où une diminution de la population algale. De plus, les C. reinhardtii
permettent d’apporter du carbone dans le milieu par photosynthèse ce que ne sont pas
capables de faire les bactéries. Il y aurait donc une partie du carbone fixé par photosynthèse
qui serait utilisé par la population bactérienne en co-culture. La forme sous laquelle se fait ce
transfert (lipides, sucres, polysaccharides…) ne peut pas être identifiée dans ces expériences
mais ce mécanisme semble assez général puisque ces résultats sont observés chez l’ensemble
des bactéries et non uniquement chez les P. syringae.
Nous pouvons aussi imaginer un effet de compétition vis-à-vis d’autres éléments
nutritifs que l’azote, par exemple : le phosphore, le fer… Les bactéries ayant une vitesse de
croissance plus élevée, elles sont plus compétitives que les microalgues pour ces éléments en
quantités limitées dans le milieu, ceci expliquerait les résultats globaux obtenus.
De manière plus approfondie, au niveau des deux populations étudiées, on remarque
qu’il y a des différences significatives et d’autres pas. Les bactéries semblent plus sensibles au
fait d’être au sein d’une co-culture que les microalgues. Cependant, ces différences ne
semblent pas être dues aux caractères étudiés, à part, peut-être un rôle du phage. En effet, ce
phage détecté sur le génôme bactérien, proche de l’îlot de pathogénicité entraîne dans tous les
cas étudiés un effet significatif au moins sur l’une des deux populations microbiennes. Il
semble néanmoins difficile de faire un lien entre la présence de ce phage et les effets
observés : peut-être conviendrait-il mieux de faire un criblage de plus de souches possédant ce
dernier avant de faire des études plus poussées.
Des résultats assez inattendus comme celui-ci se sont aussi manifestés pour les
souches témoins, et notamment pour E. coli, qui était la seule bactérie non pathogène des
plantes et qui était significativement sensible à la présence de C. reinhardtii. Ceci
confirmerait donc le fait que les caractères pathogènes observés ne rentreraient pas en compte
dans les effets observés sur les populations de microorganismes.
Les résultats obtenus permettent de conclure que les caractères pathogènes étudiés ne
semblent pas jouer de rôle particulier dans les souches testées. Les effets observés sont ceux
induits par une co-culture « banale ». Il semblerait qu’il faille cribler un plus grand nombre de
souches pour être certain qu’ils n’interviennent pas dans les interactions avec les microalgues,
peut-être en association avec d’autres caractères absents dans les souches testées ici. Il est
donc possible que d’autres caractères que ceux étudiés rentrent eu jeu : il faudrait donc étudier
un plus grand nombre de ces caractères.
D’un point de vue technique, le protocole est améliorable. En effet, on observe des
différences entre manipulations qui montrent que ces dernières ne sont pas équivalentes entreelles. Ceci pose un problème au niveau de l’analyse statistique des résultats puisque nous
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sommes obligés de regrouper les manipulations équivalentes pour pouvoir comparer les
souches bactériennes, et nous ne pouvons donc pas comparer toutes les souches entre-elles.
Il serait donc peut-être préférable d’effectuer les manipulations au sein de
microplaques de 96 puits permettant de comparer un grand nombre de traitement en une seule
expérience. Cependant, nous avions testé cette possibilité au départ et le problème est qu’il y a
formation de biofilms de microalgues à la surface des puits, qui gêne le prélèvement et biaise
le dénombrement. L’agitation qui permet de disperser ces biofilms dans les tubes en verre
n’est pas possible en microplaques ce qui fait que nous avons abandonné ce choix. Cependant,
ce problème pourrait être contourné en utilisant des plaques avec des puits plus larges
(plaques à 12 puits) permettant de faire passer des barreaux aimantés, ce qui faciliterait
l’agitation des suspensions et donc éviterait la formation de biofilms. Ces plaques n’étaient
pas disponibles pendant le stage.
Pour pouvoir comparer plus de souches entre-elles, il faudrait cribler plus de souches
par manipulations. Cependant, il y a une limite de temps : il est difficile de cribler plus de dix
souches par jour, le dénombrement bactérien étant assez long. En effet, dix souches signifient
vingt tubes de cultures bactériennes pures, vingt tubes de co-cultures et deux tubes de
microalgues pures. Le dénombrement bactérien supposant des dilutions pour chaque tube, il
faut effectuer quarante suspensions de dilution et étaler neuf gouttes sur quarante boîtes de
Petri soit 360 gouttes, sans compter le dénombrement des microalgues, le dénombrement
après deux jours des bactéries sur boîtes de Petri et le traitement des résultats… Il semble
donc assez compliqué de cribler plus de dix souches par jour.
