1 tout ce monde si petit, petit, petit, petit….

OS TRAVAUX PRATIQUES
OS 5ème Planta/11-12
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1 TOUT CE MONDE SI PETIT, PETIT, PETIT, PETIT….
1.1 Objectifs
Via des observations au microscope (frottis, eau ,étang) classer les êtres vivants
observés. Via une connexion Internet établir quelques caractéristiques des mêmes
échantillons.
1.2 Matériel et méthode
1.
2.
3.
4.
lames
microscope
ordinateurs
feuille et crayon
1.3 Déroulement de la manipulation
Pour chaque élève étudier un représentant :
5. des Protozoaires
6. des Algues
7. des Bactéries
8. des Champignons
A l’aide de votre cours, de la documentation et d’Internet établissez pour chaque être
vivant observé un tableau avec :
1. un dessin avec son nom
2. sa classification
3. ses principales caractéristiques (physiologiques, mode de reproduction, mode de
nourriture, mode de déplacement,caractéristiques spéciales, etc.).
Pour certains microorganismes pathogènes donnez les signes de la maladie
provoquée,le mode de transmission, les traitements.Pour les Bactéries précisez la
coloration de Gram ainsi que la forme.
Mise en commun des résultats.
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2 INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR LES GENES
2.1 But
 étude des relations génotype-phénotype.
 utilisation de mutants themosensibles pour montrer que l’expression de certains
gènes dépend aussi de l’environnement (ici la température).
 étude des relations structure-fonction.
2.2 Matériel et méthode
Souches de levure
[C] Schizosaccharomyces pombe
Cette souche présente la particularité de se reproduire par scissiparité (cloisonnement
transversal)
[Cdc] Schizosaccharomyces pombe cdc2-33
Souche mutée sur un gène impliqué dans la division cellulaire (le gène cdc2). Cette
mutation ne s’exprime qu’à partir d’une température donnée (thermosensible) ce qui
permet de mettre en évidence que l’expression de certains gènes dépend aussi de
l’environnement.
Cette mutation allonge le cycle cellulaire et se traduit par une taille des cellules plus
longue que la normale et des formes souvent aberrantes.
Milieux
A lire avant toute manipulation
Lorsque l’on manipule des micro-organismes, il faut prendre des précautions qui sont de
deux ordres : ne pas contaminer l’espèce étudiée avec des souches externes et ne pas
polluer l’environnement avec nos expériences. Ainsi, il est fondamental de respecter
certaines conditions expérimentales propres à l’espèce étudiée.
Voici quelques règles concernant la manipulation des levures :
 nettoyage de la paillasse à l’alcool ou à l’eau de javel
 travail dans un rayon de 30 cm autour de la flamme d’un bec bunsen
 mains passées à l’alcool, port d’une blouse en coton
 instruments et milieux stérilisés ouverts et utilisés autour de la flamme
 ne mettre en contact que des matériels stérilisés entre eux et avec les cellules ; ne
pas poser le matériel sur la paillasse ni toucher le col des tubes ou la partie du
matériel qui sera en contact avec les levures, les milieux ou les solutions
 pot avec javel pour récupérer les pipettes usagées
 éviter lhes mouvements brusques, ne pas parler devant des boîtes ouvertes
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 les levures sédimentent rapidement, il est donc nécessaire d’agiter les suspensions
avant chaque prélèvement
 noter au marqueur indélébile au dos des boîtes : initiales des binômes et
dénomination de la boîte.
2.3 Déroulement de la manipulation
2.3.1 Milieu pré stérilisé à couler :
Faire chauffer les bouteilles de milieu au bain-marie bouillant (niveau de l’eau : 1cm au
dessus du niveau du milieu) jusqu’à totale dissolution (30 à 60 minutes). Penser à
dévisser légèrement le bouchon pour éviter l’explosion. Laisser légèrement refroidir, puis
couler 16 à 17 boîtes par bouteille.
Soit faire fondre le milieu au micro-ondes, cependant éviter la puissance maximale et
surveiller pour éviter les projections (baisser alors la puissance) ; contrôler également
l’état du milieu toutes les 30 secondes (agiter par rotation) et penser à dévisser le
bouchon. Couler.
