Rôle dans la résistance des insectes aux baculovirus

Année 2016-2017 - Demande d’allocation doctorale
ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549
1. Informations administratives :
Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Elisabeth Herniou
Unité : IRBI, UMR CNRS 7261
Equipe EVIL : Evolution des Virus Integrés et Libres
Email de l’encadrant : [email protected]
2. Titre de la thèse :
Interactions entre microbiotes et virus: Rôle dans la résistance des insectes aux
baculovirus
3. Résumé :
Les insectes jouent un rôle toujours plus important pour la sécurité alimentaire tant en termes
agronomiques qu’économiques. Notamment, les nouvelles filières porteuses d’innovation de
production d’insectes pour l’alimentation animale ou humaine sont en pleine expansion. Ces élevages
de masse entrainent de nouvelles problématiques sanitaires qui peuvent avoir des conséquences
économiques catastrophiques. En effet, le densovirus du grillon a causé l’effondrement des élevages
américains et européens entrainant, outre les pertes de revenus, la nécessité de changer le modèle de
production (Weissmann 2012). Dans ce contexte émergeant, mieux comprendre les interactions entre les
virus et les insectes dans des environnements contrôlés, tels que les élevages, prend une toute nouvelle
dimension.
Un aspect clé de ces nouvelles filières de production repose en particulier sur le rôle du microbiote
bactérien associé aux insectes dans les interactions avec les pathogènes. En effet, le microbiote peut
héberger aussi bien des espèces conférant une protection contre les pathogènes que des pathogènes
opportunistes qui peuvent ainsi profiter de l’infection virale pour proliférer (Xu et al Plos Path 2014,
Johnston & Rolff PloS Path 2015). Il a été montré par exemple que le microbiote bactérien intestinal de la
chenille Spodoptera exigua et du moustique Culex pipiens est plus abondant et divers lorsque les
insectes sont infectés par des virus (Jakubowska et al Plos Path 2013, Zink et al Viruses 2015). Paradoxalement,
il contribue à inhiber l’infection virale chez le moustique Aedes aegypti (Johnson, Curr Op Insect Sci
2015) et la chenille de Galleria melonella (Johnston & Rolff, PloS Path 2015).
Les bactéries intestinales du genre Enterococcus sont très largement représentées dans les études de
microbiome intestinal d’insectes y compris chez diverses espèces de chenilles, telles que Bombyx mori
et Heliothis virescens (Sun et al PLoS one 2016 ; Staudache et al PLoS one 2016). Elles semblent cependant
jouer un rôle ambigu. En effet, Enterococcus faecalis devient un pathogène très virulent dès qu’il entre
dans l’hémolymphe de la chenille Manduca sexta (Mason et al, MBio 2011). Cependant certaines espèces
d’Enterococcus ont une action protectrice et sont considérées comme des probiotiques (Sun et al PLoS
one 2016). Afin de mieux protéger les insectes en élevages, il s’avère donc opportun de décrypter le
rôle du microbiote intestinal dans les interactions avec les virus.
Le projet de thèse se focalisera sur les interactions entre les lépidoptères, qui sont le 2ème ordre
d’insecte le plus consommé dans le monde en nombre d’espèce (U Wageningen), et les baculovirus
qui engendrent un fort taux de mortalité chez les chenilles. Nous disposons au laboratoire d’une
librairie unique de 20 lignées de baculovirus spécialistes, issues de dix générations d’évolution
expérimentale in vivo sur les espèces hôtes Spodoptera exigua ou Manduca sexta (produit au cours de la
thèse d’A Chateigner soutenue en 2014).
La thèse sera découpée en deux axes pour étudier la question de la résistance alternativement sous
l’angle du microbiote ou du virus, ce qui permettra de poser les bases conceptuelles d’écologie des
communautés microbiennes intestinales chez les lépidoptères, mais aussi d’examiner dans ce cadre
l’étape clé de l’initiation de l’infection chez les baculovirus.
Axe 1 : Impact de la composition du microbiote sur le virus et potentiel probiotique.
1) Caractérisation des microbiotes. La composition du microbiote de S exigua et M sexta en
condition d’élevage sera déterminée par séquençage NGS (16S sur plateforme nanopore ou
illumina). Les espèces bactériennes aérobiques majoritaires seront isolées in vitro (collaboration
avec l’INRA de Jouy en Josas).
2) Test de l’activité antivirale. Suite à une étape d’axénisation par traitements antibiotiques, le
microbiote des chenilles sera reconstitué avec des bactéries isolées en (1) soit en utilisant une
souche unique soit en cocktail reflétant la composition naturelle. Les lots de chenilles (S exigua et
M sexta) seront exposés à souche clonale du baculovirus AcMNPV afin de déterminer le potentiel
antiviral des différents traitements. Cette activité sera aussi testée sur les 20 lignées issues de
l’évolution expérimentale afin de confirmer qu’elle n’est pas restreinte à un seul génotype viral.
Axe 2 : Impact de la souche virale dans l’initiation de l’infection.
