sujet 08

BCPST-Véto 1 – Mercredi 8 octobre 2008 - Devoir n°1 – Durée 3h30
Épreuve de type B (partielle) : Étude de documents (40 points) - durée : 1h45
A partir de l'exploitation des documents et de vos connaissances, mettez en
évidence un certain nombre de propriétés des lipides de la membrane plasmique et
quelques aspects de leur mise en place.
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Une introduction et une conclusion générale sont attendues.
les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d'être
légendés, commentés ou exploités. Des croquis légendés peuvent également être
proposés.
L'exposé doit se limiter aux deux thèmes abordés par les documents, qui font
l'objet de deux parties indépendantes
THEME I – ORGANISATION LIPIDIQUE DE LA MEMBRANE PLASMIQUE
Document 1: observation en microscopie électronique d'une membrane plasmique
Une cellule de racine de pois est fixée
et des coupes fines sont réalisées.
Après coloration métallique, la
membrane est observée en coupe par
microscopie
électronique
à
transmission.
Document 2: immunomarquage des glucides de la membrane plasmique
Des anticorps reconnaissant des polyosides
particuliers ont été couplés à des billes d'or.
Ces anticorps ont ensuite été incubés en
présence
d'hématies
(globules
rouges)
humaines.
Les hématies ont enfin été fixées et coupées, et
leur membrane plasmique observée en
microscopie électronique à transmission.
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Document 3: composition et distribution des phospholipides dans la membrane plasmique
Un dosage chimique à partir de la membrane plasmique des globules rouges (hématies) humains,
montre qu'elle contient:
- 60% de phospholipides
- 23% cholestérol
- 5% d'acides gras libres
- 3% glycolipides.
Parmi les phospholipides, on distingue:
- 17% de phosphatidylcholine (PC)
- 18% de phosphatidyléthanolamine (PE)
- 18% de sphingomyéline (SM)
- 7% de phosphatidylsérine (PS).
On étudie la sensibilité des différents phospholipides en réaction à deux enzymes =
- la sphingomyélinase (enzyme qui hydrolyse spécifiquement la sphingomyéline)
- la phospholipase de venin de serpent (enzyme qui hydrolyse les phospholipides à base de
glycérol).
Remarque : une hydrolyse est un fractionnement moléculaire faisant intervenir de l’eau.
L'action de ces deux enzymes est testée sur
- des globules rouges entiers, séparés du reste du sang, et placés dans une solution de
concentration équivalente à celle des liquides physiologiques.
- Des "fantômes" d'hématies, obtenus en plaçant les globules rouges dans de l'eau distillée,
puis en isolant la membrane ainsi obtenue, devenue poreuse à toutes les molécules, y
compris les macromolécules.
Après action des deux enzymes, on isole et analyse les phospholipides membranaires pour tester si
ils ont été (+) ou non (-) hydrolysés par l'enzyme.
Les résultats de cette expérience sont résumés dans le tableau ci-dessous:
Hydrolyse par la sphingomyélinase
Phospholipide
PC
PE
SM
PS
Globule rouge
entier
"fantôme"
d'hématie
+
-
+
-
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Hydrolyse par la phospholipase de
venin de serpent
Globule rouge
"fantôme"
entier
d'hématie
+
-
+
+
+
Document 4: synthèse du phosphatidyléthanolamine
Du réticulum endoplasmique lisse (lieu de
synthèse des phospholipides membranaires
passant par la voie de sécrétion) est isolé à
partir de cellules végétales.
Les molécules de phosphatidylethanolamine
membranaire du REL sont ensuite extraites, et on
teste le % de ces molécules qui ont été liées au
FDNB ainsi que le % de molécules liées au TNBS.
Le REL isolé est mis en présence
d'éthanolamine marquée au 14C pendant 30
minutes, puis l'éthanolamine radioactive
est remplacée par de l'éthanolamine non
marquée.
L'éthanolamine
est
un
précurseur
nécessaire
à
la
synthèse
du
phosphatidyléthanolamine.
