12.3 Distribution des sous-unités chez l`adulte
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Sous-sections
12.1 Introduction
12.2 Matériel et méthodes
o 12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides
o 12.2.2 Animaux
o 12.2.3 Procédure d'hybridation in situ
12.2.3.1 Prélavage commun
12.2.3.2 Premier protocole de lavage
12.2.3.3 Second protocole de lavage
12.2.3.4 Troisième protocole de lavage
12.2.3.5 Post-lavage commun
o 12.2.4 Analyses des préparations histologiques
12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte
o 12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs
o
o
o
o
12.3.2 Distribution des ARNms codant 2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat
12.3.3 Diencéphale
12.3.4 Mésencéphale
12.3.5 Rhombencéphale
12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris recombinantes
12.5 Distribution des sous-unités durant le développement embryonnaire
12.6 Discussion
o 12.6.1 Aspects méthodologiques
o 12.6.2 Colocalisations
o 12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula
o 12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques
12.6.4.1 Implication de 2
12.6.4.2 4 ne semble pas impliquée
12.6.4.3 6 est plus probablement impliquée que
12.6.4.4 Implication de
12.7 Conclusion
3
3
12. Localisation des ARN messagers codant
pour les sous-unités des nAChRs dans le
système nerveux
[ZOLI M, LE NOVÈRE N, HILL JA, CHANGEUX JP (1995). Developmental regulation of
nicotinic ACh receptor subunit mRNAs in the rat central and peripheral nervous systems.
Journal of Neuroscience 15 : 1912-1939.
LE NOVÈRE N, Zoli M, CHANGEUX JP (1996). Neuronal nicotinic receptor 6 subunit
mRNA is selectively concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain. European
Journal of Neuroscience 8 : 2428-2439.
Voir aussi:
PICCIOTTO MR, ZOLI M, LÉNA C, BESSIS A, LALLEMAND Y, LE NOVÈRE N, VINCENT P,
MERLO-PICH E, BRÛLET P, CHANGEUX JP (1995). Abnormal avoidance learning in mice
lacking functional high-affinity nicotine receptor in the brain. Nature 374 : 65-67.
MARUBIO LM, ARROYO-JIMENEZ MM, CORDERO-ERAUSQUIN M, LÉNAéna C, LE NOVÈRE
N, DE KERCHOVE d'EXAERDE A, HUCHET M, DAMAJ MI, CHANGEUX JP. Reduced nicotineelicited antinociception in mice lacking the neuronal nicotinic alpha-4 subunit. Soumis pour
publication. ]
12.1 Introduction
De nombreuses études d'hybridation in situ ont été réalisées afin de détecter les sous-unités du
nAChR présentes dans le système nerveux du rat adulte [134,80,335,334,90,299,284,53] et
embryonnaire [161,372]. Cependant, la distribution de l'ARNm d' 6 n'avait pas été décrite en
détail. Ici, je présente une étude détaillée de la distribution de l'ARNm d' 6 dans le système
nerveux central du rat adulte. Les motifs de marquage, ainsi que la codistribution d' 6 avec
les autres sous-unités du nAChR nous amène à penser que les nAChRs contenant cette sousunité contribuent à certains des effets pharmacologiques documentés de la nicotine.
12.2 Matériel et méthodes
La méthode d'hybridation in situ avec oligonucléotides radio-marqués est décrite en détail
dans [354]. Voir le chapitre 5 pour les fondements théoriques de l'expérience.
12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides
Après analyse des structures secondaires de l'ARNm par le programme STEMLOOP de la suite
WISCONSIN du GCG [85], les séquences des sondes sont choisies dans des régions uniques en
séquence au sein de la famille, dépourvues de structures secondaires putatives, contenant à
peu près 50-60 %GC. Les oligonucléotides furent synthétisés à l'aide d'un synthétiseur d'ADN
Cyclone (Biosearch inc.) ou commandés à la société Genset (Paris, France). Les sondes sont
décrites dans le tableau 12.1.
Tableau 12.1 : Oligodésoxynucléotides utilisés dans cette étude. La température de fusion est
calculée pour la condition de lavage la plus stringente, à l'aide de l'équation 3 de [336] (0,1 M
NaCl, 0 % formamide) (mais voir le chapitre 5 pour un type de calcul plus exact). Les
séquences des sous-unités peuvent être retrouvées dans la Ligand Gated Ion Channel
Database (voir le chapitre 2) à l'URL:
http://www.pasteur.fr/units/neubiomol/LGIC.html ou à partir de GenEMBL (les
d'accession sont dans le tableau)
cibl accessi positi
Séquence de l'oligodésoxynucléotide
%G T
e
on
on
C
m
2rn
L1007
1425
7
5'CTCCAGCATCCATGTTAGTCTCTAGCCAATGGTATG 51
AGGGGCTGA-3'
75,
6
3rn
L3162
1040
1
5'CCCAAGTGGGCATGGTGTGTGTGGTTGGAGTTCTAT 53
AGTGCAC-3'
76,
2
3rn
L3162
1138
1
5'GCGCCGTAGAAGGTCCTCGTCTTAGGAGTGTCCCCC 62
TCACCACTG-3'
83,
5
3rn
L3162
215
1
5'GGACACCTCAAACTGGATGATGACTGGATGGGACA 51
CATTAGCCAC-3'
75,
6
3rn
L3162
623
1
5'CTCCCAGTAGTCCTTGCGGTTCATGGAGGAGCCGAT 58
GAGGACCAG-3'
80,
6
4rn
M1568
1389
1
5'GCTGCTTCTTGGGAGCTGGGCACATGCTGGACACTC 62
AGGGACCTG-3'
83,
5
5'GAAGTCCAGTTGGTCCACACGGCTGTGCATGCTCA
CCAAGTCAAT-3'
4rn
5rn
J05231 1076
5'CCGAGATTTAGGTCCAGCCCCACTCTCGGCTTCTTC 56
TCTCTGAGT-3'
79,
2
6rn
L0822
325
7
5'TCAAAGTGCACCGTGACGGGATCAGAAACGTTTTC 56
CACTGGCCGG-3'
79,
2
6rn
L0822
1575
7
5'GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACGATTATAAAC 49
ACCCAGAGGA-3'
74,
2
6m
m
6m
m
7rr
5'TCAAGATGCACCGTGACGGGATCGGAGACATTCTC
CACCGGCCGG-3'
5'GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACAATTATAAAT
ACCCAAAGGA-3'
5'CCTGCACTCAGCTCCACACTGGCCAGGCTGCAGCG 70
CCGAG-34
5'-
58
7rr
ATCATGTGTTGGGGAGCAGGCCAAACGGCCACATA
CGACCCCAGA-34
2rn
L3162
1341
2
5'AGCCAAGCCCTGCACTGATGCAGGGTTGACAAAGC 55
AGGTACATGG-3'
78,
5
2rn
L3162
1455
2
5'TCGCATGTGGTCCGCAATGAAGCGTACGCCATCCA 60
CTGCTTCCCG-3'
82
2rn
L3162
1315
2
5'TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCCGCAGGACCT 55
TCACCGAAGA-3'
78,
5
5'TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCTGCAGGACCT
TGGCGGAAGA-3'
2m
m
5'TCGCATATGGTCCGCAATGAAGCGTACACCGTCCA
CAGCTTCCCG-3'
2m
m
J04636 1306
5'CAGAACTCTTTCTCCATCGCTGGCGGGAGTCTGTTT 53
CCTTTTGCC-3'
77
3rn
J04636 431
5'ATTCTTCCGGATTCCAGCGTAATTTTTGGTCTGTGC 42
ATTCCTGCT-3'
69,
4
4rn
J05232 1020
5'ACCAGGCTGACTTCAAGACCGGGACGCTTCATGAA 55
GAGGAAGGTG-3'
78,
5
4rn
J05232 1259
5'AGCTGACACCCTCTAATGCTTCCTGTAGATCTTCCC 53
GGAACCTCC-3'
78,
5
5'AGGGTGTGCAGCTCATCCTGGACCCCCTCCAAGGA 65
GCGCT-3'
83,
4
3rn
TH
Les oligonucléotide sont marqués en 3' avec du [35S]-dATP ou du [33P]-dATP (NEN,
Boston, MA) et de la désoxynucleotidyl-transférase terminale (Boehringer Mannheim,
Allemagne), en suivant les spécifications du fabriquant, à une activité spécifique de 200-600
KBq/pmol. Les sondes marquées sont précipitées dans l'éthanol, séparées des nucléotides non
incorporés avec des NucTrap push columns (Stratagene, La Jolla, CA), précipitées de nouveau
dans l'éthanol et resuspendues dans de l'eau distillée.
12.2.2 Animaux
Six rats Sprague-Dawley adultes (Iffacredo, Lyon, France), pesant 300-400 g, ont été utilisés.
Les animaux sont tués par injection d'hydrate de chloral (1 ml de solution à 35 %); le cerveau
est rapidement disséqué et congelé dans de la carbo-glace. Les tissus sont stockés à -80 °C
jusqu'à la coupe.
Plusieurs âges embryonnaires et post-natals ont été examinés: E10, E11, E12, E13, E15, E17,
E19, P0 and P4. Les embryons ont été datés selon [250], E0 dénotant le jour suivant
l'accouplement et P0 le jour suivant la naissance. Pour chaque stade, entre deux et cinq
animaux ont été utilisés. Pour le prélèvement des embryons, les mères ont été anesthésiées à
l'éther.
12.2.3 Procédure d'hybridation in situ
Les tissus congelés sont coupés au cryostat (coupes de 14 µm d'épaisseur), montés à chaud
sur des lames de verre recouvertes de poly-L-lysine et stockées à -80 °C (moins de 2
semaines). La procédure est mené selon le protocole de [363], modifié selon [372] et le
protocole suivant. Brièvement, les coupes sont fixées avec du para-formaldéhyde 4 % durant
5 min à température ambiante, lavées dans du PBS, acétylées, et stockées dans de l'éthanol
80 % à 4 °C. Les coupes sont alors délipidées dans de l'éthanol et du chloroforme (5 min),
pré-hybridées durant 2-4 h à 37 °C et hybridées durant 20 h à 37 °C sous des lamelles de
parafilm. La composition du milieu de pré-hybridation (et d'hybridation) est:
50 % formamide
0,6 M NaCl
10 mM di-thiothreitol
10 % sulfate de dextran
1 mM EDTA
Solution de DENHARDT 1x (50x =
o 1 % sérum-albumine bovine
o 1 % Ficoll
o 1 % polyvinyl-pyrrolidone )
0,1 mg/ml poly-A (Boehringer Mannheim, Allemagne)
0,5 mg/ml ARNt de levure (Sigma)
0,05 mg/ml ADN de sperme de hareng (Promega, Madison, WI)
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
Les sondes sont ajoutées au mélange d'hybridation à la concentration de 0,55 nM
(correspondant à 15 fmol/coupe ou 3000-25000 Bq/30 µl/coupe selon les marquages).
12.2.3.1 Prélavage commun
Après retrait du parafilm les coupes sont initialement rincées dans de la solution saline citrate
standard (SSC) 2x (0,3 M NaCl, 0,03 M citrate de sodium) à température ambiante (2 fois
5 min).
12.2.3.2 Premier protocole de lavage
Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités durant l'ontogenèse.
Les coupes sont lavées quatre fois 15 min dans du SSC 2x , 50 % formamide à 42 °C puis
deux fois 30 min dans du SSC 1x à température ambiante. 1 mM de di-thiothréitol est ajouté
à chaque solution.
12.2.3.3 Second protocole de lavage
Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités chez le rat adulte ainsi
que chez les souris recombinées 2-/-. Les coupes sont lavées trois fois durant 15 min dans
du SSC 1x à température ambiante, puis 15 min dans du SSC 0,5x à 55 °C (cela dépend
des oligonucléotides). Les sondes utilisées dans cette étude ont la même longueur et
approximativement le même contenu en GC. Les températures de fusion des différent duplex
oligonucléotide/ARNm, calculées en utilisant l'équation 3 de [336], sont similaires dans les
mêmes conditions d'hybridation (0,6 M NaCl, 50 % formamide). La température du lavage le
plus stringent est égale à la Tm -20 °C (dans 0,01 M NaCl, 0 % formamide), afin de
corriger les petites différences de contenu en GC entre les différentes sondes. Nous avons
préalablement montré que cette température de lavage donne un rapport signal/bruit optimal,
avec un signal spécifique à peu près maximum et un faible signal non-spécifique.
