Analyse génétique
Aurélien Chateigner
Semestre 5
TP d’étude de la complémentation et de
la recombinaison de la région rII chez le
bactériophage T4
I.
Introduction
A.
Phage T4
1.
Structure
Ce TP a pour but d’étudier la complémentation et la recombinaison de la région rII chez le
bactériophage T4. Nous utilisons les bactériophages dans nos études pour 2 raisons principales. En
effet, ils parasitent et tuent les bactéries, et c’est cette propriété qui nous intéresse dans nos
expériences.
La première raison est que l’on peut croiser 2 génotypes de 2 phages distincts pour mesurer la
recombinaison, et ainsi cartographier le génome viral.
La deuxième raison est que l’on peut utiliser ces bactériophages pour rassembler des gènes
bactériens, afin de réaliser des études de liaison ou d’autres études génétiques.
On peut aussi les utiliser en technologie moléculaire comme porteur ou vecteur d’inserts d’ADN
étranger provenant de n’importe quel organisme, mais cette utilisation est plus spécifique, et donc
moins répandue.
Au cours de ce TP, nous étudierons principalement 2 techniques qui sont utilisées pour les 2 raisons
citées plus tôt. Ces 2 techniques sont la recombinaison et la complémentation.
Nous utiliserons au cours de ce TP des bactériophages T4, et plus particulièrement, nous allons nous
concentrer sur la région rII. Les bactériophages T4 font partie de la classe de bactériophages les mieux
étudiés. Leur structure se compose de 6 parties :
-
La tête (contenant un acide nucléique)
Le col et le collier
La partie centrale
La gaine
La plaque basale
Les fibres
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2.
Cycle bactérien
Pour infecter une bactérie, un phage va aller se fixer à la bactérie pour lui injecter son matériel
génétique, qui va alors utiliser les différents outils utilisés par l’acide nucléique de la bactérie
habituellement.
La synthèse de composés ne fabrique plus alors que des composés du phage, et plus de la bactérie.
Le matériel alors formé servira à faire de nouveaux phages, qui seront libérés par la lyse de la
bactérie (rupture de la paroi).
Dans l’étude des caractères des phages, la seule manifestation visible à l’œil est amenée par les
bactéries dans lesquelles les phages sont entrés. On ne peut étudier que la morphologie des plages
de lyse, ou la gamme des hôtes, qui est la manifestation de la sélection d’infestation du phage.
Cellule non infectée
Phages libres
Adsorption du
phage sur la
cellule hôte
Lyse de la cellule hôte
Assemblage
des
phages à l’intérieur de
l’hôte
Entrée de l’acide
nucléique du phage
Chromosome
l’hôte dégradé
Acide nucléique
du phage
Protéine
du phage
de
Les protéines phagiques
sont synthétisées et le
matériel génétique est
répliqué : le chromosome
de l’hôte est ensuite
dégradé
2
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Semestre 5
3.
Région rII
La région rII étudiée permet la différenciation des croissances en fonction des bactéries. En effet,
avec le phénotype rII, le phage ne croit que sur des bactéries de type B, alors que le phénotype
sauvage permet de croitre sur les bactéries de type B et de type K. Cette différence de liaison est due
au fait que la région rII est responsable de la lyse des bactéries, et donc à la croissance des phages. Ce
phénotype est lié à 2 régions géniques distinctes : rIIa et rIIb. Une seule mutation sur l’une de ces
deux régions suffit à entrainer un phénotype rII. Le phénotype sauvage se rencontre quand les 2
régions sont sauvages, et la bactérie peut alors croitre sur les bactéries K, et ici, ce sont des bactéries
K12.
On fait alors la distinction entre les 2 types de bactéries, les bactéries B étant appelée permissives, et
les K12 étant appelées restrictives.
On présente donc les différents génotypes que l’on peut rencontrer :
rIIa+
rIIb-
Phénotype rII : lyse sur
bactéries B seulement
rIIa-
rIIb+
Phénotype rII : lyse sur
bactéries B seulement
rIIa-
rIIb-
Phénotype rII : lyse sur
bactéries B seulement
rIIa+
rIIb+
Phénotype sauvage : lyse sur
tous les types de bactéries
On a ici utilisé le code habituel pour signifier la mutation (-) et le type sauvage (+).
B.
Complémentation chez le phage
La complémentation chez le phage se fait en infectant une bactérie par 2 phages distincts ou non. On
a donc affaire à un système de complémentation haploïde.