Après ce pulse d'éthanolamine marquée, le
REL est mis en présence de molécules se
liant
par
liaison
covalente
au
phosphatidyléthanolamine:
Chase-time (h)
- le FDNB (1-fluoro-2,4-dinitrobenzene),
auquel la membrane du REL est perméable
- ou le TNBS (acide 2,4,6 trinitrobenzenesulfonique),
auquel
la
membrane du REL est imperméable.
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THEME II – SYNTHESE ET TRANSPORT DU CHOLESTEROL DANS LES CELLULES ANIMALES
Le cholestérol est un composant essentiel des membranes cellulaires. Une partie du cholestérol des
cellules animales est fourni par l'environnement (alimentation), mais les cellules sont également
capables de synthétiser le cholestérol à partir de précurseurs, dont l'acétate. Cette synthèse a lieu au
niveau du réticulum endoplasmique lisse (REL), et le cholestérol synthétisé est ensuite transporté
dans la cellule.
Document 1: Synthèse du cholestérol dans les cellules
Expérience de pulse-chase
Des cellules animales de rein de hamster (cellules) BHK ont été cultivées dans un milieu appauvri
en cholestérol pendant 48h.
Passé ce délai, les cellules sont mises en
présence d'acétate marqué avec de la
thymidine tritiée 3H pendant 15 minutes, puis
l'acétate radioactive est supprimée du milieu et
remplacée par de l'acétate non marquée. Les
cellules sont conservées ainsi en culture
pendant un temps variable, puis les lipides
cellulaires sont extraits, et la radioactivité
présente dans l'extrait est dosée.
Les résultats sont indiqués dans la courbe cicontre:
Document 2 : Intégration du cholestérol à la membrane plasmique
Une deuxième expérience de pulse-chase
identique à la précédente est réalisée.
Aux différents temps de chasse, la membrane
plasmique des cellules est extraite et la
radioactivité présente dans cette membrane est
mesurée et rapportée à la quantité de
radioactivité présente dans l'ensemble de la
cellule.
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Document 3 : Voie de transport du cholestérol à la membrane plasmique
La Bréfeldine A (BFA) est une drogue qui provoque la désorganisation et le dysfonctionnement de
l'appareil de Golgi.
L'effet de la BFA est testé sur l'export membranaire du cholestérol.
Une expérience de pulse-chasse identique à
celle du document 2 est réalisée en présence
ou en absence de BFA.
Les résultats sont exprimés par un rapport:
Cholestérol radioactif présent dans la
membrane plasmique à un temps t de chasse /
Cholestérol radioactif présent dans la
membrane plasmique à la fin de la chasse et en
absence de BFA.
Dans une expérience parallèle, on peut
observer que la BFA inhibe à plus de 90% le
transport
des
protéines
nouvellement
synthétisées vers la membrane plasmique.
DS n°1 du 8/10/08 - Corrigé de la partie de type B
40 points
Introduction : cellules limitées par une membrane, composition majoritairement lipidique,
étude portant sur la disposition de ces lipides, leur diversité, leur répartition, leur synthèse
et leur mise en place.
I. Organisation lipidique de la membrane plasmique
1. Aspects de l’organisation détectable par la microscopie électronique à transmission
Membrane montre 3 parties : 2 couches sombres et une claire
→Ceci est du à des composants de propriétés comparables (affinité pour colorant)
vers l’extérieur et vers l’intérieur de la cellule et composants ayant d’autres
propriétés (pas d’affinité pour le colorant) au cœur de la membrane.
2 couches de lipides : têtes hydrophiles => bandes sombres
Queues hydrophobes => bande claire
= bicouche lipidique
La dissymétrie observée traduit une dissymétrie des constituants des deux
couches ou hémimembranes constituant la membrane
2. Mise en évidence de glucides membranaires
La fixation des anticorps anti-polyosides rendus visibles par les billes d’or conduit à
des taches sombres repérables uniquement sur face externe.
→Il existe donc des polyosides sur cette face. Il s’agit de polyosides reliés à des
lipides.
La membrane contient donc des glycolipides membranaires localisés dans
l’hémimembrane externe.
