Le sujet proposé a un caractère pluridisciplinaire
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BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°1 AFBB Page 1 BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR BIOANALYSES ET CONTROLES Techniques de microbiologie Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène et de sécurité en laboratoire. Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de commencer les manipulations. Tous les milieux ensemencés (boites, tubes) doivent être identifiés avec vos initiales inscrites au feutre indélébile. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°1 AFBB Page 2 Observation et culture des micro-organismes 1. Les manipulations stériles en microbiologie 1.1. Notions théoriques Tous les instruments du microbiologiste devront être stériles et utilisés dans la zone de travail stérile créée par le bec Bunsen (zone d’environ 30 cm de diamètre). Les prélèvements et les transferts de produits devront être effectués dans cette zone stérile. Le poste de travail de microbiologie met en jeu une organisation précise des différents matériels. Cette organisation doit permettre d’assurer la stérilité du travail. Organisation du poste de travail en microbiologie (pour un droitier) : 1.2. Manipulation But : transférer avec une pipette Pasteur quelques gouttes d’eau stérile dans un milieu de culture en bouillon stérile aussi. Après incubation, le bouillon ne devrait montrer aucun signe de développement bactérien si le transfert à été effectué en conditions stériles. Mode opératoire : prendre une pipette Pasteur, casser l’extrémité et stériliser celle-ci par passage rapide dans la flamme du bec Bunsen. Effectuer le prélèvement d’eau stérile et transférer celle-ci dans le bouillon. Homogénéiser le bouillon par mouvement de rotation. Incuber 24 heures à 37°C. 1.3. Compte-rendu (après lecture lors du 2e jour) Observer le tube. Présenter le résultat obtenu ci-dessous et conclure en ce qui concerne la qualité du travail réalisé (stérilité de la manipulation). BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE AFBB Page 3 1e année - TP n°1 2. Observation microscopique de micro-organismes 2.1. Notions théoriques Un champ microscopique ou champ d’observation est la zone d’observation éclairée qui apparaît au manipulateur lors d’une observation au microscope. Le diamètre du champ microscopique est fonction de l’objectif utilisé. 2.2. Manipulation 2.2.1. Observation de levures Mode opératoire : dans un tube contenant 5 mL d’eau physiologique stérile, introduire à l’aide d’une pince Brucelles un « grain » de levure de boulanger lyophilisée. Noter le tube « S ». Homogénéiser au « Vortex ». Déposer à l’aide d’une pipette Pasteur, une petite goutte de cette suspension de Saccharomyces cerevisiae au centre d’une lame et recouvrir la goutte d’une lamelle. Observer aux objectifs x10 puis x40. 2.2.2. Observation de moisissures Mode opératoire : déposer à l’aide d’une pipette Pasteur au centre d’une lame une goutte de bleu de méthylène. Prélever quelques filaments de Penicillium (moisissure du fromage) et les dissocier dans le colorant. Recouvrir d’une lamelle et observer aux objectifs x10 puis x40. 2.2.3. Observation de bactéries lactiques ETAT-FRAIS FROTTIS COLORE (GRAM) Déposer au centre d’une lame à l’aide d’une pipette Pasteur, Procéder au dépôt comme pour l’état-frais, puis étaler la une petite goutte de lait fermenté. goutte sur les ¾ de la lame. Laisser sécher complètement le Recouvrir la goutte d’une lamelle. frottis. Fixer les bactéries en passant la lame trois fois dans la Observer à l’objectif x40. flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir. Réaliser la coloration de Gram (Cf. fiche technique « examens microscopiques »). Laisser sécher. Observer aux objectifs x40 puis x100 à immersion. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°1 AFBB Page 4 2.2.4. Observation de bactéries dans un bouillon de culture A partir du bouillon « B » fourni en tube à hémolyse, effectuer les mêmes examens que précédemment (état-frais, Gram). 2.3. Compte-rendu Représenter schématiquement les micro-organismes observés. Décrire leurs morphologies respectives (et le mode de groupement pour les bactéries). 3. La culture des micro-organismes 3.1. Notions théoriques Dans la plupart des laboratoires de microbiologie (ceux qui pratiquent des analyses dites « de routine » : laboratoires d’analyses médicales, laboratoires de contrôles agro-alimentaires ou cosmétiques…), le travail est basé sur l’identification des micro-organismes, et éventuellement leur dénombrement. La première étape de ce travail est de réussir à isoler le micro-organisme afin de n’étudier que celui-ci. Les bactéries et les levures forment sur milieu solide des colonies visibles à l’œil nu. Une colonie est généralement formée par la division d’une seule cellule : elle donc normalement constituée d’individus identiques. L’étude des différents caractères (morphologiques, culturaux, biochimiques ou antigéniques) peut donc être pratiquée sur cette colonie, afin d’identifier l’espèce l’ayant formée. L'isolement est une technique qui permet de séparer les bactéries d’une suspension monomicrobienne polymicrobienne. L'isolement permet d'obtenir des colonies espacées les unes des autres, afin de les observer et les caractériser. Pour ce faire, on utilise une anse de platine ou une pipette Pasteur boutonnée. L’ensemenceur est stérilisé avant utilisation. 3.2. Manipulation 3.2.1. Préparation de boites de Pétri contenant un milieu solide stérile But : obtenir un milieu en boite de Pétri prêt à l’emploi pour une analyse et montrer l’importance des conditions de réalisation de cette opération. Mode opératoire : les boites de Pétri sont fournies vides et stériles. Le milieu de culture (gélose « Sabouraud » pour les levures et « MRS » pour les bactéries lactiques) stérile est fourni en flacon placé à 100°C pendant 15 minutes puis maintenu « en surfusion » à environ 50°C. Introduire dans trois boites, à proximité du bec Bunsen, une couche d’environ 4 mm de milieu gélosé en surfusion. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°1 Laisser solidifier pendant quelques minutes de la façon suivante : Poser le couvercle sur chaque boite après solidification. 3.2.2. Ensemencement d’un milieu liquide But : obtenir une culture de levures dans un milieu nutritif liquide. Mode opératoire : Introduire stérilement une goutte de suspension de levures « S » dans le bouillon fourni. Incuber 24 heures à 37°C. 3.2.3. La technique de l’isolement But : obtenir des colonies de micro-organismes isolées sur milieu solide en boite de Pétri à partir : - de la suspension de levures « S » sur milieu Sabouraud coulé en boite de Pétri ; - du lait fermenté sur milieu MRS coulé en boite de Pétri ; - du bouillon « B » sur milieu Trypticase-Soja fourni. Mode opératoire : Suivre les instructions de la fiche « la technique d’isolement ». Incuber les boîtes retournées 24 heures à 37°C. 3.3. Compte-rendu (après lecture lors du 2e jour) Décrire les colonies obtenues (Cf. fiche « la technique d’isolement »). AFBB Page 5
