Le monde microbien
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BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 1/31 Chapitre n°1 : Le monde microbien La microbiologie est l’étude des organismes trop petits pour être vus à l’œil nu, les micro-organismes. Leur taille est généralement inférieure à un millimètre : il doivent être observés au microscope (photonique ou électronique) et cultivés dans des milieux permettant leur croissance et leur isolement. La microbiologie est divisée en plusieurs branches, en fonction du type de « microbe » étudié (figure 1). Figure 1 : les différentes branches de la microbiologie Quelques repères historiques… Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) observe et décrit en 1676 des micro-organismes grâce à un microscope qu’il a lui-même construit. Il emploie le terme « animalcules » pour qualifier les diverses formes présentes dans des échantillons d’eau, des décoctions de foin ou dans la salive. En 1798, Jenner introduit le vaccin contre la variole. En 1857, Louis Pasteur (1822-1895) démontre que la fermentation du sucre en acide lactique est due à un micro-organisme. Il participe à la remise en cause de la théorie de la génération spontanée (apparition d’organismes vivants à partir de matière non vivante). En 1876, Robert Koch (1843-1910) démontre que le charbon est dû à Bacillus anthracis. Il cultive des bactéries sur de la gélatine, puis découvre l’agent de la tuberculose (le bacille de Koch : BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 2/31 Mycobacterium tuberculosis). Les postulats de Koch sont publiés pour la première fois en 1884. En 1884, Hans Christian Gram (1853-1928) développe une technique de coloration qui est encore aujourd’hui la plus utilisée dans l'étude et la classification des bactéries. La première édition du manuel de Bergey est publiée en 1923. En 1928, Griffith découvre la conjugaison bactérienne. En 1929, Fleming découvre la pénicilline. En 1952, Zinder et Lederberg découvrent la transduction généralisée. En 1961, Jacob et Monod proposent le modèle de l’opéron pour la régulation des gènes. En 1979, de l’insuline recombinante est synthétisée par Escherichia coli. En 1982, le vaccin contre l’hépatite B est obtenu par des techniques de génie génétique. 1. Classification des êtres vivants 1.1. L’arbre phylogénétique des êtres vivants (Figures 2 et 3) Les êtres vivants peuvent être divisés en deux groupes : les organismes procaryotes, dont l'organisation cellulaire est simple, c'est à dire sans noyau, l'ADN portant l'information génétique est directement au contact du cytoplasme. Les bactéries appartiennent à ce groupe ; les organismes eucaryotes, dont l'organisation cellulaire comprend un noyau contenant l'information génétique, portée par l'ADN des chromosomes. Les procaryotes sont séparés en deux groupes très différents : les eubactéries, les archéobactéries. Les eucaryotes sont eux-mêmes répartis dans trois règnes : les champignons (Fungi), les plantes (Plantae), les animaux (Animalia). Les organismes eucaryotes unicellulaires (« protistes ») suivent cette classification. Il s’agit : des algues unicellulaires, dont les cellules ressemblent aux cellules végétales, des protozoaires, dont les cellules ressemblent aux cellules animales, des levures, dont les cellules ressemblent aux cellules des champignons. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 3/31 Figure 2 Figure 3 : Arbre phylogénétique universel du vivant : représentation simplifiée établie à partir de l’étude comparative des ARNr 16S et 18S. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 4/31 Chez les virus, l’absence de structure cellulaire, de métabolisme et de croissance fait qu’on ne peut les considérer comme des êtres-vivants. 1.2. Classification des eubactéries La classification des bactéries a été profondément remaniée avec l’avènement des techniques de biologie moléculaire. Les critères phénotypiques (aspect macroscopique des colonies, morphologie et structure cellulaires, conditions de culture, caractères biochimiques, antigéniques…) sont progressivement remplacés par des critères moléculaires (GC%, hybridation, étude des ARNr…). La classification en deux divisions, bactéries Gram positives et bactéries Gram négatives, est désormais obsolète (même si la coloration de Gram reste un élément fondamental du diagnostic au laboratoire). Les eubactéries (domaine Bacteria) sont actuellement réparties en 23 phylums ! Le tableau ci-dessous, tout en séparant les bactéries Gram négatives et positives, donne la position taxonomique des genres bactériens les plus connus. On constate que les mycoplasmes (Mycoplasma, Ureaplasma), bactéries sans paroi, appartiennent aux Firmicutes (bactéries à « peau dure »). BACTERIES GRAM NEGATIVES BACTERIES GRAM POSITIVES BXII. Phylum Proteobacteria BXIII. Phylum Firmicutes 1. Alphaproteobacteria 1. Clostridia Acetobacter, Rickettsia, Rhizobium, Bartenella, Brucella Clostridium, Peptostreptococcus, Eubacterium 2. Betaproteobacteria 2. Mollicutes Burkholderia, Alcaligenes, Bordetella, Neisseria Mycoplasma, Ureaplasma, Erysipelothrix (?) 