Navette citrique
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METABOLISME DE L’EXERCICE UV 303/308 OXYDOREDUCTION P. PILARDEAU 1 METABOLISME DE L’OXYDO REDUCTION Les mécanismes d’oxydoréduction appartiennent à quatre grandes catégories : = La lutte contre les agents pathogènes, = La détoxification des xénobiotiques, = Un certain nombre de synthèses, = Le système respiratoire cellulaire, connu sous le nom de chaîne d’oxydoréduction ou chaîne respiratoire. Au sein de ces systèmes le transfert des électrons est assuré par les flavoprotéines et des hémoprotéines contenant du fer (sous forme Fe ++ ou Fe+++ seul ou associé à du cuivre ou du soufre) appelés cytochromes. Ces transferts sont à l’origine de la formation de radicaux libres particulièrement toxiques (anion superoxyde 02-) qui nécessiteront d’être éliminés pour préserver les structures protéiques et lipidiques des tissus. I DANS LA MITOCHONDRIE 1.1 CYCLE DE KREBS Le cycle de Krebs ou cycle tricarboxylique existe dans toutes les cellules de l’organisme humain à l’exception des érythrocytes. Les enzymes qui le constituent se trouvent placées au niveau de la membrane interne de la mitochondrie ce qui facilite le transfert des équivalents réducteurs aux enzymes de la chaîne respiratoire. Le cycle de Krebs a pour fonction d’oxyder un acétyl CoA. (CH3-CO-SCoA) en 2 CO2 et H2O. Il comprend 10 réactions dont deux seulement sont irréversibles, la citrate synthétase et l’alpha cétoglutarate déshydrogénase. Condensation de l’acétyl CoA avec oxaloacétate ATP NADH2 ----Citrate synthétase Oxaloacétate + Acétyl-CoA CH2 -COOH I CO-COOH Acide citrique + CH3-CO-SCoA + HS-CoA CH2-COOH I OH-C-COOH I CH2-COOH Cette réaction est inhibée par l’ATP et le NADH2 et un excès de citrate. 2 Pendant l’exercice d’intensité modérée l’apport suffisant d’oxaloacétate et la bonne réoxydation des NADH2 par la chaîne respiratoire permet un fonctionnement satisfaisant de cette réaction. La baisse locale de l’ATP, l’utilisation du citrate dans le cycle et la faible concentration en NADH2, permettent de lever l’inhibition portant sur la citrate synthétase. Si l’intensité de l’exercice croît l’effondrement de l’ATP et le maintien à une concentration modérée des NADH2 permet une accélération considérable de l’activité de la citrate synthétase. Cependant, si l’exercice dépasse un certain seuil d’intensité (VO2 max locale), le « débordement » de la chaîne respiratoire est alors responsable d’une augmentation de la concentration des NADH2 mitochondriaux qui tendent à infléchir la vitesse de la citrate synthétase. Activité de la citrate synthétase Repos Exercice Exercice maximal Isomérisation de l’acide citrique Grâce à une aconitase l’acide citrique peut dans un premier temps se déshydrater en acide cisaconitique puis se réhydrater en acide iso citrique. Cette réaction est réversible. CH2-COOH I OH-C-COOH I CH2-COOH CH-COOH H2O Acide citrique HOCH-COOH II H2O C-COOH I CH2-COOH I CH-COOH I CH2-COOH Acide cis citrique Acide isocitrique Oxydation de l’acide iso citrique La réaction est catalysée par l’isocitrico-déshydrogénase . Elle se réalise en deux temps, la déshydrogénation puis la décarboxylation. NADH2 --Acide isocitrique NAD Isocitrico-déshydrogénase acide oxalo succinique NADH2 acide alpha céto-glutarique CO2 3 HOHC-COOH + NAD I CH-COOH I CH2-COOH O = C-COOH NADH2 I CH2 + CO2 I CH2-COOH Acide isocitrique Acide alpha céto glutarique La vitesse de cette réaction enzymatique est freinée par un excès de NADH2. Pour les exercices de faible intensité la vitesse de cette enzyme dépend essentiellement de l’apport en substrat. Si l’exercice est de forte intensité, mais ne dépasse pas les capacités oxydatives de la chaîne respiratoire, la vitesse est maximale (synthèse très importante de citrate à partir de l’oxaloacétate issu de la désamination de l’acide aspartique ou du pyruvate, et des acétyl CoA en provenance de la bêta oxydation. Dans le cas contraire l’excès de NADH2 freine la vitesse de la réaction (exercice minimal). Cette réaction existe également dans le cytoplasme, mais dans ce cas l’accepteur de proton est le NADP. Décarboxylation oxydative de l’alphacéto-glutarate Cette réaction a pour coenzyme le pyrophosphate de thiamine (vitamine B1) et de l’acide lipoïque. Le transfert des protons sur le NAD est assuré par ce dernier qui fixe les H+ en ouvrant son pont disulfure. Il s’agit d’une réaction irréversible. Alpha cétoglutarate déshydrogénase Acide alpha céto glutarique HS-CoA NAD CO-COOH I CH2 I CH2 I COOH + HS-CoA Acide alpha céto glutarique Succinyl CoA + CO2 NADH2 CO-S-CoA I CH2 I CH2 + I COOH + CO2 NADH2 