UE 13 –Parcours N° 3 – Cours N°7
02/12/15
M. Philippe Girard.
philippe.girard@ijm.fr
RT : Pauline AUBRY
Clara AUBERTON
RL : Samy SI LARBI
Au cœur du vivant : la photonique au service de la
recherche en biologie et en médecine.
Plan :
I.
Introduction : l’imagerie médicale
a. Les techniques classiques
i.
ii.
iii.
iv.
Les Rayons X
L’échographie
La médecine nucléaire
L’IRM
b. Les nouvelles techniques : les techniques photoniques
i.
ii.
iii.
La lumière, généralités
Propagation des photons
Transillumination
II.
La microscopie de fluorescence
a. Principes de la fluorescence
i.
ii.
Généralités
Les marqueurs pour l’imagerie moléculaire
b. Microscopie « Plein Champ »
c. Microscopie Confocale
III-
La microscopie non linéaire
a. La microscopie biphotonique (ou multiphotonique)
IV-
La tomographie optique
a. OCT : Optical Coherence Tomography
b. OPT : Optical Projection Tomography
Abréviations : Ac : Anticorps
Mot du RT
I.
Introduction : l’imagerie médicale
Dans ce cours, nous allons voir les différentes techniques microscopiques qui deviennent
petit à petit utilisées en médecine.
A- Les techniques classiques
Il faut se demander à quoi sert cette imagerie, qui est différente de l’imagerie en biologie. Il
est possible d’observer le patient sans opération c’est-à-dire regarder un endroit particulier sans
l’ouvrir => méthode non invasive. Il est possible d’obtenir une représentation visuelle
d’informations médicales : signal en 1D, 2D, 3D, 4D (lorsqu’on ajoute le temps). Au sens large,
elles permettent d’acquérir et de stocker des données médicales. L’ordinateur est derrière
pour arriver à extraire des informations nécessaires à l’établissement du diagnostic et à des fins
physiologiques + thérapeutiques. Tout est lié au développement des ordinateurs.
Il existe 4 grandes familles de techniques d’imagerie :
-Radio X
-Echographie
-IRM
-Médecine nucléaire
Elles permettent notamment d’observer le sein et d’apprécier différents contrastes.
i.
Les Rayons X
Elles regroupent elles aussi différentes techniques. Chaque onde a une fréquence bien
définie, autour de 10^19 Hz (grande fréquence et faible en temps, c’est-à-dire période), il faut
les envoyer très rapidement. On regarde le coefficient d’atténuation, qui nous indique
comment les ondes sont absorbées par le milieu. La résolution est bonne 1/10 du mm. Mais
pour la biologie, elle ne sera pas adaptée. C’est un examen rapide et très répandu, cependant,
c’est un examen très irradiant (mais moins irradiant que le scanner). Il existe un nombre limité
de radios que l’on peut faire au cours d’une vie, sinon risque de modifications et cassures dans
l’ADN. On ne peut pas distinguer les différents tissus, ex : les tissus mous pas de contraste, on
ne voit pas le cartilage. Mais on peut distinguer l’os (blanc=opacité) et l’air (noir=hyperclarté).
Les RX sont très irradiants mais Goerges Charpak (prix nobel de physique 1992) a découvert
une méthode pour utiliser des RX à plus faible dose afin de réaliser une radio du corps
entier en 20min (Irradiation divisée par 10 en 2D et par 1000 en 3D). Cette radio est appelée
EOS. Il est nécessaire d’avoir plusieurs images en 2D pour créer du 3D. Sur un EOS, on peut
diagnostiquer de l’ostéoporose et il n’y a plus de problème de contraste parmi les tissus mous. Il
est donc possible de voir un cancer du sein.
ii.
L’échographie
Imagerie reposant sur le principe des ondes sonores. Ici, on utilise des ondes sonores
appelées ultrasons de 10^6 Hz (haute fréquence). On regarde l’impédance. C’est un examen
peu coûteux, non invasif, animé en temps réel avec un appareillage mobile.
Inconvénient : qualité de l’image, exemple : pas capable de voir sur le fœtus tous les éléments
de l’enfant. De plus, on ne peut pas voir quelque chose derrière l’os.
iii.