Pour finir, comme l’illustre l’exemple précédent, il faudrait mettre en place un
nouveau système de dénombrement bactérien. Ceci afin de diminuer le temps de manipulation
et afin de cribler plus de souches, mais aussi pour dépenser moins de consommables. Une des
techniques possibles pour dénombrer les bactéries rapidement et de manière fiable serait
d’utiliser le compteur de cellules avec un tube adapté à la taille des bactéries, avec un orifice
de 30 ou 50 microns. Ceci permettrait de compter tous les microorganismes grâce à la même
technique, ce qui serait plus cohérent au niveau de l’analyse des résultats.
Enfin, ces co-cultures sont des systèmes très simplifiés qui sont assez éloignés des
biofilms naturels. Des expériences avec des microalgues en biofilms sont prévues et
permettront d’aborder des interactions plus complexes qui tiennent compte de la structure
d’un biofilm.
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CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Afin de démontrer l’existence d’une interaction entre des bactéries et des microalgues,
un protocole relativement simple d’utilisation a été mis au point. Ce dernier permet de cultiver
mais aussi de suivre l’évolution des populations de microalgues et de bactéries au sein de
culture pure ou de co-culture. Il consiste à dénombrer les deux populations au début de
l’expérience puis au bout de six jours de culture : le comptage bactérien se faisant par
suspension-dilution-étalement, les microalgues quant à elles sont dénombrées grâce à un
compteur automatique de cellules.
La mise en pratique de ce protocole sur différentes souches de P. syringae ainsi que
sur la souche 137 de C. reinhardtii a permis d’obtenir un certain nombre de résultats. Nous
pouvons tout d’abord dire que globalement la croissance bactérienne de P. syringae est
modifiée par la présence de C. reinhardtii 137. Inversement, la présence de ces bactéries
modifie la croissance des microalgues. En effet, toutes souches bactériennes confondues, nous
avons observé une diminution significative des populations de microalgues en co-culture alors
que dans le même temps, les bactéries en présence de microalgues voyaient leurs populations
augmenter. Ce résultat global cache cependant des variabilités entre souches de P. syringae.
L’étude statistique montre que certaines différences, au niveau d’une population entre la
culture pure et la co-culture, sont significatives et d’autres pas. Les bactéries montrent plus
souvent des différences significatives entre culture pure et co-culture que les algues : les P.
syringae sont donc plus sensibles que les C. reinhardtii au fait d’être en présence d’une autre
population microbienne.
Nous en concluons qu’il existe bien une forme d’interaction entre les bactéries P.
syringae et des microalgues photosynthétiques que sont les C. reinhardtii. Cependant les
souches bactériennes testées à titre de témoin, qui n’appartiennent pas à l’espèce P. syringae,
peuvent montrer les mêmes effets sur les algues : nous observons probablement le résultat de
la compétition trophique pour une ou plusieurs ressources nutritives. De plus, l’examen des
différences significatives obtenues pour les P. syringae en regard de l’implication de certains
caractères pathogènes notamment la production de toxine, la présence de certains gènes
impliqués dans la pathogénicité ainsi que l’effet sur le tabac ne donnent pas de résultats. Les
caractères testés ne semblent pas intervenir dans les interactions observées. La seule
corrélation trouvée est le fait que quand la souche possède un certain phage proche de l’îlot de
pathogénicité, on observe un effet soit sur la bactérie, soit sur C. reinhardtii, soit sur les deux.
On ne connaît pas le rôle, ni l’histoire évolutive de ce phage et ce résultat ne signifie pas qu’il
existe un lien de causalité. Ces souches avec phage ont peut-être aussi, un autre caractère
qu’on ne connaît pas qui leur confère une capacité un peu supérieure à utiliser un des
nutriments du milieu, leur donnant l’avantage sur la microalgue.
Pour être élargis, les résultats globaux de cette étude doivent être complétés. Par la
suite, il faudra tester d’autres types de microalgues, et davantage de souches de P. syringae
avec plus de caractères pathogènes ou de combinaisons de ceux-ci, afin de rechercher d’autres
types d’interaction. Des tests plus élaborés sur des biofilms constitués, seront développés afin
de savoir si les P. syringae et les microalgues des biofilms interagissent dans ces conditions.
