Diagnostic - Gustave Roussy

Cancérologie moléculaire :
place de la pathologie moléculaire
Julien ADAM
Jean-Yves SCOAZEC
Service de pathologie morphologique et moléculaire
Département de Biologie et Pathologie Médicales
AMMICa, CNRS UMS3655/INSERM US23
INSERM U981
Gustave Roussy, Villejuif
Le pathologiste : un rôle essentiel
• Le diagnostic de cancer repose sur le
pathologiste
• La prise en charge du malade nécessite une
preuve anatomopathologique
Les apports du pathologiste
• Diagnostic
– Apporter la preuve du cancer
– Identifier, nommer et classer le cancer
– Contribuer à :
• déterminer le stade évolutif (bilan d’extension)
• évaluer le risque évolutif (pronostic)
– Aider à la prise en charge thérapeutique
• Dépistage et prévention
– Diagnostiquer les lésions précancéreuses
• Biologie des tumeurs
– Recherche translationnelle
– Transfert de nouveaux outils diagnostiques
Les apports de la pathologie moléculaire
• Diagnostic
– Apporter la preuve du cancer
– Identifier, nommer et classer le cancer
– Contribuer à :
• déterminer le stade évolutif (bilan d’extension)
• évaluer le risque évolutif (pronostic)
– Aider à la prise en charge thérapeutique
• Dépistage et prévention
– Diagnostiquer les lésions précancéreuses
• Biologie des tumeurs
– Recherche translationnelle
– Transfert de nouveaux outils diagnostiques
Les outils et les techniques
• Les techniques conventionnelles
– Histologie
– Histochimie
– Analyse ultrastructurale
• Les techniques d’analyse moléculaire in situ
– Immunohistochimie
– Hybridation in situ chromogénique
– Cytogénétique moléculaire in situ (FISH)
• Les techniques d’analyse moléculaire après extraction
d’ADN
– Séquençage (NGS)
– CGH array
Outils d’analyse pour le pathologiste
Analyse
Informations
Application dans les cancers du poumon
Macroscopique
(pièces opératoires)
Taille, extension tumorale
Limites d’exérèse
Préparation et sélection pour
analyse histologique
Stade tumoral
Histologique (morphologique)
Type histologique
Facteurs pronostiques (grade,
envahissement vasculaire et
ganglionnaire,…)
Immunohistochimie
(expression protéique in situ)
Diagnostic
Sous-typage histologique
Marqueurs
pronostiques/prédictifs
Expression de protéines mutées
ou de fusion
Hybridation in situ
FISH/CISH
Amplification de gène
Remaniements
Remaniements gènes ALK, ROS1, RET
Séquençage (NGS)
Mutations de gènes (cibles,
facteurs prédictifs de réponse,
mécanismes de résistance,…)
Mutations gènes EGFR, BRAF, HER2,
PIK3CA, KRAS
Classification histologique (WHO 2015) avec
impact pronostic
Diagnostic différentiel
Expression protéines ALK, ROS1
Expression protéines EGFR, BRAF mutées
 Compte-rendu de pathologie moléculaire, discussion pluridisciplinaire
Le processus de l’examen anatomopathologique
Réception du
prélèvement
RCP cancer
Envoi au clinicien
Etape technique
Production d’un
compte rendu
Lecture et interprétation
Diagnostic
Techniques
complémentaires
Diagnostic
Tissus et étapes préanalytiques
Echantillons tissulaires : inclusion en paraffine vs. congélation
Tissus fixés et inclus en paraffine (FFPE)
– Disponibilité universelle
– Facilité de stockage, conservation à long terme
– Facilité de coupes, recoupes : débit
– Qualité de la morphologie
Tissus congelés
– Préservation épitopique (phospho‐
protéines,…)
– Préservation des acides nucléiques
Biologie moléculaire (certaines techniques)
Recherche
Fixation et inclusion
Masquage voire perte épitopique +++
Hétérogénéité de fixation intratumorale (pièces opératoires)
Hétérogénéité de fixation entre prélèvements (délai, durée, type de fixateur)
16/10/2015
9
Engel, Arch Pathol Lab Med 2011
Prise en charge des prélèvements