La médecine nucléaire
Imagerie nucléaire=Tomographie axiale par ordinateur=PET Scan=Scanner
Utilisation systématique d’un produit invasif isotope (++) qui émet des
rayonnements gamma de 5.10^19 Hz. On mesure la concentration de l’élément radioactif.
Résolution très bonne 2 à 5mm. Cette technique permet de rendre compte de phénomènes
relatifs au fonctionnement des cellules : imagerie métabolique.
Inconvénients : TRES irradiant + Limité aux régions où le radioélément va se fixer. Exemple :
témoin de glucose viabilité des cellules, si fixation tumeur. On ne sait pas aujourd’hui les effets à
long terme d’injections prolongées de produit isotope au sein de l’organisme pour faire des
scanners.
iv.
L’IRM
Elle repose sur des propriétés magnétiques. On aligne le moment bipolaire de chaque
molécule d’eau avec un champ magnétique puissant puis on l’éteint et on observe la relaxation
de chaque molécule qui donne des informations structurales et fonctionnelles. On utilise 1,5
teslas pour les IRM faibles (mais c’est quand même 30000 fois le champ magnétique terrestre),
3 teslas pour les IRM plus puissantes.
Résolution en mm, bien pour le corps humains. On distingue les différents tissus mous mais
on ne peut pas le faire avec les tissus durs. On peut faire des coupes en 3D.
Inconvénients : Coûts très élevé, l’examen est très lent, inconfortable pour le patient. On
peut combiner cette technique avec d’autres techniques. Exemple : on peut voir les vaisseaux
sanguins avec une angiographie IRM. Autres techniques : IRMd et IRM fonctionnelle (prise en
compte du temps dans l’IRMf, on peut faire du 4D)
Le scanner permet de faire du 4D mais limite en temps car il faut acquérir vite, la résolution en
prend alors un coup. En IRM, on peut aussi faire du 4D pour étudier des lésions ex : SEP
(Sclérose en plaques).
B- Les nouvelles techniques : les techniques photoniques
 Les Techniques photoniques de l’UV aux IR (diapo passée vite par le prof)
-
Tomographie : Tomographie Optique Cohérente (OCT) (machine fréquente chez
l’ophtalmo) + Tomographie Optique par Projection (OPT)
-
Imagerie par fibre optique : Microendoscopie + Microendoscopie confocale +
Microendoscopie biphotonique
-
Imagerie biphotonique intravitale sur la peau et cerveau mais il faut ouvrir le crâne.
i.
La lumière, généralités
Pour bien comprendre ce qu’est l’imagerie en biologie il est nécessaire de comprendre la
lumière.
Problème du XXème siècle : lumière dualité onde - corpuscule? Aujourd’hui, on connaît
l’existence de photons mais on ne sait toujours pas si elle est onde ou corpuscule. Finalement, le
choix dépend des cas.
Le comportement ondulatoire apparait avec un certain nombre d’impacts et un nombre
de photons bien définis. Plus les photons sont nombreux, plus le contraste est meilleur, plus on
opte pour le choix du corpuscule. L’aspect granulaire de la lumière est révélé par l’interaction
avec la matière: chaque point correspond à la marque d’un photon. A très faible intensité, les
points semblent se répartir de façon aléatoire sur l’image. Quand l’intensité augmente, le
caractère de quanta disparaît.
Il s’agit toujours d’un paquet de corpuscules (=les quanta) qui va
se propager en vagues. Les ondes propageant les photons sont
caractérisées par une longueur d’onde souvent en nm + une
fréquence en Hz. Relation entre longueur d’onde et fréquence
E=h*=(h*c)/
  est inversement proportionnel à 
ii.
Propagation des photons
3 différentes interactions photon/tissu
1. Réflexion : les rayons arrivent sur le tissu et repartent en sens inverse.
2. Absorption : signifie transformer le photon en énergie, le tissu a absorbé de
l’énergie.
3. Transmission : ballistique ou diffusion
-> Ballistique : Le rayonnement traverse le tissu sans effet.
->Diffusion : Il s’agit d’un changement de direction des photons dès leur entrée dans le
tissu cible. C’est l’effet généralement prédominant. On perd en intensité et on diminue de
manière exponentielle. Plus le tissu est dense plus on va avoir du mal a pénétrer dans le
tissu. Problème en imagerie car on se retrouve incapable d’emmener des photons loin dans
le tissu. On ne peut pas travailler en profondeur.