Zone de mutation rII
Infection par 2 phages
Pas
de
complémentation
Bactérie
Complémentation
Suite à l’infection de la bactérie par les 2 phages, on a 2 types de réactions possibles, en fonction des
génotypes de 2 phages. On a vu précédemment les différents types de génotypes que les phages
3
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peuvent présenter, et donc transmettre à la bactérie. Dans le cas de mutations, on a 2 cas qui se
présentent alors :
-
Les mutations sont sur le même gène, l’autre gène est sauvage dans les 2 cas : Pas de
complémentation, phénotype muté, il n’y a pas de lyse des bactéries.
Les mutations ne sont pas sur le même gène, chaque bactérie présente un gène sauvage, et
un muté : complémentation, phénotype sauvage, lyse des bactéries.
Ce phénomène s’effectue de la manière suivante :
rIIa+
rIIb-
Gènes (phage 1)
Trajet
Enzyme A
(1)
(2)
Enzyme B
lyse
Gènes (phage 2)
rIIa-
rIIb+
Dans ce cas, chaque enzyme est apportée par un gène fonctionnel, l’enzyme A par le gène a du
phage 1, et l’enzyme B par le gène b du phage 2, et la lyse est effective. C’est le phénomène de
complémentation.
C.
Recombinaison chez le phage
Il faut bien différencier la recombinaison de la complémentation dans l’étude des phages T4. La
recombinaison, c’est la formation de nouvelles combinaisons de gènes, par cassure et réunion de
chromosomes. Les génotypes des enfants de la recombinaison sont nouveaux, recombinés. C’est ici
que se fait la différence avec la complémentation, puisqu’il n’y a pas de mélange, dans le cas de la
complémentation, les génotypes restent les parentaux.
Ici, nous considérons que la région rIIa est composée de 6 sous-parties, que l’on nommera a1, a2, a3,
a4, a5 et a6 :
rIIa
rIIb
a1
a2
a3
a4 a5
a6
On a alors plusieurs souches de phages qui présentent des délétions différentes :
-
La souche de phage X : délétion de toute la région rII
La souche de phage Y : délétion de a4, a5 et a6 et rII
La souche de phage Z : délétion de a6 et rII.
Représentons les phages de la façon suivante :
partie délétée
Phage X :
Phage Y :
Phage Z :
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On peut alors supposer 2 choses :
-
Soit la mutation est dans la région délétée
Soit la mutation n’est pas dans la région délétée
Phage connu incapable de lyser K12
Mutation
Phage à tester incapable de lyser K12
rII [a-b-]
rII [a-b-]
rII [a-b+]
rII [a+b+]
Les deux phages ne peuvent toujours
pas lyser la bactérie, l’un ayant été en
grande partie délété, l’autre ayant
toujours la mutation qui empêche la
lyse des bactéries K12. Cependant, la
lyse des bactéries B est possible. Cette
recombinaison est dite léthale.
Ici, en revanche, on a un phage qui est
muté et délété, et donc qui ne peut
lyse, mais on a aussi un phage qui a
récupéré le génotype sauvage, et donc
qui a gagné la capacité à lyser les
bactéries de type K12.
On peut alors déduire le résultat de ces manipulations, en fonction du phage que l’on va étaler sur
les bactéries K12 :
-
-
II.
Phage X : Toute la région rII a été délétée, donc il n’y aura pas de plage de lyse
Phage Y : Si les régions a1, a2 et a3 contiennent la mutation, il y aura des plages de lyse,
puisqu’elles ne seront pas délétées. Dans le cas contraire, il n’y aura pas de plages de lyses,
et donc la mutation sera dans les régions a4, a5 ou a6, qui seront délétées.
Phage Z : Le cas est quasiment le même que le précédent, sauf que les régions qui pourraient
contenir la mutation en cas de lyse sont les régions a1, a2, a3, a4 et a5, et que celle qui
contiendrait la mutation en cas d’absence de lyse serait la région a6.
Manipulations
Nous avons 3 souches de phages dont nous ne connaissons pas le génotype. Nous allons tenter de
déterminer quel gène est muté, et ensuite en quelle partie il l’est.
A.