2.3.2 Repiquage des souches :
Donner à tous les binômes deux boîtes de pétri divisées en trois parties égales.
Au marqueur, diviser les boîtes (écrire au dos de la boîte).
Attribuer à chaque quartier une lettre correspondant au nom des souches.
Pour chaque souche : avec un ensemenceur stérile, prélever quelques levures en
déposant l’extrémité arrondie sur le sommet d’une colonie. Strier ensuite le quartier
correspondant sur les deux boîtes de milieu.
NB : Iln’est pas nécessaire de prélever beaucoup de levures, une pointe suffit
amplement pour ensemencer.
NB : Chaque binôme va utiliser trois ensemenceurs : un par souche.
Après avoir pris soin de noter les initiales des binômes au dos des boîtes, incuber une
boîte à 25°C ou à température ambiante (20-22°C) et une boîte à 38°C.
Après 48 heures de culture, conserver les boîtes au réfrigérateur (couvercle vers le bas)
jusqu’à la séance suivante.
2.3.3 Observation des souches :
Réaliser un montage lame-lamelle des trois souches. Observer la forme des cellules.
2.4 Annexes sur les souches de levures
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3 ANTIBIOGRAMME
3.1 Principe
Permettre l’isolement de germes présents dans la gorge, leur mise en culture sur le milieu,
la sélection d’un type bactérien (E.coli par exemple) et l’observation de l’effet
d’antibiotiques sur son développement.
Les antibiotiques « déposés » (sous forme de disques imprégnés) sur la gélose
ensemencée diffusent selon un gradient de concentration.Une zone d’inhibition se crée
alors autour du disque, plus ou moins grande selon la sensibilité de la souche à cet
antibiotique.Il est donc possible de définir l’antibiotique le plus efficace contre une souche
bactérienne donnée.
3.2 Manipulation
Les différentes manipulations doivent être effectuées dans les meilleures conditions de
stérilité afin d’éviter une contamination extérieure. Bec Bunsen.
3.2.1 Préparation des boîtes
Milieu déjà prêt, placer le flacon dans un bain-marie ou sous un robinet d’eau chaude
jusqu’à liquéfaction de la gélose. Répartir dans les boîtes de Pétri stériles. Laisser
refroidir.
3.2.2 Prélèvement des germes
Le prélèvement s’effectue au moyen d’un écouvillon stérile au niveau du fond de la gorge
par exemple. Le prélèvement est ensuite mis en suspension dans une petite quantité
d’eau distillée stérile et le tout est ensemencé sur la gélose (utilisation d’une pipette
Pasteur au bout fermé et arrondi sur la flamme).
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3.2.3 Identification de colonies de la même souche
Après 18 à 24 heures passées à l’étuve 37 0 C (boîtes fermées et disposées à l’envers),
l’identification de colonies de même souche se fait à la loupe.
Les colonies d’E.coli sur la gélose : colonies de 2-3-mm de diamètre, violet très foncé avec
souvent un reflet métallique ; par transparence, elles présentent un centre opaque
occupant les 3/4 de leur surface.
Quelques colonies sont récupérées à l’aide d’un ensemenceur et mises en suspension
dans une petite quantité d’eau stérile.
3.2.4 Mise en culture des colonies en présence de disques antibiotiques
L’eau stérile renfermant les colonies de bactéries identifiées est étalée sur les boîtes de
Pétri précoulée en gélose de Müller-Hinton. Ce milieu est tout particulièrement utilisé dans
la recherche de la sensibilité des germes aux antibiotiques.
Quatre disques imprégnés d’antibiotiques sont disposés (à l’aide d’une pince flambée)de
façon circulaire sur la gélose, à environ 15 mm du bord de la boîte, en veillant à bien les
mettre en contact avec la gélose.
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Sur chaque boîte :un disque de Pénicilline, un de Streptomycine, un de Bacitracine, un
d’Ampicilline suivant le schéma suivant.
Les boîtes sont refermées et mises à l’étuve à 37o C pendant 18 heures.
