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Biomatériaux à Base de
Fibres Protéiniques Naturelles
Isabelle Marcotte
Prof. Adjointe
Département de Chimie
Université du Québec à Montréal
1
Structure des protéines – acides aminés
● Les protéines sont des polymères d’acides aminés
R
NH3+
C
COO-
H
● La nature du groupe R sur la chaîne latérale marque la différence entre les
acides aminés
●
Apolaires, aromatiques, polaires, chargés (+) ou (-)
2
Structure des protéines – acides aminés
● 20 acides aminés naturels:
APOLAIRES ET ALIPHATIQUES
POLAIRES NON CHARGÉS
CHARGÉS POSITIVEMENT
CHARGÉS NÉGATIVEMENT
AROMATIQUES
http://trc.ucdavis.edu/biosci10v/bis10v/week2/2webimages/ch5-amino-acids.jpg
3
Acides aminés
● Nomenclature
Alanine
Ala
A
Arginine
Arg
R
Asparagine
Asn
N
Aspartate
Asp
D
Cystéine
Cys
C
Glutamine
Gln
Q
Glutamate
Glu
E
Glycine
Gly
G
Histidine
His
H
Isoleucine
Ile
I
Leucine
Leu
L
Lysine
Lys
K
Méthionine
Met
M
Phénylalanine
Phe
F
Proline
Pro
P
Sérine
Ser
S
Thréonine
Thr
T
Tryptophane
Trp
W
Tyrosine
Tyr
Y
Valine
Val
V
4
Structure des protéines
● Les protéines sont composées d’acides aminés reliés entre eux dans une
séquence donnée par des liaisons amides aussi appelées liens peptidiques
●
Voici la nomenclature des protéines:
● Les chaînes peptidiques ont un sens, donc deux extrémités différentes:
●
●
●
N-terminale avec groupe ammonium libre
C-terminale avec groupe carboxyle du dernier acide aminé
On donne la séquence d’une protéine en commençant par le C-terminal
Koolman & Röhm (2004)
5
Structure des protéines
● Le lien peptidique est stabilisé par mésomérie
●
Liaison plane
●
N’est possible qu’avec un apport d’énergie important
● La rotation autour du lien C-N n’est pas libre
● Les rotations ne sont possibles qu’autour des liaisons
●
simples
La rotation entre 2 plans peptidiques est décrite par
les angles dihèdres  et y
●
●
  rotation autour de N-Ca
y  rotation autour de Ca-C′
R
O
R
O

R
C
y C
Ca
N
Ca
H
N
H
Ca
H
H
H
● Le squelette (backbone) d’un polypeptide est constitué des atomes C′-N-Ca
●
●
●
C′ = carbonyle
Ca = carbone lié à l’azote et portant le groupe substituant
C = carbone du groupe R directement lié au Ca
Koolman & Röhm (2004)
6
Structure des protéines
● Pour des raisons stériques, seules certaines combinaisons d’angles dihèdres sont
possibles.
●
Diagramme de Ramachandran
● Relation entre les angles  et y
 = 0o
y = 180o
La distance entre les
carbonyle est trop petite
 = -139o
y = +135o
permis
 = -57o
y = -47o
interdit
 = 180o
y = 0o
Les groupements NH
entreraient en collision
a = Feuillet  antiparallèle ar = Hélice a droite
p = Feuillet  parallèle
al = Hélice a gauche
C = hélice de collagène
Koolman & Röhm (2004)
7
Structure des protéines
● Diagramme de Ramachandran
●
Montre que la plupart des combinaisons /y sont
interdites (rose).
● Ex.: combinaison  = 0o/y = 180o
● Ex.: combinaison  = 180o/y = 0o
●
Montre qu’il existe des espaces conformationnels où
on retrouve la plupart des structures secondaires des
peptides et protéines
● Ces zones (vertes) sont favorisées sur le plan stérique
●
●
Ex.: combinaison  = -139o/y = 135o  feuillet 
antiparallèle
●
Ex.: combinaison  = -57o/y = -47o  hélice a droite
Les conformations correspondant aux zones jaunes
sont possibles mais moins favorables sur le plan
énergétique
8
Structure des protéines
● Rappel: on distingue
●
Ex.: insuline
Structure primaire
● C’est la séquence en acides aminés
●
Structure primaire
Structure secondaire
● Domaine de la chaîne peptidique ayant
une conformation définie stabilisée par
des liaisons hydrogènes internes ou
externes (entre 2 chaînes peptidiques)
●
●
20
Hélices a, feuillets , etc.
Structure tertiaire
● Conformation 3D d’une protéine bâtie à
partir d’éléments de structure
secondaire et de fragments non
ordonnés
●
6
Structure secondaire
Structure tertiaire
Structure quaternaire
● Association de protéines par des
interactions non covalentes pour
constituer des complexes
Koolman & Röhm (2004)
9
Structure des protéines
● Structures secondaires les plus courantes:
●
Hélices, feuillets et coudes
Hélice a
Hélice de collagène
<
+130o < y < +155o
-80o <
 = -57oy = -47o
-50o
Antiparallèle
 = -139o
y = +135o
Parallèle
 = -119o
y = +113o
Coudes 
Type I
Type II
Koolman & Röhm (2004)
10
Quelques biofibres protéiniques structurales
●
●
●
Il existe plusieurs fibres protéiniques naturelles intéressantes
●
Actine, collagène, élastine, kératine, soies, etc.
