Analyse protéomique et peptidomique d`extraits de
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Analyse protéomique et peptidomique d’extraits de glandes salivaires de tiques infectées ou non par Borrelia Département des Sciences Analytiques - IPHC - Strasbourg Institut de bactériologie - Groupe Borréliose de Lyme - Strasbourg A. Bœuf CJSFEAP 2010 ‐ Grenoble 18/11/10 Plan Généralités sur la maladie de Lyme Analyse d’extraits de glandes salivaires de tiques Analyse d’une protéine de surface de Borrelia Introduction – Borréliose de Lyme Borréliose de Lyme : infection bactérienne due à Borrelia burgdorferi sensu lato et transmise à l’hôte par piqûre de tique du genre Ixodes Bactérie Borrelia Tique Ixodes ricinus Introduction – Borréliose de Lyme Borréliose de Lyme : infection bactérienne due à Borrelia burgdorferi sensu lato et transmise à l’hôte par piqûre de tique du genre Ixodes Aspects cliniques : ‐ phase précoce localisée : érythème migrant (EM) Introduction – Borréliose de Lyme Borréliose de Lyme : infection bactérienne due à Borrelia burgdorferi sensu lato et transmise à l’hôte par piqûre de tique du genre Ixodes Aspects cliniques : ‐ phase précoce localisée : érythème migrant (EM) ‐ phase précoce disséminée : EM multiple, lymphocytome cutané, neuroborréliose, arthrites, troubles cardiaques Introduction – Borréliose de Lyme Borréliose de Lyme : infection bactérienne due à Borrelia burgdorferi sensu lato et transmise à l’hôte par piqûre de tique du genre Ixodes Aspects cliniques : ‐ phase précoce localisée : érythème migrant (EM) ‐ phase précoce disséminée : EM multiple, lymphocytome cutané, neuroborréliose, arthrites, troubles cardiaques ‐ phase tardive : atteintes dermatologiques, neurologiques et rhumatologiques chroniques Incidence : 1ère maladie vectorielle dans l’hémisphère nord ∼ 50 000 cas/an en Europe ∼ 25 000 cas/an aux Etats‐Unis en Alsace + de 3 000 cas/an → zone endémique tique Ixodes – bactérie Borrelia • La tique Ixodes → ectoparasite temporaire • La bactérie Borrelia burgdorferi sensu lato→ spirochète Les différentes stases Cycle du développement de la tique tiques Ixodes bactérie Borrelia Etats‐Unis I. scapularis, I. pacificus B. burgdorferi sensu stricto Europe I. ricinus, I. persulcatus B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii Asie I. persulcatus, I. ovatus B. garinii, B. afzelii Introduction – Effet de la salive de tique Modèle in vitro de culture cellulaire de kératinocytes : Effet immunorégulateur de la salive de tique sur la réponse immunitaire innée Inhibition de la réponse immunitaire innée de la peau par la salive de tique Hovius J., J. Invest Derm., 2009 Boulanger et coll., J. Invest Derm., 2009 Ì β‐defensin (HBD‐2) Introduction – Effet de la salive de tique Modèle in vitro de culture cellulaire de kératinocytes : Effet immunorégulateur de la salive de tique sur la réponse immunitaire innée Salp15 : identifiée chez I. scapularis Inhibition de la réponse immunitaire innée de la peau par la salive de tique → Objectif : module rép. immunitaire de l’hôte facilite l’infection par B. burgdorferi Déterminer les molécules de salive de tiques ayant un pouvoir immunomodulateur Analyse de glandes salivaires de tiques • Stratégie d’analyse Extrait GS de tiques Analyse microHPLC Colonne Zorbax C18, 5µm, 150x0,5mm Collecte de fractions Analyse MALDI‐MS Couplage spectrométrie de masse (ESI‐trappe ionique) Réduction S‐S, alkylation cystéines, digestion trypsine Analyse nanoLC‐Chip‐MS/MS LSMBO Analyse de glandes salivaires de tiques Résultats Miniaturisation: injection d’extrait de GS de 2 tiques Colonne C18, 150 x 0,5 mm, 11 µL/min Gradient ACN : 2% (5min), 2‐ 9.5% (0,5% ACN/min), 9.5 – 29.5% (0,25% ACN/min), 29.5 – 59.5% (0,5% ACN/min) – Durée 160 min Collecte 1 fraction /min Absorbance (214 nm) Digestion et nanoLC‐Chip‐MS/MS ⇒ identification de 49 protéines Ixodes (sans séquençage de novo) 0 80 Temps (min) 160 Analyse différentielle • Analyse différentielle d’extraits de GS de tiques infectées et non infectées Echantillons : GS de tiques adultes non gorgées non infectées : GSnegng