1) Synergie des génotypes viraux. L’initiation de Les infections baculoviralessont initiées par de
grandes populations de virions fortement polymorphiques (Chateigner 2015). Pour tester si la
diversité génétique virale permet de contourner la résistance de l’hôte et d’accélérer l’initiation de
l’infection, la virulence des souches issues de l’évolution expérimentale sera comparée à celle de
baculovirus clonaux obtenus sous forme de bacmid représentant leur génotype majoritaire. Les
cinétiques d’infection in vivo seront évaluées par mesure qPCR du titre viral de l’hémolymphe de
chenilles avec et sans microbiote ce qui déterminera la capacité de la population virale ou du virus
clonal à traverser la barrière intestinale et à monter une infection systémique.
2) Effet des probiotiques contre les baculovirus. Les souches les plus virulentes de baculovirus seront
testées face à différentes doses de bactéries probiotiques afin d’évaluer si de tels traitements
pourraient remédier à une épidémie de baculovirus dans les élevages.
Au cours de cette thèse l’étudiant acquerra de solides bases en biologie moléculaire et pathologie des
insectes en s’appuyant sur les théorie d’écologie des communautés microbiennes.
4. Résumé en anglais :
Interactions between microbiota and viruses: Role in insect resistance to baculoviruses
Insects play an increasingly important role in food security both in agronomic and economic terms. In
particular, the new pathways leading to innovations in the production of insects for animal or human
consumption are rapidly expanding. These mass farms bring about new health problems that can have
catastrophic economic consequences. Indeed, the cricket densovirus was responsible for the collapse
of American and European farms, which led to the need to change the production model (Weissmann
2012), in addition to loss of income. In this emerging context, better understanding of the interactions
between viruses and insects in controlled environments, such as livestock, takes on a whole new
dimension. n this emerging context, better understanding of the interactions between viruses and
insects in controlled environments, such as livestock, takes on a whole new dimension.
A key aspect of these new production lines is the role of the bacterial microbiota associated with
insects on interactions with pathogens. Microbiota can harbor both pathogen-protecting species and
opportunistic pathogens that can benefit from viral infection to proliferate (Xu et al Plos Path 2014,
Johnston & Rolff PloS Path 2015). For example, the intestinal bacterial microbiota of the Spodoptera
exigua caterpillar and the Culex pipiens mosquito are more abundant and diverse when insects are
infected with viruses (Jakubowska et al Plos Path 2013, Zink et al Viruses, 2015). Paradoxically, it
helps inhibit infection in the mosquito Aedes aegypti (Johnson, Curr Op Insect Sci 2015) and Galleria
melonella (Johnston & Rolff, PloS Path 2015).
Intestinal bacteria of the genus Enterococcus are widely represented in intestinal microbiome studies
of insects including various caterpillar species such as Bombyx mori and Heliothis virescens (Sun et
al. PLoS 2016, Staudache et al. PLoS one 2016). However, they seem to play an ambiguous role.
Indeed, Enterococcus faecalis becomes a very virulent pathogen as soon as it enters the hemolymph of
the caterpillar Manduca sexta (Mason et al, MBio 2011). However, some species of Enterococcus
have a protective action and are considered probiotics (Sun et al. PLoS one 2016). In order to better
protect insects in rearing, it is therefore appropriate to decipher the role of the intestinal microbiota in
interactions with viruses.
The thesis project will focus on the interactions between lepidoptera, which are the 2nd most widely
consumed insect order in the world in number of species (U Wageningen), and the baculoviruses
which generate a high mortality rate in caterpillars. We have a unique library of 20 specialist
baculovirus lines from ten generations of in vivo experimental evolution on host species Spodoptera
exigua or Manduca sexta (Thesis A Chateigner).
The thesis will be divided into two axes to study the question of resistance alternately in terms of
microbiota or virus, which will allow to lay the conceptual bases of ecology of intestinal microbial
communities in butterflies, but also to examine in This framework the key step in the initiation of
infection in baculoviruses.
Axis 1: Impact of microbiote composition on the virus and probiotic potential.
1) Characterization of microbiota. The microbiota composition of S exigua and M sexta under rearing
conditions will be determined by NGS sequencing (16S on nanopore platform or illumina). The
majority of aerobic bacterial species will be isolated in vitro (collaboration with the INRA of Jouy en
Josas).
2) Test of the antiviral activity. Following a stage of axenization by antibiotic treatments, the
microbiota of the caterpillars will be repopulated with bacteria isolated in (1) either individually or in
a cocktail reflecting the natural composition. The batches of caterpillars (S exigua and M sexta) will
be exposed to a clonal strain of the AcMNPV baculovirus in order to determine the antiviral potential
of the different treatments.
Axis 2: Impact of the viral strain in the initiation of the infection.
1) Synergy of viral genotypes. Baculoviruses are transmitted in large, highly polymorphic populations
(Chateigner 2015). To test whether viral genetic diversity can bypass host resistance and accelerate
infection initiation, the virulence of the strains derived from the experimental evolution will be
compared with that of bacmid representing their majority genotype. The kinetics of infection in vivo
will be evaluated by measuring the viral titer of the haemolymph of caterpillars with and without
microbiota, which will determine the onset of systemic infection.
2) Effect of probiotics against baculoviruses. The most virulent strains of baculoviruses will be tested
against different doses of probiotic bacteria in order to assess whether such treatments could remedy
an epidemic of baculoviruses in farms.
During this thesis the student will acquire solid foundations in molecular biology and pathology of
insects based on the ecological theory of microbial communities.