Succinyl CoA Formation de l’acide succinique 4 Cette réaction consiste à récupérer l’énergie contenue dans la liaison acétyl CoA sur un GDP. Elle est réversible et catalysée par la succinate thiokinase. C’est la seule réaction du cycle de Krebs libérant directement de l’énergie. Le GTP formé peut être utilisé localement comme second messager (GMPc) ou redonner du GDP par le transfert d’une liaison riche sur de l’ADP. CO-S-CoA COOH I Succinate thiokinase CH2 I GDP GTP CH2 I COOH Succinyl CoA I CH2 + HS-CoA I CH2 I COOH Acide succinique Oxydation de l’acide succinique L’acide succinique est déshydrogéné de façon réversible par la succinate déshydrogénase, enzyme utilisant le FAD. COOH COOH I Succinate déshydrogénase I CH2 CH I II CH2 FAD FADH2 CH I I COOH COOH Acide succinique Acide fumarique La vitesse de cette réaction dépend de la concentration des substrats et notamment du FAD sous sa forme oxydée. Comme toutes les réactions d’oxydoréduction du cycle de Krebs sa vitesse augmente en fonction de l’intensité de l’exercice jusqu’au moment où la chaîne respiratoire se trouve débordée par la quantité de substances réduites (NADH2 et FADH2) à oxyder. Formation de l’acide malique Il s’agit d’une simple réaction d’hydratation catalysée par la fumarase. H-C-COOH II HOOC-C-H Acide fumarique Fumarase + H2O OH-CH-COOH I CH2-COOH Acide malique Oxydation de l’acide malique 5 C’est la dernière réaction du cycle de Krebs, l’acide malique redonne par oxydation de oxaloacétate. Il s’agit d’une réaction réversible qui marchera dans un sens ou dans l’autre suivant l’état métabolique local. Au niveau musculaire le malate formé donne de l’oxaloacétate pour fixer un acétyl coenzyme A. Au niveau hépatique, l’oxaloacétate provenant du pyruvate (existence à ce niveau d’une pyruvate carboxylase) donne du malate, point de départ de la néoglucogenèse. OH-CH-COOH I CH2-COOH Malate déshydrogénase O=C-COOH I NAD NADH2 CH2-COOH Acide malique Oxaloacétate Pyruvate AG NAD Pyruvate déshydrogénase CO2 Pyruvate NADH2 CO2 carboxylase Acétyl CoA Oxaloacétate Citrate synthétase Malate déshydrogénase NADH2 NAD Malate Citrate Fumarase Aconitase Fe++ Fumarate Cis aconitate FADH2 Succinate déshydrogénase FAD Aconitase GTP Isocitrate Succinate CoA Fe++ Succinate thiokinase GDP NAD Succinyl CoA Isocitrico déshydrogénase NADH2 NADH2 CO2 Alpha céto glutarate déshydrogénase NAD CO2 CoA Alpha céto glutarate 6 Bilan du cycle de Krebs L’oxydation complète du radical acétyl donne : 3 NADH2 1 FADH2 1 GTP 9 ATP 2 ATP 1 ATP 12 ATP Régulation du cycle de Krebs = Dans le muscle Au repos, la vitesse de fonctionnement du cycle de Krebs est réduite. La présence de quantité suffisante d’ATP et un taux de citrate élevé agissent sur les enzymes de la régulation. Cette régulation porte sur l’entrée des substrats dans le cycle de Krebs et sa vitesse de fonctionnement proprement dite. Entrée des substrats * La pyruvate déshydrogénase est inhibée par les acétyl CoA et les NADH2 provenant de la bêta oxydation des acides gras, ce qui a pour effet de réaliser une épargne glucidique. La majorité des acétyl CoA consommés par le cycle de Krebs provient de la bêta oxydation. Pyruvate Bêta oxydation NAD Pyruvate déshydrogénase --NADH2 NAD NADH2 Acétyl CoA Vitesse du cycle La vitesse de fonctionnement du cycle de Krebs dépend des besoins énergétiques du muscle. Lors de la contraction musculaire, les diminutions de l’ATP provoque une augmentation de la vitesse de fonctionnement du cycle. Si l’exercice se poursuit au delà des capacités oxydatives de la chaîne respiratoire, le taux de NADH2 réduit augmente (diminuant de ce fait le rapport Substrat/produit NAD/NADH2). Les réactions d’oxydoréduction du cycle se trouvent ainsi freinées (Isocitrate déshydrogénase, Alpha céto glutarate déshydrogénase, succinate déshydrogénase, Malate déshydrogénase) provoquant une augmentation relative du taux de citrate. 7 L’augmentation du taux de citrate provoque un ralentissement de la citrate synthétase et la PFK1. F-6-P PFK F-1-6-P Pyruvate Citrate synthétase - Oxaloacétate + Acétyl CoA Citrate = Dans le foie L’oxaloacétate provenant du pyruvate ou du fumarate pourra : + Soit se transformer en malate et passer dans le cytoplasme (début de la néoglucogenèse) si le glucagon et/ou les catécholamines sont élevés + Soit se condenser à l’acétyl CoA pour débuter le cycle de Krebs ou participer à la lipogenèse. = Dans le premier cas, le foie produit des ATP ou des dérivés indispensable à ses synthèses (l’acétyl CoA provient de la bêta oxydation). = Dans le second cas, l’acétyl CoA provient du Pyruvate, (l’insuline est élevé et le glucagon bas) il participera à la lipogenèse. Dans le cas très particulier du foie, il est donc difficile d’apprécier la vitesse de fonctionnement du cycle qui peut s’orienter vers la néoglucogenèse, la lipogenèse ou la fourniture d’énergie. 