Blocs d’inclusion
en paraffine
Fixation
Décalcification pour
les prélèvements
osseux
Pièce opératoire
Microbiopsie
Déshydratation et
inclusion en paraffine
Coulage des blocs
Prise en charge des prélèvements
Lame blanche (non colorée)
Coloration
HES
Niveau 1
Rubans
Coupe des blocs (4 µm)
Niveau 2
Etalement des
lames blanches
IHC
Analyse histologique:
l’outil de base du diagnostic et du phénotypage
«Polypes» du côlon
Adénomes
Muqueuse normale
Lésion
précancéreuse
Polypes
hyperplasiques
«Polypes» du côlon
Stade pré-invasif:
adénome
Stade invasif:
adénocarcinome
Diagnostic de malignité
Identifier le cancer
Adénocarcinome
Carcinomes pulmonaires non à
petites cellules
Carcinome épidermoïde
Types histologiques
différents :
-Pronostic différent
-Altérations moléculaires
différentes
-Traitements différents
Morphologie : impact pronostic
• Type architecturaux dans les
adénocarcinomes pulmonaires
• Grade histologique dans de
multiples types tumoraux :
• Différenciation
• Atypies cyto-nucléaires
• Mitoses
• Nécrose
Sein : Elston et Ellis
Prostate : Gleason
Rein : Fuhrman
Vessie : G1-G3
Sarcomes : grade FNCLCC
…
• Mode d’invasion : vaisseaux, nerfs, « tumor budding »
• Infiltrat lymphocytaire (TILs)
• …
Détermination du stade tumoral (pTNM)
• Pronostic différent
• Traitement adjuvant
différent
Classification histologique :
Corrélation avec le contexte moléculaire
• Présence d’un driver oncogénique :
ALK et ROS1 dans les
adénocarcinomes pulmonaires
Yoshida Am J Surg Pathol 2013
• Aspect « Crohn-like » et
instabilité des microsatellites
dans les carcinomes colo-rectaux
Ueno, Am J Clin Pathol 2012
Immunohistochimie
• Objectif :
– Détecter une protéine donnée (ou un peptide)
dans une préparation cellulaire ou tissulaire
• Principe :
– utilisation d’un anticorps spécifique
– révélation du complexe antigène-anticorps par un
système permettant sa visualisation par un outil
microscopique
Immunohistochimie : principe
Principe général
Démasquage
antigénique
Systèmes d’amplification
Parfois complexes
OptiView detection, Ventana
Immunohistochimie: un outil fondamental
Des techniques maîtrisées, standardisées, automatisées
Des applications diagnostiques, pronostiques et théranostiques
Lame 1 :
morphologie
Lame 2 :
Marqueur 1
Lame 3 :
Marqueur 2
Lame 4 :
Marqueur 3
…
Petites
biopsies :
diagnostic
Immunohistochimie : applications
• Marqueurs de lignée cellulaire
– Définissant le type tumoral
– Définissant l’origine de la tumeur
• Marqueurs de malignité
• Marqueurs pronostiques
– Prolifération : Ki67 (sein, tumeurs neuro-endocrines)
• Expression de cibles thérapeutiques, marqueurs à
visée thérapeutique (« théranostic »)
– RE, RP
– HER2
– ALK, ROS1,…
Immunohistochimie : diagnostic
Tumeur maligne indifférenciée
•Cytokératines, EMA : carcinomes,
mésothéliomes
•Protéine S100, HMB45 :
mélanome
•CD3, CD20, CD45 : lymphome
•aFP, bHCG, PLAP : tumeur
germinale
•Chromogranine A,
synaptophysine, NCAM : tumeurs
neuroendocrines
•CD31, ERG : tumeur vasculaire
•CD117, DOG1 : GIST
•…
Immunohistochimie : diagnostic
Origine des adénocarcinomes
•CK7, CK20
•Autres marqueurs :
• CK19
• RE, RP, GCDFP15
• TTF1, napsine A
• Thyroglobuline, TPO
• CDX2
• Mucines
• PSA
• HepPar-1
• RCC
• …
Immunohistochimie : diagnostic
Aspect morphologique
+
Profil immunophénotypique
CD34
Diagnostic : tumeur fibreuse solitaire
STAT6
Immunohistochimie : diagnostic
Détection d’un driver oncogénique :
NUT (midline) carcinoma (fusion BRD4/3‐NUT)
• Tumeur rare, sujet jeune, agressivité
• Poumon, médiastin, ORL
• Carcinome indifférencié ou peu différencié
• IHC : p63+, NUT+ (clone C52B1)
• FISH NUT : dissociation