3. Gammaproteobacteria 3. Bacilli Xanthomonas, Stenotrophomonas, Francisella, Legionella, Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Alteromonas, Vibrio, Enterobacteriaceae, Pasteurella, Haemophilus Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus 4. Deltaproteobacteria BXIV. Phylum Actinobacteria 5. Epsilonproteobacteria Actinomycetales Campylobacter, Helicobacter Actinomyces, Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Propionibacterium, Streptomyces BXVI. Phylum Chlamydiae Bifidobacteriales Chlamydia, Chlamydophila Bifidobacterium, Gardnerella BXVII. Phylum Spirochaetes Borrelia, Treponema, Leptosipra BXX. Phylum Bacteroidetes Bacteroides, Flavobacterium BXXI. Phylum Fusobacteria Fusobacterium BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien 1.3. L’arbre phylogénétique des Procaryotes (Figure 4) Figure 4 : Arbre phylogénétique des procaryotes AFBB Page 5/31 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 6/31 1.4. Comparaison entre cellules eucaryote et procaryote EUCARYOTES PROCARYOTES Figure 5 Figure 6 Présence d’un noyau limité par une Pas de noyau, mais une région nucléaire diffuse enveloppe nucléaire (nucléoïde) Plusieurs chromosomes linéaires (visibles au Chromosome circulaire (en général unique) moment de la division cellulaire) ADN lié à des histones ADN lié à des protéines basiques Présence de mitochondries, de REG, Pas de mitochondrie, de REG, d’appareil de d’appareil de Golgi, de chloroplastes (chez Golgi, de chloroplaste les végétaux) Ribosomes cytoplasmiques 80S Ribosomes 70S Absence de peptidoglycane dans les parois Présence de peptidoglycane dans la paroi (chez les eubactéries seulement) 2. Les microorganismes eucaryotes 2.1. Les microalgues Les algues unicellulaires sont capables, comme les végétaux supérieurs, d'utiliser la lumière comme source d'énergie. Elles sont autotrophes et pratiquent la photosynthèse, grâce à leurs pigments, dont le plus important est la chlorophylle. La classification des algues ne tient pas compte de leur caractère unicellulaire ou pluricellulaire : elle est avant tout basée sur la composition en pigments. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 7/31 Rhodophycophytes (Figure 7 : Porphyridium) Les Rhodophycophytes ou « algues rouges » comportent quelques espèces unicellulaires immobiles mais la plupart sont pluricellulaires. Ces algues contiennent de nombreux pigments (chlorophylles a et d, caroténoïdes, phycoérythrine, phycocyanine, phycobilines), ce qui leur permet d’absorber la lumière, même à plus de 100 mètres de profondeur ! Les algues rouges sont connues pour les polymères qu’elles produisent (agar, carraghénanes…). Figure 7 : photographie et structure de Porphyridium Pyrrophycophytes (Figure 8 : Alexandrium) Les Pyrrophycophytes ou dinoflagellés sont des organismes des eaux douces, des eaux saumâtres et marines tempérées et chaudes. Leurs pigments sont les chlorophylles a et c, carotènes et xanthophylles. Ces algues possèdent deux flagelles et sont généralement entourées d'une thèque cellulosique. Il existe de très nombreuses espèces de dinoflagellés, dont certaines sont luminescentes tandis que d’autres sont toxiques (Dinophysis, Gymnodinium). Figure 8 : photographies d’Alexandrium BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 8/31 Euglenophycophytes Retrouvés principalement dans les eaux douces riches en matières organiques, les euglènes sont également proches des protozoaires car certaines espèces sont capables de se nourrir par absorption de molécules organiques voir même par phagocytose ! Ils possèdent un ou deux flagelles insérés dans un réservoir, invaginé dans la cellule. Les espèces photosynthétiques contiennent des chlorophylles a et b, du bêta-carotène et des xanthophylles. Figure 9 : photographie et structure d’une euglène Chrysophycophytes Les diatomées (ou Bacillariophyceae) sont des Chrysophycophytes unicellulaires protégées par une coque siliceuse (la frustule) et se déplacent par émission de mucus. Les diatomées forment la majeure partie du plancton dans les mers froides et constituent donc les principaux producteurs primaires de ces régions. Leurs pigments sont les chlorophylles a et c, caroténoïdes et xanthophylles. Figure 10 : photographie d’une diatomée pennale Figure 11 : Ochromonas Figure 12 : Ochromonas (structure) BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 9/31 Les Chrysophyceae (figures 11 et 12) sont surtout des algues d'eau douce. La plupart sont photosynthétiques mais il existe quelques espèces dépourvues de chloroplastes. De nombreuses espèces ont la possibilité de se nourrir de manière hétérotrophe. Ces algues possèdent un flagelle antérieur et un flagelle postérieur. Chlorophycophytes Les Chlorophycophytes ou « algues vertes » sont réparties dans de nombreux ordres. Les Chlamydomonas (figure 13) sont mobiles grâce à deux flagelles identiques et possèdent un organite sensible à la lumière, le stigma, localisé dans l’unique chloroplaste. Les pigments des algues vertes sont les chlorophylles a et b, carotènes et xanthophylles Figure 13 : photographies et structure de Chlamydomonas 2.2. Les protozoaires Les protozoaires sont des organismes unicellulaires hétérotrophes, dont la structure est proche de celle des cellules animales. Dépourvus de paroi, leur membrane plasmique est donc directement au contact du milieu extérieur, dans lequel ils doivent puiser leurs nutriments. Les protozoaires sont extrêmement diversifiés tant au niveau des structures cellulaires que du point vue écologique. La classification des protozoaires est complexe. Seuls quatre groupes importants sont abordés ici. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES GROUPES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien Exemples Rhizopodes Entamoeba histolytica et E. coli, Les amibes forment des responsables de diarrhées et de prolongements cytoplasmiques, douleurs abdominales, suite à la les pseudopodes, servant à la consommation d'eau locomotion et à la nutrition. contaminée. AFBB Page 10/31 Photographies Figure 14 : Entamoeba histolytica Flagellés Trypanosoma, responsable de la Ils possèdent un ou plusieurs maladie du sommeil. flagelles permettant leur Leishmania, parasite déplacement. intracellulaire qui envahit surtout les globules blancs et les organes lymphoïdes (rate, Figure 16 : Trypanosoma brucei moëlle rouge, ganglions lymphatiques). Trichomonas vaginalis, responsable d’infection urogénitales (leucorrhées). Giardia lamblia, parasite intestinal responsable de Figure 15 : structure d’un flagellé diarrhées. Ciliés (ou « infusoires ») Les paramécies occupent de Les cellules sont recouvertes de nombreux milieux, notamment cils dont les battements les eaux stagnantes. Ce sont de permettent la locomotion, grandes cellules (>150 µm) avec apportent les particules deux noyaux, (un petit et un alimentaires et renouvellent le grand). Balantidium coli est dioxygène. responsable de dysenterie. Sporozoaires Plasmodium falciparum, agent Ce sont des parasites du paludisme. intracellulaires, dont le cycle Toxoplasma gondii, responsable comprend plusieurs phases. de la toxoplasmose. (Pneumocystis carinii mycète ?) Figure 17 : Trichomonas vaginalis Figure 18 : Paramecium caudatum Figure 19 : Plasmodium vivax BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 11/31 2.3. Les champignons microscopiques 2.3.1. Morphologie et structure cellulaire L’organisation cellulaire des champignons est appelée le thalle. Chez les champignons microscopiques, le thalle peut être unicellulaire (levures) ou filamenteux (moisissures). Certaines levures sont toutefois capables de former des structures filamenteuses (pseudomycélium) dans certaines conditions (figure 20). Les levures ont une taille généralement comprise entre 10 et 50 µm. Leur forme peut être sphérique, ovoïde, allongée, cylindrique… Leur thalle est dit lévuriforme. Figure 20 : Morphologie des levures La membrane plasmique, riche en ergostérol, est protégée par une paroi rigide et épaisse (figure 21) constituée principalement de polyosides (dont la chitine, polymère de N-acétyl glucosamine). Figure 21 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 12/31 Le cytoplasme, de pH égal à 5, contient de nombreuses enzymes, des réserves (glycogène) et des organites (figure 22) : réticulum endoplasmique (ER), appareil de Golgi (G) mitochondries (M), vacuoles (Va) et ribosomes. Le noyau (N) contient 17 chromosomes chez Saccharomyces cerevisiae. Figure 22 : Saccharomyces cerevisiae Les moisissures sont pluricellulaires : les filaments, plus ou moins ramifiés, sont appelés hyphes. L’ensemble des hyphes constitue le mycélium. Chez les Phycomycètes, les cellules ne sont pas séparées par des cloisons transversales : le thalle est dit coenocytique (ou « siphonné »). Chez les Septomycètes, le thalle est cloisonné (ou « septé »). Dans ce cas, des perforations assurent la communication entre les cellules (figure 23). Figure 23 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 13/31 2.3.2. Classification Les levures et les moisissures appartiennent au règne des Mycètes (Fungi). La classification est basée sur le cloisonnement des hyphes et des caractères morphologiques observés lors de la reproduction sexuée (tableau ci-dessous). Classe Cloisonnement Reproduction sexuée Particularités / Exemples Myxomycètes non oui moisissures visqueuses plasmodiales Oomycètes non oui (oospores) Plamopara viticola (mildiou de la vigne) Zygomycètes non oui (zygospores) Mucorales : Mucor, Rhizopus, Absidia Ascomycètes oui oui Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula ; (ascospores) Neurospora, Aspergillus fumigatus, A. nidulans Basidiomycètes oui oui nombreux champignons macroscopiques : (basidiospores) Agaricus bisporus, Coprinus… Deutéromycètes oui (Fungi imperfecti) Absente (ou inconnue) Candida, Cryptococcus, Rhodothorula, Brettanomyces ; Geotrichum, Penicillium, Aspergillus flavus, A. niger 2.3.3. Multiplication végétative C’est un mode de reproduction asexué : elle est assurée par la production de spores qui se différencient à partir de cellules végétatives. Chez les levures, le bourgeonnement (figure 22) est le mode de division le plus fréquent. Après la mitose, la cellule fille (plus petite que la cellule mère), se détache et laisse une cicatrice visible au microscope électronique à balayage. La localisation du bourgeonnement varie selon les espèces (polaire, latéral…). Chez certaines levures (Schizosaccharomyces), une cellule parentale se divise en deux cellules filles par constriction centrale et formation d’une nouvelle paroi (scission : figure 24a). Chez de nombreuses moisissures, la fragmentation des hyphes peut donner naissance à de nouveaux individus. L’isolement de cellules par clivage de la paroi cellulaire permet la formation d’arthrosposres ou thallospores (figure 24b). La colonisation des milieux par les champignons est assurée par la production de spores de dissémination : blastospores, produites par bourgeonnement de cellules mères végétatives d’un pseudomycélium (figure 24d) ; chlamydospores, structures