3.2.5 Résultats
Durant le temps d’incubation à l’étuve, les bactéries se développent, ce développement va
être perturbé par la présence d’antibiotiques : soit destruction des microbes ou inhibition
de leur multiplication.
Dans le cas d’E.coli, les quatre antibiotiques proposés vont avoir des effets plus ou moins
importants sur son développement : plus l’antibiotique est efficace contre la souche, plus
la zone claire autour du disque est importante (la concentration en antibiotique étant
décroissante).
Ordre d’efficacité des antibiotiques sur E.coli : Amp>Strepto>Pénicilline>Bacitracine
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4 PRINCIPES DE MICROBIOLOGIE
La microbiologie est par définition la science qui s'occupe de l'étude des microorganismes.
Ses investigations vont donc principalement la conduire dans l'étude des bactéries, mais
aussi dans celle des champignons microscopiques, des levures et des virus.
Une partie documentation de ce cours renseignera sur les divers aspects du monde
bactérien, quant à la partie pratique, elle permettra de se familiariser avec les techniques
de laboratoire de base en bactériologie.
4.1 Techniques de laboratoire : généralités
II convient tout d'abord de définir les différences qui existent entre propreté, désinfection et
stérilisation.
4.1.1 Propreté :
1. nettoyage des mains avec un savon.
2. nettoyage des outils de laboratoire avec un produit de nettoyage approprié.
4.1.2 Désinfection :
1. utilisation d'un produit désinfecté pour les mains, savon, alcool. On peut
désinfecter des graines ou des tissus vivants à l'aide d'eau de Javel, d'alcool
d'hypochlorite de calcium ou d'eau oxygénée.
2. on désinfectera son poste de travail à l'alcool, à la flamme du bec bunsen ; on
passe également à la flamme les ouvertures et les couvercles dés récipients utilisés en
bactériologie.
4.1.3 Stérilisation
1. seul ce dernier niveau peut garantir l'absence de germes vivants. II ne peut
évidemment pas être utilisé pour les mains (gants stériles) ou pour la préparation de
tissus vivants !
2. les outils en verre ou en métal, les récipients, les milieux de culture sont stérilisés
au moyen d'un autoclave (20 à 30 minutes à 120 °C) ou dans une étuve 600 °C.
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Voici deux règles indispensables à retenir en bactériologie :
Les germes des microorganismes sont invisibles, seule la stérilisation peut garantir
leur destruction.
Dès qu'un objet ou une partie d'un objet stérilisé est touché, il n'est plus stérile !
4.2 Protocole général de travail en asepsie.
1. nettoyer la paillasse ou sa place de travail à l'alcool ou à l'eau de Javel diluée. A
l'aide d'une serviette en papier imbibée d'alcool, nettoyer sa place de travail en partant
du milieu et en exécutant un mouvement centrifuge sans revenir au centre.
2. allumer le bec Bunsen à portée de main (flamme bleue, hauteur moyenne).
3. placer dans la zone stérile, délimitée par un cercle d'une vingtaine de centimètres
autour du bec Bunsen, le matériel à utiliser.
4. le matériel métallique, comme l'anse de platine doit être stérilisé par flambage sur
la flamme du bec bunsen. L'anse est portée au rouge jusqu'à sa base ; on passe
ensuite le support brièvement sur la flamme jusqu'à la base du manche.
5. en général, pour travailler, la main gauche apporte le matériel à la main droite qui
tient l'instrument de pré1évement ou d'ensemencement.
6. les tubes et les flacons, tenus obliquement seront débouchés, ouverture vers la
flamme avant et après chaque utilisation et le bouchon sera passé à la flamme avant
d'être reposé sur le flacon.
7. on ne dépose pas le couvercle de la boîte de Pétri sur la table. On le tient sur le
bord. Pendant que la main droite travaille, la main gauche tient le couvercle, toujours
orienté en direction de la table. Dès que la manipulation est terminée, on remet en
place le couvercle sans toucher les bords de la boîte. On ne pose en aucun cas un
couvercle « face contre sol » !
