Test de recombinaison

Simonnet Jean
Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
2000/2008
Analyse Génétique : Compte rendu de TP
Etude de la complémentation et de la recombinaison au
niveau de la région R II chez le bactériophage T4 .
Notre but sera de montrer le déterminisme génétique chez différentes souches du phage T4 mutés
au niveau de la région RII, région impliquée dans la lyse bactérienne, par des tests de
complémentation pour savoir quel gène est touché et également par des tests de recombinaison
pour déterminer plus précisément la localisation des mutations.
I.
Généralités
A.
Phage T4
1.
Structure
Le phage T4 affecte Escherichia coli (E. coli). C’est un virus, de la famille des myoviridae, à ADN
double brin.
Il présente une nucléocapside qui comporte la capside, formée de protéines virales, qui contient le
matériel génétique, ici de l’ADN double brin. Il présente aussi une queue qui va lui permettre de
s’adsorber à la bactérie, grâce à des fibres présentes à son extrémité, avant l’injection de son
matériel génétique.
2.
Cycle viral
Le virion libre s’attache à la paroi bactérienne d’E. coli. Il injecte son ADN double brin dans la bactérie
qui va être répliqué après digestion de l’ADN de l’hôte. On a alors une phase de biosynthèse qui va
aboutir à l’assemblage de nouveaux virions qui seront libéré après la lyse de la bactérie. Les
nouveaux virions formés pourront alors infecter d’autres bactéries. Une bactérie peut être infectée
par 2 phages en même temps. Le cycle viral est très court, il dure environ 30 minutes, ce qui en fait
un outil très utile en génétique du fait de sa rapidité à se multiplier.
3.
Région RII
C’est la région responsable de la lyse des bactéries. Elle se compose de 2 gènes distincts, RIIa et RIIb.
La mutation des 2 gènes empêche la lyse de la bactérie. Cependant, selon le type de bactérie, la
mutation d’un seul des 2 gènes ne peut avoir aucun incident : pour les bactéries B, on à lyse des
bactéries, pour les bactéries K12, la lyse n’a pas lieu. On dit que les bactéries B sont permissives et les
bactéries K12 sont restrictives. Pour une lyse de la bactérie K12, les deux gènes doivent être
fonctionnels.
1
Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
Simonnet Jean
2000/2008
Différentes Souches en fonction de la région RII
Souche sauvage
RIIa +
RIIb +
RIIa +
RIIb -
Souches mutés
RIIa -
RIIb +
Lyse de B
et K12
Lyse de B,
pas de K12
Lyse de B,
pas de K12
Pas de lyse
RIIa -
RIIb -
Le «-» signifie que le gène est muté et le «+» signifie que le gène est sauvage
B.
Complémentation chez le phage
Lors d’une infection par 2 phages ayant un génotype opposé, on peut avoir complémentation.
Considérons deux gènes A et B commandant chacun l’expression d’une protéine spécifique.
Considérons également qu’un phage (1) comporte le gène A sauvage et le gène B muté (donnant
protéine défectueuse) et qu’un phage (2) comporte le gène A muté (donnant une protéine
défectueuse) et le gène B sauvage.
Si les 2 phages infectent la même bactérie, chaque génome va être introduit. Le génome (1) va
exprimer une protéine B défectueuse et le génome (2) une protéine A défectueuse, cependant, le
génome (1) produit une protéine A fonctionnelle et le génome (2) va produire une protéine B
fonctionnelle : les deux génomes sont défectueux sur 2 gènes différents et peuvent donc se
complémenter. Si la mutation avait touché le même gène chez les 2 phages, il n’y aurait pas eu
complémentation, le cycle phagique ne se serait pas produit.
Pour ce qui est du phage T4, une complémentation est possible entre les gènes RIIa et RIIb.
2
Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
Simonnet Jean
2000/2008
Phage RIIa+ RIIb -
Phage RIIa- RIIb +
Phage RIIa- RIIb+
Phage RIIa- RIIb +
Apporte RIIa+
Apporte RIIb+
Apporte RIIb+
Apporte RIIb+
Complémentation
Pas de Complémentation
E. coli
E. coli
Lyse de la bactérie
C.