de résistance possédant une paroi épaisse (figure 24c) ; sporangiospores, formées chez les Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizopus) à l’intérieur d’une cellule végétative différenciée, le sporange, et libérées par éclatement de ce « sac » lorsqu’il est mature (figure 24e) ; conidiospores (ou conidies), produites à l’extrémité d’un conidiophore par des organes de fructification : stérigmates chez Aspergillus, phialides chez Penicillium (figure 24f). Chez Fusarium, les spores sont pluricellulaires (macroconidies : figure 24g). BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 14/31 Figure 24 : reproduction asexuée et types de spores chez les Mycètes 2.3.4. Reproduction sexuée La reproduction sexuée implique la fusion de deux cellules haploïdes à rôle de gamètes, et entraîne la formation d’un zygote diploïde. Certaines espèces sont autofertilisantes et produisent des gamètes sexuellement compatibles sur le même mycélium. Chez d’autres espèces, un croisement entre individus différents (notés « + » et « – ») est nécessaire. Chez les Mycètes, il y a souvent un décalage entre la fusion des cytoplasmes (plasmogamie) et la fusion des noyaux (caryogamie). Il existe donc un stade dicaryote, dans lequel les cellules contiennent deux noyaux haploïdes séparés, provenant de chacun des deux parents (figure 25). BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 15/31 Figure 25 Exemple 1 : chez les Mucorales (Zygomycètes) Les hyphes des Zygomycètes sont coenocytiques et contiennent de nombreux noyaux haploïdes. La reproduction sexuée apparaît généralement si les conditions environnementales deviennent défavorables : elle intervient alors entre deux souches de types sexués compatibles + et –. Des hyphes forment des projections appelées progamétanges, sous l’influence d’hormones produites par chacun des deux partenaires. Les progamétanges murissent en gamétanges qui fusionnent pour former un zygote dur à paroi épaisse appelé zygospore. Après une période de dormance plus ou moins longue, lorsque les conditions de croissance deviennent favorables, la zygospore subit la méiose au moment de la germination (figure 26). Figure 26 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien Exemple 2 : chez les levures ascomycètes (figure 27) Figure 27 AFBB Page 16/31 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 17/31 3. Les microorganismes procaryotes : les bactéries 3.1. Formes et groupements La taille d’une bactérie est de l’ordre du micromètre (1 µm = 10-6 m). Les plus petites bactéries ont une taille similaire à celle des plus grands virus tandis que les plus grandes atteignent la taille de certaines algues unicellulaires. Quelques exemples : - Mycoplasma pneumoniae 0,2 µm - Escherichia coli 1 x 2 µm - Treponema pallidum (Spirochète) 0,1 x 10 µm - Oscillatoria (Cyanobactérie) 7 µm Les bactéries les plus communes se présentent sous deux formes : - sphérique : il s’agit des coques (ou cocci) ; - cylindrique (en bâtonnet) : il s’agit des bacilles, les bacilles courts à extrémités arrondies sont des coccobacilles. Les spirochètes ont une forme spiralée, les actinomycètes sont filamenteux (comme le mycélium des moisissures). Selon leur mode de division, les espèces bactériennes forment des arrangements caractéristiques appelés groupements, observables au microscope photonique, et utiles au laboratoire pour le diagnostic (figure 28). Figure 28 : formes et groupements chez les bactéries BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 18/31 3.2. Structure cellulaire Une cellule bactérienne est composée d’éléments constants, présents chez quasiment toutes les bactéries, et d’éléments facultatifs, observés ou non en fonction des espèces (tableau ci-dessous et figure 29). Les éléments constants Les éléments facultatifs Le chromosome bactérien (constitué d'ADN) La spore (forme de résistance) Le cytoplasme (le "liquide cellulaire") La capsule (couche entourant la paroi) Les ribosomes (présents dans le cytoplasme) Les flagelles (permettant aux bactéries de se déplacer) La membrane plasmique (délimitant la cellule) Les pili sexuels (intervenant dans la conjugaison) La paroi (enveloppe rigide protégeant la cellule) Les fimbriae (rôle d’adhésion aux cellules de l'hôte) Figure 29 3.2.1. La paroi La coloration de Gram permet la mise en évidence de deux grands types de bactéries : les bactéries dites « Gram positives » d’une part, les bactéries « Gram négatives » d’autre part. Les premières apparaissent violettes au microscope photonique, colorées par le complexe violet de gentiane – lugol ; tandis que les secondes apparaissent roses, car le violet combiné à l’iode à été éliminé par l’éthanol puis la fuchsine a permis la contre coloration. Les constituants de la paroi déterminent le degré de perméabilité à l’éthanol de la paroi. La microscopie électronique et l’analyse chimique ont permis de révéler l’architecture et la composition des deux types de paroi (figure 30). BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 19/31 Figure 30 : structure comparée des deux types de paroi bactérienne La paroi des bactéries Gram positives est épaisse et homogène. Elle est constituée principalement de peptidoglycane. Des polyosides, les acides teichoïques et lipoteichoïques (associés à la membrane plasmique par liaison avec les glycolipides) traversent cette couche de peptidoglycane. D’autres polyosides (polyoside C chez les streptocoques) ou des protéines (protéine M chez les streptocoques, protéine A et récepteur du fibrinogène chez Staphylococcus aureus) peuvent être associés à la paroi. La paroi des bactéries Gram négatives est plus complexe : une fine couche de peptidoglycane est recouverte par une membrane externe. La lipoprotéine de Braun est liée au peptidoglycane par liaison covalente d’un côté, elle est « enfouie » dans la membrane externe par son extrémité hydrophobe de l’autre côté. La membrane externe est constituée d’une double couche de phospholipides, de lipopolysaccharides (LPS) et de protéines (OMP : « outer membrane protein ») permettant le passage de petites molécules, les porines. Le LPS correspond à l’endotoxine des bactéries Gram négatives. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 20/31 Le LPS est constitué de trois parties (figure 31) : - la chaîne latérale O, contenant de nombreuses unités osidiques répétées et déterminant la spécificité antigénique (antigène O), - le polysaccharide central (ou « core »), - le lipide A, enchâssé dans la membrane externe et support de la toxicité de la molécule. Figure 31 Le constituant commun à toutes les parois des eubactéries est le peptidoglycane. C’est une macromolécule constituée (figure 32) : - d’un polymère de N-acétyl glucosamine (NAG) et d’acide N-acétyl muramique (NAM), - de tétrapeptides reliés au polyoside par le NAM ; - de ponts interpeptidiques reliant les tétrapeptides entre deux polyosides. Figure 32 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 21/31 Le peptidoglycane est synthétisé par des enzymes situées dans le cytoplasme, la membrane plasmique et l’espace périplasmique. Certaines de ces enzymes, appelées protéines liant la pénicilline (PLP ou PBP), sont la cible des antibiotiques de la famille des -lactamines (pénicillines et céphalosporines), qui inhibent donc la synthèse du peptidoglycane. Les transpeptidases, qui assurent la réticulation entre les chaînes, font partie des PLP. Pour mettre en évidence les fonctions de la paroi, on peut utiliser le lysozyme pour détruire le peptidoglycane (par hydrolyse au niveau liaisons -1,4 entre NAM et NAG). On obtient par ce traitement des protoplastes avec des bactéries à Gram positif, des sphéroplastes avec des bactéries à Gram négatif, lorsque les cellules sont placées dans des conditions isotoniques ou hypertoniques. Les protoplastes obtenus avec Bacillus subtilis (grand bacille Gram positif) sont globuleux : il ont perdu leur forme. Placés dans un milieu hypotonique, les protoplastes sont rapidement détruits par lyse osmotique, contrairement aux cellules pourvues d’une paroi. Cette expérience permet d’affirmer que la paroi confère à la bactérie sa forme et sa résistance en milieu hypotonique. La paroi possède également des propriétés antigéniques (Ag O du LPS, polyoside C, protéine M, acides teichoïques…), contient des sites de fixation des bactériophages (virus bactériens)… 3.2.2. La capsule (figure 33) L’observation au microscope photonique d’une suspension bactérienne en présence d’encre de Chine, révèle chez certaines espèces (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella sp., Bacillus anthracis, certaines souches d’E. coli…) la présence d’un halo clair et brillant autour des cellules. Cette enveloppe supplémentaire, si elle est dense et compacte, est appelée capsule. Chez les bacilles à Gram négatif, cela se traduit macroscopiquement sur milieu solide par la formation de colonies de type M (« muqueux »). La nature chimique de la capsule est généralement polyosidique : acides polyaldobioniques (ose + acide uronique) chez le pneumocoque, polymère de glucose et de rhamnose chez Clostridium perfringens… Chez les Bacillus par contre, la capsule est de nature polypeptidique (acide poly-D-glutamique chez B. anthracis). Figure 33 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 22/31 La nature des constituants de la capsule (polyosides ou polypeptides) détermine la spécificité antigénique d’une souche bactérienne, désignée par son sérotype (ou sérovar). Chez Streptococcus pneumoniae, il existe 84 types capsulaires différents, les pathologies humaines étant généralement dues au sérovars 19, 6, 23 et 14. Chez les entérobactéries capsulées (Klebsiella, E. coli), l’antigène capsulaire est appelé Ag K. Chez certaines salmonelles (Salmonella Typhi, S. Paratyphi C et S. Dublin), il existe un antigène de surface (ou « microcapsulaire ») dénommé Ag Vi, qui masque l’antigène O (il est donc détruit par chauffage avant la recherche de l’antigène O). Le pouvoir pathogène du pneumocoque est lié à la présence d’une capsule. En effet, l’injection de pneumocoques capsulés à une souris entraîne une septicémie mortelle en 24 heures. La même expérience avec des pneumocoques non capsulés n’entraîne pas d’infection. Cette différence de virulence s’explique essentiellement par le fait que les bactéries capsulées résistent à la phagocytose (et à l’opsonisation). D’autres fonctions sont attribuées à la capsule : - adhésion aux surfaces (milieux naturels et hôtes animaux) ; - résistance aux bactériophages ; - résistance à la dessiccation ; - résistance à certains agents antimicrobiens… La couche S est une enveloppe polypeptidique plus fine que la capsule retrouvée chez certaines bactéries à Gram positif (Bacillus) et à Gram négatif (Aeromonas). Ses rôles sont similaires à ceux de la capsule. 