Les coupes sont alors rincées 15 min dans du SSC 0,5x
à température ambiante.
12.2.3.4 Troisième protocole de lavage
Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités chez les souris
recombinées 4-/-. Les deux étapes de lavage réalisées dans du 0,5x SSC sont désormais
réalisées dans du 1x SSC. La température de fusion des différent duplex
oligonucléotide/ARNm est désormais calculée selon la méthode décrite au paragraphe 11.3.2.
12.2.3.5 Post-lavage commun
Après un court rinçage dans de l'eau glacé, et un gradient d'alcool elles sont séchées et
exposées à un film [3H]-Hyperfilm (Amersham) puis à une émulsion photographique (NTB2,
Kodak, Rochester, NY). Dans le cas des cerveaux de rats adultes nous avons utilisé un facteur
de correction défini au paragraphe 11.4.1 afin de comparer quantitativement différentes
expériences.
12.2.4 Analyses des préparations histologiques
Deux oligonucléotides ou plus [tableau 12.1] ont été utilisés pour caractériser la spécificité du
marquage. Par la suite, un seul oligonucléotide/ARNm a été utilisé durant la cartographie (46,
47, 51, 58, 59, 62, 131 and 133). Chaque niveau anatomique a été analysé au cours d'au moins
trois (et jusqu'à cinq) expériences indépendantes.
L'analyse des motifs de marquage a été mené à la fois sur les films et les émulsions. Les
coupes ont été contre-colorées au bleu de toluidine préalablement à l'identification des
structures. Les définitions des aires anatomiques sont basées sur différents atlas, dont
[251,250,169,314,292,111].
Une quantification relative des niveaux d'ARNm codant pour les différentes sous-unités dans
les noyaux dopaminergiques du mésencéphale a été réalisée sur les autoradiogrammes à l'aide
de l'analyseur d'image Vidas (Kontron, Munich, Allemagne). Deux expériences différentes
ont été quantifiées. Six niveaux anatomiques ont été analysés dans l'un des cerveaux (Bregma
-4,7 à -6,3 mm) et quatre dans l'autre (Bregma -4,8 à -6,1 mm). Après une procédure de
seuillage, qui permet la rétention du signal spécifique, le MGV et l'aire retenue sont mesurés.
La densité optique intégrée totale TOT est alors calculée à partir de la densité optique intégrée
de chaque niveau:
Après correction (COR) pour S (pour la sous-unité i,
), les résultats sont
exprimés par rapport aux valeurs de 2 (
) dans chaque expérience. 2 fut
arbitrairement choisie comme référence car elle est exprimée partout, de manière relativement
homogène dans le cerveau de rat adulte.
La détermination des valeurs de Kd et Bmax pour les sondes
11.3.2.
3 est décrite au paragraphe
Le comptage des cellules sur les émulsions photographiques a été réalisé au niveau Bregma 5,3 mm. La reconnaissance des neurones est basée sur la contre-coloration des coupes au bleu
de toluidine. Deux champs rectangulaires (380x250 µm) sont analysés dans chaque région.
Les champs sont localisés dans la SNc et le centre de la VTA. Un neurone est considéré
positif quand il est recouvert par une densité de grains au minimum de trois fois la densité du
bruit de fond.
12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte
12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs
L'hybridation in situ avec oligonucléotides a été choisi afin de minimiser la reconnaissance
croisée des différentes sous-unités du nAChR et de permettre des comparaisons quantitatives
entre plusieurs expériences. Pour une discussion générale sur les différentes méthodes
d'hybridation in situ et sur les fondements théoriques de l'hybridation des oligonucléotides
voir le chapitre 11.
Les oligonucléotides peuvent être choisis dans des régions de séquences hautement
spécifiques, ce qui n'est pas toujours le cas pour les sondes ARNc. Par exemple, les sondes
utilisées dans les études antérieures du nAChR étaient souvent dirigées contre la séquence
codante toute entière, et donc contre certaines parties hautement conservées. Afin de produire
des sondes plus efficaces, les auteurs les ont souvent hydrolysées en fragments de 50-200
nucléotides, une pratique qui peut engendrer du signal non-spécifique mais également des
reconnaissances croisées avec les autres membres de la même famille de gène.
L'hybridation in situ avec oligonucléotides est hautement reproductible dans (presque) tous
les tissus et avec (presque) toutes les sondes. En effet, le contrôle des paramètres de
l'expérience (i.e., concentration de la sonde, activité spécifique et température de fusion)
permet la détermination de caractéristiques quantitatives comme le KD apparent et le Bmax.
Pour la sous-unité 3, une étude de saturation a été menée sur l'habénula médiale avec
plusieurs sondes. Dans les conditions expérimentales décrites plus haut (en particulier, le
lavage le plus stringent effectué à Tm - 20 degC dans 0,5x SSC durant 15 min), la sonde 46
donne un KD de 0,075 nM avec un Bmax de 0,13 fmol/cm2 et la sonde 109 donne un KD de
0,17 nM avec un Bmax de 0,19 fmol/cm2 . De manière générale, nous avons vérifié que dans
cette étude les différences de marquage obtenues avec les différentes sondes dirigées contre le
même ARNm étaient < 50 %.
12.3.2 Distribution des ARNms codant
2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat
Le signal pour l'ARNm codant 6 est détecté dans un nombre restreint de structures [résumé
dans le tableau 12.2]. L'intervalle d'intensité du marquage varie énormément, de difficilement
détectable à très fort. Le télencéphale ne montre aucun signal spécifique [Figure 12.1].
Figure 12.1 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des
ARNm
d' 2 (S=4687),
(S=4092),
3 (S=2710) et
3 (S=2568),
4 (S=5071),
5 (S=1845),
6 (S=1623),
2
4 (S=1563) sur des coupes adjacentes de télencéphale. Bregma
+1,70 mm.
Dans toutes les autres subdivisions principales du CNS, quelques noyaux montrent des
niveaux détectables d'ARNm 6.
Tableau 12.2: Distribution et quantification relative des ARNm codant pour les sous-unités
dans le cerveau de rat. (+) difficilement détectable, + signal faible, ++ signal modéré, +++
signal fort.
2
3
4
5
6
7
2
3
4
Télencéphale
bulbe olfactif
+
++
+
++
-
++
++
-
+
noyau olfactif antérieur
-
(+)
++
(+)
-
++
++
-
-
layer II-III
-
-
+
+
-
+
++
-
-
layer IV
-
+
+
+
-
+
++
-
-
layer V
-
-
++
+
-
++
++
-
-
layer VI
-
-
++
++
-
++
++
-
-
formation hippocampale
-
+
+
+
-
+++
++
-
-
striatum
-
-
-
-
-
-
+
-
-
septum
-
-
+
-
-
+
+
-
-
noyau supra-optique
-
-
+
-
-
+++
+
-
-
noyau ventro-médial
-
-
+
-
-
-
++
-
-
reste
-
-
+
-
-
-
+
-
-
-
+++
-
++
-
-
+
-
+++
habénula médiale partie
dorsale
-
-
+
-
-
-
++
-
-
habénula médiale partie
ventro-latérale
-
+++
++
+
-
-
++
-
+++
habénula médiale partie
ventro-médiale
-
+++
(+)
-
(+)
-
++
+++
+++
habénula latérale
-
-
-
-
(+)
-
+
+
-
noyau réticulé
-
-
+
-
++
-
++
+
-
noyau antéro-ventral
-
+
+++
-
-
-
+++
-
-
isocortex
hypothalamus
Diencéphale
glande pinéale
habénula
thalamus
reste
-
-
+++
-
-
-
+++
-
-
noyaux dopaminergiques
-
(+)
++
++
+++
-
++
+++
-
noyau mésencéphalique du
trijumeau
-
-
+
-
+
-
++
+++
-
partie apicale
++
-
-
++
-
+
-
-
-
partie centrale
-
-
-
-
+
+
(+)
-
-
partie latérale
-
-
-
-
+
+
(+)
-
-
partie rostrale
++
-
-
++
-
+
-
-
-
noyaux vestibulaires
-
-
+
+
-
++
+
-
-
cervelet
-
+
-
+
-
-
+
+
+
locus coeruleus
-
(+)
-
-
+++
-
++
+++
(+)
noyaux moteurs
-
+
+
+
-
-
++
-
-
noyau du tractus solitaire
-
++
(+)
+
-
-
++
-
++
area postrema
-
++
++
+
-
-
++
-
+
rétine
-
+
+
?
++
?
++
++
+
ganglions autonomes
-
+++
-
++
-
++
++
-
+++
ganglions somato-sensoriels
-
(+)
-
-
+
-
+++
++
-
ganglions vestibulocochléaires
-
-
++
?
++
?
++
++
-
Mésencéphale
n. interpédonculaire
Rhombencéphale
Périphérie
12.3.3 Diencéphale
Dans le diencéphale, trois noyaux sont marqués par les sondes
différentes.
6, mais avec des intensités
Le noyau thalamique réticulé montre un gradient à la fois rostro-caudal et dorso-ventral du
marquage 6 [Figure 12.2]. L'intensité du marquage est modeste, même dans la partie rostrodorsale.
2 et
4 sont également présentes dans le noyau réticulé bien qu'à des niveaux
moindres. La sous-unité 3 est présente mais est difficilement détectable avec un seul
oligonucléotide. En revanche si l'on place deux sondes en tandem, le marquage apparaît
nettement.
Figure 12.2 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des
ARNm
d' 2 (S=4687),
(S=3000),
3 (S=2568),
4 (S=46848),
5 (S=1845),
6 (S=1623),
2
3 (l'expérience qui est représentée résulte de l'utilisation groupée de deux sondes.
Le facteur S est donc difficilement calculable et de plus, le bruit de fond est très élevé) et
(S=1563) sur des coupes adjacentes de diencéphale antérieur. Bregma -1,4 mm.
Le marquage
4
6 est restreint à une petite partie de l'habénula médiale [Figure 12.3], dans
quelques cellules longeant le ventricule. Cette distribution correspond à celle de
Cependant, l'intensité du marquage
3.
3 est plus forte. La distribution de l'ARNm d' 6 (ou de
3) semble complémentaire de celle d' 4. Au contraire, le marquage pour 3 et 4 est
détecté à des niveaux très forts à travers toute la partie ventrale du noyau, alors que le
marquage 5 est restreint à la partie ventro-latérale du noyau et celui de
niveaux modérés dans tout le noyau.
2 est présent à des
Dans le noyau de l'habénula latérale, nous détectons une faible marquage pour
pour
2 et
6 ainsi que
3.
Figure 12.3 : panneaux supérieurs, photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant
la distribution des sous-unités
3 (S=3469),
4 (S=4010),
5 (S=2735),
6 (S=3227),
2
(S=4092), 3 (S=2710) et 4 (S=3617) sur des coupes adjacentes de noyau habénulaire. Les
têtes de flèche et les flèches indiquent l'habénula médiale et latérale, respectivement. Note: A
cette échelle, le marquage 6 est difficilement détectable.
panneaux inférieurs, micro-photographies en fond noir d'émulsion montrant la distribution
d' 3 (S=15462), d' 4 (S=7953), d' 6 (S=1857) et de 3 (S=3512) sur des coupes
adjacentes d'habénula médiale. La contre-coloration au bleu de toluidine (TB) est reportée
dans le dernier panneau de la ligne intermédiaire. Note: Les distributions de
sont complémentaires. Bregma -3.3 mm.
6/ 3 et
La partie caudale du noyau supra-mammillaire est légèrement marquée par les sondes
ainsi que par les sondes
5 et
2. Le marquage pour
4 est absent ou très faible.
4
6
12.3.4 Mésencéphale
Le mésencéphale présente trois structures contenant du signal spécifique pour l'ARNm d' 6.
Les noyaux dopaminergiques du mésencéphale expriment une grande variété d'ARNm codant
les sous-unités du nAChR[Figure 12.6]. Le marquage pour 6 est très fort dans la substance
noire (A9), pars compacta (SNc), la VTA (A10) et l'aire rétrorubrale (A8) [Figure 12.4].
