Principe de la microscopie par absorption biphotonique
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Principe de la microscopie par absorption biphotonique Yves Usson La microscopie à 2 photons L’optique non-linéaire ou 1 photon + 1 photon = 1photon ! Yves Usson La microscopie à 2 photons Principe de la fluorescence Absorption e1 = hν1 e 1 > e2 λ1 < λ2 Emission e2 = hν2 Orbitale haute Orbitale basse Noyau Yves Usson Noyau La microscopie à 2 photons Principe de la fluorescence à 2 photons Absorption de 2 photons infrarouges Emission d’un photon visible e1< e2 et e1+e1> e2 e = hν λ1 > λ2 2 e1 = hν1 e1 = hν1 2 Orbitale haute Orbitale basse Noyau Yves Usson Noyau La microscopie à 2 photons Fluorescence 1 photon état excité Fluorescence 2 photons état excité σa ∆τ σa σs état de base section efficace σ1ph ~ σs 10-16cm2 Yves Usson état de base ∆τ, fenêtre de survie de l’état intermédiaire σ2ph ~ σsσa∆τ 10-18cm2 10-16cm2 10-15s La microscopie à 2 photons Absorption Bi-photonique Probabilité d’excitation bi-photonique : E2ph = P2 / (t.F) P = puissance moyenne t = durée d’impulsion F= fréquence de répétition Condition nécessaire pour l’absorption biphotonique : Une très haute densité en photons que ce soit d’un point de vue spatial (concentration par focalisation, objectif à grande ouverture numérique) ou d’un point de vue temporel (utilisation d’une source pulsée laser femto ou pico seconde) Yves Usson La microscopie à 2 photons Lasers pulsés temps 10ns 10ns P 100fs P 10ns 100 kW 20 W 100fs Mode continu Yves Usson temps Mode pulsé temps La microscopie à 2 photons Lasers accordables LASER USUEL milieu dispersif laser miroir Pompe miroir 99/1 LASER ACCORDABLE (690nm à 1015nm) Prisme milieu dispersif laser Pompe miroir 99/1 miroir Yves Usson La microscopie à 2 photons Lasers pulsés Aspect spectral et gamme d’excitation des fluorochromes Domaine temporel A Domaine spectral E T λ Oscillation continue, absence de localisation temporelle Oscillation continue, forte localisation spectrale A E T ∆λ=5 à 8nm λ Oscillation pulsée, localisation temporelle des impulsions Yves Usson Oscillation pulsée, étalement spectral La microscopie à 2 photons Lasers pulsés Compensateur de largeur d’impulsion 150 fs P1 Yves Usson 80 fs ajustement de la largeur P2 La microscopie à 2 photons Dispositif de microscopie bi-photonique LASER PULSE INFRA-ROUGE ACCORDABLE (690-1020 nm) MAO S LASER DE POMPE VERT UNITE DE BALAYAGE ET DE DETECTION Yves Usson STATIF DE MICROSCOPE La microscopie à 2 photons L’installation de microscopie confocale et bi-photonique du site IAB Source laser pulsée Tsunami/MilleniaVIII Yves Usson Microscope confocal Zeiss LSM510 NLO La microscopie à 2 photons Effet biphotonique Fluorescence 1 photon cône d’illumination (fluorescence !) solution de FITC excitation 488 nm objectif x10 Yves Usson Fluorescence 2 photons excitation 976 nm Spot Spot biphotonique biphotonique au au foyer foyer de de l’objectif l’objectif cône d’illumination (pas de fluorescence) La microscopie à 2 photons Microscopie photonique 3D Propriétés de sectionnement optique Absorption biphotonique Eliminer la lumière hors focale Créer de la lumière uniquement dans le plan focal AXE OPTIQUE Filtrage confocal Tache de diffraction en microscopie conventionnelle Yves Usson Lumière réfléchie - fluorescence Fluorescence Méthodes optiques Méthodes optiques non-linéaires Solution reposant sur la Solution reposant sur formation de l’image l’illumination La microscopie à 2 photons Photodégradation Fluorescence 1 photon Fluorescence 2 photons excitation 488 nm objectif excitation 976 nm gel de FITC émission fluorescente zone photodégradée Yves Usson La microscopie à 2 photons Photodégradation section xy Zone de photodégradation Fluorescence 2 photons GFP section xz Plan photodégradé 0,6 µm Yves Usson La microscopie à 2 photons Absorption bi-photonique Visualisation de molécules métaboliques par auto-fluorescence dans des cardio-myocytes en culture ‘in vitro’ Coupe optique d’une fibre myocardique Yves Usson NADH Excitation bi-photonique λ = 714nm Flavoprotéines Excitation mono-photonique λ = 488nm Crédits: K. Guerrero, A. Kuznetsov, Y. Usson La microscopie à 2 photons Absorption bi-photonique Visualisation de molécules métaboliques par auto-fluorescence Section optique axiale d’une fibre myocardique ‘in vitro’ Coupe XZ 50 µm NADH Excitation bi-photonique λ = 714nm Emission 420nm Yves Usson La microscopie à 2 photons Absorption bi-photonique Visualisation de molécules métaboliques par auto-fluorescence dans des hépatocytes en culture ‘in vitro’ NADH Excitation bi-photonique λ = 714nm Yves Usson Flavoprotéines Excitation mono-photonique λ = 488nm Crédits: A. Kuznetsov, Y. Usson La microscopie à 2 photons Respiration mitochondriale dans des hépatocytes en culture ‘in vitro’ contrôle substrat DHA découpleur complexe I substrat, octanoate substrat, oléate inhibiteur, roténone 1,4 1,2 1,0 0,8 NADH 0,6 FLAVO 0,4 0,2 0 Yves Usson contrôle DHA DNP octanoate oléate roténone La microscopie à 2 photons Application en milieu turbide Fluorescence 1 photon excitation 488 nm Fluorescence 2 photons objectif excitation 976 nm mileu diffusant émission fluorescente Yves Usson La microscopie à 2 photons Fluorescence 1 photon Fluorescence 2 photons excitation excitation émission émission diffusion raman diffusion raman Yves Usson La microscopie à 2 photons Résolution 1P vs 2P Absorption à 1P : linéairement proportionnelle à la puissance Distance de résolution à 1P : R976 nm = 2 x R488 nm Absorption à 2P : proportionnelle au carré de la puissance Distance de résolution : R(2P)976 nm = 1,37 x R(1P)488 nm Yves Usson Intensité du spot à 976 nm ≅ Probabilité d’absorption 1P à 976 nm Intensité du spot à 488 nm ≅ Probabilité d’absorption 1P à 488 nm Probabilité d’absorption 2P à 976 nm -0,5 0 0,5 La microscopie à 2 photons Conclusion Avantages de la microscopie à deux photons : Source laser infrarouge : -> grand pouvoir de pénétration dans les tissus faible diffusion et faible absorption -> rayonnement “inoffensif” pour les cellules vivantes -> accordabilité : autorise l’ajustement de l’excitation à un grand nombre de fluorochromes Absorption bi-photonique : -> confinement de la photodégradation au niveau du plan focal -> amélioration du rapport signal/bruit dans les coupes optiques sériées -> localisation assurée du “photobleaching” dans les expériences de FRAP et autres expérimentations reposant sur le photoblanchiment Yves Usson La microscopie à 2 photons
