Projet de fin d’études en physique/ biologie Les ailes de cigale et les surfaces antimicrobiennes Auteure : Lucie Brouillette département de biologie/biotechnologie Dans le cadre d’un projet de collaboration entre le collège Ahuntsic, le département de physique de l’université Concordia et la Polytechnique de l’université de Montréal Matériel : ailes de cigale Surfaces antimicrobiennes (choisies par les étudiants) Réactifs pour coloration Gram Lames et lamelles Microscope et nettoyant à lentilles Huile à immersion/microscopie Pipettes stériles et micropipettes avec embouts stériles ou loupes stériles Tubes stériles Pétris de microbiologie/ tubes et milieux divers (selon la souche microbienne) Souches microbiennes diverses à tester (Gram +, Gram-, levures….) Solution stérile de PBS pH 7.4 Brûleur Pot d’alcool Pinces à bout plat Scalpel stérile Spectrophotomètre et cuvettes jetables de cap. 2,5ml (lecture dans le visible) Incubateur de microbiologie à 37 oC Carrés de gaze stérile Bac de coloration Méthodes : Travailler stérilement autour de la flamme lorsque vous prélevez et ensemencez des microorganismes!!! 1. Coloration Gram : Cette technique de coloration différentielle permet de diviser les bactéries en deux grands groupes : les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif. Pour procéder à cette coloration, on doit d’abord préparer un frottis. La préparation du frottis est la première étape des différents types de coloration. Un bon frottis est une mince couche de culture bactérienne que l’on laissera sécher sur une lame propre, avant de le fixer à la chaleur. Le frottis sera ensuite coloré à l’aide du violet de cristal. Un mordant, une solution d’iode, sera ensuite ajouté. Un complexe iodine-violet de cristal (de taille supérieure au violet de cristal seul) sera ainsi formé. À ce moment, toutes les bactéries sont colorées en violet. Ensuite, le frottis sera décoloré à l’aide d’une solution d’alcool (ou d’acétone). À cette étape, une différence est observée : certaines bactéries gardent le colorant violet de cristal (Gram +), alors que d’autres le perdent (Gram -). Finalement, de la safranine sera utilisée afin de contre-colorer en rose les bactéries Gram -. Il est important de procéder à la coloration de Gram à partir d’une culture dans laquelle les cellules sont en phase de croissance. En effet, les cellules mortes avant la préparation du frottis réagissent comme des cellules Grampeu importe les propriétés qu’elles avaient de leur vivant. Par ailleurs, en vieillissant, certains genres de bactéries Gram + réagissent à la coloration comme si elles étaient Gram –. Trucs importants/ coloration Gram : Éviter de décolorer trop longtemps le frottis : les bactéries Gram+ seraient elles aussi décolorées. Éviter de décolorer insuffisamment le frottis : le complexe iode-violet de cristal ne serait pas complètement éliminé des bactéries Gram négatives. Utiliser des cultures fraîches (18-24 heures). 2. Préparation de la suspension microbienne (frais) Stérilement, ensemencez le milieu de culture liquide adéquat (selon la souche microbienne utilisée) avec la souche vivante. Incubez à la température optimale (temp. pièce ou 37oC) pour 1 nuit. Le jour de l’expérimentation, de cette culture, en prélevez stérilement 2 ml et transférer cette suspension bactérienne dans une cuvette jetable/ spectrophotomètre. Lire la densité optique (D.O.) à 600nm puis jeter adéquatement cet échantillon. Stérilement, faire une dilution en série de la suspension microbienne pour obtenir finalement 5 X107 cellules/ml de PBS pH 7.4. 1 D.O. 600nm = 5 X 108 cellules/ml Cette première suspension bactérienne (5 X107 cellules/ml) devra encore être diluée 1/10 dans du PBS avant l’analyse/essai et contrôles. 3. Mise en présence des matériaux avec la suspension microbienne Pour les ailes de , vous devrez couper l’aile en 2 morceaux avec un scalpel stérile. Ainsi, vous aurez 2 surfaces à utiliser. Autour de la flamme, dans un ou plusieurs Pétris stériles vierges, vous déposerez les sections de matériaux à tester puis, sur ces surfaces, pipettez 100µL de la suspension microbienne (5 X106 cellules/ml de PBS) et laissez en contact pendant 1 à 30 minutes – à votre choix- à la température de la pièce. Après l’incubation, des échantillons (10 à 100 ul) seront prélevés et vous devrez les diluer dans du PBS (faire des dilutions de 1/10, 1/100 et 1/1000). Étaler 10ul sur des milieux frais (géloses) puis incuber à 37oC ou température de la pièce, 24 à 48 heures selon les souches. 4. Prise des résultats Sans ouvrir les Pétris, observez la croissance des microorganismes et dénombrer le nombre de colonies!!!!!!!!!! N’oubliez pas de faire vos contrôles expérimentaux (positifs et négatifs!!!) L’analyse des surfaces pourra être faite avec des instruments à la Polytechnique de l’Université de Montréal, de concert avec des étudiants gradués et ou chercheurs de l’institution concernée. http://images.fineartamerica.com/images-medium-large/fakir-michal-boubin.jpg