Figure 12.4 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution de
l'ARNm d' 6 (S=1623) à 8 niveaux (bregma -4,8, -5,2, -5,3, -5,7, -6,1 et -6,4 mm) du
mésencéphale ventral. Les têtes de flèche, les flèches et les doubles têtes de flèches indiquent
respectivement l'aire tegmentale ventrale, la substance noire pars compacta et le noyau
interpédonculaire.
Des cellules dispersées montrant un marquage de forte intensité pour 6 sont également
présentes dans la zone péri-ventriculaire mésencéphalique et dans la substance noire pars
reticulata (SNr), correspondant peut-être au système dopaminergique péri-ventriculaire et aux
neurones dopaminergiques de la SNr. Les neurones de la SNc et de la VTA sont marqués de
manière homogène. La sous-unité
très importants [Figure 12.5].
3 est détectée à des niveaux plus faibles bien que toujours
Figure 12.5 : Microphotographies en fond noir d'émulsion montrant les distributions de
l'ARNm d' 6 (S=1857) et de 3 (S=3512) sur des coupes adjacentes de SNc et VTA. Note: les
distributions très similaires des deux ARNm dans ces régions. Bregma -5,3 mm. Barre
d'échelle µm. Abréviations: D = dorsal, L = latéral.
Afin de déterminer si les ARNms des sous-unités 6 et 3 sont localisés dans les cellules
dopaminergiques, nous avons compté les neurones marqués par les sondes dirigées contre les
deux sous-unités du nAChR ainsi que celle dirigée contre la tyrosine hydroxylase (TH),
l'enzyme de biosynthèse des catécholamines, après contre-coloration des coupes avec du bleu
de toluidine. Approximativement le même pourcentage de neurones (80%) de la SN et de la
VTA contiennent
du marquage spécifique pour les ARNm d' 6, de
3 et de la TH [Table
12.3].
Tableau 12.3 : Décompte des neurones positifs pour la TH, 6 et 3 dans la SNc et la VTA.
Les résultats (moyenne de deux comptage par marquage ±SD) sont exprimés en pourcentage
du nombre total de neurones.
SNc
Tyrosine hydroxylase
VTA
76,6 ±
2,3
86,4 ±
1,2
6
83,8 ±
2,3
80,9 ±
1,8
3
83,4 ±
2,3
83,0 ±
3,4
Cela montre qu'au moins 50 % des neurones TH+ (c.-à-d. dopaminergiques) contiennent
également les arnm d' 6 et de 3. Cependant, le recouvrement au niveau régional des zones
marquées par les différentes sondes suggère que les trois ARNm sont présents dans la même
population neuronale.
Du signal pour les ARNm d' 4, 5 et 2 est également visible dans les noyaux
dopaminergiques, mais à des niveaux plus modérés. [Figure 12.6].
Figure 12.6 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des
\textsc{arn}ms d' 2 (S=4687), d' 3 (S=2469), 4 (S=4648), 5 (S=4179), 6 (S=1623),
2 (S=3000), 3 (S=1828) et 4 (S=4060) sur des coupes adjacentes de mésencéphale
ventral. Les têtes de flèche et les flèches indiquent respectivement la substance noire, pars
compacta, et la VTA. Les petites croix indiquent un morceau de cervelet qui a migré
accidentellement vers la partie ventrale du cerveau durant la congélation. Bregma -5,6 mm.
12.3.5 Rhombencéphale
Dans le rhombencéphale, le locus c ruleus est le seul noyau marqué par les sondes 6
(Figure 12.7). L'intensité du marquage est extrêmement forte, au même niveau que celle des
cellules dopaminergiques du mésencéphale. Les ARNm de plusieurs autres sous-unités sont
trouvé dans ce noyau, 2 et
difficilement détectables.
3 à des niveaux modérés,
3 à un faible niveau,
4 et
5
Figure 12.7 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des
\textsc{arn}ms d' 2 (S=4687), d' 3 (S=2469), 4 (S=4648), 5 (S=4179), 6 (S=1623),
2 (S=3000),
3 (S=1828) et
4 (S=4060) sur des coupes adjacentes de rhombencéphale.
12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris
recombinantes
Des lignées de souris n'exprimant plus les sous-unités
2 [256] et
recombinaison homologue. Dans les souris dont le gène codant
4 ont été engendrées par
2 a été inactivé,
L'hybridation in situ montre une diminution du signal 2 de moitié chez les hétérozygotes et
une disparition totale chez les mutantes homozygotes [Figure 12.8]. L'hybridation in situ des
ARNms codant les autres sous-unités ne montre aucune différence significative entre les
animaux
2+/+ et
2-/-.
Figure 12.8 : Distribution des sous-unités dans le cerveau de souris
sous-unités
4 et
2-/-. L'expression des
4 n'est montrée que dans les cerveau des souris sauvages et homozygotes.
Bregma -2 mm
Dans le cerveau des souris
4-/-, une sonde dirigée contre la délétion du gène
4 ne donne
plus aucun signal (comme pour les souris 2-/-, le signal est diminué de moitié dans le
cerveau des animaux hétérozygotes) [Figure 12.9]. En revanche, avec une sonde dirigée
contre une partie du gène en 3' de la délétion, on peut noter une persistance du marquage.
Cela montre que le messager est toujours présent même si il n'y a plus formation de protéine
fonctionnelle.
Aucune modification d'expression significative des sous-unités non-recombinées n'est
décelable dans le cerveau de ces souris.
Figure 12.9 : Distribution des sous-unités dans le cerveau de souris
4-/-. L'expression des
sous-unités 3,6 et 2 n'est montrée que dans les cerveau des souris sauvages et
homozygotes. Deux images de l'hybridation in situ d' 4 dans le cerveau des homozygotes
sont montrées. L'image supérieure a été réalisée avec une sonde reconnaissant une partie du
transcrit en aval de la délétion, alors que l'image inférieure a été réalisée avec une sonde
complémentaire de la délétion. Bregma -2 mm, excepté pour 6: Bregma -3 mm.
12.5 Distribution des sous-unités durant le développement
embryonnaire
La distribution des ARNm codant les différentes sous-unités varie d'une sous-unité à l'autre
mais est bien définie pour chaque sous-unité. Michele ZOLI et moi-même avons observé la
mise en place de cette distribution durant le développement embryonnaire et peri-natal. Deux
sous-unités ( 3 et 4) ainsi que deux sous-unités ( 2 et 4) ont été particulièrement
étudiées. L'expression observée apparaît très tôt (dès le début de la neurogenèse), et suit la
différenciation neuronale . Le marquage est réparti uniformément dans les neurones postmitotiques. Puis, alors que
4 et
2 restent exprimées très largement mais à un niveau
modéré, l'expression de 3 et 4 se restreint à quelques noyaux particuliers où elle atteint
des niveaux très élevés. La mise en place de l'expression de la sous-unité 4 suit la
progression caudo-rostrale des terminaisons cholinergiques. Une distribution de type adulte
des transcrits est acquise dès le début de la vie postnatale. Trois principaux motifs
développementaux ont été identifiés:
(1)- Dans la majorité des cas étudiés (rhombencéphale, moelle épinière [Figures 12.10 et
12.11], ganglions somato-sensoriels[Figure 12.12]) les quatre sous-unités sont initialement
exprimées puis, durant le développement prénatal subséquent, le niveau d'expression de
certaines de ces sous-unités devient progressivement indécelable ( 4 dans les ganglions
autonomes,
3 et
4 dans la majeure partie du cerveau et la moelle épinière,
les ganglions des racines dorsales,
3,
4 et
4 et
4 dans
4 dans les ganglions somato-sensoriels).
Figure 12.10 : Expression de 3, 4, 2 et 4 aux jours embryonnaires 13 et 15 du rat. Les
barres d'échelle mesurent 1 mm. Panneaux supérieurs, les têtes de flèches pointent les
ganglions des racines dorsales. Panneaux médians, les flèches pointent le ganglion du
trijumeau et les têtes de flèches les ganglions des racines dorsales. Panneaux inférieurs, Les
flèches pointent le ganglion du trijumeau, les têtes de flèches pointent le ganglion
sphénopalatin et les doubles têtes de flèches le ganglion otique. Btel: télencéphale basal, Cx:
cortex, Di: diencéphale, Me: mésencéphale, MO: medulla oblongata, Po: pons, Rh:
rhombencéphale, SC: moelle épinière (spinal cord), Te: télencéphale.
Figure 12.11 : Expression de 3, 4, 2 et 4 aux jours embryonnaires 17 du rat. Coupes
coronales, Les flèches pointent le ganglion du trijumeau, les têtes de flèches pointent le
ganglion otique et les doubles têtes de flèche l'habénula médiale. La barre d'échelle mesure
1 mm. Coupes sagitales, les petites flèches pointent l'épiphyse, les grosses flèches le noyau
ventro-médial de l'hypothalamus, les têtes de flèche l'habénula médiale et les doubles têtes de
flèches le ganglion sympathique lombaire. Btel: télencéphale basal, Cx: cortex, Hy:
hypothalamus, Me: mésencéphale, MO: medulla oblongata, Po: pons, Th: thalamus.
Figure 12.12 : Expression de 3, 4, 2 et 4 dans les ganglions périphériques. La barre
d'échelle mesure 100 µm. Les flèches pointent le ganglion glosso-pharyngé inférieur, les têtes
de flèches le ganglion glosso-pharyngé supérieur et les têtes de flèche doubles le ganglion
cervical supérieur. 2 est présent partout, 4 nulle part et 3 comme 4 sont présents dans
les ganglions autonomes mais pas dans le ganglion somato-sensoriel.
(2)- Certaines sous-unités sont initialement exprimées et le reste durant tout le développement
( 3, 4, 2 et 4 dans la rétine, 3, 2 et
dans les ganglions vestibulo-cochléaires).
4 dans les ganglions autonomes,
4 et
(3)- Dans le cas du néo-cortex, 3 et 2 sont initialement exprimées (E12-E13) puis
disparaît (E15) et est remplacée par 4 (E17-E19)[Figure 12.13].
2
3
Figure 12.13: Expression d' 3, 4 et 2 dans le cortex du rat aux jours embryonnaires E13,
E15 et E19. CP: cortical plate, cx: cortical neuroépithélium, SP: cortical subplate, ICx:
intermediate cortical layer
12.6 Discussion
Depuis le premier report de l'existence de la sous-unité 6 [180] la connaissance de la
signification fonctionnelle de cette sous-unité n'a que peu progressé. Ici nous montrons que
l'ARNm d' 6 est restreint à quelques noyaux spécifiques dans le cerveau. La quantité d'ARNm
6 est particulièrement haute dans les noyaux catécholaminergiques (les noyaux A6, A8, A9
et A10) et modérée ou faible dans le noyau réticulé du thalamus, l'habénula latérale et médiale
et le noyau supra-mammillaire. Cette distribution correspond à celle mentionnée dans le
tableau de [90] et au marquage immuno-cytochimique observé par [136]. En plus, d'autres
noyaux sont positifs, comme le noyau interpédonculaire et le noyau mésencéphalique du
trijumeau. Au contraire de ce qui est rapporté par [135], aucun marquage n'a été détecté dans
l'aire prétectale antérieure.
12.6.1 Aspects méthodologiques
Pour cette étude nous avons utilisé l'hybridation in situ avec oligonucléotides, une méthode
largement utilisée dans le champ des LGIC [221,366,218,219,259,260,341,353,372], bien que
différente de la méthode avec ARNc qui a été utilisée pour cartographier les sous-unités du
nAChR dans le CNS des mammifères adultes [335,281,334,80,90,284,299]. De manière
générale, nos études réalisées avec oligonucleotides sont en bon accord avec les études
précédentes réalisées avec ARNc (avec quelques exceptions notables, comme 5 dans
l'habénula médiale). Cependant une différence claire avec les résultats précédents est observée
quand on s'intéresse à 3 et 6. En particulier, nous voyons un fort signal 6 et presque pas
de signal 3 dans quelques régions précédemment supposées riches en ARNm 3, à savoir
les noyaux catécholaminergiques [335]. Cette différence ne peut être expliquée sur la base des
sensibilités différentes des deux types de méthodes, puisque dans la plupart des structures du
cerveau notre cartographie d' 3 correspond avec les précédentes [335]. 3 et 6 sont
phylogénétiquement très proches (voir le chapitre 9). Les séquences de leurs ARNm sont très
proches. Puisque, selon l'étude présentée ici, 6 est presque 20 fois plus exprimée qu' 3
dans certaines régions, il est possible qu'une sonde ARNc dirigée contre la séquence entière
d' 3 révèle également les ARNm d' 6 (particulièrement si la sonde a subi une hydrolyse
alcaline avant l'expérience).