La lumière peut schématiquement s’utiliser de trois manières.
1. La transillumination : émission de photons et recueil de ceux qui traversent les
tissus: Au bout de leur parcours, l’analyse des diverses modifications qu’ils ont subies
dessine une image de la structure interne traversée. (source de lumière et détecteur
du côté opposé)
Ex : lorsqu’on expose un doigt à de la lumière blanche, il
devient rouge. On pourrait penser que c’est à cause du sang
mais ce n’est pas la première raison. Pour qu’il apparaisse
rouge, les seules photons qui vont aller le plus en profondeur
c’est ceux qui correspondent a une certaine couleur, en
l’occurrence qui sont dans le rouge 650nm et au delà. Les
faisceaux sanguins accentuent ce phénomène.
2 et 3. Emission de photons sur un tissu et recueil des photons qui ont été ré-émis par un
mécanisme de réflexion (pas vu en cours) ou ceux émis par un mécanisme de
fluorescence. (source de lumière et détecteur sont placés du même côté)
iii.
Transillumination
Technique pas invasive (lumière->innocuité), on peut l’utiliser autant de fois qu’on veut.
La lumière est fortement absorbée dans le tissu donc elle se combine avec d’autres techniques et
ne peut pas prétendre supplanter toutes les autres techniques, c’est un complément. On utilise
une fenêtre de transparence du tissu où on voit le coefficient d’absorption en fonction des
différentes ondes. Ce qui permet de choisir au mieux sa fréquence d’onde.
Fœtus de souris avant et après traitement : souris transparentes. On imagine possible le fait de
rendre transparent des objets.
A l ‘échelle du corps humain, composé de 70% d’eau, la lumière est rapidement absorbée, la
fenêtre de transparence des tissus varie entre 0,6 et 1,2 μm (600 à 1200 nm).
La transillumination est surtout utilisée pour le sein. Image 3D du sein pour déceler des
lésions et de cancers. Autres méthodes par Hamamatsu mais pas de bonnes résolutions. On peut
toujours avoir recours à des agents de contraste : ICG (vert d’indocyanine) pic d’absorption
à 800nm, confiné dans le secteur vasculaire donc on sait le nombre de molécule a ce niveau là.
Il permet d’avoir une meilleur résolution ex : voir les vaisseaux. C’est un produit bénéficiant de
l’AMM.
Avec ICG, il faut utiliser un autre appareillage (compused
tomography laser mammography (pour de la mammo)). Ce
marqueur va spécifiquement reconnaître certaines cellules et
permettre de déceler des cancers.
Questions test :
1. Quelle est la technique d’imagerie optique parmi cette
liste ? Confocal
2. Quel est l’effet prédominant sur les photons dans
l’interaction tissu/lumière? Diffusion
3. Quelle est la zone de transparence des tissus biologiques ?
0,6/1,2micron (soit 650nm : IR)
C- La microscopie de fluorescence
A- Principes de la fluorescence
i.
Généralités
=>luminescence : indique l’effet d’un photon qui apparaît (++)
=>le terme avant dit la cause : photon absorbé pour relâcher un autre photon
Chimiluminescence : réaction chimique qui va relâcher un photon
Bioluminescence : réaction enzymatique
Thermoluminescence : température
Electrectoluminescence : électrique
Photoluminescence : phénomène radiatif consécutif à une excitation lumineuse.
Le photon lui même garde la même énergie mais change de trajectoire.
Quand un photon rencontre une molécule, il peut être (réfléchi ou transmis)=pas d’effet, ou
absorbé.
Etats d’énergie possibles et d’autres non pour chaque atome. L’orbite est constitué de
petits états proches les uns des autres donc plus complexe.
Lorsqu’un atome absorbe un photon, le photon véhicule
de l’énergie (le photon est transformé en énergie).
L’atome acquiert un surplus d’énergie, il est obligé
de passer sur un état excité S1 ou S2. L’électron a le
droit d’absorber le photon seulement si le photon
est de bonne énergie. S’il a une énergie pas suffisante
il ne l’absorbe pas, et s’il a une énergie pour passer d’un
état de S1 au S2, le photon est obligé de donner toute
son énergie. Transfert en 10^-15secondes donc très
rapide.
->Seuls les photons dont le quantum d’énergie
correspond à un niveau d’énergie autorisé de la
molécule peuvent être absorbés.