Filippakopoulos, NRDG 2014
Stelow, French, Am J Surg Pathol 2008
16/10/2015
28
Morphologie et IHC :
Les difficultés pour le pathologiste
• Taille et représentativité des prélèvements
(microbiopsies+++)
• Qualité du pré-analytique
• Informations cliniques
– Une même lésion histologique peut être associée à plusieurs
maladies
• Diagnostics différentiels du cancer
– Caractère tumoral vs réactionnel/inflammatoire d’une lésion
– Caractère infiltrant d’une prolifération tumorale
• Type tumoral : aspect trompeurs
• Evaluation des limites histologiques d’exérèse
• Standardisation de l’IHC (technique, interprétation)
Hybridation in situ
Hybridation in situ
• Objectif :
– Détecter une séquence d’acides nucléiques (ADN
ou ARN) dans une préparation cellulaire ou
tissulaire
• Principe :
– utilisation d’une sonde moléculaire spécifique
– détection des hybrides par une technique
permettant leur visualisation par un outil
microscopique
Cytogénétique moléculaire in situ
Labeling of specific chomosomal sequences by
molecular probes:
- identification of chromosomes (or chromosome
segments)
- identification of specific domains
•
Applications en
cancérologie
– Amplification, modifications
de nombre
– Réarrangements
•
Techniques de révélation
– Fluorescence (FISH)
– Technique enzymatique
(CISH)
– Technique argentique
(SISH)
Speicher, Nat Rev Genetics, 2005
Cytogénétique moléculaire in situ
Réarrangements
• Sondes de dissociation
(break apart)
• Sondes de fusion
Fusion
Dissociation
Fusions et mutations de ALK dans les cancers
Hallberg, Nat Rev Cancer 2013
Gènes de fusions impliquant EWSR1
Fisher, Histopathology 2014
Cytogénétique moléculaire in situ
Amplifications
Modifications de nombre, amplification
Amplification du
chromosome 17
(Her2/neu)
Hybridation in situ chromogénique
•
Détection de gènes viraux : EBV, HPV
EBV infection associated with gastric adenocarcinoma: EBER detection by ISH
Kerroucha et al, Ann Pathol 2004;24:228
Hybridation in situ chromogénique
• Recherche d’amplification : HER2
Centromère
(rouge)
HER2 (vert)
Laasko, J Pathol 2012
Biologie moléculaire appliquée aux tissus
Les outils du pathologiste
• Biologie moléculaire appliquée aux tissus
– analyse à partir d’acides nucléiques extraits
d’échantillons cellulaires ou tissulaires, congelés
(ADN, ARN) ou fixés (ADN)
– adaptation de toutes les techniques existantes
• PCR, séquençage, pyroséquençage, CGH, NGS,
méthylation
Les nouvelles responsabilités du pathologiste
• Choix du fixateur / cryopréservation
Les nouvelles responsabilités du pathologiste
• Contrôle histologique de la qualité et de la
représentativité de l’échantillon
• Cellularité tumorale
• Nécrose
• Optimisation de l’utilisation des échantillons
Nécrose tumorale
Infiltrat inflammatoire
Macrodissection
Microdissection
From: Palm Systems
Une station de microdissection
CGH array
•
•
ADN tumoral comparé à ADN de
référence
Hybridation entre les deux préparations
préalablement marquées
Lecture des zones non hybridées
•
– Si ADN tumoral: gain dans la tumeur
Si ADN de référence: perte dans la tumeur
•
Intérêts
• Approche globale des macrolésions du
génome
• Evaluation du paysage chromosomique
dans lequel évoluent les microlésions
• Applications précliniques
– Neuroblastome
– Autres tumeurs pédiatriques
Techniques de séquencage
Technique de Sanger
Séquençage de nouvelle génération
NGS
• Plus rapide
• Plus précis
• Moins coûteux
Next (2nd/3rd) generation sequencing
•
Fragmentation de l’ADN
•
Ligation d’adaptateur sur les fragments
2-4 jours
•
Amplification clonale
engendrée des millions de « colonies » de
produits de PCR à partir d’un fragment
uniques).