12.6.2 Colocalisations
Nos travaux montrent que les ARNm d' 6 et 3 possèdent une distribution similaire dans le
cerveau. Quelques expériences exploratoires indiquent que cela serait également le cas en
périphérie. Par exemple, dans la rétine post-natale et dans les ganglions somato-sensoriels
(comme le ganglion du trijumeau),
co-localisation d' 6 et de
6 et
3 sont tous les deux détectés. Dans le cerveau, la
3 est réalisée dans la plupart de leur zones d'expression [Tableau
12.2]. Le marquage pour 3 est parfois d'une intensité inférieure (noyau thalamique réticulé,
noyau interpédonculaire, locus c ruleus, noyaux dopaminergiques) et parfois d'une intensité
supérieure (habénula médiale, noyau mésencéphalique du trijumeau) à celui d' 6. Une
exception est le noyau supra-mammillaire où l'ARNm d' 6 est détecté mais non celui de
Dans ce noyau, le marquage pour 6 est très bas, et les niveaux d'ARNm de
être au-dessous du seuil de détection de la technique.
3.
3 pourraient
La sous-unité 6 possède tous les résidus qui ont été identifiés comme faisant partie de
composant principal du site de liaison (voir le tableau 7.1 et l'alignement 7.2). La sous-unité
6 est donc une << vrai >> sous-unité , qui peut être engagée dans la liaison de l'ACh. In
vitro,
6 de poulet forme des récepteurs fonctionnels avec la sous-unité
4 d'homme [130]
ou de poulet[116]. La colocalisation extensive d' 6 et de 3 rapportée ici, supporte l'idée
que ces sous-unités pourraient s'assembler au sein d'hétéro-oligomers. Une possibilité est que
3, comme
5, soit un troisième type de sous-unité (en sus des types
et
<< standards >>). Ces sous-unités, comme la sous-unité 1 musculaire ne participeraient pas
au site de liaison de l'ACh et n'existeraient donc que dans des hétéro-oligomères comportant
au moins 3 sous-unités différentes (voir les paragraphes 7.2 et 9.4.2). Dans le système
nerveux, des nAChRs ont été identifiés composés de
et
4 2 5 [63]
3 4 5 [63,330,297]
3 2 4 5 [62]. De manière similaire, on peut faire l'hypothèse qu'il pourrait exister
dans le système nerveux des récepteurs comme
6 2 3.
12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula
Dans l'habénula latérale, la distribution de l'ARNm d' 6 est très similaire à celle des ARNm de
2 et 3, bien qu'il n'y ait aucune preuve directe de leur colocalisation dans les mêmes
cellules. Comme l'habénula latérale envoie des projections à la substance noire [154], et
inversement celle-ci envoie des projections à l'habénula latérale [305,196], des nAChRs
composés de 6 2( 3) pourraient être présents dans les deux branches de cette voie bidirectionnelle.
Si l'on considère les sous-unités du nAChR, l'habénula médiale peut être subdivisée en trois
sous-noyaux: dorsal, ventro-médial et ventro-latéral [Figure 12.14]. 6 et 3 sont localisées
dans le sous-noyau ventro-médial, avec un gradient de la ligne médiane vers la partie latérale
(voir aussi [80]). La distribution plus restreinte d' 6 relativement à 3 peut être due à une
moindre quantité d'ARNm, et donc à un niveau plus faible du signal. Le seuil de sensibilité
couperait alors le gradient d'expression plus près de la ligne médiane. Goldner et coll. [136]
ont également trouvé par immuno-cytochimie la sous-unité 6 dans l'habénula médiale. La
seule photographie présentée par les auteurs montre 6 localisée dans la région ventromédiale. La distribution de l'ARNm d' 4 est complémentaire de celle d' 6 et 3. La sousunité 4 est détectée à un niveau très faible dans le sous-noyau ventro-médial, à un niveau
intermédiaire dans le sous-noyau dorsal et à un niveau important dans le sous-noyau ventrolatéral (voir aussi [335,157]). Contrairement à [334], nous trouvons un marquage pour l'ARNm
d' 5 dans l'habénula médiale. Sa distribution est restreinte au sous-noyau ventro-latéral. Un
marquage fort pour
3 et
4 est détecté dans les sous-noyaux ventro-médial et ventro-latéral
équivalent à celui décrit dans [335,90,157]. Le marquage pour 2 est présent de manière à
peu près uniforme dans l'ensemble du noyau. Les sous-noyaux ventro-médial et ventro-latéral
correspondent aux deux tiers ventraux de l'habénula médiale, qui sont formés de neurones
cholinergiques [192,357]. De fait, la distribution des sous-unités 3 et 4 se superpose à
celle des neurones exprimant la choline acétyl-transférase (voir les Figures 2 et 8b de [238]).
Le sous-noyau ventro-latéral semble plus riche en choline acétyl-transférase que le sousnoyau ventro-médial [163]. Finalement, le sous-noyau dorsal contient de forts niveaux de
substance P [64].
Figure 12.14 : Schéma de la distribution des sous-unités du nAChR dans l'habénula médiale.
Les combinaisons de sous-unités pour lesquelles des témoignages électrophysiologiques (en
ovocytes après expression hétérologue) et, pour certaines, biochimiques (coprécipitation à
partir de tissu natif) ont été obtenue sont indiquées pour chaque sous-noyau. La localisation
des récepteurs putatifs 6 et 2 ou 4 avec ou sans 3 est également représentée
(encadrée). D, dorsal; VL, ventro-latéral; VM, ventro-médial.
L'habénula médiale était supposée, pour ce qui est du nAChR, être un noyau homogène,
contenant plusieurs isoformes différentes de récepteur dans les même cellules. Les différents
courants nicotiniques enregistrés à partir de neurones habénulaires étaient donc assignés à de
multiples isoformes de récepteurs présentes dans une classe de cellules homogènes
[224,225,61]. Les données présentées plus haut, en particulier celles montrant la ségrégation
des ARNm d' 4/ 5 et d' 6/ 3, suggèrent que les isoformes de nAChR sont, au moins
partiellement, cellule-spécifiques. Sur la base des résultats présents et antérieurs (en cultures
de cellules transfectées et par immuno-précipitation) on peut inférer les isoformes qui
pourraient être présentes dans les différents sous-noyaux [Figure 12.14].
12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques
Le locus c ruleus et les noyaux A8, A9 et A10 présentent les plus forts niveaux d'expression
de l'ARNm d' 6 dans le CNS. Ces noyaux contiennent de forts niveaux de TH et sont
responsables de la majeure partie de l'innervation noradrénergique et dopaminergique du
cerveau. L'action potentiatrice de la nicotine sur la libération de dopamine [347,132,9] est
transmise par les récepteurs localisés sur les terminaisons (stimulation rapide), et par les
récepteurs localisés sur les soma dopaminergiques du mésencéphale (stimulation à long
terme). Les deux ensembles de récepteurs pourraient être identiques ou différents.
12.6.4.1 Implication de
2
L'ARNm codant 4 n'est pas détecté dans les cellules dopaminergiques [91,90,185]. [257] ont
montré qu'aucun courant nicotinique somatique ne persistait dans les cellules
dopaminergiques des souris
2-/-.
[55] ont clairement montré l'existence de récepteurs à haute affinité pour la nicotine en
autoradiographie dans les soma dopaminergiques et dans les terminaisons. [256] ont montré
que l'inactivation de la sous-unité 2 entraîne une disparition complète des récepteurs à haute
affinité pour la nicotine en autoradiographie.
Au moins une partie, si ce n'est la totalité des nAChRs de la cellule dopaminergique nécessite
donc la sous-unité
12.6.4.2
2.
4 ne semble pas impliquée
La pharmacologie de l'accroissement de libération de dopamine entraîné par la nicotine
indique que le(s) récepteur(s) impliqué(s) n'est pas 4 2 [263,137,285]. Dans les
synaptosomes striataux, Grady et coll. [137] ont trouvé un ordre d'efficacité cytisine =
nicotine > DMPP=ACh. Dans des tranches de striatum, [285] ont trouvé l'ordre d'efficacité
cytisine > nicotine = DMPP. Ces spectres pharmacologiques ne correspondent pas aux
propriétés des récepteurs contenant 4 2 [203]. De plus, 100 nM de bungarotoxine
neuronale bloque la potentiation endogène de la libération de dopamine par la nicotine [296].
A cette concentration, la toxine est capable d'inhiber l'action de
2 [204].
12.6.4.3
6 est plus probablement impliquée que
3 2 mais pas celle de
4
3
Plus haut nous montrons que le marquage pour 6 est à peu près 20 fois plus intense que
celui pour 3 dans les cellules dopaminergiques ainsi que celles du locus c ruleus. Goldner
et coll. [136] ont également observé par immuno-cytochimie un fort marquage pour 6 dans
les noyaux catécholaminergiques A6,9,10. On peut donc faire l'hypothèse que la
pharmacologie observée pour la potentiation de la libération de dopamine résulte d'un
récepteur contenant 6. Signalons que Clarke et Reuben [56] trouvent que les
caractéristiques pharmacologiques des libérations de dopamine dans le striatum et de
noradrénaline dans l'hippocampe diffèrent. On possède peu de données sur la pharmacologie
des récepteurs contenant 6. Cependant, l'identité de séquence protéique entre 3 et 6 est
très forte (61 % d'identité sur la longueur totale, les différences étant principalement localisées
dans le peptide signal et la partie variable de la boucle cytoplasmique, voir les Figures 7.2 et
10.4). Il est important de noter que tous les acides aminés identifiés comme faisant partie du
site de liaison de l'ACh [Table 7.1] sont conservés; en particulier les << boucles >> A et C
dans leur entièreté [122] sont 100 % identiques entre les deux sous-unités. La contribution des
sous-unités 3 et 6 au site de liaison pourrait donc être similaire, et pourrait rendre compte
des données pharmacologiques initialement reportées12.1.
12.6.4.4 Implication de
3
Bien que les niveaux d'expression des protéines puissent ne pas être parallèle aux niveaux
d'ARNm, la forte expression de
3 dans les neurones positifs pour la TH supporte l'idée que
cette sous-unité contribue à la réponse des neurones catécholaminergiques à la nicotine. A ce
stade il n'existe pas de preuve directe de l'existence d'oligomères contenant
6 et
3 dans ces
cellules. Cependant, la co-localisation extensive des sous-unités 6, 2 et 3 indique que la
formation d'un oligomère contenant ces trois sous-unités pourrait rendre compte de la
libération des catécholamines par la nicotine.
12.7 Conclusion
La présence de forts niveaux d'ARNm codant la sous-unité 6 dans les neurones contenant de
la dopamine pourrait être d'une importance physiologique considérable, puisque la libération
de dopamine induite par la nicotine est supposée être à la base de ses propriétés locomotrices
et addictives [54,312,66]. Plus généralement, il a été postulé que les neurones
catécholaminergiques du locus c ruleus et des noyaux A8, A9 et A10 contrôlent directement
la dépendance physique aux drogues à accoutumance [88,174,232,295,149]. Le design de
drogues dirigées spécifiquement contre les sous-types de récepteur responsables de ces
comportements est un challenge important de la neuro-pharmacologie moderne. Afin
d'atteindre ce but, la constitution moléculaire exacte de ces récepteurs doit être établie. Nous
proposons que des récepteurs 6 2 3 sont des candidats probable pour la médiation de la
libération de catécholamines induite par la nicotine.
