Acide L-malique
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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES D’ANALYSES – OIV Acide L-malique – Méthode enzymatique Méthode OIV-MA-AS313-11 Méthode Type II Acide L-malique Méthode enzymatique 1. Principe de la méthode En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) l'acide Lmalique (Lmalate) est oxydé en oxaloacétate dans une réaction catalysée par la Lmalatedeshydrogénase (L-MDH). L'équilibre de la réaction est en faveur du malate. L'élimination de l'oxaloacétate du milieu réactionnel délace l'équilibre de la réaction dans le sens de la formation d'oxaloacétate. En présence de L-glutamate, l'oxaloacétate est transformé en Laspartate, réaction catalysée par la glutamate-oxaloacétate-transaminase (GOT). L-MDH + + oxaloacétate + NADH + H (1) L-malate + NAD GOT (2) Oxaloacétate + L-glutamate L-aspartate + – cétoglutarate La formation de NADH, mesurée par l'augmentation de l'absorbance à la longueur d'onde de 340 nm, est proportionnelle à la quantité de L-malate présente. 2. Appareillage 2.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer les mesures à 340 nm, maximum d'absorption du NADH. À défaut, photomètre à spectre discontinu permettant d'effectuer les mesures à 334 nm ou à 365 nm. 2.2. Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique. 2.3. Micropipettes permettant de prélever des volumes compris entre 0,01 et 2 ml 3. Réactifs Eau bidistillée 3.1. Tampon pH 10 (glycylglycine 0,60 mol/l, L-glutamate 0,1 mol) Dissoudre 4,75 g de glycylglycine et 0,88 g d'acide L-glutamique dans environ 50 ml d'eau bidistillée ; ajuster le pH à 10 avec environ 4,6 ml de solution d'hydroxyde de sodium 10 M et porter à 60 ml avec de l'eau bidistillée. La solution reste stable pendant au moins 12 semaines + 4 °C. 3.2. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD), environ 0,047 M : dissoudre 420 mg de NAD dans 12 ml d'eau bidistillée. La solution reste stable pendant au moins 4 semaines à + 4 °C. OIV-MA-AS313-11 : R2009 1 RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES D’ANALYSES – OIV Acide L-malique – Méthode enzymatique 3.3. Suspension de glutamate-oxaloacétate-transaminase (GOT) à 2 mg/ml. La suspension est stable pendant au moins un an à + 4 °C. 3.4. Solution de L-malate-deshydrogénase (L-MDH) à 5 mg/ml. La solution est stable pendant au moins un an à + 4 °C. Remarque : L'ensemble des réactifs nécessaires pour le dosage est disponible dans le commerce. 4. Préparation de l’échantillon Le dosage du L-malate s'effectue généralement directement sur le vin sans décoloration préalable et sans dilution, à condition que la teneur en acide Lmalique soit inférieure à 350 mg/l (mesures à 365 nm). Sinon, procéder à la dilution du vin avec de l'eau bidistillée de sorte que la concentration en Lmalate se situe entre 30 et 350 mg/l (quantité de L-malate dans la prise d'essai comprise entre 3 et 35 µg). Si la concentration en malate du vin est inférieure à 30 mg/l le volume de la prise d'essai peut être augmenté jusqu'à 1 ml. Dans ce cas le volume de l'eau à ajouter est réduit afin que les volumes totaux soient les mêmes dans les deux cuves. 5. Mode opératoire Le spectrophotomètre étant réglé sur la longueur d'onde 340 nm, les mesures d'absorbance se font dans les cuves de 1 cm de trajet optique, l'absorbance zéro étant réglé par rapport à l'air (pas de cuve sur le trajet optique) ou par rapport à l'eau. Dans les cuves de 1 cm de trajet optique introduire : Solution 3.1 ………………….……………………. Solution 3.2 …………………………………….…. Eau bidistillée ………………………………….…. Suspension 3.3 ……………….……………….…. Echantillon ……………………….…………….…. Témoin 1,00 ml 0,20 ml 1,00 ml 0,01 ml - Dosage 1,00 ml 0,20 ml 0,90 ml 0.01 ml 0,10 ml Mélanger ; après environ 3 min., mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A1). Ajouter : Solution 3.4 ………………………………………. 0,01 ml 0,01 ml Mélanger ; attendre la fin de la réaction (environ 5 à 10 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A2). Déterminer les différences d'absorbances (A2 - A1) du témoin et du dosage. OIV-MA-AS313-11 : R2009 2 RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES D’ANALYSES – OIV Acide L-malique – Méthode enzymatique Déduire la différence d'absorbances du témoin de la différence d'absorbances du dosage. AAD AT Remarque : Le temps nécessaire à l'action des enzymes peut varier d'un lot à l'autre. Il n'est donné ci-dessus qu'à titre indicatif. Il est recommandé de le déterminer pour chaque lot. 6. EXPRESSION DES RÉSULTATS La concentration en acide L-malique est donnée en grammes par litre (g/l) avec 1 décimale. 6.1. Mode de calcul La concentration en grammes par litre est calculée par la formule générale : C V x PM x x x 1000 V = v = P.M = = = volume du test en ml (ici 2,22 ml) volume de l'échantillon en millilitres (ici 0,1 ml) masse moléculaire de la substance à doser (ici, acide L-malique = 134,09) trajet optique de la cuve en centimètres (ici 1 cm) coefficient d'absorption du NADH ; à 340 nm, -1 -1 = 6,3 mmole x l x cm on obtient pour le L-malate : C = 0,473 x A Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution. Remarque : -1 -1 Mesure à 334 nm, = 6,2 (mmole x l x cm ). C = 0,482 x A Mesure à 365 nm, = 3,4 (mmole x l x cm ). C = 0,876 x A -1 OIV-MA-AS313-11 : R2009 -1 3 RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES D’ANALYSES – OIV Acide L-malique – Méthode enzymatique 6.2. Répétabilité (r) r = 0,03 + 0,034 xi. xi = concentration en acide malique de l’échantillon en g/l. 6.3. Reproductibilité (R) R = 0,05 + 0,071 xi xi = concentration en acide malique de l’échantillon en g/l. BIBLIOGRAPHIE BERGMEYER H.U., Méthodes d’analyse enzymatique, 2e éd., Verlag-Chemie Weinheim/Bergstrasse, 1970 BOERHINGER, Mannheim, Méthodes d’analyse enzymatique en chimi alimentaire, documentation technique. VAN DEN DRIESSCHE S. et THYS L., F.C. O.I.V., 1982, n° 755 OIV-MA-AS313-11 : R2009 4
