TESTS DE RÉSISTANCE - test génotypique
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TESTS DE RÉSISTANCE 3 types : - test génotypique - test phénotypique - test phénotypique virtuel Seuls les tests phénotypiques peuvent permettre de déterminer si un virus est sensible ou résistant à un antirétroviral. I. LES TESTS GÉNOTYPIQUES Ils déterminent des codons sauvages, mutés ou mixtes (de population virale, sauvage et mutée). • Aspect technique: Plasma, extraction ARN virale, rétrotranscription de cet ARN en ADN, PCR amplifiant un fragment spécifique des gènes de la RT et de la Protéase. ARN et amplification sont positifs quand le titre d'ARN est > 500 copies/ml. Les techniques : - Techniques de référence séquence nucléotidique complète des gènes codant pour la RT ou la Protéase. - Technologie des puces : développée par affymétrix, d'abord rétro transcription de l'ARN en ADN double brin à l'aide d'amorces complémentaires contenant les séquences des promoteurs de l'ARN polymérase T7. L'ADN est alors secondairement transcrit par l'ARN polymérase T7 en présence de dUTP marqué à la fluorescéine. L'ARN fluorescent ainsi produit est coupé (chauffage) en petits fragments qui vont aller s'hybrider sur des "puces " recouvertes de milliers de sondes oligonucléotidiques. L'intensité de l'hybridation est mesurée par faisceau laser. - Troisième technique génotypique : la PCR sélective double amplification : une première PCR amplifie le gène de la RT, une deuxième PCR nichée utilise les amorces correspondant aux codons sauvages et mutés. Indications très limitées du fait du nombre de codons mutés. - Quatrième technique : le test LIPA Extraction de l'ARN à partir du plasma, rétro transcription, double amplification de la RT à l'aide d'amorces biotinylées. Les produits d'amplification sont hybridés à des sondes correspondant aux codons sauvages et mutés sur une membrane de Nylon. Information limitée aux codons représentés sur la bandelette. • Limites du génotypage - La plupart des méthodes ne permettent pas de détecter des variants viraux représentant moins de 20 % de la population virale totale. - Elles ne permettent pas de mettre en évidence les premiers variants mutés qui apparaissent après le début du traitement. à Interprétation complexe. Certaines mutations entraînent toujours une résistance (augmentation de la CI50) : T215Y , M184V, Y181C. Mais une mutation ne permet d'affirmer que les virus ont perdu in vivo la sensibilité aux composés : exemple : L74V,(DVI), V75A dont la présence entraîne seulement une augmentation de deux fois de la CI50. Enfin, phénomène possible de resensibilisation (AZT, 3TC). Grand polymorphisme naturel au niveau de certains des codons impliqués dans les résistances aux inhibiteurs de la protéase (10, 36, 63, 77…). D'où la nécessité d'une séquence de départ avant traitement. • Futur du génotypage : - Puces à ADN ? - Light Cycler ? - Phénotype virtuel ? II. LES TESTS PHENOTYPIQUES Ils permettent de définir la concentration de l'anti-rétroviral inhibant 50 % et 90 % de la réplication virale in vitro : ce sont les concentrations inhibitrices : 50 % et 90 % ; ces 50 et ces 90 sont exprimées en µM ou nM. La résistance se définie comme la capacité du virus à se multiplier en présence d'un composé inhibant la réplication d'un virus sensible donc augmentation des CI50 et CI90. Deux grands types de tests : - tests classiques - tests à virus dits recombinants • Le phénotype classique : Plusieurs techniques ont été développées aux États-Unis (ACTG), en France (AC11). 1) Isolement viral: impérativement isolement préalable du virus à partir des lymphocytes du sang périphérique ou du plasma. (limitation majeure de ce test). L'isolat viral du patient va être utilisé à plusieurs dilutions pour infecter des lymphocytes de donneurs sains, ceci en présence de plusieurs concentrations croissantes de l'anti-viral à tester et ceci en général en quadripliquette. 2) L'inhibition de la réplication : concentration de l'antigène p24 (ACTG) ou de la Reverse Transcriptase chaude (ARNS) ou froide – en cours d'évaluation – . La croissance de culture du virus, testée au 5ème, 7ème, 11ème jour et la lecture de l'activité en présence des inhibiteurs s'effectue au jour du pic d'activité de la RT dans les puits témoins. Le résultat est alors lu pour le titre viral qui correspond à 100.TCID50 dans les puits contenant les différentes concentrations de drogues et les CI50 et les CI90 sont déterminées. • Limites du phénotypage classique Chez les patients traités isolement viral négatif à partir du plasma Les lymphocytes peuvent contenir une majorité de virus provenant de cycle de réplication ancien. Émergence de la résistance détectable au niveau du virus plasmatique plusieurs semaines avant l'ADN proviral ? Problème technique et de coût évident. • Les tests phénotypes recombinants Mise au point, pour contourner le manque de sensibilité des tests phénotypiques. - première étape : après extraction de l'ARN à partir du plasma, amplification par PCR du gène de la transcriptase inverse du virus. - Co-transfection ou clonage de ce fragment du virus du patient dans des cellules réceptrices avec un clone viral non infectieux. - production d'un virus infectieux dont la RT (ou la Protéase) sont celles du patient. - le virus recombinant est cultivé en présence d'antirétroviraux sur des systèmes cellulaires. Tests commercialisés (virco, virologique). Le test virologique : repose sur un site unique de réplication virale, les ihibiteurs de protéase étant ajoutés au moment de la transfection dans les cellules réceptrices et les inhibiteurs de la RT dans les cellules cibles. En plus le gène de l'enveloppe est délété afin de ne permettre qu'un seul cycle de réplication. Limitation de ces tests recombinants : infrastucture importante, personnel nombreux, résultat en une dizaine de jours, très coûteux. • Interprétation des tests phénotypiques Ils permettent une mesure directe de la résistance. Les valeurs de CI50 et de CI90 ne sont pas comparables d'un test à l'autre. - varient en fonction des systèmes cellulaires, de l'inoculum viral, de la durée des tests. - une souche est résistante si les CI50 et CI90 sont multipliées par un facteur au moins égal à 4 par rapport à : les valeurs des souches sensibles ou la valeur de la souche avant traitement ou la valeur d'une souche de référence testée en même temps.