Footnotes
... reportées12.1
Les données présentées dans [130] et [116] sont difficiles à interpréter dans le cadre de
la comparaison 3, 6. En effet, dans [130], les auteurs étudient des récepteurs
contenant 6gg 4hs et les comparent à 3gg 4gg et 3gg
4hs. Les différences
observées entre ces deux derniers récepteurs sont aussi importantes qu'entre eux et le
premier. Quant à [116], il rapporte la comparaison entre
mais pas
6gg 4gg et
3gg 6gg 4gg
3gg 4gg
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1999-06-19
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Sous-sections
12.1 Introduction
12.2 Matériel et méthodes
o 12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides
o 12.2.2 Animaux
o 12.2.3 Procédure d'hybridation in situ
12.2.3.1 Prélavage commun
12.2.3.2 Premier protocole de lavage
12.2.3.3 Second protocole de lavage
12.2.3.4 Troisième protocole de lavage
12.2.3.5 Post-lavage commun
12.2.4 Analyses des préparations histologiques
12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte
o 12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs
o
o
o
o
o
12.3.2 Distribution des ARNms codant 2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat
12.3.3 Diencéphale
12.3.4 Mésencéphale
12.3.5 Rhombencéphale
12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris recombinantes
12.5 Distribution des sous-unités durant le développement embryonnaire
12.6 Discussion
o 12.6.1 Aspects méthodologiques
o 12.6.2 Colocalisations
o 12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula
o 12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques
12.6.4.1 Implication de 2
12.6.4.2 4 ne semble pas impliquée
12.6.4.3 6 est plus probablement impliquée que
12.6.4.4 Implication de
12.7 Conclusion
3
3
12. Localisation des ARN messagers codant
pour les sous-unités des nAChRs dans le
système nerveux
[ZOLI M, LE NOVÈRE N, HILL JA, CHANGEUX JP (1995). Developmental regulation of
nicotinic ACh receptor subunit mRNAs in the rat central and peripheral nervous systems.
Journal of Neuroscience 15 : 1912-1939.
LE NOVÈRE N, Zoli M, CHANGEUX JP (1996). Neuronal nicotinic receptor 6 subunit
mRNA is selectively concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain. European
Journal of Neuroscience 8 : 2428-2439.
Voir aussi:
PICCIOTTO MR, ZOLI M, LÉNA C, BESSIS A, LALLEMAND Y, LE NOVÈRE N, VINCENT P,
MERLO-PICH E, BRÛLET P, CHANGEUX JP (1995). Abnormal avoidance learning in mice
lacking functional high-affinity nicotine receptor in the brain. Nature 374 : 65-67.
MARUBIO LM, ARROYO-JIMENEZ MM, CORDERO-ERAUSQUIN M, LÉNAéna C, LE NOVÈRE
N, DE KERCHOVE d'EXAERDE A, HUCHET M, DAMAJ MI, CHANGEUX JP. Reduced nicotineelicited antinociception in mice lacking the neuronal nicotinic alpha-4 subunit. Soumis pour
publication. ]
12.1 Introduction
De nombreuses études d'hybridation in situ ont été réalisées afin de détecter les sous-unités du
nAChR présentes dans le système nerveux du rat adulte [134,80,335,334,90,299,284,53] et
embryonnaire [161,372]. Cependant, la distribution de l'ARNm d' 6 n'avait pas été décrite en
détail. Ici, je présente une étude détaillée de la distribution de l'ARNm d' 6 dans le système
nerveux central du rat adulte. Les motifs de marquage, ainsi que la codistribution d' 6 avec
les autres sous-unités du nAChR nous amène à penser que les nAChRs contenant cette sousunité contribuent à certains des effets pharmacologiques documentés de la nicotine.
12.2 Matériel et méthodes
La méthode d'hybridation in situ avec oligonucléotides radio-marqués est décrite en détail
dans [354]. Voir le chapitre 5 pour les fondements théoriques de l'expérience.
12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides
Après analyse des structures secondaires de l'ARNm par le programme STEMLOOP de la suite
WISCONSIN du GCG [85], les séquences des sondes sont choisies dans des régions uniques en
séquence au sein de la famille, dépourvues de structures secondaires putatives, contenant à
peu près 50-60 %GC. Les oligonucléotides furent synthétisés à l'aide d'un synthétiseur d'ADN
Cyclone (Biosearch inc.) ou commandés à la société Genset (Paris, France). Les sondes sont
décrites dans le tableau 12.1.
Tableau 12.1 : Oligodésoxynucléotides utilisés dans cette étude. La température de fusion est
calculée pour la condition de lavage la plus stringente, à l'aide de l'équation 3 de [336] (0,1 M
NaCl, 0 % formamide) (mais voir le chapitre 5 pour un type de calcul plus exact). Les
séquences des sous-unités peuvent être retrouvées dans la Ligand Gated Ion Channel
Database (voir le chapitre 2) à l'URL:
http://www.pasteur.fr/units/neubiomol/LGIC.html ou à partir de GenEMBL (les
d'accession sont dans le tableau)
cibl accessi positi
e
on
on
Séquence de l'oligodésoxynucléotide
%G T
C
m
2rn
L1007
1425
7
5'CTCCAGCATCCATGTTAGTCTCTAGCCAATGGTATG 51
AGGGGCTGA-3'
75,
6
3rn
L3162
1040
1
5'CCCAAGTGGGCATGGTGTGTGTGGTTGGAGTTCTAT 53
AGTGCAC-3'
76,
2
3rn
L3162
1138
1
5'GCGCCGTAGAAGGTCCTCGTCTTAGGAGTGTCCCCC 62
TCACCACTG-3'
83,
5
3rn
L3162
215
1
5'GGACACCTCAAACTGGATGATGACTGGATGGGACA 51
CATTAGCCAC-3'
75,
6
3rn
L3162
623
1
5'CTCCCAGTAGTCCTTGCGGTTCATGGAGGAGCCGAT 58
GAGGACCAG-3'
80,
6
4rn
M1568
1389
1
5'GCTGCTTCTTGGGAGCTGGGCACATGCTGGACACTC 62
AGGGACCTG-3'
83,
5
5'GAAGTCCAGTTGGTCCACACGGCTGTGCATGCTCA
CCAAGTCAAT-3'
4rn
5rn
J05231 1076
5'CCGAGATTTAGGTCCAGCCCCACTCTCGGCTTCTTC 56
TCTCTGAGT-3'
79,
2
6rn
L0822
325
7
5'TCAAAGTGCACCGTGACGGGATCAGAAACGTTTTC 56
CACTGGCCGG-3'
79,
2
6rn
L0822
1575
7
5'GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACGATTATAAAC 49
ACCCAGAGGA-3'
74,
2
5'TCAAGATGCACCGTGACGGGATCGGAGACATTCTC
CACCGGCCGG-3'
6m
m
5'GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACAATTATAAAT
ACCCAAAGGA-3'
6m
m
7rr
5'CCTGCACTCAGCTCCACACTGGCCAGGCTGCAGCG 70
CCGAG-34
7rr
5'ATCATGTGTTGGGGAGCAGGCCAAACGGCCACATA 58
CGACCCCAGA-34
2rn
L3162
1341
2
5'AGCCAAGCCCTGCACTGATGCAGGGTTGACAAAGC 55
AGGTACATGG-3'
78,
5
2rn
L3162
1455
2
5'TCGCATGTGGTCCGCAATGAAGCGTACGCCATCCA 60
CTGCTTCCCG-3'
82
2rn
L3162
1315
2
5'TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCCGCAGGACCT 55
TCACCGAAGA-3'
78,
5
2m
5'TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCTGCAGGACCT
TGGCGGAAGA-3'
m
5'TCGCATATGGTCCGCAATGAAGCGTACACCGTCCA
CAGCTTCCCG-3'
2m
m
3rn
J04636 1306
5'CAGAACTCTTTCTCCATCGCTGGCGGGAGTCTGTTT 53
CCTTTTGCC-3'
3rn
J04636 431
5'ATTCTTCCGGATTCCAGCGTAATTTTTGGTCTGTGC 42
ATTCCTGCT-3'
69,
4
4rn
J05232 1020
5'ACCAGGCTGACTTCAAGACCGGGACGCTTCATGAA 55
GAGGAAGGTG-3'
78,
5
J05232 1259
5'AGCTGACACCCTCTAATGCTTCCTGTAGATCTTCCC 53
GGAACCTCC-3'
78,
5
5'AGGGTGTGCAGCTCATCCTGGACCCCCTCCAAGGA 65
GCGCT-3'
83,
4
4rn
TH
77
Les oligonucléotide sont marqués en 3' avec du [35S]-dATP ou du [33P]-dATP (NEN,
Boston, MA) et de la désoxynucleotidyl-transférase terminale (Boehringer Mannheim,
Allemagne), en suivant les spécifications du fabriquant, à une activité spécifique de 200-600
KBq/pmol. Les sondes marquées sont précipitées dans l'éthanol, séparées des nucléotides non
incorporés avec des NucTrap push columns (Stratagene, La Jolla, CA), précipitées de nouveau
dans l'éthanol et resuspendues dans de l'eau distillée.
12.2.2 Animaux
Six rats Sprague-Dawley adultes (Iffacredo, Lyon, France), pesant 300-400 g, ont été utilisés.
Les animaux sont tués par injection d'hydrate de chloral (1 ml de solution à 35 %); le cerveau
est rapidement disséqué et congelé dans de la carbo-glace. Les tissus sont stockés à -80 °C
jusqu'à la coupe.
Plusieurs âges embryonnaires et post-natals ont été examinés: E10, E11, E12, E13, E15, E17,
E19, P0 and P4. Les embryons ont été datés selon [250], E0 dénotant le jour suivant
l'accouplement et P0 le jour suivant la naissance. Pour chaque stade, entre deux et cinq
animaux ont été utilisés. Pour le prélèvement des embryons, les mères ont été anesthésiées à
l'éther.
12.2.3 Procédure d'hybridation in situ
Les tissus congelés sont coupés au cryostat (coupes de 14 µm d'épaisseur), montés à chaud
sur des lames de verre recouvertes de poly-L-lysine et stockées à -80 °C (moins de 2
semaines). La procédure est mené selon le protocole de [363], modifié selon [372] et le
protocole suivant. Brièvement, les coupes sont fixées avec du para-formaldéhyde 4 % durant
5 min à température ambiante, lavées dans du PBS, acétylées, et stockées dans de l'éthanol
80 % à 4 °C. Les coupes sont alors délipidées dans de l'éthanol et du chloroforme (5 min),
pré-hybridées durant 2-4 h à 37 °C et hybridées durant 20 h à 37 °C sous des lamelles de
parafilm. La composition du milieu de pré-hybridation (et d'hybridation) est:
50 % formamide
0,6 M NaCl
10 mM di-thiothreitol
10 % sulfate de dextran
1 mM EDTA
Solution de DENHARDT 1x (50x =
o 1 % sérum-albumine bovine
o 1 % Ficoll
o 1 % polyvinyl-pyrrolidone )
0,1 mg/ml poly-A (Boehringer Mannheim, Allemagne)
0,5 mg/ml ARNt de levure (Sigma)
0,05 mg/ml ADN de sperme de hareng (Promega, Madison, WI)
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
Les sondes sont ajoutées au mélange d'hybridation à la concentration de 0,55 nM
(correspondant à 15 fmol/coupe ou 3000-25000 Bq/30 µl/coupe selon les marquages).
12.2.3.1 Prélavage commun
Après retrait du parafilm les coupes sont initialement rincées dans de la solution saline citrate
standard (SSC) 2x (0,3 M NaCl, 0,03 M citrate de sodium) à température ambiante (2 fois
5 min).
12.2.3.2 Premier protocole de lavage
Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités durant l'ontogenèse.
Les coupes sont lavées quatre fois 15 min dans du SSC 2x , 50 % formamide à 42 °C puis
deux fois 30 min dans du SSC 1x à température ambiante. 1 mM de di-thiothréitol est ajouté
à chaque solution.
12.2.3.3 Second protocole de lavage
Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités chez le rat adulte ainsi
que chez les souris recombinées 2-/-. Les coupes sont lavées trois fois durant 15 min dans
du SSC 1x à température ambiante, puis 15 min dans du SSC 0,5x à 55 °C (cela dépend
des oligonucléotides). Les sondes utilisées dans cette étude ont la même longueur et
approximativement le même contenu en GC. Les températures de fusion des différent duplex
oligonucléotide/ARNm, calculées en utilisant l'équation 3 de [336], sont similaires dans les
mêmes conditions d'hybridation (0,6 M NaCl, 50 % formamide). La température du lavage le
plus stringent est égale à la Tm -20 °C (dans 0,01 M NaCl, 0 % formamide), afin de
corriger les petites différences de contenu en GC entre les différentes sondes. Nous avons
préalablement montré que cette température de lavage donne un rapport signal/bruit optimal,
avec un signal spécifique à peu près maximum et un faible signal non-spécifique.