Les états S1 et S2 ont toujours une gamme de
petits états, le photon a le droit de passer de l’un a
l’autre. Lorsque l’électron va aller sur son état excité, il
va vouloir retourner sur son état fondamental donc sur
le temps où il reste sur son état excité, il a besoin d’énergie=relaxation vibrationnelle (il va
perdre de l’énergie en vibrant). Il va donc passer sur son état excité le plus bas possible puis
sur son état fondamental. Il en ressort la fluorescence, il émet un photon qui a une
énergie plus basse que le photon qui lui a permis de grimper. Ce décalage permet la
fluorescence. Il n’est pas obligé de faire de la fluorescence
(d’excitation)< (d’émission)
On va avoir un spectre d’absorption et un spectre d’émission. S’il ne va pas sur son état
excité le plus bas assez vite, il va directement sur son état fondamental. Il ne peut rester dans
son état excité que de 10^-11 a 10^-12s. Donc il n’est pas obligé d’aller sur son état excité le plus
bas.
Le spectre absorption est la probabilité d’émettre
un photon, elle se situe au maximum de cette
courbe.
On est capable de mettre une sorte de filtre qui va
séparer les longueurs d’onde les plus faibles des plus
longues. Séparer les photons d’émission des photons
d’absorption. C’est important si on veut voir que les
photons qui sont émis et non ceux qui sont absorbés.
C’est la base du microscope à fluorescence. Le décalage
entre les maxima sur les 2 spectres est le
« déplacement de Stokes ». La détection d’une
espèce fluorescente est d’autant plus facile que le
déplacement de Stokes est grand (marge pour le
filtre). Plus l’énergie est basse plus on augmente la longueur d’onde (++)
->On va toujours exciter avec une source lumineuse de plus faible longueur d’onde et on
va regarder les longueurs d’onde plus hautes.
ii.
Les marqueurs pour l’imagerie moléculaire
3 grandes familles :
-Les molécules organiques
-Les protéines autofluorescences : GFP et ses dérivées
-Les nanos cristaux semi-conducteurs : quantum dots
-La stratégie pour marquer la protéine d’intérêt d‘utiliser un immunomarquage qui va
reconnaitre les protéines d’intérêt. Soit on met un Ac qui va reconnaître N term ou C term et un
Ac qui va reconnaître le premier Ac grâce au fait qu’il soit marqué avec un moyen de
fluorescence. Le problème est de marquer quelque chose dans la cellule car les Ac ne rentre
pas dans la membrane donc on rend la membrane poreuse pour mettre les Ac à l’intérieur
des cellules, c’est très invasif (donc pas transposable chez le vivant). On fait une fixation avant,
on gèle la cellule puis on utilise des molécules qui vont tuer la cellule mais en la laissant telle
quel quand on a la fixé.
Des molécules peuvent traverser la membrane et reconnaissent spécifiquement des parties de
l’ADN (comme le DAPI) mais le problème est qu’ils ne sont pas biocompatibles, ils restent dans
les cellules et peuvent induire des changements à l ‘intérieur des chromosomes.
-Les protéines fluorescentes : Le chromophore va fournir l’électron qui va avoir tendance a se
d’exciter. On est capable de faire plusieurs couleurs. GFP était pas suffisamment fluorescence
donc on a amplifie le rendement. On va produire de l’ADN dans les différents organismes et on
leur faire produire des protéines couplées avec cette protéine la. Il en résulte une protéine
marquée au chromophore.
- Les quantum dots, plus c’est petit, plus on va fluorescer dans le bleu, si gros en rouge.
Marquage de cellule avec 4 couleurs. Plusieurs couleurs dans une cellule donc on utilise des Ac
car on ne sait pas faire une molécule qui reconnaît spécifiquement une molécule d’intérêt
sauf anticorps. Les traceurs qui sont sur le marchés sont utilisés pour faire des tests on les
utilise sur des patients qui ont accepté. La seule gamme de marqueur qu’on est capable
d’utiliser pour l’instant bleu de méthylène et le vert d’indocyanine.
Marqueur qui va reconnaître les cellules cancéreuses. On commence à voir des objets par
fluorescence.
Fluorescence de la protoporphynine IX.
