Laboratoire : Bactériologie (2)
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Laboratoire : Bactériologie (2) MICROBIOLOGIE. SEMAINE 2 : Contrôle des micro-organismes (techniques de destruction et contrôle des micro-organismes) Matériel - Activité 2.1 : Cultures bactériennes de la semaine 1 (géloses nutritives) - Activité 2.2 (Selon ta table) Désinfectants chimiques Alcool 70%, proviodine, Bio-clean II, Pine sol Eau de Javel, vinaigre, peroxyde, scope, etc… Pipette pasteur Poires Anse de platine Brûleur bunsen Briquet Écouvillons stériles Lampe U-V + lunettes spéciales Distributeurs pour antibiotiques Plaque chauffante Bécher de 250 ml Pince à éprouvette Crayon gras Géloses nutritives en boîte de Pétri. Milieux de culture liquides contenant des bactéries à identifier. - Disques d’antibiotiques : Ampicilline 10 g (AM). Bacitracine 10 u.i. (B). Clindamycine 2 g (CC). Pénicilline G 10 u.i. (P). Polymyxine B 300 u.i. (PB) - ACTIVITÉ 2.1: EXAMEN DES RÉSULTATS DE LA DERNIÈRE SÉANCE 1. Placer les boîtes de Pétri devant soi et les examiner 2. Décrire en termes généraux, l’apparence des colonies isolées. colonies, indiquer la couleur et se servir du vocabulaire ci-dessous 3. Répondre au questionnaire pour guider ton analyse Pour décrire les CARACTÉRISTIQUES DES CULTURES BACTÉRIENNES (COLONIES) ACTIVITÉ 2.2 : CONTRÔLE ANTI-MICROBIEN Nous testons ici divers moyens d’intervention physique (chaleur, rayons UV) et chimiques (désinfectants, antibiotiques) pour lutter contre les bactéries. Théorie CHALEUR. La chaleur détruit physiquement la paroi et les organites bactériens en augmentant la vitesse et l’énergie des molécules. RAYONS UV. Les rayons UV sont des rayons puissants et très pénétrants. Ils détruisent ou modifient les molécules chimiques bactériennes, principalement ils attaquent l’ADN en bouleversant l’ordre des bases azotées. Des précautions spéciales doivent être prises lorsqu’on manipule les UV (lunette, éloignement, etc.). Ce sont les mêmes UV qui émis par le soleil peuvent entraîner la détérioration des cellules souches de la peau (vieillissement, taches sombres ou même cancers). Lorsque nous bronzons, des cellules spéciales de la peau appelées mélanocytes fabriquent et placent une couche de pigments protecteurs de type mélanine au dessus des cellules souches de la peau. La diminution de la couche d’ozone cause un accroissement des UV solaires reçus par chacun. Plusieurs bactéries sont sensibles aux UV. Souvent les salles d’opérations sont stérilisées par rayonnement UV. DÉSINFECTANTS CHIMIQUES. Les désinfectants chimiques sont des molécules chimiques que modifient ou brisent les molécules chimiques bactériennes. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), par exemple, introduit de l’oxygène moléculaire qui oxyde les molécules ; un phénomène semblable à la rouille, l’oxydation du fer. Un autre exemple se trouve dans les solutions acides; la présence de fortes quantités d’ions H+ modifie la structure tertiaire des enzymes bactériens. Un œuf dans le vinaigre n’est pas attaquée par les bactéries. D’autres molécules comme le menthol qu’on trouve dans les plantes de menthe sauvage sont utilisées pour combattre les infections bactériennes ou fongiques ; c’est pourquoi on en ajoute dans les gommes à mâcher et les dentifrices. Certains atomes, comme le Chlore, le fluor ou le soufre sont de bons antimicrobiens. Dans nos régions, la résine du sapin baumier était renommée chez les amérindiens pour ses propriétés antibactériennes et antifongiques. L’homme utilise, modifie ou invente constamment des molécules pour contrôler les microbes. La toxicité des désinfectants est grande et ils ne peuvent, généralement, être utilisés que de façon externe. ANTIBIOTIQUES. Les