–
–
–
•
Emulsion PCR
Bridge PCR
…
Extension enzymatique avec
génération d’un signal pour chaque
NTP incorporé (PPi/fluo. /pH/ autre).
•
Lecture d’image par cycle sur le
support (array).
•
Information Clone par clone (plusieurs
millions de lecture indépendantes
1-8 jours
Shendure, 2008, Nat. Biotech
Next (2nd/3rd) generation sequencing
Le NGS permet de produire des séquences correspondant
à chaque clone (et non pas à un mélange de clones)
• 1 run => quantité de données (Nb de bases)
= Nombre de “reads” x longueur de lecture
• Ces données correspondent à :
- beaucoup de lecture sur peu de positions
ou
- peu de lecture sur beaucoup de positions
= couverture x profondeur
Next Generation Sequencing technologies
454 FLX Roche
PGM (LifeTech)
(et SOLID)
Amplification
Amplification
► emPCR
► emPCR
Séquençage
Séquençage
► pH variation.
► pyrosequençage
(ou Fluo + ligation )
Illumina (Solexa)
Amplification
► bridge PCR
Séquençage
► NTP fluorescents
53
Principe du test d’instabilité des microsatellites
1- Extraction d’ADN à partir de la tumeur et du tissu sain
2- Etude de la taille de 5 microsatellites: bat25, bat26, NR21, NR24 et
mono27, après PCR
Tumeur MSS
N
N
T
T
N
T
Tumeur MSI-H
N
N
T
T
N
T
Le syndrome de Lynch est lié à une mutation germinale d’un
des gènes MMR: MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2.
Inactivation d’un gène
MMR , dans les cellules
tumorales, conduisant à
une instabilité
génétique
1er évènement: mutation
constitutionnelle
2ème évènement: mutation
acquise (somatique)
(toutes les cellules)
(cellules tumorales)
Alternative au test MSI: IHC des protéines MMR
MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2
Méthode indirecte
Tissu normal
Tissu tumoral
Système de réparation post-réplicatif de l’ADN (MMR)
A
G
5’
3’
AAA
TTT
T
CACACACA
GTGTGTGT
3’
5’
GT
5’
3’
hMSH2
hMSH6
hMLH1
hPMS2
A
T
hMSH2
hMLH1
AAA
TTT
hMSH3
hPMS2
CACACACA
GTGTGTGT
3’
5’
Interprétation de l’immunohistochimie
MLH1
PMS2
MSH2
MSH6
Résultat
-
-
+
+
Altération de
+
-
+
+
Altération de
+
+
-
-
Altération de
+
+
+
-
Altération de
MLH1
PMS2
MSH2
MSH6
Une instabilité des microsatellites est retrouvée dans près de 15% des CCR:
- 12% correspondent à des formes sporadiques (non familiales)
- 3% correspondent à des syndromes de Lynch
Comment les différencier?
Les formes sporadiques sont dues à l’hyperméthylation du promoteur du gène
MLH1
Ces tumeurs présentent donc une perte d’expression de MLH1
Au laboratoire mise en évidence de cette hyperméthylation par deux
techniques, après traitement de l’ADN par le bisulfite de Na :
- la MSP methyl specific PCR (qualitative)
- le pyroséquençage (quantitative)
T‐
1 2 3 4 5 6 7 8 9
T‐ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 U+ M+
MSP
PCR u
PCR m
Pyroséquençage
Promoteur non méthylé
Promoteur méthylé
cancer spectre HNPCC
avant 60 ans
Test MSI
MSS
MSI-H
Extinction MSH2
et/ou MSH6
PMS2 seul
IHC
Extinction MLH1
Analyse du
promoteur
Promoteur non méthylé
Analyse constitutionnelle des
gènes MMR
Promoteur
méthylé
Biomarqueurs de réparation de l’ADN
« Cicatrices » génomiques
Des facteurs prédictif de réponse à
différents traitements ?