3.2.3. Les polymères extracellulaires Les polymères extracellulaires (exopolysaccharides essentiellement) ne sont pas toujours organisés en structure compacte comme pour la capsule. Ils peuvent prendre la forme d’un glycocalyx, pellicule qui assure l’adhésion aux surfaces ou l’attachement entre bactéries (de la même espèce ou non) dans les biofilms (plaque dentaire, bactéries intestinales, obstruction ou corrosion de conduits…). Les exopolysaccharides bactériens ne restent pas toujours liés à la surface cellulaire, ils peuvent être libérés dans le milieu environnant. Le tableau ci-dessous propose quelques applications industrielles de la production de polymères microbiens. Polymères Micro-organismes producteur Applications Cellulose Acetobacter xylinum Production de membranes acoustiques Curdlane (β-1,3 glucane) Agrobacterium, Rhizobium Gel alimentaire Pullulane (α-D-glucane) Aureobasidium pullulans Film d’emballage alimentaire Gellane Sphingomonas paucimobilis Agent gélifiant dans les produits cosmétiques Xanthane Xanthomonas campestris Additif alimentaire Dextrane Leuconostoc mesenteroides Agent défloculant pour l’industrie du papier Variés Lactococcus, Lactobacillus Industrie laitière (viscosité du produit fermenté, prébiotiques) BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 23/31 3.2.4. Les endospores (figure 34) Certaines bactéries (Bacillus, Clostridium) sont capables de former une unité sphérique ou ovale, douée d’une grande de résistance à des environnements hostiles. Les spores bactériennes sont relativement difficiles à colorer, mais leur observation au microscope photonique est possible, lorsqu’elles sont encore présentes dans les sporanges (cellule végétative dans laquelle la spore est formée) : - à l’état frais, la spore est fortement réfringente à l’intérieur de la cellule mère ; - après coloration de Gram, la spore apparaît incolore alors que le reste de la cellule est violet (parfois rose, même chez les bacilles à Gram positif) ; - après coloration à chaud au vert de malachite puis contre coloration à la fuchsine, la spore est verte alors que le reste de la cellule est rose. La position de la spore dans le sporange peut être centrale, subterminale, ou terminale. Si le diamètre de la spore est supérieur au diamètre de la cellule mère, la spore est dite déformante. La microscopie électronique permet la révélation de l’ultrastructure de la spore : l’appareil nucléaire, « baignant » dans le cytoplasme sporal, est protégé par plusieurs enveloppes : - la membrane plasmique ; - la paroi (constituée principalement de peptidoglycane) ; - le cortex, couche épaisse composée de peptidoglycane et de dipicolinate de calcium ; - les tuniques (interne et externe), de nature protéique, imperméables et résistantes ; - l’exosporium, couche externe non essentielle, composée de lipoprotéines. Figure 34 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 24/31 Les détails du cycle sporal sont donnés dans la figure 35. La sporulation, déclenchée par des facteurs environnementaux (appauvrissement du milieu en nutriments, accumulation de substances défavorables pour la croissance…), conduit à la formation d’une spore libre contenant un génome identique à celui de la cellule mère mais dont les activités métaboliques sont « en sommeil » : la spore est dormante, jusqu’à ce que les conditions redeviennent favorables. Cependant, le lever de la dormance n’intervient que si les tuniques sporales sont partiellement rompues par un agent mécanique, physique ou chimique (activation), afin de permettre la réhydratation de la spore (initiation). Figure 35 : le cycle sporal Les spores bactériennes sont pauvres en eau (seulement 15 à 20 % du poids de la spore, 80 % pour une cellule végétative). Cet état déshydraté leur confère une grande résistance à la chaleur (les protéines et les acides nucléiques résistent fortement à la dénaturation thermique dans ces conditions). Le dipicolinate de calcium, présent dans le cortex, contribue à cette thermorésistance. Un chauffage prolongé à 100°C est insuffisant pour éliminer les spores bactériennes. La destruction des spores de Clostridium botulinum n’est obtenue qu’au bout de 20 minutes à 120°C avec la chaleur humide (10 minutes à 180°C avec la chaleur sèche). La présence de spores de bactéries pathogènes (Clostridium botulinum, C. perfringens, C. tetani, C. difficile, Bacillus cereus, B. anthracis) dans les hôpitaux ou les industries alimentaires pose donc problème compte tenu des difficultés rencontrées pour les éliminer. Les spores assurent la survie des bactéries face à d’autres traitements physiques ou chimiques : elles sont capables de résister aux ultra-violets, aux rayons X, aux désinfectants, antiseptiques et antibiotiques… La durée de vie d’une spore bactérienne est très longue : plusieurs dizaines à plusieurs centaines d’années ! Les endospores bactériennes, formes de résistance, ne doivent pas être confondues avec les spores des moisissures ou des Actinomycètes (bactéries filamenteuses), qui sont des formes de dissémination. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 25/31 3.2.5. Les flagelles De nombreuses bactéries sont mobiles car elles disposent d’un (ou plusieurs) appendice(s) locomoteur(s), le(s) flagelle(s). Un flagelle, dont le diamètre est d’environ 20 nm et dont la longueur est comprise entre 10 et 20 µm, est constitué (figure 36) : - d’un corps basal, lui même formé d’un axe central et de deux ou quatre anneaux reliés à la membrane plasmique ou à la paroi ; - d’un crochet ; - d’un filament, structure cylindrique dont le constituant majeur est la flagelline, protéine de 30 000 à 60 000 Daltons. Figure 36 Les flagelles ne sont pas directement visibles au microscope photonique car ils sont trop fins. Il est nécessaire de les « épaissir » grâce à des techniques de coloration spéciales (technique de Leifson : acide tannique + fuchsine). Le nombre et la localisation des flagelles permettent de distinguer plusieurs types de ciliature (figure 37), dont la mise en évidence constitue parfois un critère d’identification important (chez les bacilles à Gram négatif en particulier). Figure 37 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 26/31 L’examen microscopique à l’état frais (réalisé à partir d’une culture en milieu liquide) permet, en fonction de la mobilité observée, de distinguer ciliature polaire (déplacement rectiligne et rapide avec des changements de direction brusques) et ciliature péritriche (déplacement désordonné et rotations de la bactérie sur elle même). Pour fonctionner, un flagelle doit tourner comme l’hélice d’un bateau (d’où la nécessité de la présence du crochet : des mutants ayant un flagelle droit n’avancent pas). Si on immobilise des bactéries sur une lame avec des anticorps dirigés contre la flagelline, on observe que ce sont les corps cellulaires qui tournent autour de l’axe constitué par le flagelle. La vitesse de rotation d’un flagelle est estimée à environ 50 tours par seconde, les bactéries pouvant atteindre une vitesse de 50 µm.s-1. Le « moteur » du mouvement flagellaire est le corps basal : un des anneaux est fixe (rôle de « stator »), un autre est en rotation (rôle de « rotor ») : il met en mouvement le reste du flagelle. La source d’énergie de ce système provient directement d’un gradient de protons : le flux de protons à travers l’anneau « rotor » entraîne la rotation de celui-ci (on estime la consommation de protons à 256 par tour). Les bactéries changent de direction (« culbute ») par une inversion brève du sens de rotation du (des) flagelle(s). En présence d’un gradient de concentration en substance nutritive, on observe que le mouvement devient orienté selon le gradient : ce phénomène est appelé chimiotactisme positif. Une bactérie peut également « fuir » en présence d’un composé répulsif (chimiotactisme négatif). C’est la diminution de la fréquence de culbute qui permet l’orientation du mouvement. La détection des substances attractives et répulsives et assurée par des chimiorécepteurs. Les flagelles ont également des propriétés antigéniques : la spécificité antigénique repose sur le nombre et sur la séquence en acides aminés des protéines qui composent le flagelle. Chez les bacilles à Gram négatif, les flagelles sont les supports des antigènes « H ». La classification des salmonelles par Kauffman-White repose sur ces propriétés (la détermination du sérovar en particulier). Exemples : Salmonella Typhimurium O 1,4,5,12 (groupe B) : H i (phase 1) 1,2 (phase 2) Salmonella Enteritidis O 1,9,12 (groupe D) : H g,m (phase 1) 3.2.6. Les pili Les pili « communs » ou fimbriae, sont des appendices plus courts et plus rigides que les flagelles (figure 29) fréquents chez les bacilles à Gram négatif. Ce sont de minces tubes composés de sous-unités protéiques (piline, 17 kDa), arrangées en hélice. Comme les flagelles, ils possèdent des propriétés antigéniques (antigène F chez les entérobactéries). Ils interviennent surtout dans les processus d’adhésion aux surfaces. L’adhésion aux muqueuses de l’hôte constitue souvent la première étape de l’infection par les bactéries pathogènes : les pili communs sont donc des facteurs d’adhésion ou adhésines, qui sont reconnus par des récepteurs glycoprotéiques BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 27/31 ou glycolipidiques des cellules de l’hôte. La libération de toxine chez Vibrio cholerae et chez les ETEC (E. coli entérotoxinogènes) est provoquée par la liaison entre les fimbriae de ces germes et des récepteurs spécifiques situés à la surface des entérocytes. Un des sites de l’adhésion des salmonelles à la muqueuse intestinale est le récepteur à l’epithelial groth factor (EGF). Chez les streptocoques, les pili sont appelés protéines M. Certaines bactéries possèdent également des pili « sexuels », plus longs que les fimbriae. Les pili sexuels interviennent dans la reconnaissance entre bactéries au cours du phénomène de conjugaison (transfert de matériel génétique entre bactéries par contact). Ces pili sont déterminés génétiquement par des plasmides conjugatifs. 