1.2 NAVETTES MITOCHONDRIALES Ces navettes ont pour fonction de transporter à travers la membrane mitochondriale des substances incapables de franchir seules cette barrière ou de transmettre les informations sur le niveau RED/OX de la mitochondrie. Il existe différents types de navettes suivant leur réversibilité ou non et leur mode de transport (acide aminé, sucre, lipide). = Navette malique Cette navette bidirectionnelle permet d’établir des échanges d’équivalents réducteurs entre la mitochondrie et le cytoplasme sans dépense d’énergie. Cet échange s’effectue du compartiment où le NADH2 est le plus concentré vers celui où il l’est le moins suivant le gradient de concentration. Elle permet également au niveau hépatique la sortie de l’oxaloacétate dans le cytoplasme et sa décarboxylation en phospho énol pyruvate (deuxième étape de la néoglucogenèse). 8 + Au niveau musculaire Cytoplasme Mitochondrie Acide malique Acide malique NAD NAD Malate déshydrogénase Malate déshydrogénase NADH2 NADH2 Acide oxaloacétique Acide oxaloacétique Glycolyse Chaîne respiratoire Cycle de Krebs Au repos le cytoplasme fournit des NADH2 issus de la glycolyse, à la chaîne respiratoire. La navette fonctionne dans le sens cytoplasme mitochondrie (le malate entre dans la mitochondrie et libère localement ses NADH2 pour donner de l’oxaloacétate). A l’exercice ce processus s’accélère jusqu’à ce que la chaîne respiratoire mitochondriale soit incapable d’assumer faute d’une quantité suffisante d’oxygène la régénération du NAD. Le NADH2 mitochondrial augmente alors provoquant une extravasion d’équivalents réducteurs vers le cytoplasme cellulaire et une accélération de la synthèse du lactate malgré la freination de la glycolyse. Le malate sort de la mitochondrie et donne dans le cytoplasme de l’oxaloacétate et de l’acide aspartique qui entre à nouveau dans la mitochondrie. Cytoplasme Lactate NAD Pyruvate Acétyl CoA Citrate NADH2 Oxaloacétate NADH2 Malate déshydrogénase Mitochondrie Oxaloacétate NADH2/NAD NAD Acide malique Acide malique Fumarate 9 Lors de la période de régénération (récupération de la dette d’oxygène), la navette revient à son état initial, des équivalents réducteurs sont acheminés du cytoplasme vers la mitochondrie . Cytoplasme Mitochondrie Acide malique Acide malique NAD NAD Malate déshydrogénase Malate déshydrogénase NADH2 NADH2 Acide oxaloacétique Au niveau hépatique Acide oxaloacétique Glycolyse + Au niveau hépatique La navette a pour principal objet de sortir de la mitochondrie oxaloacétate en vue de sa transformation en phosphoénolpyruvate pour la néoglucogenèse. Cytoplasme Mitochondrie Lactate Alanine LDH Pyruvate Pyruvate Pyruvate carboxylase Oxaloacétate NADH2 Malate déshydrogénase NAD Malate NAD Malate déshydrogénase NADH2 Oxaloacétate Malate PEP Carboxylase PEP 10 Cette navette est particulièrement active lors de l’exercice physique. La stimulation des récepteurs hépatiques par le glucagon et l’adrénaline provoque une stimulation de la néoglucogenèse et une dégradation du pyruvate issu de l’alanine ou de l’acide lactique en oxaloacétate. La sortie de l’oxaloacétate s’accompagne d’une libération cytoplasmique de NADH2 qui sera utilisée par la néoglucogenèse pour régénérer le 3 PGA. = Navette du Glycérol 3 phosphate (3PG) Cette navette unidirectionnelle permet d’établir une communication d’équivalents de réduction entre le cytoplasme cellulaire et la mitochondrie contre un gradient de concentration. Le NADH cytosolique issu de la transformation du 3 phosphoglycéraldéhyde en acide 1-3 di P glycérique (voir glycolyse), réduit le phospho-dihydroxy-acétone (PDHA) en 3 P glycérol (3PG) qui passe dans la matrice mitochondriale où il est réoxydé grâce à un FAD. Cytoplasme Mitochondrie PDHA PDHA 3 PGA NAD NADH2 FADH2 Glycérol phosphate déshydrogénase 1-3 di P Glycérique NAD Glycérol phosphate déshydrogénase FAD 3 PG 3 PG Tout se passe comme si une molécule d’ATP était consommée. En effet, si un NADH2 peut générer 3 ATP, un FADH2 ne peut en donner que 2. Cette navette permet un transport actif contre un gradient de concentration (équivalents de réduction), elle est essentiellement musculaire. Pendant l’exercice physique (et tant que la VO2 max locale n’est pas atteinte), les NADH2 issus de la glycolyse peuvent ainsi être utilisés sous forme de FADH2 par la chaîne respiratoire mitochondriale. Si l’intensité de