Les mécanismes qui engendrent ces interactions seront étudiés pour montrer l’implication ou
non du pouvoir pathogène dans les interactions bactéries / algues au sein des biofilms
Bien qu’améliorable notamment pour le comptage des bactéries, le protocole mis en
place au cours de cette étude pourra être réutilisé en vue de ces différentes perspectives.
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GLOSSAIRE
Biofilm : communauté de microorganismes qui se développe à la surface d’un solide dans une
matrice constituée de polysaccharides, protéines, acides nucléiques, lipides et autres
molécules.
Épilithe : qui se développe sur des roches.
Microalgue : ensemble des microorganismes photosynthétiques y compris les cyanobactéries.
Phage : virus bactérien. Dans notre cas, pour être plus rigoureux, il faudrait parler de
prophage puisque l’on cherche à désigner une partie du génome d’un phage.
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LISTE DES ANNEXES
Annexe 1 : Les différentes souches bactériennes étudiées et certaines de leurs propriétés ..... 43
Annexe 2 : La composition des milieux de culture utilisés...................................................... 44
Annexe 3 : Principe de fonctionnement du compteur de particules Beckman Coulter
Multisizer 3 .............................................................................................................................. 45
Annexe 4 : Correspondance souches/manipulations ................................................................ 46
42
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Annexe 1 : Les différentes souches bactériennes étudiées et certaines de leurs propriétés
1
HR : réaction d’hypersensibilité du tabac
avrE, hrpW, hrpL : gènes codant pour des protéines effectrices
3
hrpK, hrcC, hopl1 : gènes de structure du système de sécrétion de type III
4
INA : présence de la protéine permettant l’activité glaçogène (INA : ice nucleation activity).
2
43
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Annexe 2 : La composition des milieux de culture utilisés
Pour 1L de milieu TAT :
400 mg
NH4Cl
50 mg
CaCl2
100 mg
MgSO4
53 mg
KH2PO4
K2HPO4
106 mg
Eléments traces (BO3H3, ZnSO4, MnCl2,
< 0,1 mg
FeSO4, CoCl2, CuSO4, Mo7O24(NH4)6
Trizma base
2,42 g
../ Ajuster avec de l’eau distillée pour obtenir 1L de solution
../ Vérifier le pH qui doit être compris entre 7,2 et 7,4
../ Filtrer à 0,22 µm pour stériliser.
Tryptone
Peptone soja
Glucose
NaCl
K2HPO4
Agar
Pour 1L de milieu TSA/10e (tryptone soja agar) :
1,7 g
0,3 g
0,25 g
0,5 g
0,25 g
15 g
../ Ajuster avec de l’eau distillée pour obtenir 1L de solution
../ Autoclaver
../ Pour faire du TSB/10e (liquide) : ne pas mettre d’agar.
44
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Annexe 3 : Principe de fonctionnement du compteur de particules Beckman Coulter Multisizer 3
Un petit volume de la solution à mesurer doit être versé dans un liquide conduisant le courant (dans notre cas, une solution de NaCl à 0,9%).
Lorsque l’on effectue une mesure, un certain volume de notre solution est aspiré par l’appareil à travers un petit orifice. Ce dernier sépare deux
électrodes entre lesquelles un courant électrique est mesuré. Lors de leur passage par l’orifice, les particules en suspension dans la solution vont créer une
différence de potentiel (une particule remplaçant son volume de liquide conducteur). Le principe de l’appareil est que l’amplitude de la différence de potentiel
entre les deux électrodes est proportionnelle au volume de la particule qui engendre cette différence de potentiel. L’appareil peut donc compter le nombre de
particules dans un volume donné en dénombrant le nombre de différences de potentiel ainsi que le volume des particules selon l’amplitude de la différence de
potentiel.
En résumé, pour les volumes que nous utilisons :
45
L’évolution du pouvoir pathogène de la bactérie Pseudomonas syringae en présence de microalgues by DEBREYNE Valentin est mis à disposition selon les termes de la licence Creative Commons Paternité - Pas d'Utilisation Commerciale - Pas de Modification 2.0 France.
Annexe 4 : Correspondance souches/manipulations
Date de la manipulation (début de la culture :
t0)
01/09/2010
02/09/2010
03/09/2010
08/09/2010
09/09/2010
10/09/2010
14/09/2010
15/09/2010
16/09/2010
Souches bactériennes manipulées
P. syringae CC94.
P. syringae DC3000,
P. syringae B728a,
P. syringae 1448A.
P. fluorescens,
E. coli,
Erwinia.