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3. Composition et distribution des lipides membranaires
Parmi les 60% de phospholipides, on compte
*des glycérophospholipides dont les molécules sont le résultat d’estérifications
d’un glycérol par des acides gras et un groupement phosphate (relié lui-même
soit à de la choline (PC) soit à de l’éthanolamine (PE), soit à de la sérine (PS)
*des sphingophospholipides dont les molécules sont le résultat d’une
amidification d’une sphingosine par un acides gras et d’une estérification par un
groupement phosphate lui-même relié à de la choline (SM).
On doit donc s’attendre à ce que la sphingomyélinase n’hydrolyse que SM et que la
phospholipase hydrolyse les 3 autres phospholipides mentionnés.
Or on constate que la PE et la PS ne sont détruites que sur les fantômes d’hématies.
→Ceci s’explique par le fait que ces molécules ne sont pas exposées à l’enzyme
dans le cas de globules rouges entiers parce qu’elles ne se trouvent qu’au niveau de
l’hémimembrane interne.
Ce résultat montre donc une dissymétrie dans la répartition des phospholipides
membranaires. En particulier PE et PS ne se trouve qu’un niveau de
l’hémimembrane interne.
4. Synthèse et mise en place du phosphatidyléthanolamine
Avec les 2 molécules permettant le marquage, losqu’on augmente de temps de chasse,
on constate une augmentation de la quantité de PE marqué dans la membrane, avec une
stabilisation au bout de 3h.
→L’éthanolamine marquée a donc été intégrée à la membrane dans du PE.
Le TNBS permet la localisation du PE synthétisé à partir de l’éthanol amine et se
retrouvant à l’extérieur de la membrane du REL (vers le hyaloplasme)
Le FDNB permet la localisation du PE se retrouvant sur les 2 faces de la membrane
(vers le hyaloplasme et vers l’intérieur de la cavité).
Or, on constate qu’il n’y a pas beaucoup plus de PE marqué avec la FDNB qu’avec la
TNBS (moins de 20% de plus).
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→On en déduit donc que la quasi-totalité du PE se trouve sur la face
hyaloplasmique du REL.
Si on considère que cette membrane s’intègre à la membrane plasmique par exocytose,
la face contenant le PE se retrouve vers le hyaloplasme, ce qui est bien conforme à ce
qui a été mis en évidence dans la partie 3.
II Synthèse et transport du cholestérol dans les cellules animales
1. Synthèse du cholestérol dans les cellules
Lorsqu’augmente le temps de chasse, on constate une augmentation puis une
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stabilisation du cholestérol marqué dans les lipides cellulaires.
→Ceci correspond à l’intégration progressive de l’acétate fourni dans du
cholestérol synthétisé dans la cellule, jusqu’à une intégration maximale.
Dans les cellules étudiées, (cellules de rein), il y a donc synthèse de
cholestérol à partir d’acétate.
2. Intégration du cholestérol dans la membrane plasmique
On constate que le % de cholestérol marqué repérable au niveau de la membrane
plasmique augmente au cours du temps puis se stabilise à 30% du cholestérol
marqué.
→On en déduit que du cholestérol synthétisé rejoint la membrane plasmique
mais en une proportion qui correspond à 30% du cholestérol synthétisé.
3. Voie de transport du cholestérol vers la membrane plasmique
La destruction de l’appareil de golgi par la BFA, réduit l’intégration maximale
du cholestérol à la membrane plasmique de 25%
Avec la BFA la baisse de l’intégration des protéines membranaire est de 90%
alors que celles-ci empruntent exclusivement la voie du golgi
→On en déduit que l’exportation du cholestérol vers la membrane
plasmique ne se fait qu’entre 10 et 15% par la voie de l’appareil de Golgi.
D’autres voies sont empruntées entre le réticulum lisse (lieu de synthèse) et la
membrane. On peut formuler l’hypothèse de vésicules produites directement par
bourgeonnement du réticulum endoplasmique lisse.
Conclusion-bilan :
Diversité des constituants lipidiques membranaires
Asymétrie de la composition lipidique des membranes
Compartiments voués à la synthèse des lipides membranaires : REL
Plusieurs voies dont celle de l’appareil de Golgi conduisent les lipides du REL à la
membrane plasmique
Plan, rigueur du raisonnement
Présentation des documents, clarté et soin
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