Pas de lyse de la bactérie
Recombinaison chez le phage
Considérons la région RII comme il suit : la région RIIa se divise en 6 sous unités (a1 à a6).
a1
a2
a3
a4
a5
a6
RIIa
RIIb
La souche de phage X présente une délétion de toute la région RII
La souche de phage Y présente une délétion de A4, A5, A6 et RII
LA souche de phage Z présente une délétion de A6 et RII.
Pour la recombinaison, deux hypothèses sont envisageable pour chaque test de recombinaison. Soit
la mutation est dans la région délétée, soit elle est en dehors de cette région.
3
Simonnet Jean
Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
2000/2008
Hypothèse 1 : Mutation dans la région délétée
Délétion
Crossing
over
Phage connu (X, Y ou Z),
incapable de lyser K12
Mutation
Phage à tester (1, 2 ou 3),
incapable de lyser K12
Les 2 phages ne peuvent
toujours pas lyser K12 : un
est délété et l’autre muté :
recombinaison léthale. Le
deuxième phage peut lyser
les bactéries B : RIIb sauvage
Hypothèse 2 : Mutation hors de la région délétée
Délétion
Mutation
Phage connu (X, Y ou Z),
incapable de lyser K12
Crossing
over
Phage à tester (1, 2 ou 3),
incapable de lyser K12
Phage présentant et un
mutation et une délétion :
pas de lyse.
Génotype sauvage
récupérée : lyse des
bactéries K12
Sur K12:
Avec X : il n’y aura pas de plage de lyse, car il n’y a plus de région RII : on vérifiera que la mutation est
bien dans la région RII.
Avec Y : S’il y a des plages de lyses, c’est que la mutation se situe en a1 a2 a3. S’il n’y en a pas, c’est
que la mutation est comprise dans la région délétée.
Avec Z : s’il y a des plages de lyse, c’est que la mutation se situe avant a6. (De a1 à a5) S’il n’y en a
pas, c’est qu’elle est après a5.
4
Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
Simonnet Jean
II.
2000/2008
Manipulations
On dispose de 3 souches de phages inconnues. Notre but sera, dans un premier temps, de
déterminer quel gène est touché, puis par la suite nous préciserons quelle partie du gène est touché.
A.
Test de complémentation : détermination du gène muté
On dispose de 2 souches bactériennes d’E. coli. Une souche B, permissive, et une souche K12,
restrictive.
On dispose également d’une souche de phages mutants, dont la mutation est connue : RIIa- RIIb+. On
appelle ce mutant le mutant tester.
On va faire des tests de complémentation entre les différentes souches de phages (1, 2 et 3) et le
phage T, c'est-à-dire que l’on va mettre en présence la souche 1, 2 ou 3 et T, dans un milieu
comportant des bactéries. Dans chaque boite (a, b et c), place 10 µl des solutions de 1, 2, 3, T et LB
(0) en des points bien distincts.
On réalise 3 boites de culture : 1 témoin négatif, un témoin positif et la boite de complémentation.
Le témoin positif montre que les mutants ne poussent pas sur des bactéries restrictives. Le témoin
positif montre que les phages mutants peuvent pousser sur les bactéries permissives, et donc qu’ils
ont gardé leur capacité à lyser.
a : Témoin négatif, on dispose une solution de bactéries K12 dans la boite de Pétri contenant un
milieu gélosé. On réalise une solution contenant 100µl de K12 et 1 mL de solution LB que l’on met
dans un tube de solution soft agar fournie.
b : Témoin positif, on dispose une solution de B dans la boite de Pétri contenant un milieu gélosé. On
réalise une solution contenant 100µl de B et 1ml de solution LB que l’on met dans un tube de
solution soft agar fournie.
c : boite de complémentation : on dispose une solution contenant des bactéries K12 et les phages T
(1.107pfu/mL) dans une boite de Pétri contenant un milieu gélosé que l’on met dans un tube de
solution soft agar fournie.