8. pour sortir un outil d'un sachet de stérilisation, on ouvre ce dernier du coté du
manche sur une distance d'environ deux centimètres. On rabat les deux côtés du
sachet sans effleurer leur partie interne puis on extrait délicatement l'outil. Il ne faut pas
le mettre en contact avec quoi que ce soit.
9. avant toute manipulation, se laver soigneusement les mains en utilisant une brosse
à ongles puis les passer à l'alcool à 70° et les laisser sécher.
10. au cours des manipulations, il faut éviter de bouger et de parler pour ne pas
projeter de microorganismes et ne pas porter ses mains à la bouche. Se laver
soigneusement les mains après les manipulations.
La réussite de toute manipulation de microbiologie est conditionnée par la parfaite asepsie
du matériel et des milieux utilisés. Toute dérogation aux règles précédentes a les plus
grandes chances de se traduire par des contaminations des cultures rendues ainsi
inutilisables. Il est donc absolument impératif de suivre ces règles.
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5 PRODUCTION D’AMYLASE, MISE EN EVIDENCE DANS
DES BACTERIES DU SOL
L’amidon est une matière première (base alimentaire) bon marché pour les processus de
fermentation. Voir l’annexe sur la nature et l’utilisation de l’amidon dans l’industrie.
5.1 Principe
L’amidon est un polymère de glucose arrangé soit de manière linéaire (amylose) soit de
manière ramifiée (amylopectine). Ces polymères sont décomposés par des amylases
extra-cellulaires produites par différents types d’organismes, comprenant des bactéries et
des champignons. De nombreux microorganismes sont criblés pour déceler les plus aptes
à une production commerciale d’enzymes.
5.1.1 Objectif
Il s’agit de cribler les microorganismes naturels du sol pour leur production d’amylase.
5.1.2 Matériel
- boîtes de Petri, contenant 15-20 ml de milieu nutritif amidonné et agarosé, préparés à
base d’agar commercial additionné de 0,2% d’amidon soluble.
- 1 g de sol sec prélevé à 10 cm de surface.
- une solution d’iode, préparée en
Préparation anticipée :
dissolvant 1 g de cristaux d’iode et 2 g - La solution d’iode doit être préparée 1 jour à
l’avance (dissolution des cristaux d’iode);
de iodure de potassium dans 300 ml
- Les milieux nutritifs d’agar et d’amidon et les bouteilles d’eau
d’eau distillée.
stérile doivent être préparés 1 jour avant;
- Les échantillons de sol doivent être auparavant séchés à l’air;
- 15 ml d’eau distillée stérile
- Les tiges de coton peuvent être stérilisés par autoclave durant
15 minutes à 121 °C ;
- tiges de coton stérile
- Préparation et inoculation des boîtes de Petri : 45 minutes ;
- Observation des résultats 2 à 3 jours après : 15 minutes.
- marqueurs indélébiles
5.1.3 Procédure
1. Placer 1 g de sol sec dans 15 ml
d’eau distillée stérilisée.
2. Inoculer les boîtes de Petri agarosées
à l’aide de tiges de coton stériles
trempées dans la suspension de sol.
3. Marquer la boîte de Petri avec ses initiales, la date et la source de l’inoculum.
4. Incuber les boîtes inoculées renversées pendant 2-3 jours à 30 °C.
5. Verser délicatement la solution d’iode sur toute la surface de la boîte de Petri. Les
molécules d’iode colorent l’amidon en bleu-noir. La présence de taches claires indique
que l’amidon a été dégradé par les microorganismes.
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Sites d’action des
enzymes
sur
l’amylopectine
Les unités glucose
dans l’amylose et
l’amylopectine
sont
liés par des liens α(1→4) ;
dans
l’amylopectine,
les
branches
latérales
sont liées à la chaîne
par des liens α(1→6).
Les
principales amylases
disponibles sur le
commerce sont :
α-amylase :
elle
hydrolyse les liens α(1→4)
dans
les
polymères
de
glucose,
mais
uniquement
à
l’intérieur
de
la
chaîne, et laisse des
chaînes plus courtes. Extraite à partir de Bacillus spp.