Test de complémentation : détermination du gène muté
Le matériel dont nous disposons pour déterminer quel gène est muté est le suivant :
-
Une bactérie d’E. coli de type B (permissive)
Une bactérie d’E. coli de type K12 (restrictive)
Un phage mutant de mutation connue, le mutant tester (rIIa-/rIIb+)
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Grâce à ceci, nous avons mis en place un test de complémentation, qui nous sert à déterminer quel
gène est muté. Pour cela, nous avons placé les 3 souches de phage de génotype inconnu en contact
avec le phage tester, puis nous avons déposé les mélanges sur des boites de pétri avec un tapis
bactérien, variant suivant la boite. Nous avons de plus déposé du phage Tester (T) seul et un témoin
négatif (du LB seul : 0).
1
2
0
3
T
Tapis :
1
2
0
3
T
K12 + LB
1
B + LB
2
0
3
T
K12 + Tester
Dans ces boites, la première est un témoin négatif, la 2ème un témoin positif, et la dernière une boite
de complémentation. Grâce au témoin négatif, on met en évidence que les mutants ne peuvent pas
pousser sur des bactéries K12. Le témoin positif met en évidence que les mutants ont la possibilité de
pousser sur des bactéries B. Grâce à ces deux témoins, nos expériences peuvent être validées.
La première boite est donc le témoin négatif, et on dépose sur cette boite une solution de bactéries
de type K12 en un tapis sur le milieu gélosé. Notre solution contient 100 µl de bactéries, ajoutées à 1
mL de solution LB. Le tout est ajouté à un tube de soft agar en surfusion.
La 2ème boite est le témoin positif. On dépose sur cette boite une solution de bactéries B
(permissives). La solution est la même que précédemment, à ceci près que les bactéries sont des
bactéries de type B.
La 3ème boite est la boite de complémentation. On dépose sur cette boite une solution de K12, mais
cette fois, on y ajoute les phages Testers (1.107 pfu.mL-1), qui devront faire de la complémentation,
de la même façon que les préparations précédentes.
Nous avons à chaque fois fait des dilutions, car nous voulions certaines concentrations pour nos
phages :
Phage 1
Phage 2
Phage 3
Phage Tester
Concentration de la Solution fournie
(pfu.mL-1)
1,6.108
2,1.108
2,8.108
2,5.108
Volume et Concentration auquel utiliser le
phage
50 µL à 1.108
50 µL à 1.108
50 µL à 1.108
1,1 mL à 1.107
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Semestre 5
Pour obtenir ces concentrations, nous avons dû faire les dilutions suivantes :
Volume de solution
mère
31,25 µL
23,81 µL
17,86 µL
440 µL
Phage 1
Phage 2
Phage 3
Phage Tester
B.
Volume de solution
LB
18,75 µL
26,19 µL
32,14 µL
660 µl
Volume et concentration finale (en
pfu/mL)
50 µL à 1.108
50 µL à 1.108
50 µL à 1.108
1,1 mL à 1.107
Test de recombinaison
Pour nos tests de recombinaison, nous disposons de 3 phages, X, Y et Z que nous avons décrits
précédemment. Nous devons, avant toute expérience, déterminer la concentration des phages dans
les préparations.
1.
Titration des phages X, Y et Z.
a)
Numérotation approximative
Pour déterminer la concentration, nous avons réalisé des dilutions en cascade à partir de la solution
mère. Nous avons dilué 10 fois à chaque étape, et ce jusqu’à 10-6. Ensuite, nous avons déposé 10 µL
des dilutions à 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 et 10-6 sur une boite de pétri, contenant un tapis de bactéries B
(même technique que précédemment).
10-3
10-2
10-6
10-4
10-5
Notre but, en faisant ces dépôts, est d’obtenir des dilutions pour lesquelles on pourra compter des
plages de lyses. En procédant ainsi, on peut déterminer (de manière peu précise) la concentration en
phages dans la solution initiale.
Mais cette technique étant peu précise, on utilise la numérotation précise.
b)
Numérotation précise.
Pour faire la numérotation précise, on a placé sur une boite de pétri les dilutions 10-5 et 10-6, à
hauteur de 100 µL, mélangé à des bactéries B en soft Agar.
2.
Test de Recombinaison
Pour la recombinaison, on a numéroté une série de tubes Eppendorf de A à I, et dans ces tubes, on a
placé des mélanges entre les phages 1, 2 et 3 et les phages X, Y et Z.
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Aurélien Chateigner
Phage X
Tube A
Tube D
Tube G
Phage 1
Phage 2
Phage 3
Phage Y
Tube B
Tube E
Tube H
Semestre 5
Phage Z
Tube C
Tube F
Tube I
Dans chaque tube, on a déposé 25 µL du phage (1, 2, 3, X, Y ou Z) à une concentration de 1,6.108
pfu.mL-1.