3.2.7. Les plasmides et les transposons Les plasmides sont des petites molécules d’ADN circulaire (103 à 105 paires de bases). Leur réplication est indépendante de celle du chromosome bactérien, car ils possèdent leur propre origine de réplication (ORI-R). Ils portent un nombre réduit de gènes, qui ne sont pas essentiels à la survie de la cellule , mais qui lui confèrent des capacités d’adaptation plus importantes. Les plasmides conjugatifs sont transférables d’une bactérie à une autre par conjugaison : ils portent les gènes nécessaires à la synthèse des pili sexuels et les gènes de conjugaison, ainsi qu’une origine de transfert (ORI-T). Le tableau ci-dessous présente les principaux types de plasmides et quelques exemples. Type de plasmide Conjugatif Exemple (hôte) Facteur F (E. coli) Propriétés 100 kb, 1 à 3 copies par cellule, code pour les pili sexuels et les protéines nécessaires à la conjugaison (opéron « tra ») RP4 (Pseudomonas) 54 kb, 1 à 3 copies par cellule, code pour les pili sexuels et les protéines nécessaires à la conjugaison ; gènes de résistance (Amp, Kan, Chl, Str, Sulf) Résistance Virulence Métabolisme pSJ23a (S. aureus) 36 kb, gènes de résistance (Ab : Pen, Gen, Kan, Neo, Ery ; Metaux : As, Hg) pAD2 (E. faecalis) 25 kb, gènes de résistance (Ery, Kan, Str…) ColV-K30 (E. coli) 2 kb, code pour des sidérophores permettant la capture du fer PZA10 (S. aureus) 56 kb, code pour l’entérotoxine B TOL (Pseudomonas putida) 75 kb, code pour les enzymes de dégradation du toluène sym (Rhizobium) permet la symbiose avec les légumineuses et la fixation de l’azote atmosphérique (gène de la nitrogènase) Bactériocine ColE1 (E. coli) 9 kb, 10 à 30 copies par cellule, code pour la colicine E1 ColE2 (Shigella) 10 à 15 copies par cellule, code pour la colicine E2 pSQR11 9,4 kb, code pour la pediocine PA-1, active sur Listeria monocytogenes (Pediococcus acidilactici) (les bactéries lactiques produisent de nombreuses bactériocines) Les plasmides artificiels sont des outils importants en biologie moléculaire : ils sont utilisés comme vecteurs de clonage, car ils possèdent des sites d’ouverture par des enzymes de restriction (figure 38). BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 28/31 figure 38 : le plasmide pBR322 Les transposons sont des fragments d’ADN capables de se « déplacer » dans le chromosome bactérien ou d’être transféré dans un autre réplicon (un plasmide par exemple). Contrairement aux plasmides, leur réplication n’est pas autonome, elle est liée à celle du réplicon qui les héberge. Les transposons les plus simples sont des fragments d’ADN de 750 à 1600 pb, contenant le gène de la transposase (enzyme permettant l’insertion du transposon dans l’ADN cible), encadré par des séquences répétées inversées. Les transposons composites contiennent d’autres gènes que celui de la transposase (figure 39). figure 39 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 29/31 4. Notions d’écologie microbienne 4.1. Micro-organismes et milieux naturels Les micro-organismes occupent de multiples milieux naturels : sols, lacs, rivières, océans... Ils interagissent avec leur environnement en participant activement aux cycles biogéochimiques : carbone (figure 40), azote (figure 41), soufre, métaux… figure 40 : cycle du carbone figure 41 cycle de l’azote BTS BIOANALYSES ET CONTROLES Les micro-organismes saprophytes MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien se nourrissent de matières AFBB Page 30/31 organiques présentes dans l’environnement. Dans un sol par exemple, la flore microbienne tellurique participe activement à la décomposition de la matière organique (minéralisation). Ces micro-organismes (bactéries et champignons principalement) sont des décomposeurs. Dans les écosystèmes aquatiques, les bactéries assurent également la décomposition des matières organiques en solution. En surface, d’autres bactéries (Cyanobactéries, bactéries pourpres et vertes) et des algues unicellulaires assurent au contraire la production primaire de matière organique grâce à la photosynthèse. 4.2. Relations hôte – micro-organisme 4.2.1. La symbiose La symbiose désigne une interaction étroite entre un micro-organisme et son hôte. Lorsque les deux organismes interagissent à leur profit mutuel, il s’agit d’une relation de type mutualisme. Exemple 1 : dans le rumen des ruminants, des micro-organismes assurent la digestion de la cellulose en sures simples utilisables par le mammifère, tandis que le rumen constitue un fermenteur naturel pour les micro-organismes. Exemple 2 : les bactéries Rhizobium forment sur les racines de leur légumineuse hôte des organes spécialisés, les nodosités, au sein desquels elles réduisent l’azote atmosphérique en ammonium, assimilable par la plante (figure 42). Cette symbiose produit chaque année, à l’échelle de la planète, une quantité d’azote assimilable équivalente à celle synthétisée par l’ensemble de l’industrie mondiale des engrais ! figure 42 4.2.2. Le commensalisme Dans ce type de relation, le microorganisme tire un bénéfice de son hôte, sans lui nuire pour autant. Les bactéries vivant sur la peau ou dans le tube digestif (figure 43) sont des bactéries commensales. figure 43 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES MICROBIOLOGIE 1. Le monde microbien AFBB Page 31/31 4.2.3. Le parasitisme et la pathogènicité Un micro-organisme parasite satisfait ses besoins nutritifs aux dépens de l’hôte. S’il entraîne un état maladif de l’hôte, il est dit pathogène. Les bactéries pathogènes strictes (BPS) entraînent des maladies cliniquement définies chez l’hôte sain. Exemples : Salmonella Typhi, Yersinia pestis, Shigella dysenteriae Les bactéries pathogènes opportunistes (BPO) produisent une maladie chez l’hôte dont les défenses sont affaiblies (immunodéficience). De nombreuses bactéries saprophytes ou commensales peuvent devenir pathogènes lorsque le « terrain » est favorable. Exemples : Klebsiella, Enterococcus… Tableau récapitulatif : Hôte Micro-organisme + 0 – + 0 – mutualisme commensalisme pathogénicité neutralisme amensalisme compétition