Applications biologiques
●
Mobilité, échafaudage (scaffolding), stabilisation et protection
Caractéristiques structurales de quelques protéines:
Protein fibre
Secondary structure
Collagens
General primary sequence (Gly-X-Y)
X, Y = variable amino acid with Pro
and Hyp the most frequent
Collagen triple helix
Elastin
Val-Pro-Gly-Val-Gly
Cross-linked polymer
chains without
secondary structure
Mammalian akeratins
Ala-Glu-Gln-Phe-Arg-Asp-Gln
Mostly a-helices
Resilin
None
Cross-linked polymer
chains without regular
secondary structure
Bombyx mori
Gly-X with X = Ala, Ser, Thr, Val.
High occurrence of Gly-Ala-Gly-AlaGly-Ser repeats
Dominated by -sheet,
presence of a-helices
Spider dragline
silk spidroins
(Ala)n, Gly-Gly-X for spidroin I and
Gly-Pro-Gly-Gly-X/Gly-Pro-Gly-GlnGln for spidroin II where X =
variable amino acid
Ala-rich -sheet
crystallites and Gly-rich
31-helix domains.
cocoon silk
fibroin
Scheibel (2005)
Arnold & Marcotte (2009)
Most found repeats
11
Collagène
● Protéine la plus abondante chez les mammifères
●
●
●
Représente environ 25% de l’ensemble des protéines
Tissu connecteur de la peau et des os
Retrouvé dans le byssus de la moule
●
X, Y = acide aminé variable, Pro et Hyp surtout
●
3 chaînes de collagène enroulées pour former une triple
hélice de 1.4 nm de diamètre et 300 nm de longueur
Souvent agrégées en ballots semblables à des câbles
de plusieurs m de diamètre
Hyp
● Séquence primaire générale: (Gly-X-Y)
● Structure secondaire:
●
● In vitro, les molécules de collagènes purifiées s’auto-
●
assemblent spontanément pour former des fibres
identiques à celles générées in vivo
Peuvent former des gels rigides
Koolman & Röhm (2004), Scheibel (2005), Hart & Gehrke (2007)
12
Élastine
● Protéine retrouvée chez les vertébrés et les insectes
●
Les artères élastiques
● Aorte, artères pulmonaires
●
Les alvéoles pulmonaires
● Expansion/compression alvéolaire (respiration)
●
Le derme
● Rôle de soutien
● Propriétés semblables au caoutchouc qui donnent de l’élasticité aux tissus
● Protéine durable dont la demi-vie est de l’ordre de 70 ans
●
Plus d’un milliard de cycles étirement/relaxation pendant cette période
● Protéine non structurée
● Séquence la plus répétée: Val-Pro-Gly-Val-Gly
● Très réticulée entre les résidus Lys pour donner un réseau extensif de fibres et
de feuillets
Debelle & Tamburro (1999), Li & Daggett (2002), Scheibel (2005)
13
Kératine a
● Protéine retrouvée chez la plupart des animaux
● Fonctions
●
●
Stabilise les cellules épithéliales
Protéine-échafaudage des ongles, cheveux, plumes, sabots, laine, etc.
●
●
●
Composée d’hélices-a
2 hélices forment une superhélice gauche
Les superhélices s’assemblent en tétramères pour
former un proto-filament
8 proto-filaments s’assemblent pour former un
filament
● Séquence la plus répétée: Ala-Glu-Gln-Phe-Arg-Asp-Gln
● Structure:
●
● Les cheveux sont formés de plusieurs filaments pour
former un brin de 20 m de diamètre
Kaplan (1998) , Duer et al. (2003), Koolman & Röhm (2004), Scheibel (2005), Vasconcelos et al. (2008)
14
Fibroïne
● Compose la soie des cocons produits par les vers à soie tels que le
●
ver domestique Bombyx mori
Faite de 2 polypeptides liés par des ponts disulfures
●
Un de haute masse moléculaire (~390 kDa) et l’autre de faible masse
(~26 kDa)
● Structure secondaire
●
●
●
Dominée par les feuillets  qui forment des microcristaux dans la fibre
Présence d’hélices-a
Domaines cristallins de Gly-X où X = Ala, Ser, Thr, Val
10-25 m de diamètre
● La plus répété = GAGAGS
●
Régions « linkers » composées d’une 40 aine d’acides aminés
● Séquence de 25 acides aminés identiques incluant des résidus chargés
absents des régions cristallines
Soie native non lavée
● Cocon recouvert de séricines
●
Protéines (20-310 kDa) qui collent les deux polypeptides et maintiennent la structure
du cocon
● Fibroïne possède une grande résistance mécanique + résistance à la protéolyse
● Biocompatible une fois dégommée
Shao & Vollrath (2002), Huang et al. (2007), Vepari & Kaplan (2007)
15
Spidroïne
● L’araignée produit différents types de soie
●
Fil de trame, cocon, nid, pièges
● Le fil de trame de la soie d’araignée est composée de
spidroïnes I et II
●
●
Motifs répétés de poly-Ala (8-10 résidus)
