biomolecules 1

1. Les propriétés des biomolécules
™ Acides aminés, peptides et protéines
™ Acides nucléiques et ADN
™ Comparaison de la chimie analytique classique et la
chimie bioanalytique
1
1.1 Acides aminés, peptides et protéines
™ Les peptides et protéines sont constitués d’acides aminés, reliés
entre eux par un lien amide.
™ Les acide aminés:
R1 R2
Acide α-aminé
R1 R2
OH
H2N α
O
H2N
Acide β-aminé
β
OH
α
O
™ Les protéines sont constituées d’une vingtaine d’acides α-aminés
naturels. D’autres acides aminés sont aussi retrouvés dans des
peptides qui sont biologiquement actifs et dans certaines protéines.
2
™ Une chaîne de quelques centaines d’acides aminés, dont la masse
moléculaire est typiquement < 10 kDa constitue un polypeptide.
™ Les protéines sont constituées d’un ou plusieurs polypeptides et
possèdent des masses moléculaires élevées; la majorité des
protéines ayant des masses moléculaires entre 10 et 100 kDa
(où 1 kiloDalton (kDa) = 1000 g/mol).
™ La séquence des acides aminés et leur arrangement spatial
déterminent la structure ainsi que la fonction des protéines et
peptides dans des processus biologiques.
3
1.1.1 Structure et propriétés des acides α-amines
™ Structure générale des acides α-aminés naturels:
forme neutre
NH2
H
C
R
COOH
forme zwitterionique
à pH physiologique
NH3+
H
C
-
COO
R
groupement
latéral
™ Les différents groupements latéraux des acides α-aminés naturels
varient selon leur grandeur, forme, charge, capacité à créer des
ponts hydrogène et réactivité chimique.
4
Classification des acides α-aminés naturels
- Groupement latéral basique: charge positive à pH neutre
O
+
H3N
CH C
O
O-
+
H3N
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH
NH3+
C
Lysine (Lys; K)
O
O-
CH C
+
H3N
CH C
O-
CH2
+
HN
NH
Histidine (His; H)
NH2+
NH2
Arginine (Arg; R)
5
- Groupement latéral acide: charge négative à pH neutre
O
O
+
-
+
H3N CH C O
H3N
CH2
CH C OCH2
C O
CH2
O-
C O
O-
Acide aspartique (Asp; D)
Acide glutamique (Glu; E)
- Groupement latéral amide
O
+
H3N
CH C O
O
-
CH2
+
H3N
CH C OCH2
C O
CH2
NH2
C O
Asparagine (Asn; N)
NH2
Glutamine (Gln; Q)
6
- Groupement latéral aliphatique
O
O
O
+
H3N CH C O
-
+
+
H3N CH C O-
-
H3N
CH C O
H
CH CH3
CH3
Alanine (Ala; A)
Glycine (Gly; G)
O
CH3
Valine (Val; V)
O
+
H3N CH C O
-
+
H3N
CH C O-
CH2
CH CH3
CH CH3
CH2
CH3
CH3
Leucine (Leu; L)
(isomère de Leu)
Isoleucine (Ile; I)
7
- Groupement latéral aromatique
O
O
+
H3N
-
CH C O
+
H3N CH C O-
CH2
CH2
Phénylalanine (Phe; F)
OH
Tyrosine (Tyr; Y)
O
+
H3N
CH C OCH2
HN
Tryptophane (Trp; W)
8
- Groupement latéral sulfuré
O
+
H3N CH C O
O
-
+
H3N CH C O-
CH2
CH2
SH
CH2
S
Cystéine (Cys; C)
CH3
Méthionine (Met; M)
- Groupement latéral hydroxyle
O
O
+
H3N CH C O-
+
CH C O-
H3N
CH2
CH OH
OH
CH3
Thréonine (Thr; T)
Sérine (Ser; S)
- Acide aminé secondaire
9
O
C O+
H2N
Proline (Pro; P)
- Acides aminés modifiés
O
O
+
O
-
H3N CH C O
C O-
+
H3N
CH2
+
H2N
OH
4-Hydroxyproline
CH
OOC COOγ-Carboxyglutamate
CH C OCH2
O
-
O
P O-
O
O-Phosphosérine
10
Stéréochimie des acides α-aminés
™ Les acides α-aminés naturels:
™ sont tous chirals (et donc optiquement actifs), à l’exception de
la glycine pour laquelle le substituant latéral est un atome
d’hydrogène
™ sont tous de configuration “L” selon la convention de Fischer
ou “S” selon la notation de Cahn-Ingold-Prelog, à l’exception
de la cystéine qui est de configuration “R”.