β-amylase : elle hydrolyse les liens α-(1→4) dans les polymères de glucose, cassant
successivement les unités maltose à la fin des chaînes. Elle ne peut pas passer sur les
liens α-(1→6). Extraite de l’orge et du malt.
amyloglucosidase : elle casse les liens α-(1→4) , libérant progressivement les unités
glucose à la fin des chaînes. Elle hydrolyse également les liens α-(1→6), mais lentement.
Extraite des champignons Aspergillus spp. et Rhizopus oryzae.
pullulanase : elle hydrolyse les liens α-(1→6). Extraite des bactéries Bacillus acidophilus
et Klebsiella pneumoniae.
Source : http://www.eibe.info/
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6 LEVURES ET FERMENTATION
La levure ordinaire du Boulanger (S. cerevisiae) est incapable de fermenter le lactose.
C’est l’enzyme -galactosidase qui doit casser le lactose en glucose et galactose.Les
levures immobilisées avec cet enzyme sont capables de grandir dans un milieu qui
contient du lactose. Des deux sucres formés par l’action de l’enzyme, c’est le glucose qui
est utilise préférentiellement.Une fois que la source de glucose s’est tarie, la levure utilise
alors (en ajustant son métabolisme) le galactose. L’activité de la levure est observée en
mesurant le volume de CO2 émis durant la fermentation.
6.1 Principe
Dans ce travail nous allons immobiliser des levures et de la -galactosidase dans une
solution d’alginate de sodium. Puis immersion de ces « levures immobiles » dans un
milieu qui contient du lactose ou du glucose. Le phénomène de fermentation et la
production de CO2 liée seront observés via des ballons (gonflage ou non de ces ballons).
Ne pas oublier de mettre au point des contrôles négatifs pour cette expérience.
6.2 Protocole
Préparation de la levure “immobilisée”
1. Mélanger 25 grammes de levure sèche avec 25 ml d’eau distillée dans un petit bécher,
couvrez et laissez 10 minutes à température ambiante (ta). Un autre groupe fera la même
chose avec 25 gr de levure fraîche. Un autre groupe avec un contrôle négatif (discuter de
ce que l’on va choisir comme substance).
2. Préparer la solution de calcium chloride (1.5% CaCl2, 100 ml pour chaque échantillon).
3. Mélanger la solution d’alginate de sodium (15 ml de solution à 4%) et l’enzyme dans un
autre bécher . Y incorporer 10 ml de la suspension de levures.
4. Mettre la solution levure/enzyme/alginate dans une seringue et ajouter doucement,
goutte par goutte, dans la solution de calcium chloride.
5. Laisser les gouttes de levures solidifier pendant 10 minutes.
6. Séparer les pellets de la solution en les passant dans une passoire à thé, les stocker
dans de l’eau stérile.
Préparation des milieux de culture
1. Préparer 500 ml de chacun des milieux liquide pour levures ( 500 ml d’un milieu avec
glucose et 500 d’un milieu avec lactose).
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Cette préparation doit se faire dans des conditions stériles (rincage de la verrerie avec eau
de Javel diluée, rinser avec de l’eau distillée); travail avec bec Bunsen.
 milieu glucose : 500 ml eau distillée, 10 g glucose, 5 g extrait de levure, 5 g
peptone.
 milieu lactose : 500 ml eau distillée, 10 g lactose, 5 g extrait de levure, 5 g peptone.
Mise en présence des levures et des milieux
1. Mettre le même nombre de pellets dans chacun des milieux.
2. Boucher le sommet de l’Erlenmeyer avec un ballon et observer l’évolution de la réaction
(production de CO2 et “gonflage” du ballon). Bien rendre hermétique la fermeture avec du
Parafilm.
Annexe
1. L'alginate de sodium :
Tout d'abord l'alginate de sodium (E401) ou polymannuronate sodique, de formule
NaC6H7O6 est un additif alimentaire utilisé dans beaucoup de domaines. Les additifs
alimentaires sont des produits ajoutés aux denrées alimentaires commerciales destinés à
l'alimentation humaine et/ou à l'alimentation animale. Sa masse molaire est de 198,1
g/mol et sa température de fusion est supérieure à 300°C. L'alginate de sodium est
constitué d'alginate et de sodium et est composé d'unités d'hydrates de carbone reliées
ensemble pour former une chaîne.