Autofluorescence, fluorescence émise par des molécules déjà fluorescentes dans l’organisme, il y
en a mais avec un débit très faible : NADPH, flavine, collagène, élastine.
marquage aux nanos cristaux semi conducteurs : quantum dots
de cellule : noyau ; mitochondries ; microtubules ; filaments d’actine
B- Microscopie « Plein Champ »
->Microscopie « plein champ » ou en épifluorescence.
Le décalage entre le spectre d’émission et
d’excitation permet de placer un filtre. On éclaire
l’échantillon avec une lumière collimatée. Pour cela, on
focalise la lumière dans le plan focal arrière de l’objectif.
Le jaune est réfléchi par le miroir, l’objectif va condenser
les faisceaux vers l’échantillon, les photons vont pouvoir
exciter des électrons ou pas, puis quand les électrons vont
s’excité, ils vont envoyer des photons dans la gamme du rouge => phénomène de fluorescence.
Lorsque les photons atteignent le miroir dichroïque, seules les longueurs d’onde au dessus
de 600nm (rouge) vont pouvoir passer contrairement au jaune. On va collecter uniquement
ce qui a été émis par fluorescence. Les éléments qui nous permettent de faire de la microscopie
de fluorescence sont un filtre d’excitation, un miroir dichroïque, un miroir d’émission.
La microscopie de fluorescence in vivo permet de visualiser des tumeurs, du flux sanguin et du
flux lymphatique.
La résolution dépend de l’ouverture numérique et de la longueur d’onde
3 phénomènes qui font que le rendement est très faible :
-Les photons émis vont dans toutes les directions donc lorsque l’on récupère de la fluorescence
on collecte uniquement ce qui est arrivé vers le détecteur.
-Les lentilles du microscope sont de dimension finies. La résolution du microscope est de
200nm pour les meilleurs on ne peut pas aller en dessous, c’est-à-dire qu’on ne peut pas
distinguer deux molécules à une distance inférieure à 200nm. Or une molécule est de l’ordre de
nm ou de quelques nm.
-Un autre problème est du fait de focaliser à un endroit précis, le devant et le derrière sont
flous. Autour des zones nettes on a des zones de floues car quand on excite l’échantillon, toutes
les molécules qui sont sur le trajet de faisceau laser sont potentiellement excitables. L’électron
en se désexcitant va émettre de la fluorescence ce qui rend l’image floue.
Si on place un mur avec un petit trou, on est capable d’enlever la plus grosse partie du flou car
toute la fluorescence qui provient du plan focal va passer à travers ce trou et la fluorescence au
dessus et en dessous vont passer dans le trou mais très faiblement donc on réduit la partie floue.
Il va y avoir un effet de bruit mais il est très faible. Plus le signal d’intérêt passe, plus le bruit
diminue. (ce concept est également valable pour la Microscopie Confocale). On ajoute donc un
diaphragme (« pinhole »), plus on le rétréci plus la résolution sera meilleure sera bonne et plus
le bruit sera diminué.
Aujourd’hui, développement du microscope « plein champ » et des marqueurs. Il existe un
microscope avec une sonde détachable ce qui est plus pratique. Visualisation des tumeurs, grâce
à des marqueurs qui reconnaissent spécifiquement ces cellules tumorales. Cependant, on ne
peut voir si un pontage fonctionne ou pas.
C- Microscopie Confocale
Notre objet est dans le plan focal.
Seul un tout petit volume de l’objet est illuminé
(volume focal). L’illumination totale de l’objet se fait par balayage du volume focal. Elle permet
d'obtenir des images de grande résolution qui sont comme des coupes "optiques" d'une
épaisseur d'environ 0,4μm, obtenues à différents niveaux dans l'épaisseur d'un échantillon. On
va scanner l’échantillon. On s’astreint des phénomènes de flou ce qui permet de faire de la 3D.
On fait des coupes successives d’images 2D, des logiciels permettent de visualiser des coupes en
3D.
Cette technique est utilisée en dermato + ophtalmo, observation des lésions pigmentées et non
pigmentées, évaluation de l‘eczéma, psoriasis.
Aujourd’hui, on utilise souvent l’infrarouge, et on regarde ce qui se passe dans la peau. Des
fibres optiques les unes à côte des autres permettent d’aller plus loin en profondeur.
Aide au diagnostic : cancer de la peau ou formes précoces de cancer de la peau. : mélanome mais
il suppose qu’on ait injecté sur la peau un agent de contraste de la fluorescence.