antibiotiques sont des molécules principalement développées par les moisissures (mycètes) pour lutter contre les bactéries. Ce sont des molécules souvent très complexes qui agissent au niveau du blocage enzymatique bactérien et de la réplication, de la transcription ou de la traduction du génome bactérien. La spécificité « relative » des antibiotique permet leur utilisation en usage interne (injection) ou externe (onguent, crème). Ce sont des armes précieuses souvent un peu sur utilisées. Consignes : Le professeur distribue les tâches. Toutes les équipes ne font pas les mêmes tests et pour un même test, les produits utilisés peuvent varier selon les équipes. Lire les instructions au complet avant de procéder à un test. Activités. 2.2.1 Désinfection chimique : ( 2 agents chimiques / table). Chaque personne fait un test. Identification. - Identifie deux boîtes de Pétri de la façon suivante : La boîte est séparée en 4 parties égales (4 quarts). Écrire dans un quart le mot « TÉMOIN », dans un autre quart « 30 SECONDES », puis « 2 MIN » et finalement « 8 MIN ». N’oublie pas de mettre ton numéro de table, le NOM DU DÉSINFECTANT TESTÉ et la lettre identifiant la bactérie utilisée. Tu as deux désinfectants à tester par équipe et les désinfectants varient selon les équipes de la classe. De plus, les équipes utilisent diverses bactéries. Ensemencement du quart « témoin » des Pétri avec l’agent chimique pur. - - Il est nécessaire de vérifier si l’agent chimique que tu teste n’est pas lui-même une source de contamination. Certains agents antiseptiques sont très faibles ou inefficaces ou détériorés et les bactéries peuvent y survivre et même s’en nourrir. Si la semaine prochaine, tu trouve des colonies bactériennes dans ton quart témoin, c’est évidemment très inquiétant pour l’efficacité du désinfectant testé. Chauffe ton fil de platine à blanc (stérilisation à la flamme). Laisse le refroidir. - - Trempe le fil de platine dans un de tes deux désinfectants à tester Localise le Pétri portant le nom du désinfectant à tester. Ouvre ce Pétri d’une main. De l’autre main, fais trois stries avec le fil de platine dans le quart « TÉMOIN ». Les stries doivent déposer sur la gélose un peu de liquide désinfectant testé. C’est ton témoin. Procède de la même façon pour ton autre Pétri. Contamination de l’éprouvette de désinfectant avec ta bactérie à tester. - Tu contamine maintenant tes désinfectants avec ta bactérie. A l’aide d’une poire et d’une pipette Pasteur, prélève quelques millilitres du bouillon de ta bactérie inconnue. Dépose exactement 10 gouttes (env. 0.5 ml) dans l’éprouvette contenant l’agent chimique à tester (tu choisis un des 2 tubes du support à éprouvettes de ta table). Note l’heure. Procède de la même façon pour ton autre agent chimique à tester. Ensemencement des quarts restants des géloses avec le désinfectant contaminé. - - - Tes deux désinfectants sont maintenant contaminés avec des millions de cellules bactériennes bien vivantes. Plus ton désinfectant est efficace, plus les bactéries vont mourir rapidement et ne pourront se multiplier si tu les dépose sur ta gélose nutritive. Tu pourra vérifier l’efficacité de ton produit la semaine prochaine par la présence ou l’absence de colonies. Rappelle toi aussi que ta classe teste trois (3) espèces bactériennes différentes et que certaines espèces sont beaucoup plus résistantes que d’autres. Après 30 secondes, en te servant de ton anse de platine stérilisée à la flamme, retire une ansée du mélange (l’ansée est le petit film de liquide bactérien que tu peux remarquer sur le cercle à l’extrémité de l’anse de platine). Ensemence le quart « 30 secondes » de ta gélose en y faisant 3 stries. Refais les mêmes opérations après « 2 minutes » et ensemence le quart « 2 minutes ». Refais les mêmes opérations après « 8 minutes » et ensemence le quart « 8 minutes ». À réfléchir pour la semaine prochaine. - - Tes géloses contaminées seront mises à l’étuve. Si des bactéries ont survécues aux désinfectants testés, ils vont pouvoir se multiplier (MITOSE) et former des colonies visibles à l’œil nu. Que pense-tu d’une bactérie qui survivrais à 8 minutes dans un désinfectant. Qu’estce que cela indique en ce qui concerne la bactérie ou le désinfectant ? Pourquoi est-il important de recueillir les résultats de toute la classe ? - Que pense-tu d’une bactéries qui survivrait à 8 minutes mais pas à 2 minutes. Qu’est ce que cela peut indiquer en ce qui concerne les manipulations effectuées ? 2.2.2 Rayons U-V (en équipe) - identifie 3 boîtes de Pétri (géloses nutritives) de la façon suivante : Numéro de table, groupe, U-V, numéro de la boîte –1 à 3 , lettre de l’inconnu) travaille toujours dans le rayon de la flamme pour limiter les contaminations. trempe un écouvillon stérile dans le bouillon de culture de ton inconnu, puis ensemence de façon uniforme la surface de la première gélose (tu dois travailler stérilement). procède comme suit pour chacune des boîtes : #1 ne rien faire (c’est notre témoin) #2 enlève le couvercle et, pendant 30 secondes, place la surface ensemencée directement sous la lampe U-V (sur la table près de la hotte) #3 enlève le couvercle et expose la gélose aux U-V pendant 3 minutes. 2.2.3 Antibiogramme : (en équipe) - identifie une boîte de Pétri (géloses nutritives) de la façon suivante : Numéro de table, groupe, Antibiogramme, numéro de l’inconnu) ensemence la surface entière de la gélose en utilisant un écouvillon stérile préalablement trempé dans la culture de ton inconnu (tu dois travailler stérilement) à l’aide des distributeurs, dépose 5 disques différents, préalablement imprégnés d’antibiotiques, sur ta gélose (selon la technique indiquée par le professeur) 2.2.4 Chaleur humide : (en équipe) - - - fais bouillir de l’eau (dans un bécher rempli à 200 ml) sur la plaque chauffante identifie une gélose nutritive de la façon suivante : (numéro de table, groupe, chaleur, numéro de l’inconnu) et sépare-la en 4 quarts (à l’aide d’un crayon gras sur le fond de la boîte) ensemence le quart « témoin » en effectuant 3 stries dépose l’éprouvette contenant la culture de ton inconnu dans le bécher d’eau bouillante enlève le bouchon de ton éprouvette pour éviter l’excès de vapeur dans l’éprouvette note l’heure après 30 secondes, retire ton éprouvette en te servant de la pince à éprouvette. Prends stérilement une ansée, puis ensemence le quart correspondant « 30 secondes » en effectuant 3 stries.. répète les mêmes opérations après « 2 minutes » et « 8 minutes » de traitement. À la fin du laboratoire, dépose toutes tes boîtes sur le comptoir de service. Ces boîtes seront placées dans l’étuve (37°C) pendant 24 heures. La semaine prochaine, vous procéderez à la collecte des données, à l’interprétation de vos résultats et à l’observation microscopique de votre inconnu. Annexe 1: Plan d'échantillonnage. Laboratoire. Bactériologie 2. Laval Duchesne. BACTÉRIE A BACTÉRIE B BACTÉRIE C 01 02 03 UV + Antibio + Alcool 70% Proviodine (6 Pétri) UV + Antibio + Alcool 70% Proviodine (6 Pétri) UV + Antibio + Alcool 70% Proviodine (6 Pétri) 04 05 06 UV + Antibio + Bioclean Pinesol (6 Pétri) UV + Antibio + Bioclean Pinesol (6 Pétri) UV + Antibio + Bioclean Pinesol (6 Pétri) 07 08 09 Chaleur + Vinaigre Scope (3 Pétri) Chaleur + Vinaigre Scope (3 Pétri) Chaleur + Vinaigre Scope (3 Pétri) 10 11 12 Chaleur + Coke Plax (3 Pétri) Chaleur + Coke Plax (3 Pétri) Chaleur + Coke Plax (3 Pétri) 13 UV + Antibio + Alcool 70% Proviodine (6 Pétri)