l’exercice augmente, le gradient d’oxydoréduction croît de façon considérable mais le passage peut néanmoins se réaliser diminuant d’autant l’acidose cytoplasmique. = Navette citrique La navette citrique peut présenter deux fonctions, toutes deux liées à la synthèse intrahépatique des lipides. + Sortir de la mitochondrie des groupements acétyl + Former dans le cytoplasme du NADPH2, substance réductrice utilisée pour la synthèse des acides gras. Sortie des groupements acétyl 11 L’acide oxaloacétique peut servir de véhicule aux groupements acétyl pour franchir la membrane mitochondriale. Cette navette fonctionne dans le sens mitochondrie cytoplasme. Schématiquement, l’acétyl CoA se fixe sur de l’oxaloacétate en abandonnant le CoA, franchit la membrane pour se reformer dans le cytoplasme. Cette navette existe dans les adipocytes et les cellules hépatiques. Coût de l’opération = 1 ATP L’intérêt de cette navette est de sortir les acétyl CoA intra-mitochondriaux issus des hydrates de carbone le cytoplasme pour la synthèse des acides gras. L’acide oxaloacétique libéré dans le cytoplasme ne peut retraverser la membrane dans l’autre sens faute d’un transporteur spécifique. Il est métabolisé en malate (voire navette du malate). Acétyl CoA + H2O Citrate synthétase Acide Oxaloacétique HS-CoA Acide Citrique L’acide citrique franchit la membrane et libère à l’intérieur l’acétyl CoA. Citrate lyase Acide citrique CoA ATP Acide oxaloacétique ADP Acétyl CoA + Pi Cytoplasme Glycolyse Mitochondrie Pyruvate Pyruvate NADPH2 NAD Pyruvate déshydrogénase NADP NADH2 Enzyme malique Malate Acétyl CoA + Oxaloacétate Citrate Citrate synthétase Citrate NAD Citrate lyase NADH2 Oxaloacétate + Acétyl CoA Synthèse des acides gras Formation de NADPH2 Le citrate mitochondrial gagne le cytoplasme où l’isocitrate déshydrogénase le métabolise en alpha céto glutarate. Contrairement à l’enzyme mitochondriale, celle-ci fonctionne avec du NADP. 12 Cytoplasme Mitochondrie Oxaloacétate + acétyl CoA Citrate synthétase Citrate Citrate NADP Citrate déshydrogénase Citrate déshydrogénase NADPH2 Alpha-cétoglutarate 1.3 Alpha-cétoglutarate CHAINE RESPIRATOIRE La chaîne respiratoire est constituée d’une succession de réactions d’oxydoréduction phosphorylantes. Elle est intra-mitochondriale et présente dans la totalité des cellules de l’organisme à l’exception des érythrocytes (dépourvus de mitochondries). La localisation de ce processus oxydatif majeur est à rapprocher de l’hypothèse selon laquelle les mitochondries seraient des cellules animales (ou des sortes de bactéries) phagocytées par des cellules végétales, vivant depuis cette lointaine inclusion en parfaite symbiose. Cette hypothèse se trouve étayée par de nombreuses constatations : + L’existence d’un DNA propre + La double membrane, une membrane initiale (interne) et une membrane externe peut être en rapport avec un reste de membrane cellulaire d’inclusion + La séparation très nette des différents métabolismes caractérisant les cellules animales et végétales (systèmes de synthèse des sucres, lipides et protéines dans le cytoplasme, systèmes d’oxydation dans la mitochondrie). Les oxydations intra-mitochondriales (bêta oxydation, cycle de Krebs) et la chaîne respiratoire apparaissent dans ces conditions comme des systèmes isolés et pratiquement autonomes, responsables de la presque totalité des oxydations cellulaires. La chaîne respiratoire est formée de couples rédox associés à des protéines situées sur les crêtes internes de la mitochondrie. Le transfert d’électrons réalisé dans de système ou phosphorylation oxydative consiste à oxyder les NADH2 et FADH2 principalement issus du cycle de Krebs et de la bêta oxydation des acides gras en libérant l’énergie sous forme d’ATP. + Oxydation Une oxydation consiste en une perte d’une ou plusieurs charges d’électricité négative (perte d’électron). 13 Réduit Oxydé NADH Fe++ O2 NAD+ Fe+++ O2 – La chaîne respiratoire est un mouvement d’électrons à partir d’éléments très électronégatifs (NADH) vers le constituant le plus électropositif, l’oxygène. + Chaîne respiratoire = Complexe I Le NADH entant dans la chaîne respiratoire est oxydé par une métallo-flavoprotéine, la NADH-Coenz Q réductase. NADH-FMN FeS Ce complexe se fixe au Coenzyme Q (ou ubiquinone) pour former le complexe I. Le complexe Q est un transporteur qui lie les flavoprotéines au cytochrome b. NADH-FMN-FeS-Coenz. Q La première molécule d’ATP est formée à ce niveau par oxydation du NADH et transfert des électrons sur le complexe FeS Coenz. Q = Complexe II Le complexe II est formé de la réunion du Coenz.Q au FADH. Ce complexe sera transféré grâce à une navette dans la membrane mitochondriale. NADH FMN FeS FADH Coenz.Q NADH Coenz. Q réductase NAD FMN FeS Coenz. Q ADP FADH ATP Complexe I Complexe II Le Coenz.Q est le carrefour de la chaîne respiratoire où se rejoignent les équivalents réducteurs provenant des autres substrats via la flavoprotéine (FAD). = Complexe III Le complexe II constitué du Coenz.Q oxydé et du FADH réduit est fixé sur les cytochromes b et cl pour former le complexe III. La Coenz Q H2 cyt c réductase permet la formation d’un ATP et de deux cytochromes c porteurs du potentiel rédox. 