a
b
1
1
2
0
T
3
Milieu avec E. coli K12
c
1
2
0
T
3
Milieu avec E. coli B
5
2
0
T
3
Milieu avec E. coli K12
Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
Simonnet Jean
2000/2008
Concentration de la Solution fournie
(pfu/mL)
Volume et Concentration auquel
utiliser le phage
2,5.108
1,1 mL à 1.107
1,6.108
2,1.108
2,8.108
50 µL à 1.108
50 µL à 1.108
50 µL à 1.108
Pfu : plaque forming unit
Phage
Tester
Phage 1
Phage 2
Phage 3
Préparation des solutions :
Volume de solution
mère
Volume de
solution LB
Volume et concentration finale
(en pfu/mL)
440 µL
660 µl
1,1 mL à 1.107
31,25 µL
23,81 µL
17,86 µL
18,75 µL
26,19 µL
32,14 µL
50 µL à 1.108
50 µL à 1.108
50 µL à 1.108
Phage
Tester
Phage 1
Phage 2
Phage 3
B.
Test de recombinaison
On dispose de 3 souches de phages X Y et Z mutés dans la région RII. On doit tout d’abord évaluer la
concentration en phage pour effectuer les tests de recombinaison.
1.
Titration des phages X, Y et Z.
a)
Numérotation approximative
On réalise une dilution en cascade au 1/10ème de la solution mère de phage. On dépose ensuite 10 µl
des solutions à 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 et 10-6 dans une boite de pétri dans laquelle on a disposé
précédemment une solution de bactéries B dans du soft agar.
Pour les dilutions, où ce sera possible on pourra compter, le nombre de plages de lyse, on pourra
déterminer la concentration approximative. ON réalisera ensuite pour ces dilutions une
numérotation plus précise (voir partie suivante)
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Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
Simonnet Jean
20 µL
20 µL
20 µL
20 µL
20 µL
2000/2008
20 µL
Solution
mère
180 µL LB
10-1
180 µL LB
10-2
180 µL LB
10-3
180 µL LB 180 µL LB 180 µL LB
10-4
10-5
Dilution en cascade
10-6
10-2
10-6
10-3
10-5
10-4
Soft agar
+ Bactéries B
b)
Numérotation précise.
La numérotation approximative est possible à 10-5 et 10-6
On dispose alors 100 µL des solutions à 10-5 et à 10-6
dans le milieu soft agar avec des bactéries B. On coule
ensuite les solutions dans des boites de Pétri.
10-5
100 µL
100 µL
10-6
Bactéries B
Soft agar
Boites de Pétri
2.
Test de Recombinaison
Nous allons réaliser une série de tubes, numérotés de A à I. On va réaliser des mélanges entre les
phages 1,2, 3 et les phages X, Y, Z.
25 µl de chaque solution de phage à 1,6.108 pfu seront introduits dans les tubes. Les dilutions des
solutions X, Y et Z se feront en fonction des résultats trouvés à la titration (voir partie interprétation).
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Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
Simonnet Jean
2000/2008
Voici le tableau du croisement des phages :
Phage 1
Phage 2
Phage 3
Phage X
Phage Y
Phage Z
Tube A
Tube D
Tube G
Tube B
Tube E
Tube H
Tube C
Tube F
Tube I
Dans 3 tubes de soft agar maintenu à chaud, on dispose 100µl de bactéries K12, que l’on laisse au
moins 10min au bain marie avant de les étaler sur 3 boites de Pétri (I, II et III).
On dilue 300µl de bactéries B dans 1mL de milieu LB. On maintient le milieu pendant 10min au bain
marie. On met ensuite 50µL de bactéries B dilué dans les tubes A à I. en utilisant une solution
bactérienne diluée, on augmente ainsi la probabilité d’une co-infection par les deux phages qui
doivent recombiner. On mélange, puis on laisse 10 min au bain marie. Par ce temps relativement
court, on évite alors une multiplication trop importante des phages, qui pourraient masquer les
résultats de la recombinaison.