Observation des cicatrisations, brûlures, maladie inflammatoires.
Endomicroscopie confocale = Microscopie Confocale fibrée : évite de faire des biopsies, 12
images par seconde.
QCM moodle :
1. D’ou vient la fluo ? Absorption puis désexcitation
2. Comment peut on avoir des zones plus nettes sur une image ? en utilisant un diaphragme
3. Existe-t-il des marqueurs moléculaires cliniques utilisables sur l’homme ? Oui
II.
La microscopie non linéaire
A- Microscopie biphotonique (ou multiphotonique)
PRINCIPE :
Les techniques de microscopie vues ci-dessus sont qualifiées de microscopie monophotonique :
on envoie un seul photon pour faire passer l’électron de son état fondamental à un état excité.
En microscopie non linéaire, on parle de microscopie biphotonique : on envoie 2 photons.
Il y a 2 conditions pour obtenir une image en microscopie non linéaire : il faut que la somme des
énergies des 2 photons soit égale à l’énergie d’excitation du marqueur et que les 2 photons
arrivent au même endroit au même moment (probabilité extrêmement faible, mais augmentée
au niveau du plan focal : on considèrera que cette rencontre ne peut avoir lieu que dans le plan
focal).
Cependant cette probabilité reste très faible même au niveau du plan focal, pour l’augmenter, on
utilise des lasers pulsés (contrairement à la microscopie confocale où le laser est continu) : on
envoie des pulses de « paquets » de photons afin de concentrer les photons à un moment précis
(attention il y a en moyenne autant de photons envoyés que dans un laser continu !!! Ils sont
juste répartis différemment).
Chaque photon doit avoir une énergie égale à la moitié de celle nécessaire à l’excitation du
marqueur, la longueur d’onde du faisceau doit donc être doublée par rapport à celle utilisée en
microscopie monophotonique.
Ex : si un marqueur s’excite à 450nm, en microscopie monophotonique on utilise des photons de
longueur d’onde 450nm ; et en microscopie biphotonique on aura des photons de longueur
d’onde de 900nm.
Alors qu’en monophotonique on utilise des lasers de l’UV et du visible, en biphotonique on
utilisera des lasers de l’IR  zone de meilleure traversée des tissus car moins de phénomène de
diffusion, meilleure profondeur d’observation (fenêtre de transparence des tissus : 6001200nm).
AVANTAGES :
- Profondeur d’exploration plus grande (jusqu’à 1mm) : moins de diffusion, les photons
vont plus loin dans les tissus
- Volume focal plus petit (on observe un point qui correspond au plan focal, en
microscopie monophotonique on observe un trait : on excite aussi les électrons tout au
long du parcours du photon)
- Moins de perte de lumière (il y a moins de flou, on n’a donc pas besoin de pinhole)
- Pas de photoblanchiement hors du plan focal
Photoblanchiement : les marqueurs fluorescents ne vont pas s’exciter de manière continue. Ils
vont être excités jusqu’à certains moments où ils ne pourront plus être excités -> ils ont en
quelques sortes un temps de vie, ie un nombre limité d’excitations. Si on excite trop les
marqueurs, leur temps de vie diminue. . En n’excitant pas (ou très peu) les marqueurs en dehors
du plan focal, on évite ce phénomène. (Le photoblanchiement augmente avec une longueur
d’onde d’excitation plus faible car énergie plus élevée)
APPLICATIONS :
- Etude du cerveau chez la souris
- Etude des mouvements morphogénétiques et clivages dans l’embryon de drosophile
- Etude chez l’humain (pas besoin de fluorescence, on utilise l’organisation en réseau du
sarcomère pour avoir une image car les fibres sont alignées dans le même sens) : On
injecte avec une aiguille endoscopique qui va avoir une fibre optique ou des objectifs
miniaturisés au bout. On va ainsi pouvoir suivre au cours du temps l’évolution lors de la
contraction du muscle du sarcomère
 C’est adaptable à l’homme mais on est loin de pouvoir l’utiliser : on a toujours ce
problème de marqueurs fluorescents et les lasers sont très couteux.
QCM moodle :
- La probabilité d’exciter un marqueur fluorescent avec 2 photons est plus grande qu’avec
un photon. FAUX
-
Pourquoi le photoblanchiement est-il plus faible en microscopie biphotonique ? On
n’excite pas en dehors du plan focal et longueur d’onde augmente.