14 FADH Coenz.Q 2 Cytochromes B , cl Fe +++ Coenz.Q H2 Cyt c Réductase FAD ADP ATP 2 Cytochromes c Fe ++ Complexe II Complexe III B, cl Fe ++ = Complexe IV Le cytochrome c réduit (c Fe ++) est transféré par une navette à la face externe de la membrane interne de la mitochondrie où il donne ses électrons aux cytochromes a et a3, cytochromes fonctionnant au cuivre (complexe IV). Cyt a, a3 2 Cu ++ 2 Cytochromes c Fe ++ O2 Cytochrome c oxydase 2 Cytochromes c Fe +++ Cyt a, a3 2 Cu ++ 2H ADP H2 O ATP Complexe IV Bilan de la chaîne respiratoire Une molécule de NADH donne 3 ATP Une molécule de FADH donne 2 ATP L’efficacité de la chaîne d’oxydoréduction se définit par le rapport du nombre de molécules d’ATP synthétisées par atomes d’hydrogènes consommés (2 électrons), ce rapport est noté P/O. Oxygénase mitochondriale Ce système est à l’origine de la synthèse des stéroïdes gonadiques et surrénaliens réalisée à partir du cholestérol. Deux types de réactions sont directement concernés, le clivage de la chaîne latérale du cholestérol et les réactions d’hydroxylation des hormones surrénaliennes et de la vitamine D. Cyt P 450 Cholestérol Prégnénolone 15 II DANS LE CYTOPLASME 2.1 CYTOCHROME P 450 Le cyt P 450 se trouve engagé dans des réactions d’oxydoréduction au niveau des microsomes cytoplasmiques mais aussi dans la mitochondrie. Oxygénase microsomique Le cytochrome P 450 appartient à un système microsomique destiné à lutter contre les agents pathogènes et à détoxiquer les xénobiotiques. Les protons sont fournis par le NADH et le NADPH. Ce système fonctionne de façon fermé entre le c P 450 Fe +++ et sa forme Fe ++. NADPH2 2 Fe2S2 +++ FADH2 NADPH NADP cyt P 450 P 450 Fe ++ réductase 2 Fe2 S2++ FAD P 450 Fe +++ Le cytochrome P450 permet d’oxyder des substrats (A-H), les rendant ainsi inactifs (A-OH). C’est la cas pour de nombreuses substances toxiques et les xénobiotiques. Ce cycle hydroxylasique est responsable de fuites d’anions superoxydes excessivement dangereux pour la cellule. Substrat A - H H-A-P450-Fe+++ H-A-P450 - Fe++ eO2 NADP FADH2 2Fe2S2+++ H-A-P450-Fe++-O2 P-450-Fe+++ NADPH2 2Fe2S2++ FAD e2H+ H20 H-A-P450-Fe++-O-2 A-OH III – OXYDATION ET MECANISMES DE LUTTE CONTRE L’OXYDATION L’oxydation des tissus est une des origines non programmées de leur vieillissement. Pour 16 lutter contre ces phénomènes induits par les « fuites » d’oxygène atomique l’organisme dispose de plusieurs systèmes faisant intervenir des vitamines et des enzymes chargés de réduire les substrats oxydés. 2.1 Origines de la peroxydation Physiologiquement les transferts d’électrons dans la chaîne respiratoire mitochondriale ou lors du catabolisme peroxysomial produisent par réduction de l’oxygène (O2) un radical libre, l’anion superoxyde O2-. Ce dernier est à l’origine du radical .OH (radical hydroxyl), particulièrement toxique comme initiateur de la lipoperoxydation. Ce phénomène est dû à une voie minoritaire de la réduction de l’oxygène. Physiologiquement, la réduction de l’O2 est réalisée de façon tétravalente grâce à l’action de la cytochrome c oxydase. Cependant, 1 à 2% de l’oxygène se trouve réduit de façon monovalente. C’est cette fraction qui est à l’origine des anions superoxydes. Les processus de peroxydation se produisent essentiellement lors : De la respiration cellulaire (courses prolongées et répétées) De l’intoxication tabagique De l’utilisation de médicaments oxydant comme la Nivaquine. Lors de l’exercice sportif, la concentration en radicaux libres du muscle peut être multipliée par trois. 2.2 Processus d’hyperoxydation Physiologiquement deux types de réactions peuvent se manifester, la réduction tétravalente qui aboutit à la formation d’eau, et la réaction monovalente, génératrice d’anions superoxydes. Réduction tétravalente O2 + 4 e- + 4 H + H2O Réduction monovalente La réduction monovalente est à l’origine : + De la synthèse d’eicosanoïdes, (leucotriènes, prostaglandines), substances impliquées dans les processus inflammatoires. + De la synthèse dans les cellules phagocytaires d’anions superoxydes O2- destinés à protéger les tissus contre les corps étrangers, ou reconnus comme tel. La formation de l’anion superoxyde donne naissance aux radicaux hydroxyl (.OH), qui jouent un rôle de défense contre les virus et les bactéries. O2 + e- O2-. 