C= centre chiral
H CH3
H3C H
+
H3N
C
-
COO-
OOC
C
HS-H2C H
+
NH3+
H3N
COO-
(R)-Cystéine
D-Alanine
ou
(R)-Alanine
L-Alanine
ou
(S)-Alanine
C
11
Propriétés acido-basiques des acides α-aminés
™ Les acides aminés sont des acides polyprotiques.
™ Les acides aminés sont amphotères; ils possèdent à la fois un
groupement acide (acide carboxylique, pKa ≈ 1.8 - 2.5) et un
groupement basique (amine, pKa ≈ 8.7 - 10.7).
K1
NH3+
H
C
COOH
OH
K2
NH3+
+
H
C
COO-
H3O
R
pH 1
R
pH 7
OH
NH2
-
H3O+
H
C
COO-
R
pH 11
zwitterion
™ Les groupements latéraux ionisables ont aussi des valeurs de
pKa (voir Table 1.1).
12
+
NH3
H
K1
H
COOH
C
NH3
+
C
COO
-
+
H
+
R
R
NH3+
H C COO-
H
NH3+
H+
COO-
C
R
-log K1= -log
NH3+
H C COOH
R
R
K1 =
- log [H+]
NH3+
H
C
NH3+
H C COOH
COOH
pK1= pH + log
R
R
NH3+
H C COOR
13
H
NH3
+
C
COO
NH2
K2
-
H
-
COO
+
H+
R
R
NH2
H
K2 =
C
C
COO-
H+
pK2 = -log K2
R
NH3+
H
C
COO-
R
14
Table 1.1 Valeurs de pKa et pI des acides α-aminés naturels
(D.C. Harris, Exploring Chemical Analysis, 2è éd. 2001;
A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
Acide α-aminé
(abréviations)
pK1
α-COOH
pK2
α-NH3+
pKR
groupement
latéral
pI
Lysine (Lys; K)
2.04
9.08
10.69
(ε-NH3+)
9.74
Histidine (His; H)
1.7
9.08
6.02
(imidazole)
7.58
Arginine (Arg; R)
1.823
8.991
12.48
(guanidino)
10.76
Acide aspartique (Asp; D)
1.990
10.002
3.900
(β-COOH)
2.87
Acide glutamique (Glu; E)
2.23
9.95
4.42
(γ-COOH)
3.22
Asparagine (Asn; N)
2.14
8.72
-
5.41
Glutamine (Gln; Q)
2.17
9.01
-
5.65
Glycine (Gly; G)
2.350
9.778
-
5.97
Acide α-aminé
(abréviations)
pK1
α-COOH
pK2
α-NH3+
pKR
(groupement
latéral)
pI
Alanine (Ala; A)
2.348
9.867
-
6.02
Valine (Val; V)
2.286
9.718
-
5.97
Leucine (Leu; L)
2.329
9.747
-
5.98
Isoleucine (Ile; I)
2.319
9.754
-
6.02
Phénylalanine (Phe; F)
2.20
9.31
-
5.98
Tyrosine (Tyr; Y)
2.17
9.19
10.47
(phénol)
5.65
Tryptophane (Trp; W)
2.35
9.33
-
5.88
Cystéine (Cys; C)
1.71
10.77
8.36
(sulfhydryl)
5.02
Méthionine (Met; M)
2.20
9.05
-
5.75
Sérine (Ser; S)
2.187
9.209
-
5.68
Thréonine (Thr; T)
2.088
9.100
-
6.53
Proline (Pro; P)
1.952
10.640
-
6.10
15
16
Exemple 1.1: Les différentes espèces de l’alanine en fonction du pH
O
α-COOH, pK1 = 2.35
H2N CH C OH
α-NH3+, pK2= 9.87
CH3
O
O
pH 1.3:
+
H3N CH C OH
pH 4.0:
+
CH3
CH3
O
pH 2.35:
+
H3N CH C O-
H3N CH C OH
O
50%
CH3
pH 7.0:
+
H3N CH C OCH3
O
+
H3N CH C O-
50%
CH3
17
O
pH 9.87: +H3N CH C O-
50%
CH3
O
H2N CH C O-
50%
CH3
O
pH 10.9:
H2N CH C OCH3
18
Exemple 1.2: Les différentes espèces de l’acide aspartique en fonction du pH
O
α-COOH, pK1 = 1.99
H2N CH C OH
α-NH3+, pK2= 10.00
CH2
C O
β-COOH, pKR = 3.90
O
OH
pH 1.0:
+
H3N CH C OH
O
pH 2.0:
+
CH2
H3N CH C OH
C O
50%
OH
CH2
C O
O
OH
pH 3.0:
O
+
H3N CH C O-
+
H3N CH C OCH2
50%
CH2
C O
C O
OH
19
OH
O
pH 3.9:
+
H3N CH C O
O
-
50%
CH2
pH 10.0:
+
H3N CH C OCH2
C O
C O
OH
OO
+
H3N CH C O
O
-
+
H2N CH C OCH2
C O
C O
-
H3N CH C OCH2
C O
O-
50%
O-
O
pH 7.0:
50%
CH2
O
50%
O
pH 11.0: H2N CH C O
CH2
C O
O-
20
™ Pour chaque acide aminé, il existe une valeur spécifique du pH
où la charge globale de la molécule est nulle. Cette valeur de
pH représente le point isoélectrique où la concentration du
zwitterion de l’acide aminé est maximale. Au point isoélectrique,
il n’y a pas de migration de l’acide aminé dans un champ
électrique appliqué.