P. syringae UB246,
P. syringae SZ131,
P. syringae UB184.
P. syringae SZ030,
P. syringae CC1504,
P. syringae UB313.
P. syringae UB295,
P. syringae TA043,
P. syringae CC0655.
P. syringae USA046,
P. syringae SZ046,
P. syringae CC1582,
P. syringae SZ035,
P. syringae CC0654,
P. syringae SZ145.
P. syringae Psy508,
P. syringae UB330,
P. syringae Psy642,
P. syringae CC1419,
P. syringae Psy cit7.
P. syringae SZ122,
P. syringae UB368,
P. syringae UB407,
P. syringae UB197,
P. syringae CC1418.
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TABLE DES FIGURES
Figure 1 : Schéma des habitats et des flux possibles de P. syringae dans l’environnement. ................................... 7
Figure 2 : Schéma représentant un exemple de dénombrement bactérien sur milieu solide en boîte de Petri ...... 13
Figure 3 : Evolution des populations microbiennes en fonction du temps. ........................................................... 14
Figure 4 : Intérieur de la chambre de culture où les co-cultures sont effectuées en conditions contrôlées ........... 15
Figure 5 : Procédure de contrôle de croissance microbienne en co-culture .......................................................... 15
Figure 6 : Dénombrements de C. reinhardtii 137 au compteur de cellules en fonction des valeurs attendues
calculées à partir d’une estimation par cellule de Malassez sur la suspension dense............................................ 17
Figure 7 : Dénombrements d’E. coli au compteur de cellules en fonction des valeurs attendues calculées à partir
d’une estimation par suspension-dilution-étalement ............................................................................................. 18
Figure 8 : Nombre de particules dans 500 µ L de suspension en fonction de leur « diamètre équivalent » qui
indique celui de la sphère de même volume que celui de la particule quelle que soit la forme de la particule..... 19
Figure 9 : Evolution de la population de C. reinhardtii 137 en fonction de la présence ou de l’absence de P.
syringae B728a dans le milieu de culture ............................................................................................................. 20
Figure 10 : Evolution du diamètre de C. reinhardtii 137 en fonction de la présence ou de l’absence de P.
syringae Psy642 dans le milieu de culture ............................................................................................................ 22
Figure 11 : Evolution de la population de P. syringae B728a en fonction de la présence ou de l’absence de C.
reinhardtii 137 dans le milieu de culture .............................................................................................................. 23
Figure 12 : Evolution du logarithme des populations de microalgues en fonction des manipulations (un
contaminant bactérien mineur était présent dans les expériences du 15 et 16 septembre) .................................... 26
Figure 13 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 1, toutes souches confondues .. 27
Figure 14 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 1 à t0+6j, tous traitements confondus ......... 28
Figure 15 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 1 en fonction de la présence ou de l’absence
de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls. ......................................... 28
Figure 16 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 2, toutes souches confondues .. 29
Figure 17 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 2 à t0+6j., tous traitements confondus ........ 30
Figure 18 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 2 en fonction de la présence ou de l’absence
de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls. ......................................... 30
Figure 19 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 3, toutes souches confondues .. 32
Figure 20 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 3 à t0+6j., tous traitements confondus. ....... 32
Figure 21 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 3 en fonction de la présence ou de l’absence
de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture. Résultats du test de Newman-Keuls. ......................................... 33
Figure 22 : Effet des C. reinhardtii 137 sur les souches bactériennes du groupe 4, toutes souches confondues. . 34
Figure 23 : Taux de croissance des souches bactériennes du groupe 4 à t0+6j., tous traitements confondus. ....... 34
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TABLE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Les caractères pathogènes des souches bactériennes ayant un effet significatif négatif sur
les populations de C. reinhardtii 137 .................................................................................................... 21
Tableau 2 : les caractères pathogènes des souches bactériennes ayant un effet significatif sur le
diamètre de C. reinhardtii 137 .............................................................................................................. 22
Tableau 3 : Les caractères pathogènes des souches bactériennes significativement sensibles à la
présence de C. reinhardtii 137 dans le milieu de culture ...................................................................... 24
Tableau 4 : Les effets induits par les souches bactériennes et leur sensibilité à C. reinhardtii 137 ..... 24
Tableau 5 : Résultats de l’ANOVA à un facteur sur les populations de C. reinhardtii 137 à t0+6j ...... 25
Tableau 6 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 1 ......... 27
Tableau 7 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 2 ......... 29
Tableau 8 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 3 ......... 31
Tableau 9 : Résultats de l’ANOVA à deux facteurs pour les souches bactériennes du groupe 4 ......... 34
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