On réalise ensuite une dilution à 10-1 des solutions des tubes A à I avant de disposer sur les boites I, II
et III, les solutions de la façon indiquée ci-dessous.
Tube A
TubeD
10-1
Tube G
10-1
0
10-1
0
10-1
0
0
Tube B
Boite I
10-1
10-1
Tube C
0
10-1
0
10-1
0
Tube E
0
0
Tube F
TubeH
Boite II
10-1
Tube I
Boite III
On met la solution mère et la solution à 10-1 de chacun des tubes A à I.
Remarque : on étale sur K12, car de ce fait, seulement les recombinants donnant un type sauvage
pourront donner des plages de lyse. En effet, on sait que RIIb n’est pas muté chez 1, 2 et 3 : les
phages ne recombinant pas pousseraient et certaine recombinaisons donneraient des phages
poussant sur B.
Pour les tubes où la recombinaison aura redonné des sauvages, on aura alors des plages de lyse. On
va réaliser une manipulation pour ces tubes, nous permettant d’estimer le nombre de phage
recombinés. On dispose 1mL de l solution des tubes concernés diluée à 10-6 dans un tube de soft agar
dans lequel on a ajouté 100µl de bactéries B. On peut alors étaler le tout sur une boite de Pétri et on
pourra alors dénombrer les plages de lyse.
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Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
Simonnet Jean
III.
2000/2008
Résultats
A.
Complémentation
On constate qu’aucune boite ne contient de plage de lyse.
B.
Recombinaison
1.
Titration
Dans notre groupe, les expériences ne semblent pas avoir fonctionnée. Cela proviendrait surement
de la solution de phage. On se sert des résultats de l’autre groupe de TP pour effectuer la titration.
Voici le tableau des résultats bruts (en nombre de plage de lyse)
Phage X
Phage Y
183
15
-5
Dilution à 10
Dilution à 10-6
2.
Test de recombinaison
9
Phage Z
197
65
Simonnet Jean
IV.
Licence 3ème année : Biologie cellulaire et physiologie
2000/2008
Interprétation
A.
Complémentation
Il n’y a donc pas eu complémentation. On peut en déduire que la mutation des phages 1, 2 et 3 sont
portées par le gène RIIa. En effet le phage tester portait une mutation en RIIa. Si un des phages avait
comporté la région RIIa sauvage, celle-ci aurait complémentée la région RIIa mutée du phage tester,
mais l’absence de complémentation montre que cette région n’est pas fonctionnelle, donc mutée.
B.
Recombinaison
1.
Titration
On constate une aberration dans les résultats de titration. Il devrait y avoir un facteur 10 entre les
résultats 10-6 et 10-5. On constate qu’il n’en est rien.
ON considère tout de même ces résultats pour la suite de l’expérience. On cumule les deux résultats
(10-5 et 10-6) pour déterminer la titration.
Concentration de X : à 10-5 on trouve alors 714 pdl (plage de lyse). Pour 100µl cela fait 357 pdl à 10-5.
Soit 357.105 phages dans les 100µl de solution mère, soit une concentration d’environ 3,6.108 pfu.
On utilise la même méthode de calcul pour Y et Z et on trouve 1,7.108 pfu pour Y, et 4,25.108 pfu
pour Z.
On doit réaliser des dilutions pour pouvoir les utiliser pour la recombinaison. Il nous faut 25 µl de
solution de phage par tube. Ce qui fait un total de 75 µl de chaque solution de phage. On en prépare
100µl en cas d’erreur. Voici le tableau des dilutions :
X
Y
Z
Concentration
initiale
Volume
solution mère
Volume
LB
Volume total Concentration
final
finale
3,6.108 pfu
1,7.108 pfu
4,25.108 pfu
44 µL
94 µL
37,6 µL
66µL
6 µL
62,4µL
100µl
100µl
100µl
10
1,6.108 pfu
1,6.108 pfu
1,6.108 pfu