Les coupes sont alors rincées 15 min dans du SSC 0,5x
à température ambiante.
12.2.3.4 Troisième protocole de lavage
Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités chez les souris
recombinées 4-/-. Les deux étapes de lavage réalisées dans du 0,5x SSC sont désormais
réalisées dans du 1x SSC. La température de fusion des différent duplex
oligonucléotide/ARNm est désormais calculée selon la méthode décrite au paragraphe 11.3.2.
12.2.3.5 Post-lavage commun
Après un court rinçage dans de l'eau glacé, et un gradient d'alcool elles sont séchées et
exposées à un film [3H]-Hyperfilm (Amersham) puis à une émulsion photographique (NTB2,
Kodak, Rochester, NY). Dans le cas des cerveaux de rats adultes nous avons utilisé un facteur
de correction défini au paragraphe 11.4.1 afin de comparer quantitativement différentes
expériences.
12.2.4 Analyses des préparations histologiques
Deux oligonucléotides ou plus [tableau 12.1] ont été utilisés pour caractériser la spécificité du
marquage. Par la suite, un seul oligonucléotide/ARNm a été utilisé durant la cartographie (46,
47, 51, 58, 59, 62, 131 and 133). Chaque niveau anatomique a été analysé au cours d'au moins
trois (et jusqu'à cinq) expériences indépendantes.
L'analyse des motifs de marquage a été mené à la fois sur les films et les émulsions. Les
coupes ont été contre-colorées au bleu de toluidine préalablement à l'identification des
structures. Les définitions des aires anatomiques sont basées sur différents atlas, dont
[251,250,169,314,292,111].
Une quantification relative des niveaux d'ARNm codant pour les différentes sous-unités dans
les noyaux dopaminergiques du mésencéphale a été réalisée sur les autoradiogrammes à l'aide
de l'analyseur d'image Vidas (Kontron, Munich, Allemagne). Deux expériences différentes
ont été quantifiées. Six niveaux anatomiques ont été analysés dans l'un des cerveaux (Bregma
-4,7 à -6,3 mm) et quatre dans l'autre (Bregma -4,8 à -6,1 mm). Après une procédure de
seuillage, qui permet la rétention du signal spécifique, le MGV et l'aire retenue sont mesurés.
La densité optique intégrée totale TOT est alors calculée à partir de la densité optique intégrée
de chaque niveau:
Après correction (COR) pour S (pour la sous-unité i,
), les résultats sont
exprimés par rapport aux valeurs de 2 (
) dans chaque expérience. 2 fut
arbitrairement choisie comme référence car elle est exprimée partout, de manière relativement
homogène dans le cerveau de rat adulte.
La détermination des valeurs de Kd et Bmax pour les sondes
11.3.2.
3 est décrite au paragraphe
Le comptage des cellules sur les émulsions photographiques a été réalisé au niveau Bregma 5,3 mm. La reconnaissance des neurones est basée sur la contre-coloration des coupes au bleu
de toluidine. Deux champs rectangulaires (380x250 µm) sont analysés dans chaque région.
Les champs sont localisés dans la SNc et le centre de la VTA. Un neurone est considéré
positif quand il est recouvert par une densité de grains au minimum de trois fois la densité du
bruit de fond.
12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte
12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs
L'hybridation in situ avec oligonucléotides a été choisi afin de minimiser la reconnaissance
croisée des différentes sous-unités du nAChR et de permettre des comparaisons quantitatives
entre plusieurs expériences. Pour une discussion générale sur les différentes méthodes
d'hybridation in situ et sur les fondements théoriques de l'hybridation des oligonucléotides
voir le chapitre 11.
Les oligonucléotides peuvent être choisis dans des régions de séquences hautement
spécifiques, ce qui n'est pas toujours le cas pour les sondes ARNc. Par exemple, les sondes
utilisées dans les études antérieures du nAChR étaient souvent dirigées contre la séquence
codante toute entière, et donc contre certaines parties hautement conservées. Afin de produire
des sondes plus efficaces, les auteurs les ont souvent hydrolysées en fragments de 50-200
nucléotides, une pratique qui peut engendrer du signal non-spécifique mais également des
reconnaissances croisées avec les autres membres de la même famille de gène.
L'hybridation in situ avec oligonucléotides est hautement reproductible dans (presque) tous
les tissus et avec (presque) toutes les sondes. En effet, le contrôle des paramètres de
l'expérience (i.e., concentration de la sonde, activité spécifique et température de fusion)
permet la détermination de caractéristiques quantitatives comme le KD apparent et le Bmax.
Pour la sous-unité 3, une étude de saturation a été menée sur l'habénula médiale avec
plusieurs sondes. Dans les conditions expérimentales décrites plus haut (en particulier, le
lavage le plus stringent effectué à Tm - 20 degC dans 0,5x SSC durant 15 min), la sonde 46
donne un KD de 0,075 nM avec un Bmax de 0,13 fmol/cm2 et la sonde 109 donne un KD de
0,17 nM avec un Bmax de 0,19 fmol/cm2 . De manière générale, nous avons vérifié que dans
cette étude les différences de marquage obtenues avec les différentes sondes dirigées contre le
même ARNm étaient < 50 %.
12.3.2 Distribution des ARNms codant
2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat
Le signal pour l'ARNm codant 6 est détecté dans un nombre restreint de structures [résumé
dans le tableau 12.2]. L'intervalle d'intensité du marquage varie énormément, de difficilement
détectable à très fort. Le télencéphale ne montre aucun signal spécifique [Figure 12.1].
Figure 12.1 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des
ARNm
d' 2 (S=4687),
(S=4092),
3 (S=2710) et
3 (S=2568),
4 (S=5071),
5 (S=1845),
6 (S=1623),
2
4 (S=1563) sur des coupes adjacentes de télencéphale. Bregma
+1,70 mm.
Dans toutes les autres subdivisions principales du CNS, quelques noyaux montrent des
niveaux détectables d'ARNm 6.
Tableau 12.2: Distribution et quantification relative des ARNm codant pour les sous-unités
dans le cerveau de rat. (+) difficilement détectable, + signal faible, ++ signal modéré, +++
signal fort.
2
3
4
5
6
7
2
3
4
Télencéphale
bulbe olfactif
+
++
+
++
-
++
++
-
+
noyau olfactif antérieur
-
(+)
++
(+)
-
++
++
-
-
isocortex
layer II-III
-
-
+
+
-
+
++
-
-
layer IV
-
+
+
+
-
+
++
-
-
layer V
-
-
++
+
-
++
++
-
-
layer VI
-
-
++
++
-
++
++
-
-
formation hippocampale
-
+
+
+
-
+++
++
-
-
striatum
-
-
-
-
-
-
+
-
-
septum
-
-
+
-
-
+
+
-
-
noyau supra-optique
-
-
+
-
-
+++
+
-
-
noyau ventro-médial
-
-
+
-
-
-
++
-
-
reste
-
-
+
-
-
-
+
-
-
-
+++
-
++
-
-
+
-
+++
habénula médiale partie
dorsale
-
-
+
-
-
-
++
-
-
habénula médiale partie
ventro-latérale
-
+++
++
+
-
-
++
-
+++
habénula médiale partie
ventro-médiale
-
+++
(+)
-
(+)
-
++
+++
+++
habénula latérale
-
-
-
-
(+)
-
+
+
-
noyau réticulé
-
-
+
-
++
-
++
+
-
noyau antéro-ventral
-
+
+++
-
-
-
+++
-
-
reste
-
-
+++
-
-
-
+++
-
-
noyaux dopaminergiques
-
(+)
++
++
+++
-
++
+++
-
noyau mésencéphalique du
trijumeau
-
-
+
-
+
-
++
+++
-
partie apicale
++
-
-
++
-
+
-
-
-
partie centrale
-
-
-
-
+
+
(+)
-
-
partie latérale
-
-
-
-
+
+
(+)
-
-
partie rostrale
++
-
-
++
-
+
-
-
-
hypothalamus
Diencéphale
glande pinéale
habénula
thalamus
Mésencéphale
n. interpédonculaire
Rhombencéphale
noyaux vestibulaires
-
-
+
+
-
++
+
-
-
cervelet
-
+
-
+
-
-
+
+
+
locus coeruleus
-
(+)
-
-
+++
-
++
+++
(+)
noyaux moteurs
-
+
+
+
-
-
++
-
-
noyau du tractus solitaire
-
++
(+)
+
-
-
++
-
++
area postrema
-
++
++
+
-
-
++
-
+
rétine
-
+
+
?
++
?
++
++
+
ganglions autonomes
-
+++
-
++
-
++
++
-
+++
ganglions somato-sensoriels
-
(+)
-
-
+
-
+++
++
-
ganglions vestibulocochléaires
-
-
++
?
++
?
++
++
-
Périphérie
12.3.3 Diencéphale
Dans le diencéphale, trois noyaux sont marqués par les sondes
différentes.
6, mais avec des intensités
Le noyau thalamique réticulé montre un gradient à la fois rostro-caudal et dorso-ventral du
marquage 6 [Figure 12.2]. L'intensité du marquage est modeste, même dans la partie rostrodorsale.
2 et
4 sont également présentes dans le noyau réticulé bien qu'à des niveaux
moindres. La sous-unité 3 est présente mais est difficilement détectable avec un seul
oligonucléotide. En revanche si l'on place deux sondes en tandem, le marquage apparaît
nettement.
Figure 12.2 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des
ARNm
(S=3000),
d' 2 (S=4687),
3 (S=2568),
4 (S=46848),
5 (S=1845),
6 (S=1623),
2
3 (l'expérience qui est représentée résulte de l'utilisation groupée de deux sondes.
Le facteur S est donc difficilement calculable et de plus, le bruit de fond est très élevé) et
(S=1563) sur des coupes adjacentes de diencéphale antérieur. Bregma -1,4 mm.
4
Le marquage
6 est restreint à une petite partie de l'habénula médiale [Figure 12.3], dans
quelques cellules longeant le ventricule. Cette distribution correspond à celle de
Cependant, l'intensité du marquage
3.
3 est plus forte. La distribution de l'ARNm d' 6 (ou de
3) semble complémentaire de celle d' 4. Au contraire, le marquage pour 3 et 4 est
détecté à des niveaux très forts à travers toute la partie ventrale du noyau, alors que le
marquage 5 est restreint à la partie ventro-latérale du noyau et celui de
niveaux modérés dans tout le noyau.
2 est présent à des
Dans le noyau de l'habénula latérale, nous détectons une faible marquage pour
pour
2 et
6 ainsi que
3.
Figure 12.3 : panneaux supérieurs, photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant
la distribution des sous-unités
3 (S=3469),
4 (S=4010),
5 (S=2735),
6 (S=3227),
2
(S=4092), 3 (S=2710) et 4 (S=3617) sur des coupes adjacentes de noyau habénulaire. Les
têtes de flèche et les flèches indiquent l'habénula médiale et latérale, respectivement. Note: A
cette échelle, le marquage 6 est difficilement détectable.
panneaux inférieurs, micro-photographies en fond noir d'émulsion montrant la distribution
d' 3 (S=15462), d' 4 (S=7953), d' 6 (S=1857) et de 3 (S=3512) sur des coupes
adjacentes d'habénula médiale. La contre-coloration au bleu de toluidine (TB) est reportée
dans le dernier panneau de la ligne intermédiaire. Note: Les distributions de
sont complémentaires. Bregma -3.3 mm.
6/ 3 et
4
La partie caudale du noyau supra-mammillaire est légèrement marquée par les sondes
ainsi que par les sondes
12.3.4 Mésencéphale
5 et
2. Le marquage pour
4 est absent ou très faible.
6
Le mésencéphale présente trois structures contenant du signal spécifique pour l'ARNm d' 6.
Les noyaux dopaminergiques du mésencéphale expriment une grande variété d'ARNm codant
les sous-unités du nAChR[Figure 12.6]. Le marquage pour 6 est très fort dans la substance
noire (A9), pars compacta (SNc), la VTA (A10) et l'aire rétrorubrale (A8) [Figure 12.4].