17 Lors des exercices prolongés et répétés, une partie des cellules tendineuses sont détruites par des phénomènes mécaniques et chimiques (acidoses). Pour « évacuer ces déchets » cellulaires, l’organisme dépêche sur place des lymphocytes chargés de phagocyter les débris cellulaires et de « nettoyer » la zone irritée. Lors de cette action physiologique, des fuites d’anions superoxydes se produisent, induisant ainsi un processus inflammatoire local, responsable de la tendinite. + De radicaux libres, susceptibles d’agresser les tissus environnants. Le radical O.2- libre peut être : Soit fixé sur des protons pour donner du peroxyde d’hydrogène, ou eau oxygénée (moins toxique) grâce à la superoxyde dismutase (SOD), SOD O2-. + H+ + e- H2O2 (peroxyde d’hydrogène) Soit fixé sur du peroxyde d’hydrogène et donner un radical hydroxyl (réaction dite de Fenton). Réaction de Fenton H2O2 + H+ + e - H2O + °OH L’électron est donné par le passage du Fe++ en Fe+++ ou par le Cu+ qui est transformé en Cu++. Un deuxième électron permet de transformer le peroxyde d’hydrogène en eau. °OH + H+ + e- H2O Réaction avec du peroxyde d’hydrogène Réaction de Weiss O2-. + H2O2 OH° + OH- + O2 La réduction monovalente aboutissant à la formation d’O2-. est un processus physiologique au niveau de la chaîne respiratoire et de la chaîne du cytochrome 450. Les substances peroxydantes présentes dans l’organisme sont essentiellement le radical hydroxyl °OH et les radicaux alcoxy RO° et peroxy ROO°. 2.3 Effets de la peroxydation Le radical °OH génère des structures radicalaires lipidiques, protéiques ou nucléoprotéiniques. Si l’oxydation est très poussée la structure peut être totalement détruite, on parle dans ce cas d’oxydation disruptive. 18 Du fait de sa très brève demi vie (10-9 sec), le radical OH° ne peut exercer son effet toxique que localement c’est à dire sur son lieu de production (foie, muscles, érythrocytes...). A l’opposé O2-. et H2O2 du fait de leur relative stabilité peuvent diffuser dans les liquides extracellulaires et produire leur effet toxique à distance. Les structures les plus menacées sont les membranes cellulaires riches en acides gras polyinsaturés de type malonique présents dans les phospholipides constitutifs des membranes cellulaires. -CH=CH-CH2-CH=CHGroupement malonyl La lipoperoxydation comporte : Une phase d’initiation (attaque par °OH de la chaîne acylée d’un acide gras polyinsaturé au niveau du –CH2– situé entre les deux liaisons insaturées), Initiation LH + OH° L° + H2O Une phase de propagation utilisant l’O2 dissout et aboutissant à la formation d’un radical lipoperoxyl et d’un hydroperoxyde Propagation L° + O2 LOO° + LH LOO° (très agressif) LOOH + L° Une phase de terminaison à l’origine de divers hydrolipoperoxydes, d’aldéhydes et de traces d’hydrocarbures (éthane, pentane) retrouvés dans l’air expiré. Terminaison L° + L LOO° + LOO° L° + LOO° L-L LOOL - O2 LOOL La lipoperoxydation peut être évaluée par la mesure du malonaldéhyde plasmatique, réalisée grâce à l’acide thiobarbiturique issu de l’oxydation disruptive -CH=CH-CH2-CH=CH CHO-CH2-CHO Malonaldéhyde L’attaque des radicaux libres porte également sur : - la dépolymérisation de l’acide hyalunorique 19 - la dénaturation des acides nucléiques - la fonction lymphocytaire - la dégradation des polysaccharides et du collagène - La dénaturation protéique par rupture des ponts disulfures L’attaque des membranes modifie leurs propriétés biologiques et leur capacité à se déformer (fluidité membranaire). A ce niveau le mécanisme oxydatif intervient sur les structures phospholipidiques, très insaturées, et les protéines présentant un groupement thiol (cystéine) par formation de ponts disulfures. AA AA-SH AA AA HS-AA AA Protéine réduite AA AA AA-S-S-AA AA AA Protéine oxydée Formation de ponts disulfures Cette dénaturation est à l’origine : = De remaniements structuraux des récepteurs de surface (difficulté ou incapacité à reconnaître les substrats), = D’une rigidification des structures membranaires particulièrement handicapante pour les érythrocytes, = De modification des capacités d’échange (Na+, H+, Ca++). Le mécanisme de peroxydation est particulièrement important au niveau vasculaire. Les lésions endothéliales associées à un déficit en prostacycline favorisent l’apparition des plaques d'athérome (très riches en peroxydes lipidiques). 