GS de tiques adultes à J+3 (gorgées sur lapin) non infectées : GSnegJ+3 GS de tiques adultes à J+5 (gorgées sur lapin) non infectées : GSnegJ+5 GS de tiques adultes à J+3 (gorgées sur lapin) infectées : GSposJ+3 GS de tiques adultes à J+5 (gorgées sur lapin) infectées : GSposJ+5 Infection : souche Borrelia 297wt Deux analyses par échantillon (eq 2 tiques / analyse) µHPLC – UV – ESI‐MS µHPLC – collecte 160 fractions – MALDI‐TOF‐MS Analyse différentielle Gsnegng GsposJ+3 Induction de plusieurs pics Analyse spectres ESI‐MS ⇒ complexe Analyse MALDI‐MS ⇒ peptides/protéines Beaucoup de pics induits par le gorgement A Absorbance (214 nm) E C I F G D B H J 0 80 160 Analyse différentielle GSnegJ+5 GSposJ+5 Absorbance (214 nm) Pic induit à J+3 et J+5 1449 Da ; 9100 Da Pic induit à J+5 1140 Da ; 8230 Da 0 80 160 Temps (min) Activité anti-inflammatoire Evaporation des fractions HPLC Reprise dans 10µL H2O Addition de Borrelia Pré‐incubation 30 min, T ambiante Transfert dans microplaque contenant keratinocytes (250 000 cellules/puits) Incubation 24h, 37°C, 5% CO2 Quantification de la production de chimiokine IL‐8 (ELISA) dans le surnageant cellulaire Fractions potentiellement active Absorbance (214 nm) GSnegJ+5 GSposJ+5 4 fractions potentiellement actives : Inhibition de la production d’IL‐8 * * 0 * * 80 160 Time (min) Identification protéine y8 100% 1,694.84 AMU, +2 H (Parent Error: 120 ppm) E K G D A C+57 E T Y Y N C+57 W C+57 W y7 Y N E A Y D T C+57 E 75% Relative Intensity GSnegJ+5 GSposJ+5 50% b4-H2O b5-H2O y6 y5 y9 b6-H2O 25% y10 y4 y2 y3 b3 b5 b7 b4 b8 b10 0% 0 Absorbance (214 nm) K G 250 500 750 1000 1250 b11 b12 1500 m/z MS/MS spectrum Identification de la protéine putative anti‐ coagulant Salp‐9 like (I. scapularis) * * 0 * * 80 160 Time (min) Conclusion - Perspectives Conclusion : ‐ Miniaturisation de la technique d’analyse ‐ Identification de la protéine putative anti‐coagulant Salp‐9 like Perspectives : ‐ Confirmation de l’activité anti‐inflammatoire potentielle des fractions d’intérêt ‐ Confirmation de l’activité anticoagulante des fractions contenant la protéine identifiée ‐ Analyse différentielle à partir de repas sanguin plus longs (J+7 et J+11) ‐ Analyse différentielle à partir d’autres souches de Borrelia Identification de marqueurs Vecteur Tique Ixodes OspC P66 BBK32 DbpA DbpB Pathogèn e Salp15 + extrait de GS Hôte peptides induits par l’infection homme/souris Borrelia → Objectif : Déterminer les peptides/protéines marqueurs de l’infection chez les trois acteurs Co‐localiser ces marqueurs par MS sur des tissus infectés : ‐ sur des extrait de biopsies par MRM ‐ directement sur des biopsies de peau par MALDI‐IMS (collaboration : Dr Philippe Bulet, Archamps) OspC Lipoprotéine de surface de la bactérie surexprimée dans les glandes salivaires OspA : dans intestin de tique se liant à TROSPA OspC : dans les GS de tique et à la surface de la peau interaction TLR/Pam3Cys → bon candidat pour la détection de Borrelia sur des prélèvements cutanés OspC Marqueurs PM 200 kDa OspC NL 0,1 µg Culot Culot souche B31 souche N40 10 µg 10µg → Identification de OspC 5000 66 kDa 24 kDa 20 kDa 1000 14,2 kDa 0 500 1500 2500 Analyse MALDI‐TOF MS des peptides générés par la digestion trypsique de OspC Digestion en milieu liquide : pas d’identification de OspC par MALDI‐MS dans les culots bactériens m/z Conclusion et perspectives Conclusion : Plusieurs peptides issus de la digestion de OspC sont de bons candidats pour une détection spécifique de cette protéine dans des échantillons complexes Perspectives : Mise au point de la détection de OspC par MRM Analyse d’extraits de prélèvements cutanés ‐ Mise au point de la détection des peptides dans ces prélèvements Mise au point de la détection de OspC sur des biopsies de peau par MALDI‐IMS Analyse de prélèvements cutanés Remerciements Institut pluridisciplinaire Hubert Curien ‐ Département des Sciences Analytiques Véronique Delval Laurence Sabatier Alain van Dorsselaer Groupe Borréliose de Lyme ‐ Institut de bactériologie ‐ Faculté de médecine Aurélie Kern Nathalie Boulanger Benoit Jaulhac