Lord and Ashworth, Nature 2012
Indications actuelles validées de l’étude
moléculaire des tumeurs
• Indications diagnostiques
– Sarcomes (diagnostic et classification)
– Leucémies et lymphomes (diagnostic, classification,
suivi des traitements)
– Cancer du côlon chez le malade de moins de 50 ans
(identification de risque de prédisposition familiale)
– Tumeurs pédiatriques (diagnostic et classificaiton)
– Tumeurs neurologiques (pronostic, prise en charge
thérapeutique)
Indications actuelles validées de l’étude
moléculaire des tumeurs
• Indications théranostiques
–
–
–
–
–
–
–
Cancer du sein: HER2
Cancer de l’estomac: HER2
GIST: PDGFRA et KIT
Cancer du côlon : EGFR, K-ras, N-ras, H-ras, b-raf
Mélanome: b-raf
Cancer du poumon: EGFR, B-raf, ALK, ROS1
Gliomes: LOH1p19q, méthylation de MGMT
Cancérologie moléculaire
≠
Cancérologie génomique
Le « retour » de l’immunohistochimie:
« protéogénomique »
GENE
MUTATION FAUX SENS
PROTEINE
MODIFICATION DE SEQUENCE
-Absence de détection
-Détection par anticorps spécifique
MODIFICATION FONCTIONNELLE
-Anomalie de localisation
-Anomalie de dégradation
(perte d’expression, accumulation)
MUTATION NON SENS
MUTATION TRONCANTE
PROTEINE TRONQUEE
- Absence de détection
AMPLIFICATION
SUREXPRESSION
DELETION
REGULATIONS
EPIGENETIQUES
PERTE D’EXPRESSION
VARIATIONS D’EXPRESSION
Exemple
HYPERMETHYLATION =
PERTE D’EXPRESSION
GENE
GENE
PROTEINE
PROTEINE PARTENAIRE
PROTEINE
PROTEINE
CIBLE
GENE
PROTEINE
PROTEINE PARTENAIRE
Anomalie d’expression
Anomalie de localisation
Anomalie de dégradation
(perte d’expression, accumulation)
GENE
PROTEINE
PROTEINE
CIBLE
Anomalie d’expression
Immunohistochimie:
alternative ou complément à la biologie moléculaire
• Détection de mutations :
• BRAF V600E
• EGFR : délétion E746-A750, mutation L858R
• Protéines de fusion : ALK, ROS1, NUT,…
Braf V600E
Immunohistochimie:
alternative ou complément à la biologie moléculaire
INI-1 deficient tumors
•Malignant rhabdoid tumors
•Medullary carcinoma of the
kidney
•Epithelioid sarcoma
•Epithelioid MPNST
•Other tumors
- Critère diagnostic pour
certaines tumeurs
- Marqueur prédictif : cible
thérapeutique ? (inhibiteurs
EZH2)
Hollmann, Am J Surg Pathol 2011
• Étude immunohistochimique de SDHB dans 2 séries
rétrospectives de tumeurs (n=175) de statut moléculaire
déjà connu
• 1 série prospective de tumeurs (n=45) avec étude
immunohistochimique de SDHB suivie d’une étude
moléculaire
• 2 anticorps anti-SDHB testés (monoclonal de souris et
polyclonal de lapin)
Micro-environnement tumoral
•
•
•
•
•
Cellules tumorales
Vaisseaux
Fibroblastes (CAF)
Cellules immunitaires
Cellules épithéliales
non tumorales
Facteurs du microenvironnement tumoral (stroma)
•
Cellules immunitaires et
inflammatoires:
• Cytométrie en flux
• Immunohistochimie
– Dénombrement
– Distribution
• Expression de gènes
•
CD8+
FoxP3+
Réseau vasculaire
– Angiogenèse
• Imagerie fonctionnelle
• Immunohistochimie
Marquage des cellules endothéliales CD34+
Evaluation des lymphocytes infiltrant les tumeurs
Emergence du microenvironnement immunitaire
•
Comme facteur pronostic
« Immunoscore » dans les cancers du
colon (CD3+, CD8+; localisation)
Infiltrat lymphocytaires ou populations
CD8+, FoxP3+ dans différents types
tumoraux
Immunoscore - J. Galon
•
Comme facteur prédictif de réponse
aux immunothérapies
Expression de PD-L1 en IHC
Expression d’autres cibles
Populations lymphocytaires,
macrophages,…
IHC PD-L1
Démarche diagnostique
