Milieu de Mossel pour Bacillus cereus
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BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE AFBB Page 1 1e année - TP n°16 BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR BIOANALYSES ET CONTROLES Epreuve E5 – Unité U52 Techniques de microbiologie Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène et de sécurité en laboratoire. Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de commencer les manipulations. Documents interdits – Calculatrice autorisée 1er JOUR – DUREE DE L’EPREUVE : 3h00 Les techniques d’analyses microbiologiques de l’alimentation animale sont les mêmes que celles utilisées pour l’alimentation humaine. Il n’y a pas de normes officielles, mais la qualité microbiologique de l’aliment doit respecter un cahier des charges établi par chaque fabricant. Le cahier des charges d’un industriel présente les mentions suivantes : CRITERES Micro-organismes revivifiables à 30°C par gramme de produit Bacillus cereus par gramme de produit Staphylococcus aureus par gramme de produit Salmonella pour 25 grammes de produit Listeria monocytogenes pour 25 grammes de produit Moisissures par gramme de produit Antibiotiques SEUIL MAXIMAL 107 104 103 Absence Absence 102 Absence On se propose de vérifier le respect de plusieurs aspects mentionnés dans le cahier des charges. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°16 AFBB Page 2 CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES TOURTEAUX DE SOJA DESTINES A L’ALIMENTATION ANIMALE 1. Dénombrements 10 grammes de tourteaux de soja ont été introduits puis broyés dans 90 mL de milieu tryptone sel pendant 5 minutes. 5 mL de suspension mère sont fournis en tube étiqueté « S ». 1.1. Matériels et réactifs suspension mère « S » 7 tubes de milieu tryptone sel stérile de 9 mL pipettes stériles de 1 mL 12 tubes contenant 9 mL d’eau peptonée stérile 3 milieux de Mossel en boîte de Pétri 3 milieux de Baird Parker en boîte de Pétri pipette automatique P200 et cônes stériles billes de verre stériles 1.2. Réalisation des dilutions décimales Effectuer, en milieu tryptone sel, 7 dilutions décimales de la suspension S. 1.3. Dénombrement en milieu liquide des micro-organismes revivifiables à 30°C Ensemencer les tubes d’eau peptonée avec 1 mL des dilutions 10-4 à 10-7 de la suspension « S » en triple essai. Homogénéiser chaque tube. Incuber 24 heures à 30°C. 1.4. Dénombrement des Bacillus cereus Ensemencer en surface (v = 0,1 mL) sur milieu de Mossel, en simple essai, la suspension mère « S » et chacune des dilutions 10-1 et 10-2. Incuber 24 heures à 30°C. 1.5. Dénombrement des Staphylococcus aureus Prélever 1 mL de suspension mère « S » et répartir l’inoculum sur trois milieux de Baird Parker (soit environ trois fois 0,33 mL). Incuber 24 heures à 30°C. 1.6. Compte-rendu Pour chaque dénombrement, justifier le choix de la technique utilisée (milieu, dilutions et volumes ensemencés). La composition des milieux est fournie en annexe. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°16 AFBB Page 3 2. Confirmation de la présence de Bacillus cereus par identification en microméthode et recherche d’enzymes spécifiques Après un dénombrement sur milieu de Mossel, une colonie typique a été isolée sur gélose Trypticase soja. 2.1. Matériels et réactifs culture de la souche à identifier un tube d’eau physiologique stérile de 5 mL gélose viande-foie en surfusion gélose trypticase soja en boîte de Pétri Galerie API 20E étalon 2 de Mac Farland gélose au lait en boîte de Pétri gélose à l’amidon en boîte de Pétri disques oxydase et peroxyde d’hydrogène 2.2. Mode opératoire Effectuer les observations microscopiques nécessaires puis un test d’orientation rapide. Ensemencer les milieux fournis. 