2.4 Lutte contre la peroxydation des structures lipidiques et protéiques. Pour « limiter les dégâts », l’organisme dispose de divers moyens de protection dans les cellules et dans le plasma. 2.4.1 Moyens de protection La protection contre les phénomènes peroxydasiques est réalisée à l’intérieur et à l’extérieur des cellules. = Protections intracellulaires 20 Superoxyde dismutase Glutathion peroxydase Catalase Glutathion transférase Antioxydants (Vit E, Vit C, Glutathion réduit). = Protections extracellulaires Les liquides extracellulaires sont peu protégés contre la lipoperoxydation et sont pauvres en SOD, glutathion réductase et glutathion réduit. Les principales molécules présentant une efficacité réelle sont : la vitamine C très hydrosoluble, la vitamine E présente dans les lipoprotéines circulantes et dans une moindre mesure la transferrine, la céruléoplasmine, l’haptoglobine et l’hémopexine, enfin les caroténoïdes participent activement à la réduction des structures oxydées. 2.4.2 Mise en œuvre Si l’O2-. formé grâce à la NADP cyt 450 réductase permet l’oxydation de nombreux xénobiotiques, l’O2-. et l’°OH synthétisés en dehors du système microsomial doivent être considérés comme des toxiques et éliminés. Cette opération est réalisée en deux temps : = Formation d’H2O2 par la superoxyde dismutase (SOD) présente dans toutes les cellules y compris les globules rouges. SOD 2 O2-. + 2H + O2 + H2O2 La SOD ou superoxyde dismutase est une métalloprotéine chargée de catalyser la destruction de l’ion radical superoxyde.Elle permet d’accélérer plusieurs milliers de fois la vitesse spontanée de la réaction en transformant les superoxydes en eau oxygénée dont la toxicité est moindre. Il existe trois isoenzymes de la superoxyde dismutase dont le fonctionnement est basé sur le cuivre, le zinc et le manganèse. La plus active des trois est présente dans le cytoplasme de toutes les cellules de l’organisme. Elle nécessite la présence de Cu++ et de Zn++. La deuxième isoenzyme est localisée dans la matrice des mitochondries. Il s’agit d’une enzyme fonctionnant au Mn++. La troisième isoenzyme est présente dans le plasma et les liquides biologiques. Son fonctionnement nécessite du cuivre et du zinc. Cette enzyme est nettement moins efficace que les deux autres. Pour cette raison, l’espace extracellulaire se trouve moins bien protégé de l’oxydation que l’espace cellulaire. = Elimination de l’H2O2 par les peroxydases ou la catalase. 21 Plusieurs enzymes sont impliquées dans ce processus : + Réductions péroxydasiques Deux enzymes à glutathion sont chargées de réduire les molécules oxydées., la glutathion peroxydase sélénium dépendante (GSH-Px) dont le rôle est de réduire l’eau oxygénée, et la glutathion transférase non sélénium dépendante dont la fonction est de réduire les ponts disulfures ou les peroxydations lipidiques. = Glutathion peroxydase La glutathion peroxydase constitue le principal moyen de lutte des érythrocytes contre les phénomènes de peroxydation. Cette réaction sélénium dépendante, protège les lipides membranaires et l’hémoglobine de l’oxydation par les peroxydes. Le glutathion est un tripeptide présentant la particularité de pouvoir se lier à une autre molécule de glutathion par un pont disulfure au niveau de son résidu cystéinyl. Il joue un rôle essentiel dans la protection des structures membranaires contre l’oxydation et aide au passage membranaire des acides aminés. La glutathion peroxydase permet la destruction de l’eau oxygénée formée par la SOD mais aussi de synthétiser la prostaglandine-H2 à partir de la prostaglandine-G2. La destruction de l’eau oxygénée participe aux mécanismes protecteurs des tissus vis-à-vis des structures superoxydes. Glutathion peroxydase H2O2 + 2 GSH GS –GS + 2H2O Sélénium 2x Gly I Cys – SH I Glu Gly Gly I I Cys – S – S – Cys I I Glu Glu La formation de PGH2 intervient après que la cyclo-oxygénase ait transformé l’acide arachidonique en PGG2. Glutathion peroxydase PGG2 + 2 GSH GS-GS + PGH2 + H2O Sélénium = Glutathion transférase La glutathion transférase est une enzyme qui fonctionne sans sélénium mais dont l’action est couplée à celle de la GSH-Px. Elle permet de détoxifier les peroxydes formés dans la cellule (ROOH).* ROOH + 2GSH GSH-Px + GSH-S ROH + G-S-S-G + H2O Transférase = Peroxyde quinonique 22 Le Coenzyme Q, sous sa forme quinonique, est transformé par réduction monovalente en °Qdont l’oxydation par l’O2 conduit à la formation d’°O-2 et à sa régénération sous forme quinonique. = Catalase Catalase 2H2O2 2H2O + O2 Cette réaction fait suite à la désamination oxydative des acides aminés, couplant la désamination à une oxydation sur une enzyme flavinique. La catalase est présente dans les érythrocytes, le foie, les reins. + Réduction du glutathion Le glutathion oxydé lors des processus de peroxydation, doit être à nouveau réduit pour assurer sa fonction protectrice. 