Il se présente dans le commerce sous forme de poudre blanche, inodore et sans saveur,
très soluble dans l'eau. Il est extrait d'algues brunes qui poussent dans les eaux froides
d'Irlande, d'écosse, d'Amérique du Nord et du Sud, d'Australie, de Nouvelle Zélande,
d'Afrique du Sud.
L'alginate de sodium a plusieurs utilisations notamment dans l'alimentation. En effet
l'alginate de sodium peut agir en gélifiant, il permet transformer la texture d'une boisson en
éliminant les protéines indésirables ou, dans certains cocktails dits de "mixologie
moléculaire", l'alginate de sodium donne une texture semblable au caviar (c'est-à-dire
semblable à de petites billes solides qui éclatent en bouche). On le trouve également dans
les produits allégés, les surgelés, la pâtisserie, la mayonnaise, les sauces de salade, les
conserves de légumes et de viande et les potages. De plus, il entre avec le citrate de
sodium et le phosphate de sodium, dans la composition des fromages fondus. Il est
également utilisé comme produit "coupe-faim" dans les produits hypocaloriques.
L'alginate de sodium est aussi utilisé en médecine notamment comme médicament pour
favoriser la digestion. Il intervient également dans la fabrication de produits de moulage
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dentaires. Enfin, on l'utilise souvent dans l'industrie textile, il agit en effet comme agent
d'impression à sec.
2. Le processus de sphérification :
Nous allons maintenant étudier le processus proprement dit de sphérification. L'alginate
de sodium est soluble dans l'eau et peut être mélangé à de nombreux jus et purées de
fruits ou de légumes différents.
Lorsque l'alginate de sodium goutte dans une solution
contenant des ions calcium (Ca2+), chaque ion calcium repousse deux ions sodium (Na +).
De plus la molécule d'alginate contient de nombreux groupements hydroxyde (OH-) qui
peuvent s'associer à des cations.
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Quand l'alginate est associé au sodium, cela forme une chaîne très flexible ; cependant,
lorsque le sodium est remplacé par du calcium, chaque ion Ca 2+ s'associe à deux chaînes
d'alginate, les liant ensemble. Les chaînes deviennent moins flexibles et forment un vaste
réseau.
3. Protocole expérimental : formation de billes d'alginate de sodium à la grenadine
Nous allons donc procéder à la formation de billes d'alginate de sodium à la grenadine
grâce à la sphérification.
Ingrédients :
- pour le sirop :
• 1g d'alginate
• 100ml de sirop de grenadine (soit 50ml d'eau et 50ml de
sirop)
- pour le bain de calcium :
• 10g de chlorure de calcium dilué dans 100ml d'eau
Enfin, nous aurons également besoin d'eau distillée pour rincer les billes.
Ustensiles :
• une balance
• un bécher
• un mixer • un cristallisoir
• une seringue
• une passoire
ou d'un filtre
.
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1. Préparer le mélange eau-alginate de sodium-sirop en ayant pesé l'alginate dans un
grand bécher.
2. Passer le mixer plongeant pour éviter les agglomérats.
3. Préparer le bain de calcium dans un cristallisoir avec les bonnes doses.
4. Verser une partie mélange eau-alginate de sodium-sirop dans une seringue. Laisser
ensuite tomber au goutte à goutte le liquide dans le bain de calcium.
5. Après l'effet du chlorure de calcium sur la surface de la goutte, les alginates durcissent
en surface. Il est ensuite absolument nécessaire de rincer à l'eau claire ou à l'eau distillée
les billes obtenues notamment à l'aide d'une passoire ou d'un filtre.
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Les billes obtenues sont ainsi entourées d'une fine pellicule étanche qui enferme le
liquide qui sera libéré par cassure. On peut les servir en accompagnement ou en
décoration d'un cocktail ou dessert.
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