Ensuite, on dépose 3 mélanges de soft agar et de 100 µL de bactéries de type K12 sur 3 boites. On
fait ensuite un mélange de 300 µL de bactéries de type B dans 1 mL de milieu LB, le mélange sera
maintenu à une température élevée avec un bain marie pendant 10 minutes. On dépose ensuite 50
µL de ce mélange dans les tubes A à I. Cette dilution est faite pour que le rapport phages/bactéries
soit le plus bas, pour ne pas trouver de complémentation dans les bactéries. Ainsi, on est certains de
bien avoir de la recombinaison dans les bactéries. Ensuite, les mélanges sont laissés 10 minutes au
bain marie à 37 degré. Il faut faire attention à ne pas les laisser trop longtemps dans le bain marie,
sinon il y aura une trop grande multiplication des phages, et donc des résultats inexploitables.
Après tout ceci, on obtient nos tubes A à I, contenant les mélanges. On fait une dilution à 10-1 pour
chacun, et on dépose pour chaque tube la dilution et le mélange normal.
Au bout de cette manipulation, on obtient 3 boites de pétri, contenant tous les mélanges, étalés sur
des bactéries K12. On n’aura alors des plages de lyse que dans le cas où il y aura eu recombinaison
entre 2 phages de génotype différent (voir recombinaison I. C.).
Enfin, on a dilué la solution du tube F à 10-6 (F certainement car recombinaison, mais non vérifié à ce
stade, on fait confiance au professeur). On place donc 1 mL de cette solution dans un tube de soft
agar contenant 100 µL de bactéries B. Enfin, on étale le tout sur une boite de pétri avec un tapis
bactérien K12.
III.
Résultats
A.
Complémentation
Nous n’avons obtenu aucune plage de lyse sur nos boites.
B.
Recombinaison
1.
Titration
Nos résultats n’étant pas significatifs, puisqu’aucune lyse pour l’ensemble de la classe n’a été faite,
nous utilisons les résultats d’un autre groupe.
Nous avons donc les résultats bruts suivants :
-5
Dilution à 10
Dilution à 10-6
Phage X
165
55
Phage Y
183
15
Phage Z
197
65
8
Analyse génétique
2.
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Semestre 5
Test de recombinaison
9
Analyse génétique
IV.
Aurélien Chateigner
Semestre 5
Interprétation
A.
Complémentation
Nous n’avons pas réussi à obtenir de complémentation, donc on en déduit que les 3 phages sont
mutés sur le gène rIIa, puisqu’il n’y a pas eu de complémentation, ils sont mutés sur le même locus
que le phage Tester. On n’obtient donc pas le cas que l’on aurait pu obtenir en cas de
complémentation (voir l’introduction).
B.
Recombinaison
1.
Titration
Nos résultats ne sont pas crédibles, aux vues des rapports entre les dilutions. En effet, on aurait dû
obtenir un facteur 10 entre les dilutions. Ce n’est, cependant (sauf pour Y) pas le cas. Nous avons
donc un peu retravaillé les résultats, et obtenu au final la titration.
Calcul de la concentration (exemple pour X) :
On trouve pour X un titre de 165 à 10-5 et 55 à 10-6. En multipliant le résultat de 10-6 par 10, on
obtient une valeur à 10-5 de 550. En faisant la moyenne avec la valeur obtenue directement à 10-5, on
obtient un titre de 3,6.108 pfu.mL-1.
En faisant de même avec les résultats d’Y et Z, on obtient respectivement 1,7.108 pfu.mL-1 et 4,25.108
pfu.mL-1.
Pour la recombinaison, il a fallu diluer les solutions. On avait besoin de 25 µL de solution de phage
par tube, et donc au total 75 µL de chaque solution. Pour plus de sécurité, nous avons préparé 100 µL
de chaque. Nos résultats et mélanges peuvent être regroupés dans le tableau suivant :
X
Y
Z
Concentration
initiale
3,6.108 pfu
1,7.108 pfu
4,25.108 pfu
2.
Volume
solution mère
44 µL
94 µL
37,6 µL
Volume LB
66µL
6 µL
62,4µL
Volume total
final
100µl
100µl
100µl
Concentration
finale
1,6.108 pfu
1,6.108 pfu
1,6.108 pfu
Test de recombinaison
10
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Semestre 5
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