™ Le point isoélectrique (pI) peut être estimé à partir de l’équation
de Henderson-Hasselbalch:
pI =
1
(pK i + pK j )
2
où pKi et pKj sont les constantes de dissociation des étapes
impliquées.
21
™ Ce calcul est simple pour des acides aminés ayant seulement un
groupement amine et un acide carboxylique; pKi et pKj étant les valeurs de
pKa pour α-COOH et α-NH3+, respectivement.
™ Exemple:
pI valine =
1
(2.286 + 9.718 ) = 6.00
2
™ Pour des acides aminés ayant des groupements latéraux ionisables, le
calcul du pI est plus compliqué (voir les Table 1.1 et 1.2 pour les valeurs de
pI des acides α-aminés naturels et de quelques protéines).
™ Les différences de pI sont utilisées pour séparer les acides aminés, les
polypeptides et les protéines dans un champ électrique (i.e. techniques
d’électrophorèse).
22
% des espèces d’alanine existantes vs. pH
O
+
O
H3N CH C OH
+
O
H3N CH C O-
H2N CH C OH
CH3
CH3
CH3
100
% d’espèces
pI
6.02
50
2.35
9.87
0
0
1
2
3
4
5
6
pH
7
8
9
10
(D’après S.N. Eğe, Organic Chemistry, 3è éd., 1994)
11
12
23
Courbe de titrage de l’alanine
(D’après D.J. Holme, H. Peck,
Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
24
Exemple 1.3: Évolution des différentes espèces de la lysine en fonction
du pH
α-COOH, pK1 = 2.04
O
+
H3N
CH C
α-NH3+, pK2= 9.08
OH
(CH2)4
ε-NH3+, pKR = 10.69
NH3+
pI= 9.74
O
+
H3N
CH C
OH
(CH2)4
NH3+
H3O+
pH 1
3N
CH C
(CH2)4
NH3+
O
O
O
OH- +H
O
-
OHH3O+
pH 7
H2N
CH C
O- OH- H2N
(CH2)4
NH3+
CH C
(CH2)4
H3O+
pH 9.74
NH2
pH 12
25
Les mêmes notions de propriétés acido-basiques s’appliquent aux peptides:
Lys-Ala-Gly
+
O
O
CH3
H
H3N CH C N CH C N CH C OH
H
O
H
(CH2)4
pH=1
NH3+
O
+
CH3
O
H
H3N CH C N CH C N CH C OH
O
H
(CH2)4
pH=7
NH3+
O
O
H
H2N CH C N CH C N CH C OH
O
H
(CH2)4
NH2
CH3
pH=11
26
O-
Table 1.2 Valeurs de pI de quelques protéines
(A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
pH < pI: protéine chargée positivement
pH> pI: protéine chargée négativement
27
1.1.2 Structure des protéines
1. Structure primaire:
™ La séquence ou l’ordre d’enchaînement des acides aminés dans une
protéine (ou polypeptide) définit la structure primaire de la protéine
(ou polypeptide). La structure primaire caractérise une protéine de
manière univoque. La simple substitution d’un acide aminé pour un
autre peut drastiquement affecter l’activité et la fonction d’une protéine,
pouvant ainsi causer des maladies et désordres physiologiques.