Classification morphologique, phénotypique et moléculaire
WHO classification 2015
 Pronostic
 Traitement
Li, J Clin Oncol 2013
ALK et cancers du poumon : traitement par crizotinib
Données cliniques
Type histologique
IHC ALK
FISH ALK
RT-PCR
Recherche de
transcrits de fusion
Evolution de la maladie :
Mécanismes de résistance aux TKI EGFR dans les carcinomes
pulmonaires
•
•
•
•
Mutation T790M (Séquençage)
Amplification MET (FISH, IHC)
Amplification HER2 (FISH, IHC)
Transformation CPC (Histologie)
Yu, Clin Cancer Res 2013
16/10/2015
86
Microenvironnement immunitaire : exemple de PD-L1
Schmid, ECC 2015
Guider le traitement
J.C. Soria, 2015
Rôle du pathologiste dans la prise en charge des cancers pulmonaires
•
•
•
•
Classification histologique et stadification adéquate
Orientation et qualification des tissus pour les analyses moléculaires
Eléments pronostiques
Eléments prédictifs de réponse aux traitements
Shames & Wistuba, J Pathol 2014
16/10/2015
89
Outils en analyse d’image pour l’immunohistochimie
« IHC quantitative »
• Lames virtuelles
• Sélection des régions d’intérêt
• Détection des composants du
tissu
• Détection et quantification du
marquage
• Validation et rendu du résultat
Visiopharm
Immunohistochimie/immunofluorescence multiplex
GE MultiOmyx
Perkin Elmer Vectra
Gestion des petits prélèvements biopsiques +++
Carcinome pulmonaire non à petites cellules
Tissu non
tumoral
Diagnostic morphologique
Inflammation
Cellules
tumorales
Immunohistochimie
P63/p40, TTF1, Napsine A, ALK, ROS1
FISH
ALK, ROS1, RET
Nécrose
Biologie moléculaire
EGFR, KRAS, BRAF, HER2, PI3KCA,…
Nouvelles cibles
Biopsie
PD-L1,…
 Obtenir le maximum d’informations à partir de petits prélèvements
16/10/2015
92
Limites de l’approche tissulaire
• Image unique et instantanée
– Absence de suivi au cours du temps
– Reconstruction, par l’interprétation, des processus dynamiques
• Prélèvement
– accessibilité et choix de la cible
– induction d’artefacts
• Echantillon
– représentativité
• Techniques
– standardisation
• Analyse et interprétation
– standardisation, reproductibilité, quantification
Hétérogénéité intratumorale
Histologique
« Phénotypique »
Moléculaire
C. Swanton, Nat Genetics / Clin Cancer Res
Yates, Nat Rev Genetics 2012
Prélèvements sanguins
•
« Biopsie liquide » (?)
•
Intérêts :
–
–
–
•
ADN circulant
–
–
•
Prélèvements non invasif, répétable
Suivi de patients traités ++
Coût
Sensibilité de détection élevée
Information limitée
Cellules tumorales circulantes (CTC)
–
–
–
–
Méthodes d’isolement et critères d’identification
Quantification, sous populations
Anomalies moléculaires
Phénotype cellulaire
Conclusion
Le pathologiste : une position privilégiée
• Par sa position dans la chaîne diagnostique
• Par son mode de fonctionnement
Échantillon
Échantillon
Technique
Technique
Analyse
Analyse
Interprétation
Interprétation
Diagnostic
Diagnostic
Un changement de paradigme
•
•
Une position différente dans la chaîne diagnostique
Nouveaux modes de fonctionnement et nouvelles interactions
–
–
–
–
–
•
Utilisations multiples du tissu
Hiérarchie et prescription des tests
Synthèse des données générées
Intégration des nouvelles techniques
Nouveaux biomarqueurs associés à des traitements
Des informations de plus en plus nombreuses issues de l’analyse des
tissus :
– En lien avec l’histoire de la maladie, les traitements
– Enjeux de l’utilisation des échantillons
– Intégration de l’ensemble des données