Figure 12.4 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution de
l'ARNm d' 6 (S=1623) à 8 niveaux (bregma -4,8, -5,2, -5,3, -5,7, -6,1 et -6,4 mm) du
mésencéphale ventral. Les têtes de flèche, les flèches et les doubles têtes de flèches indiquent
respectivement l'aire tegmentale ventrale, la substance noire pars compacta et le noyau
interpédonculaire.
Des cellules dispersées montrant un marquage de forte intensité pour 6 sont également
présentes dans la zone péri-ventriculaire mésencéphalique et dans la substance noire pars
reticulata (SNr), correspondant peut-être au système dopaminergique péri-ventriculaire et aux
neurones dopaminergiques de la SNr. Les neurones de la SNc et de la VTA sont marqués de
manière homogène. La sous-unité
très importants [Figure 12.5].
3 est détectée à des niveaux plus faibles bien que toujours
Figure 12.5 : Microphotographies en fond noir d'émulsion montrant les distributions de
l'ARNm d' 6 (S=1857) et de 3 (S=3512) sur des coupes adjacentes de SNc et VTA. Note: les
distributions très similaires des deux ARNm dans ces régions. Bregma -5,3 mm. Barre
d'échelle µm. Abréviations: D = dorsal, L = latéral.
Afin de déterminer si les ARNms des sous-unités 6 et 3 sont localisés dans les cellules
dopaminergiques, nous avons compté les neurones marqués par les sondes dirigées contre les
deux sous-unités du nAChR ainsi que celle dirigée contre la tyrosine hydroxylase (TH),
l'enzyme de biosynthèse des catécholamines, après contre-coloration des coupes avec du bleu
de toluidine. Approximativement le même pourcentage de neurones (80%) de la SN et de la
VTA contiennent
du marquage spécifique pour les ARNm d' 6, de
3 et de la TH [Table
12.3].
Tableau 12.3 : Décompte des neurones positifs pour la TH, 6 et 3 dans la SNc et la VTA.
Les résultats (moyenne de deux comptage par marquage ±SD) sont exprimés en pourcentage
du nombre total de neurones.
SNc
Tyrosine hydroxylase
VTA
76,6 ±
2,3
86,4 ±
1,2
6
83,8 ±
2,3
80,9 ±
1,8
3
83,4 ±
2,3
83,0 ±
3,4
Cela montre qu'au moins 50 % des neurones TH+ (c.-à-d. dopaminergiques) contiennent
également les arnm d' 6 et de 3. Cependant, le recouvrement au niveau régional des zones
marquées par les différentes sondes suggère que les trois ARNm sont présents dans la même
population neuronale.
Du signal pour les ARNm d' 4, 5 et 2 est également visible dans les noyaux
dopaminergiques, mais à des niveaux plus modérés. [Figure 12.6].
Figure 12.6 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des
\textsc{arn}ms d' 2 (S=4687), d' 3 (S=2469), 4 (S=4648), 5 (S=4179), 6 (S=1623),
2 (S=3000), 3 (S=1828) et 4 (S=4060) sur des coupes adjacentes de mésencéphale
ventral. Les têtes de flèche et les flèches indiquent respectivement la substance noire, pars
compacta, et la VTA. Les petites croix indiquent un morceau de cervelet qui a migré
accidentellement vers la partie ventrale du cerveau durant la congélation. Bregma -5,6 mm.
12.3.5 Rhombencéphale
Dans le rhombencéphale, le locus c ruleus est le seul noyau marqué par les sondes 6
(Figure 12.7). L'intensité du marquage est extrêmement forte, au même niveau que celle des
cellules dopaminergiques du mésencéphale. Les ARNm de plusieurs autres sous-unités sont
trouvé dans ce noyau, 2 et
difficilement détectables.
3 à des niveaux modérés,
3 à un faible niveau,
4 et
5
Figure 12.7 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des
\textsc{arn}ms d' 2 (S=4687), d' 3 (S=2469), 4 (S=4648), 5 (S=4179), 6 (S=1623),
2 (S=3000),
3 (S=1828) et
4 (S=4060) sur des coupes adjacentes de rhombencéphale.
12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris
recombinantes
Des lignées de souris n'exprimant plus les sous-unités
2 [256] et
recombinaison homologue. Dans les souris dont le gène codant
4 ont été engendrées par
2 a été inactivé,
L'hybridation in situ montre une diminution du signal 2 de moitié chez les hétérozygotes et
une disparition totale chez les mutantes homozygotes [Figure 12.8]. L'hybridation in situ des
ARNms codant les autres sous-unités ne montre aucune différence significative entre les
animaux
2+/+ et
2-/-.
Figure 12.8 : Distribution des sous-unités dans le cerveau de souris
sous-unités
4 et
2-/-. L'expression des
4 n'est montrée que dans les cerveau des souris sauvages et homozygotes.
Bregma -2 mm
Dans le cerveau des souris
4-/-, une sonde dirigée contre la délétion du gène
4 ne donne
plus aucun signal (comme pour les souris 2-/-, le signal est diminué de moitié dans le
cerveau des animaux hétérozygotes) [Figure 12.9]. En revanche, avec une sonde dirigée
contre une partie du gène en 3' de la délétion, on peut noter une persistance du marquage.
Cela montre que le messager est toujours présent même si il n'y a plus formation de protéine
fonctionnelle.
Aucune modification d'expression significative des sous-unités non-recombinées n'est
décelable dans le cerveau de ces souris.
Figure 12.9 : Distribution des sous-unités dans le cerveau de souris
4-/-. L'expression des
sous-unités 3,6 et 2 n'est montrée que dans les cerveau des souris sauvages et
homozygotes. Deux images de l'hybridation in situ d' 4 dans le cerveau des homozygotes
sont montrées. L'image supérieure a été réalisée avec une sonde reconnaissant une partie du
transcrit en aval de la délétion, alors que l'image inférieure a été réalisée avec une sonde
complémentaire de la délétion. Bregma -2 mm, excepté pour 6: Bregma -3 mm.
12.5 Distribution des sous-unités durant le développement
embryonnaire
La distribution des ARNm codant les différentes sous-unités varie d'une sous-unité à l'autre
mais est bien définie pour chaque sous-unité. Michele ZOLI et moi-même avons observé la
mise en place de cette distribution durant le développement embryonnaire et peri-natal. Deux
sous-unités ( 3 et 4) ainsi que deux sous-unités ( 2 et 4) ont été particulièrement
étudiées. L'expression observée apparaît très tôt (dès le début de la neurogenèse), et suit la
différenciation neuronale . Le marquage est réparti uniformément dans les neurones postmitotiques. Puis, alors que
4 et
2 restent exprimées très largement mais à un niveau
modéré, l'expression de 3 et 4 se restreint à quelques noyaux particuliers où elle atteint
des niveaux très élevés. La mise en place de l'expression de la sous-unité 4 suit la
progression caudo-rostrale des terminaisons cholinergiques. Une distribution de type adulte
des transcrits est acquise dès le début de la vie postnatale. Trois principaux motifs
développementaux ont été identifiés:
(1)- Dans la majorité des cas étudiés (rhombencéphale, moelle épinière [Figures 12.10 et
12.11], ganglions somato-sensoriels[Figure 12.12]) les quatre sous-unités sont initialement
exprimées puis, durant le développement prénatal subséquent, le niveau d'expression de
certaines de ces sous-unités devient progressivement indécelable ( 4 dans les ganglions
autonomes,
3 et
4 dans la majeure partie du cerveau et la moelle épinière,
les ganglions des racines dorsales,
3,
4 et
4 et
4 dans
4 dans les ganglions somato-sensoriels).
Figure 12.10 : Expression de 3, 4, 2 et 4 aux jours embryonnaires 13 et 15 du rat. Les
barres d'échelle mesurent 1 mm. Panneaux supérieurs, les têtes de flèches pointent les
ganglions des racines dorsales. Panneaux médians, les flèches pointent le ganglion du
trijumeau et les têtes de flèches les ganglions des racines dorsales. Panneaux inférieurs, Les
flèches pointent le ganglion du trijumeau, les têtes de flèches pointent le ganglion
sphénopalatin et les doubles têtes de flèches le ganglion otique. Btel: télencéphale basal, Cx:
cortex, Di: diencéphale, Me: mésencéphale, MO: medulla oblongata, Po: pons, Rh:
rhombencéphale, SC: moelle épinière (spinal cord), Te: télencéphale.
Figure 12.11 : Expression de 3, 4, 2 et 4 aux jours embryonnaires 17 du rat. Coupes
coronales, Les flèches pointent le ganglion du trijumeau, les têtes de flèches pointent le
ganglion otique et les doubles têtes de flèche l'habénula médiale. La barre d'échelle mesure
1 mm. Coupes sagitales, les petites flèches pointent l'épiphyse, les grosses flèches le noyau
ventro-médial de l'hypothalamus, les têtes de flèche l'habénula médiale et les doubles têtes de
flèches le ganglion sympathique lombaire. Btel: télencéphale basal, Cx: cortex, Hy:
hypothalamus, Me: mésencéphale, MO: medulla oblongata, Po: pons, Th: thalamus.
Figure 12.12 : Expression de 3, 4, 2 et 4 dans les ganglions périphériques. La barre
d'échelle mesure 100 µm. Les flèches pointent le ganglion glosso-pharyngé inférieur, les têtes
de flèches le ganglion glosso-pharyngé supérieur et les têtes de flèche doubles le ganglion
cervical supérieur. 2 est présent partout, 4 nulle part et 3 comme 4 sont présents dans
les ganglions autonomes mais pas dans le ganglion somato-sensoriel.
(2)- Certaines sous-unités sont initialement exprimées et le reste durant tout le développement
( 3, 4, 2 et 4 dans la rétine, 3, 2 et
dans les ganglions vestibulo-cochléaires).
4 dans les ganglions autonomes,
4 et
(3)- Dans le cas du néo-cortex, 3 et 2 sont initialement exprimées (E12-E13) puis
disparaît (E15) et est remplacée par 4 (E17-E19)[Figure 12.13].
2
3
Figure 12.13: Expression d' 3, 4 et 2 dans le cortex du rat aux jours embryonnaires E13,
E15 et E19. CP: cortical plate, cx: cortical neuroépithélium, SP: cortical subplate, ICx:
intermediate cortical layer
12.6 Discussion
Depuis le premier report de l'existence de la sous-unité 6 [180] la connaissance de la
signification fonctionnelle de cette sous-unité n'a que peu progressé. Ici nous montrons que
l'ARNm d' 6 est restreint à quelques noyaux spécifiques dans le cerveau. La quantité d'ARNm
6 est particulièrement haute dans les noyaux catécholaminergiques (les noyaux A6, A8, A9
et A10) et modérée ou faible dans le noyau réticulé du thalamus, l'habénula latérale et médiale
et le noyau supra-mammillaire. Cette distribution correspond à celle mentionnée dans le
tableau de [90] et au marquage immuno-cytochimique observé par [136]. En plus, d'autres
noyaux sont positifs, comme le noyau interpédonculaire et le noyau mésencéphalique du
trijumeau. Au contraire de ce qui est rapporté par [135], aucun marquage n'a été détecté dans
l'aire prétectale antérieure.
12.6.1 Aspects méthodologiques
Pour cette étude nous avons utilisé l'hybridation in situ avec oligonucléotides, une méthode
largement utilisée dans le champ des LGIC [221,366,218,219,259,260,341,353,372], bien que
différente de la méthode avec ARNc qui a été utilisée pour cartographier les sous-unités du
nAChR dans le CNS des mammifères adultes [335,281,334,80,90,284,299]. De manière
générale, nos études réalisées avec oligonucleotides sont en bon accord avec les études
précédentes réalisées avec ARNc (avec quelques exceptions notables, comme 5 dans
l'habénula médiale). Cependant une différence claire avec les résultats précédents est observée
quand on s'intéresse à 3 et 6. En particulier, nous voyons un fort signal 6 et presque pas
de signal 3 dans quelques régions précédemment supposées riches en ARNm 3, à savoir
les noyaux catécholaminergiques [335]. Cette différence ne peut être expliquée sur la base des
sensibilités différentes des deux types de méthodes, puisque dans la plupart des structures du
cerveau notre cartographie d' 3 correspond avec les précédentes [335]. 3 et 6 sont
phylogénétiquement très proches (voir le chapitre 9). Les séquences de leurs ARNm sont très
proches. Puisque, selon l'étude présentée ici, 6 est presque 20 fois plus exprimée qu' 3
dans certaines régions, il est possible qu'une sonde ARNc dirigée contre la séquence entière
d' 3 révèle également les ARNm d' 6 (particulièrement si la sonde a subi une hydrolyse
alcaline avant l'expérience).