IV. La tomographie optique
A- OCT : Optical Coherence Tomography
OCT = tomographie à cohérence optique
PRINCIPE :
On sélectionne les photons ballistiques dans un milieu diffusant (ceux qui sont réfléchis) ;
équivalent de l’imagerie ultrasonore mais en remplaçant les ondes mécaniques par la lumière.
On mesure l’amplitude et le temps de parcours de la lumière réfléchie sur le tissu, en
comparaison avec la lumière sans obstacle.
 On s’intéresse au retard que vont avoir les photons en traversant les tissus d’une
manière réfléchie.
Il s’agit d’une technique d’imagerie bi ou tri dimensionnelle sans contact, utilisant les
interactions de la lumière.
Le laser envoyé est divisé en 2 faisceaux par un séparateur : une partie est envoyée sur un
miroir placé à une distance définie (faisceau de référence), l’autre partie rencontre le tissu.
Il va y avoir interférence entre le faisceau réfléchi par le miroir et le faisceau réfléchi par
l’échantillon contenu dans le volume limité dû au décalage temporel entre les 2 faisceaux. La
distance entre le miroir et l’échantillon est identique.
On est capable de détruire une onde en la faisant rencontrer une onde totalement opposée,
déphasée, ce qui donne une droite. On observe sur l’écran des franges claires : superposition
des 2 ondes (pas de décalage, elles n’en forment qu’une), et des zones sombres : ondes
opposées qui s’annulent, ce qui permet d’obtenir une figure d’interférence qui nous permet de
remonter aux propriétés du tissu.
La résolution est assez bonne (1,5 microns), et on peut avoir une image en 1D, 2D ou 3D.
Le laser utilisé est plutôt dans la gamme des IR, on a donc une faible absorption par les tissus.
APPLICATIONS :
- Ophtalmologie : l’OTC correspond au fond d’œil couramment utilisé pour observer la
rétine
- Imagerie cardiovasculaire : OTC endoscopique effectue une image 3D de l’artère pour
visualiser une sténose par exemple
- Etude de cerveaux de rats, pour visualiser la myéline
Application au cerveau humain : mise en place d’un protocole d’imagerie :
Sur des échantillons de cerveau épileptique ou tumoral, imagerie OTC puis procédure
classique d’histologie  comparaison entre les coupes histologiques et les images OTC : on
valide que l’OTC est aussi utile que l’histologie et moins invasive : l’histologie implique des
traitements chimiques pouvant endommager le tissu.
On peut combiner l’OTC au Doppler, ce qui permet en plus de visualiser le flux sanguin.
AVANTAGES DE L’OTC DANS L’ETUDE DU CERVEAU :
- Aucun agent de contraste ou chromophore nécessaire
- Images avec un champ de vue large obtenues en quelques minutes
- Améliore les soins aux patients dans le cancer et dans les maladies nécessitant une
résection chirurgicale complète (épilepsie) : on agit directement sur le patient, pas de
biopsie, non invasif
- Résolution cellulaire peropératoire pour l’amélioration de la médecine personnalisée
pour les maladies nécessitant une résection chirurgicale complète : permet de retirer
uniquement le tissu lésé
B- OPT : Optical Projection Tomography
OPT = tomographie à projection optique.
Il s’agit d’une technique pas encore utilisée pour l’être humain car on travaille sur des objets
de la taille du mm au cm, mais qui peut être intéressante sur un organe précis.
Ne nécessite ni agent de contraste, ni marqueur fluorescent.
PRINCIPE :
On fait tourner l’objet ou les détecteurs. On effectue une reconstitution avec les images obtenues,
en jouant sur le contraste de la lumière ayant traversé l’objet : on étudie l’équivalent de l’ombre
de l’objet, sa projection.
L’OPT reprend le même principe que le CT-scan avec de la lumière visible.
/ !\ En tomographie, comme en IRM, on utilise beaucoup de calculs informatiques pour
reconstruire les images, l’évolution de ces techniques consiste donc principalement à
l’amélioration des ordinateurs.
APPLICATIONS :
- Etude de l’embryon de souris. Attention : on doit rendre cet embryon transparent pour
pouvoir étudier les structures internes.