™ Les acides aminés sont reliés entre eux par un lien amide:
liaison peptidique
H
R1
H
OH
H2 N
O
+
R2
OH
HN
H
O
H
- H2O
R1
H2N
O
H
N
H
dipeptide
O
OH
R2
28
Dû à son caractère de double lien partiel, il n’y a pas de rotation
du lien C-N:
O
O
N
N
H
H
L’unité peptidique NH-CO est rigide.
Les liens de chaque côté du C-α
peuvent tourner (en dedans de
contraintes stériques) et jouent un
rôle important dans le repliement
d’une protéine.
rigide rotation
R1
H
H2 N α
O
H
N α
H
O
OH
R2
rotation
29
™ Un tétrapeptide de séquence Ser-Ala-Cys-Gly:
OH groupement latéral SH
H
squelette
+
CH2
H3N
O
acide aminé
N-terminal
O
H
N
H
CH3
H
N
H
CH2
O
O
H
N
OH
H
acide aminé
C-terminal
™ Il est peu probable qu’un acide aminé donné excède 10% de la composition
totale d’une protéine.
™ Avec 20 acides α-aminés naturels, il existe un nombre immense de
combinaisons et permutations possibles:
- Dipeptide: 202= 400 arrangements possibles
- Tripeptide: 203= 8000 arrangements possibles
- Petite protéine constituée de 100 acides aminés: 20100= 1.27 x 10130
différentes séquences possibles!
30
2. Structure secondaire:
™ La structure secondaire d’une protéine se réfère aux régions d’une
protéine dans lesquelles les chaînes peptidiques sont organisées
dans des structures régulières, tels les hélices α et les feuillets
plissés β.
™ Ces structures régulières sont déterminées par la conformation du
squelette peptidique; l’influence des groupements latéraux des
acides aminés n’est pas tenue en compte.
H
™ Les hélices α et les feuillets plissés β résultent
de la formation de ponts hydrogène entre
les groupements C=O et N-H du
squelette peptidique.
R
O δ− H
H
R
R
H δ+
N
O
Hélice α
H
N
H
R 31
axe
™ Cette forme hélicoïdale résulte de
la formation de ponts hydrogène
entre le groupement C=O du nième
résidu d’acide aminé et le
groupement N-H
du (n+4)ième résidu.
™ Chaque tour complet de la spirale
est constitué d’environ 3.6 résidus
d’acide aminé pour assurer
l’alignement des groupements
C=O (pointant vers le bas) et N-H
(pontant vers le haut).
™ Les groupements latéraux «R»
sont orientés vers l’extérieur,
perpendiculairement à l’axe de la
spirale.
32
Feuillets plissés β
™ Dans un feuillet plissé β, deux chaînes
peptidiques sont pliées et alignées l’une
à côté de l’autre. Le repliement β des
chaînes peptidiques est favorisé dans le
cas d’acides aminés portant des petits
groupement latéraux «R» non-chargés.
™ Les chaînes peptidiques sont
maintenues par des ponts hydrogène.
™ Les groupements latéraux «R» sont
orientés vers l’extérieur, pointant vers le
haut et le bas de chaque feuillet.
™ Les chaînes adjacentes peuvent être
alignées, soient dans la même direction
(plis parallèle β) ou dans des directions
opposées (plis anti-parallèle β) .
33
3. Structure tertiaire:
™ La structure tertiaire d’une protéine
décrit la configuration tridimensionnelle
(3-D) d’une chaîne polypeptidique.
™ Elle inclut la relation entre les différents
domaines (hélice α et feuillets plissés
β) formés par la structure secondaire
de la protéine et les interactions des
groupements latéraux «R».
™ La structure 3-D est thermodynamiquement stable dans un
domaine restreint de température, pH
et force ionique. Au-delà de ce
Structure 3-D de la ribonucléase H
domaine une protéine peut se déplier
(Escherichia coli) (D’après A. Manz,
et perdre sont activité biologique
N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry,
(dénaturation).
2004)
34
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
4. Structure quaternaire:
Insuline
™ Une protéine peut être constituée
de 2 ou plusieurs chaînes
polypeptidiques différentes liées
ensemble.
™ La structure quaternaire décrit
comment les différentes chaînes
et autres constituants sont liés et
interagissent ensemble via des
ponts hydrogène, attraction
électrostatique et liens disulfures.
COO+
H3N CH
CH2 SH
Cystéine
COO+
+
H3N CH
HS
CH2
Cystéine
COO+
H3N CH
COO+
H3N CH
CH2 S
S CH2
Cystine
35