2.3. Compte rendu Indiquer les résultats des observations microscopiques et du test d’orientation rapide. Conclure. 3. Recherche de Listeria monocytogenes et de Salmonella 25 grammes de tourteaux de soja ont été introduits puis broyés dans 225 mL d’eau peptonée. Après incubation 18 heures à 37°C, 1 mL de ce milieu de préenrichissement est fourni en tube à hémolyse noté « P ». 3.1. Matériels et réactifs milieu de préenrichissement « P » lames et réactifs pour coloration de Gram un milieu de Agosti et Ottaviani coulé en boite de Pétri un milieu SM2 coulé en boite de Pétri BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°16 AFBB Page 4 3.2. Mode opératoire Effectuer les observations microscopiques nécessaires. Isoler sur les milieux fournis. 3.3. Compte rendu Indiquer les résultats des observations microscopiques et conclure. 4. Détection d’antibiotiques dans les tourteaux L’objectif de cette recherche est de déceler la présence d’antibiotiques promoteurs de croissance. La viande commercialisée « Label Rouge » doit être exempte d’antibiotiques. La détection est réalisée par une méthode de diffusion en milieu gélosé. Deux extraits de tourteaux sont analysés. 4.1. Matériels et réactifs culture de Micrococcus en bouillon nutritif un tube de 10 mL de milieu Mueller-Hinton en surfusion deux extraits de tourteaux A et B une solution d’antibiotique notée T un milieu Mueller-Hinton en boite de Pétri stérile une pipette stérile de 1 mL emporte pièce 4.2. Mode opératoire Introduire 0,5 mL de culture de Micrococcus dans le tube de milieu Mueller-Hinton. Couler en boite de Pétri sur le milieu Mueller-Hinton fourni. Laisser solidifier sur une surface horizontale. Creuser dans la gélose six puits à l’aide de l’emporte pièce. Déposer 1 goutte de chaque extrait et de la solution témoin dans les puits. Incuber 24 heures à 37°C. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°16 AFBB Page 5 Annexe 1 Milieu de Mossel pour Bacillus cereus Composition : Peptone 10,0 g Extrait de viande 1,0 g Mannitol 10,0 g Jaune d'oeuf à 20 % 10 % Sulfate de Polymyxine B 0,01 g Rouge de phénol 0,025 g Chlorure de sodium 10,0 g Agar 14,0 g pH=7,2 Préparation : 40 g par litre. Autoclavage classique. Le jaune d'œuf est ajouté après stérilisation du milieu à l'autoclave dans le milieu en surfusion à raison de 10 % environ de l'émulsion à 20 %. Lecture : Les colonies rouges sont mannitol -. Les colonies jaunes sont mannitol +. Les colonies entourées d'un halo de précipitation sont lécithinase +. En règle générale, le halo trouble dépasse le halo clair dû à la lipoprotéase pour Bacillus cereus. Les bactéries cultivant résistent à la polymyxine. Bacillus cereus est mannitol - et lécithinase +. Annexe 2 Milieu Baird-Parker pour Staphylococcus aureus Composition : peptone 10,0 g extrait de viande de boeuf 4,0 g extrait de levure 2,0 g pyruvate de sodium 10,0 g glycocolle 12,0 g émulsion de jaune d'oeuf 50,0 cm3 Tellurite de potassium 0,1 g Chlorure de lithium 5,0 g Agar 20,0 g pH = 7,2 Préparation : 63 g par litre. Le milieu de base est autoclavé. Tellurite et jaune d’œuf sont ajoutés ensuite à raison de 1 cm3 pour 20 cm3 de milieu de base. De la sulfaméthazine peut être ajoutée pour inhiber Proteus. Lecture : Trois caractères sont lus : - la présence d'une lipoprotéinase par un halo transparent autour des colonies ; - la présence d'une lécithinase par un halo trouble autour des colonies ; - la réduction du tellurite en tellure noir par la couleur de la colonie. S. aureus est lipoprotéinase + (en général), lécithinase + et réduit le tellurite en tellure. (colonies noires de 1 à 2 mm de diamètre). BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°16 Annexe 3 Annexe 4 Milieu ChromID Salmonella (SM2) AFBB Page 6