- Imagerie cellulaire
On peut combiner l’OTC et la fluorescence (ou autofluorescence) : on obtient la forme 3D de
l’objet et la visualisation des différents objets marqués (mais nécessite de rendre les tissus
transparents  très invasif, donc non transposable chez l’homme).
CONCLUSION SUR L’OTC :
- OPT : version optique du x-ray CT
- Reconstruction générique génère des données 3D à partir de projections 2D
- OTP fournit une bonne résolution isotropique sur des échantillons fixés et rendus
transparents
- Utile pour étudier les motifs d’expression des gênes
- En imagerie du vivant, la résolution cellulaire n’est pas encore obtenue
- …Mais les motifs d’expression des gênes, la morphologie et les mouvements tissulaires
peuvent être observés sur plusieurs heures au cours du développement
QCM moodle :
-
Peut-on utiliser l’OTC sur l’être humain ? Oui
-
Quelle est la différence entre l’OPT et le CT scan ? L’intensité de la source
-
Peut-on utiliser l’OTP en profondeur ? Oui même si on utilise un moyen de rendre les
objets transparents
FICHE RECAPITULATIVE
4 grandes techniques classiques :
-Les Rayons X : observation du coefficient d’atténuation, bonne résolution (1/10e du mm),
examen rapide et répandu, mais irradiant +
-L’échographie : on regarde l’impédance, peu coûteux, non invasif, animé en temps réel avec un
appareillage mobile, mais qualité mitigée et impossible de voir derrière l’os
-La médecine nucléaire : mesure de la concentration de l’élément radioactif injecté, bonne
résolution, mais irradiant +++ et limité aux régions où le radioélément va se fixer
-L’IRM : propriétés magnétiques du proton de l’eau, bonne résolution, distinction tissus mous
mais pas pour les durs, cout élevé et examen long
Lumière = dualité onde-corpuscule, on jongle entre les 2 représentations selon le cas
E=h*=(h*c)/
3 différentes interactions photon/tissu
1.
Réflexion : les rayons arrivent sur le tissu et repartent en sens inverse.
2.
Absorption : signifie transformer le photon en énergie, le tissu a absorbé de l’énergie.
3.
Transmission : -> Ballistique : Le rayonnement traverse le tissu sans effet.
->Diffusion : Il s’agit d’un changement de direction des photons = effet
prédominant qui fait que l’on ne peut pas travailler en profondeur dans les tissus
3 utilisations de la lumière :
Transillumination : émission de photons et recueil de ceux qui traversent les tissus
->Lumière pas invasive mais doit rester un complément
->Fenêtre de transparence des tissus : 0,6 et 1,2 μm
Réflexion : photons qui ont été ré-émis sans être absorbé
Fluorescence : photons qui ont été ré-émis avec une énergie moins élevée
Le décalage entre les maxima des spectres d’absorption et d’émission est le « déplacement de
Stokes ». Il est nécessaire à la fluorescence tout comme le fait que l’énergie du photon doit
correspondre à la différence entre niveaux d’énergie de l’électron qui doit être excité.
3 grandes familles de marqueurs: Les molécules organiques, les protéines autofluorescences
(GFP et ses dérivées), les nanos cristaux semi-conducteurs (quantum dots)
Microscopie biphotonique -> 2 photons -> énergie de chacun /2 donc λ x2 (IR)
Nécessité d’utilisé laser pulsé pour que les photons arrivent au même endroit au même moment
et en quantité suffisante pour que cela puisse être visible avec le detecteur de fluorescence.
Avantages :
Profondeur d’exploration plus grande (jusqu’à 1mm) : moins de diffusion, les photons
vont plus loin dans les tissus
Volume focal plus petit (on observe un point qui correspond au plan focal, en
microscopie monophotonique on observe un trait : on excite aussi les électrons tout au long du
parcours du photon)
Moins de perte de lumière (il y a moins de flou, on n’a donc pas besoin de pinhole)
Pas de photoblanchiement hors du plan focal
OCT : joue sur le principe de l’interférence entre le faisceau réfléchi par un miroir (0 obstacle) et
le faisceau réfléchi par l’échantillon dû au décalage des 2 faisceaux -> phénomène ondulatoire
OPT : joue sur le contraste de la lumière ayant traversé l’objet, sa projection -> équivalent du PT
scan avec de la lumière visible