2x Gly I Cys – SH I Glu Gly Gly I I Cys – S – S – Cys I I Glu Glu Glutathion réduit Glutathion oxydé La glutathion réductase est chargée de ramener le glutathion oxydé sous sa forme réduite, G-S-S-G + NADPH2 Glutathion réductase 2 G-SH + NADP Dans les hématies le NADPH2 provient de la voie des pentoses phosphates *. Lors du déficit de cette voie, toute utilisation de substances hyperoxydantes peut induire des phénomènes d’hémolyse. * Lors de l’invasion de la Corée par des troupes communistes, les Etats Unis envoyèrent sur place des milliers de GI pour combattre l’invasion venant du nord. Or, quelques mois après le débarquement de ces soldats, on constatait un nombre considérable de morts par hémolyse chez les GI noirs (plus que par fait de guerre). Les médecins qui se penchèrent sur ces cas découvrirent que ces sujets étaient porteurs d’une mutation génétique codant pour une enzyme la glucose 6 Phosphodéshydrogénase (G-6-PD), enzyme irréversible, chargée de synthétiser dans les cellules, et notamment dans les globules rouges, des substances réduites (il s’agit d’une transmission autosomique récessive). G-6-Phospho Déshydrogénase Glucose 6-P Gluconate 6-P NADP NADPH2 L’insuffisance de synthèse de produits réduits (NADPH2), associée à une augmentation de la pression oxydative due à la prise d’un médicament présentant un très fort pouvoir oxydant, la Nivaquine, administré à titre préventif aux sujets devant séjourner en zone infestée par le paludisme aboutissait à la destruction des hématies et à la mort. Dans ce cas, le déficit peut être considéré soit comme le résultat d’une mutation dans un 23 isolat de population, soit comme le développement, au sein de l’isolat, d’une mutation africaine transférée avec la déportation des autochtones. La pression sélective est totalement artificielle puisqu’il s’agit d’un médicament, la Nivaquine. Ce déficit affecte plusieurs millions de sujets dans le monde. On connaît à ce jour plus de 250 variétés de déficit enzymatique. Le gène de la G-6-PD est localisé sur le chromosome X, le caractère récessif de cette atteinte expliquant pourquoi les femmes porteuses ne présentent aucun déficit clinique. Le déficit en G6PD était déjà connu de façon empirique sous le nom de favisme, depuis l’antiquité chez certains consommateurs de fèves. La sensibilité à Vicia fava est encore aujourd’hui difficile à expliquer. Cette pathologie se manifeste par une hémolyse fulgurante après absorption de fèves. Cette variante, de type méditerranéen n’est pas retrouvée chez les populations noires. La glutathion réductase peut fonctionner seule, ou avec la vitamine C et la vitamine E, élargissant ainsi son champ d’application. Les structures membranaires ou cellulaires oxydées sont réduites par la vitamine E (en milieu lipidique), et la vitamine C en milieu aqueux. La vitamine C peut être immédiatement réduite par le Glutathion, alors que la vitamine E doit préalablement transférer ses électrons sur la vitamine C (Ce processus est réalisé au niveau de l’interface entre la membrane lipidique et le milieu vasculaire, interstitiel ou cytoplasmique). Structure réduite Vitamine E oxydée Vitamine C réduite Glu oxydé NADPH2 Structure oxydée Vitamine E réduite Vitamine C oxydée Glu réduit NADP Membrane lipidique Cytoplasme = Action de la vitamine E : La vitamine E agit essentiellement au niveau des membranes. L’alpha-tocophérol intervient comme donneur d’hydrogènes permettant la formation d’hydroperoxydes ou de produits stables alors qu’il se transforme en quinone. = Action de la vitamine C : L’acide ascorbique assure la régénération de l’alpha-tocophérol en se transformant en un radical très peu réactif, à partir duquel l’acide ascorbique est régénéré, grâce à une dismutase à NADH. Outre cette action régénératrice, le piégeage direct des OH° par l’acide ascorbique est très probable. Cependant, la vitamine C peut, en fonction de sa concentration et de la quantité de Vitamine E présente dans les structures lipidiques, se comporter de façon paradoxale et développer un effet prooxydant (Che L. ; 1988). Une supplémentation abusive de vitamine C en l’absence d’un apport suffisant de vitamine E peut donc conduire à stimuler la peroxydation. Ce phénomène serait en relation avec une transformation du Fe+++ en Fe ++, indispensable aux réactions de Fenton et de Weiss (Chen L. , 1989). 24