12.6.2 Colocalisations
Nos travaux montrent que les ARNm d' 6 et 3 possèdent une distribution similaire dans le
cerveau. Quelques expériences exploratoires indiquent que cela serait également le cas en
périphérie. Par exemple, dans la rétine post-natale et dans les ganglions somato-sensoriels
(comme le ganglion du trijumeau),
co-localisation d' 6 et de
6 et
3 sont tous les deux détectés. Dans le cerveau, la
3 est réalisée dans la plupart de leur zones d'expression [Tableau
12.2]. Le marquage pour 3 est parfois d'une intensité inférieure (noyau thalamique réticulé,
noyau interpédonculaire, locus c ruleus, noyaux dopaminergiques) et parfois d'une intensité
supérieure (habénula médiale, noyau mésencéphalique du trijumeau) à celui d' 6. Une
exception est le noyau supra-mammillaire où l'ARNm d' 6 est détecté mais non celui de
Dans ce noyau, le marquage pour 6 est très bas, et les niveaux d'ARNm de
être au-dessous du seuil de détection de la technique.
3.
3 pourraient
La sous-unité 6 possède tous les résidus qui ont été identifiés comme faisant partie de
composant principal du site de liaison (voir le tableau 7.1 et l'alignement 7.2). La sous-unité
6 est donc une << vrai >> sous-unité , qui peut être engagée dans la liaison de l'ACh. In
vitro,
6 de poulet forme des récepteurs fonctionnels avec la sous-unité
4 d'homme [130]
ou de poulet[116]. La colocalisation extensive d' 6 et de 3 rapportée ici, supporte l'idée
que ces sous-unités pourraient s'assembler au sein d'hétéro-oligomers. Une possibilité est que
3, comme
5, soit un troisième type de sous-unité (en sus des types
et
<< standards >>). Ces sous-unités, comme la sous-unité 1 musculaire ne participeraient pas
au site de liaison de l'ACh et n'existeraient donc que dans des hétéro-oligomères comportant
au moins 3 sous-unités différentes (voir les paragraphes 7.2 et 9.4.2). Dans le système
nerveux, des nAChRs ont été identifiés composés de
et
4 2 5 [63]
3 4 5 [63,330,297]
3 2 4 5 [62]. De manière similaire, on peut faire l'hypothèse qu'il pourrait exister
dans le système nerveux des récepteurs comme
6 2 3.
12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula
Dans l'habénula latérale, la distribution de l'ARNm d' 6 est très similaire à celle des ARNm de
2 et 3, bien qu'il n'y ait aucune preuve directe de leur colocalisation dans les mêmes
cellules. Comme l'habénula latérale envoie des projections à la substance noire [154], et
inversement celle-ci envoie des projections à l'habénula latérale [305,196], des nAChRs
composés de 6 2( 3) pourraient être présents dans les deux branches de cette voie bidirectionnelle.
Si l'on considère les sous-unités du nAChR, l'habénula médiale peut être subdivisée en trois
sous-noyaux: dorsal, ventro-médial et ventro-latéral [Figure 12.14]. 6 et 3 sont localisées
dans le sous-noyau ventro-médial, avec un gradient de la ligne médiane vers la partie latérale
(voir aussi [80]). La distribution plus restreinte d' 6 relativement à 3 peut être due à une
moindre quantité d'ARNm, et donc à un niveau plus faible du signal. Le seuil de sensibilité
couperait alors le gradient d'expression plus près de la ligne médiane. Goldner et coll. [136]
ont également trouvé par immuno-cytochimie la sous-unité 6 dans l'habénula médiale. La
seule photographie présentée par les auteurs montre 6 localisée dans la région ventromédiale. La distribution de l'ARNm d' 4 est complémentaire de celle d' 6 et 3. La sousunité 4 est détectée à un niveau très faible dans le sous-noyau ventro-médial, à un niveau
intermédiaire dans le sous-noyau dorsal et à un niveau important dans le sous-noyau ventrolatéral (voir aussi [335,157]). Contrairement à [334], nous trouvons un marquage pour l'ARNm
d' 5 dans l'habénula médiale. Sa distribution est restreinte au sous-noyau ventro-latéral. Un
marquage fort pour
3 et
4 est détecté dans les sous-noyaux ventro-médial et ventro-latéral
équivalent à celui décrit dans [335,90,157]. Le marquage pour 2 est présent de manière à
peu près uniforme dans l'ensemble du noyau. Les sous-noyaux ventro-médial et ventro-latéral
correspondent aux deux tiers ventraux de l'habénula médiale, qui sont formés de neurones
cholinergiques [192,357]. De fait, la distribution des sous-unités 3 et 4 se superpose à
celle des neurones exprimant la choline acétyl-transférase (voir les Figures 2 et 8b de [238]).
Le sous-noyau ventro-latéral semble plus riche en choline acétyl-transférase que le sousnoyau ventro-médial [163]. Finalement, le sous-noyau dorsal contient de forts niveaux de
substance P [64].
Figure 12.14 : Schéma de la distribution des sous-unités du nAChR dans l'habénula médiale.
Les combinaisons de sous-unités pour lesquelles des témoignages électrophysiologiques (en
ovocytes après expression hétérologue) et, pour certaines, biochimiques (coprécipitation à
partir de tissu natif) ont été obtenue sont indiquées pour chaque sous-noyau. La localisation
des récepteurs putatifs 6 et 2 ou 4 avec ou sans 3 est également représentée
(encadrée). D, dorsal; VL, ventro-latéral; VM, ventro-médial.
L'habénula médiale était supposée, pour ce qui est du nAChR, être un noyau homogène,
contenant plusieurs isoformes différentes de récepteur dans les même cellules. Les différents
courants nicotiniques enregistrés à partir de neurones habénulaires étaient donc assignés à de
multiples isoformes de récepteurs présentes dans une classe de cellules homogènes
[224,225,61]. Les données présentées plus haut, en particulier celles montrant la ségrégation
des ARNm d' 4/ 5 et d' 6/ 3, suggèrent que les isoformes de nAChR sont, au moins
partiellement, cellule-spécifiques. Sur la base des résultats présents et antérieurs (en cultures
de cellules transfectées et par immuno-précipitation) on peut inférer les isoformes qui
pourraient être présentes dans les différents sous-noyaux [Figure 12.14].
12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques
Le locus c ruleus et les noyaux A8, A9 et A10 présentent les plus forts niveaux d'expression
de l'ARNm d' 6 dans le CNS. Ces noyaux contiennent de forts niveaux de TH et sont
responsables de la majeure partie de l'innervation noradrénergique et dopaminergique du
cerveau. L'action potentiatrice de la nicotine sur la libération de dopamine [347,132,9] est
transmise par les récepteurs localisés sur les terminaisons (stimulation rapide), et par les
récepteurs localisés sur les soma dopaminergiques du mésencéphale (stimulation à long
terme). Les deux ensembles de récepteurs pourraient être identiques ou différents.
12.6.4.1 Implication de
2
L'ARNm codant 4 n'est pas détecté dans les cellules dopaminergiques [91,90,185]. [257] ont
montré qu'aucun courant nicotinique somatique ne persistait dans les cellules
dopaminergiques des souris
2-/-.
[55] ont clairement montré l'existence de récepteurs à haute affinité pour la nicotine en
autoradiographie dans les soma dopaminergiques et dans les terminaisons. [256] ont montré
que l'inactivation de la sous-unité 2 entraîne une disparition complète des récepteurs à haute
affinité pour la nicotine en autoradiographie.
Au moins une partie, si ce n'est la totalité des nAChRs de la cellule dopaminergique nécessite
donc la sous-unité
12.6.4.2
2.
4 ne semble pas impliquée
La pharmacologie de l'accroissement de libération de dopamine entraîné par la nicotine
indique que le(s) récepteur(s) impliqué(s) n'est pas 4 2 [263,137,285]. Dans les
synaptosomes striataux, Grady et coll. [137] ont trouvé un ordre d'efficacité cytisine =
nicotine > DMPP=ACh. Dans des tranches de striatum, [285] ont trouvé l'ordre d'efficacité
cytisine > nicotine = DMPP. Ces spectres pharmacologiques ne correspondent pas aux
propriétés des récepteurs contenant 4 2 [203]. De plus, 100 nM de bungarotoxine
neuronale bloque la potentiation endogène de la libération de dopamine par la nicotine [296].
A cette concentration, la toxine est capable d'inhiber l'action de
2 [204].
12.6.4.3
6 est plus probablement impliquée que
3 2 mais pas celle de
4
3
Plus haut nous montrons que le marquage pour 6 est à peu près 20 fois plus intense que
celui pour 3 dans les cellules dopaminergiques ainsi que celles du locus c ruleus. Goldner
et coll. [136] ont également observé par immuno-cytochimie un fort marquage pour 6 dans
les noyaux catécholaminergiques A6,9,10. On peut donc faire l'hypothèse que la
pharmacologie observée pour la potentiation de la libération de dopamine résulte d'un
récepteur contenant 6. Signalons que Clarke et Reuben [56] trouvent que les
caractéristiques pharmacologiques des libérations de dopamine dans le striatum et de
noradrénaline dans l'hippocampe diffèrent. On possède peu de données sur la pharmacologie
des récepteurs contenant 6. Cependant, l'identité de séquence protéique entre 3 et 6 est
très forte (61 % d'identité sur la longueur totale, les différences étant principalement localisées
dans le peptide signal et la partie variable de la boucle cytoplasmique, voir les Figures 7.2 et
10.4). Il est important de noter que tous les acides aminés identifiés comme faisant partie du
site de liaison de l'ACh [Table 7.1] sont conservés; en particulier les << boucles >> A et C
dans leur entièreté [122] sont 100 % identiques entre les deux sous-unités. La contribution des
sous-unités 3 et 6 au site de liaison pourrait donc être similaire, et pourrait rendre compte
des données pharmacologiques initialement reportées12.1.
12.6.4.4 Implication de
3
Bien que les niveaux d'expression des protéines puissent ne pas être parallèle aux niveaux
d'ARNm, la forte expression de
3 dans les neurones positifs pour la TH supporte l'idée que
cette sous-unité contribue à la réponse des neurones catécholaminergiques à la nicotine. A ce
stade il n'existe pas de preuve directe de l'existence d'oligomères contenant
6 et
3 dans ces
cellules. Cependant, la co-localisation extensive des sous-unités 6, 2 et 3 indique que la
formation d'un oligomère contenant ces trois sous-unités pourrait rendre compte de la
libération des catécholamines par la nicotine.
12.7 Conclusion
La présence de forts niveaux d'ARNm codant la sous-unité 6 dans les neurones contenant de
la dopamine pourrait être d'une importance physiologique considérable, puisque la libération
de dopamine induite par la nicotine est supposée être à la base de ses propriétés locomotrices
et addictives [54,312,66]. Plus généralement, il a été postulé que les neurones
catécholaminergiques du locus c ruleus et des noyaux A8, A9 et A10 contrôlent directement
la dépendance physique aux drogues à accoutumance [88,174,232,295,149]. Le design de
drogues dirigées spécifiquement contre les sous-types de récepteur responsables de ces
comportements est un challenge important de la neuro-pharmacologie moderne. Afin
d'atteindre ce but, la constitution moléculaire exacte de ces récepteurs doit être établie. Nous
proposons que des récepteurs 6 2 3 sont des candidats probable pour la médiation de la
libération de catécholamines induite par la nicotine.
Footnotes
... reportées12.1
Les données présentées dans [130] et [116] sont difficiles à interpréter dans le cadre de
la comparaison 3, 6. En effet, dans [130], les auteurs étudient des récepteurs
contenant 6gg 4hs et les comparent à 3gg 4gg et 3gg
4hs. Les différences
observées entre ces deux derniers récepteurs sont aussi importantes qu'entre eux et le
premier. Quant à [116], il rapporte la comparaison entre
mais pas
6gg 4gg et
3gg 6gg 4gg
3gg 4gg
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1999-06-19