Séquences riches en Gly dont le plus abondant est GGX
● (X = Gln, Ala, Tyr, Ser ou Leu)
● Spidroïne produite dans une glande dans l’abdomen de l’araignée
●
Pas de structure secondaire définie à l’état liquide
●
Domaines de poly-Ala majoritairement en feuillets-, incluant des
régions micro-cristallines
Domaines riches en Gly en hélices 31
Domaines sont orientés avec les chaînes principales parallèles à
l’axe de la fibre
1-4 m de diamètre
● Structure de la fibre:
●
●
●
Van Beek et al. (2002), Sponner et al. (2005), Marcotte et al. (2007)
16
Spidroïne
● Le fil de trame de l’araignée est une fibre naturelle de haute
performance qui combine élasticité et résistance
●
FIl de trame, N. edulis
Ténacité de la soie rapportée dès 1887 par le Dr Goodfellow
(Tombstone, Arizona)
● La soie d’araignée est plus résistante et élastique que celle du ver
à soie
● Applications potentielles:
●
Gilets pare-balles, cordes d’escalade, tendons artificiels, sutures nonallergènes
Nephila edulis
● Sa culture en masse présente encore un défi majeur
●
Essais de production de masse
● Par bactéries, baculovirus, chèvres, plants de tabac et pommes de terre
génétiquement modifiés
Goodfellow (1887), Colgin & Lewis (1995), Scheller et al. (2001), Scheibel (2005), Hakimi et al. (2007), Marcotte et al. (2007)
17
Propriétés mécaniques – définitions
● Quelques attributs fonctionnels des biomatériaux et propriétés mécaniques
Attribut fonctionnel
Définition
Propriété du
matériau
Unité
Extensibilité
Capacité d’un matériau à être étiré sans rupture
Élongation à la rupture,
max
Sans unités
Élasticité
Capacité de se déformer de façon réversible sans
perte d’énergie sous l’action d’une force
Résilience
%
Résistance - strength
Contrainte maximale qu'un matériau peut supporter
avant de se rompre.
Contrainte à la rupture,
max
N·m-2
Ténacité - toughness
Résistance à la fracture d’un matériau sous
contrainte. Quantité d’énergie par volume qu’un
matériau peut absorber avant de rompre
Énergie à la rupture
J·m-3
Rigidité - stiffness
Résistance d’un matériau élastique à la déformation
sous contrainte
Module d’élasticité, Einit
Contrainte - stress
Action (force) extérieure sur un matériau (traction,
compression, etc.)
Déformation- strain
Changement de dimension d’un matériau avant et lors
de l'application d'une contrainte
Gosline et al. (2002)
N·m-2
N·m-2
18
Propriétés mécaniques – biofibres protéiniques
● Graphique contrainte/déformation
●
●
Fil de trame et soie viscide sont les
plus résistantes*
Protéines caoutchouteuses (résiline et
élastine) au bas du graphique++
*
● Se déforment (s’étirent) sous une
contrainte faible
● Sous contrainte, une fibre ou un
●
matériau va éventuellement céder.
Ils vont se fracturer ou subir une
déformation permanente.
*
++
Bower (2002), Gosline et al. (2002)
19
Propriétés mécaniques – biofibres protéiniques
● Propriétés mécaniques extraites du graphique précédent
●
Le fil de trame de l’araignée est la fibre naturelle la plus tenace
● Plus performante que l’acier et le Kevlar
● Plus extensible et résistante que le collagène
●
La nature améliore les propriétés des fibres au moyen d’assemblages particuliers
● Byssus de la moule
Gosline et al. (2002)
20
Propriétés mécaniques – byssus
● Amélioration des propriétés mécaniques du collagène
●
●
Partie proximal plus élastique
Partie distale plus résistante
PreCol-D
PreCol-P
Histidine-rich
Histidine-rich
Elastin-like
50% Ala/Gly
Pro/ser abundant
Val/Phe (hydrophobic)
abundant
Silk fibroin
60% Ala/Gly
Longer Ala stretches
(10-14) than PreCol-P)
0% Pro
128 nm
P
Collagen
Collagen
34% Gly
20% (Pro-Hyp
acidic
acidic
Proline rich
Elastin-like
Silk fibroin
Histidine-rich
Histidine-rich
34% Gly
20% (Pro-Hyp
D
NG
Arnold (commun. person.), Coyne et al. (1997), Waite et al. (1998),
Holten-Andersen & Waite (2008)
21
Biomatériaux – définition
● Définition: Matériaux naturels ou synthétiques utilisés en contact avec des
systèmes biologiques
●
●
Applications médicales surtout
Autres utilisations: croissance cellulaire en culture, applications biotechnologiques
comme arrays pour diagnostic génétique, tests de protéines du sang, etc.
● Incluent matériaux synthétiques ou naturels modifiés
●
●
Métaux, céramiques, polymères, verres, carbones, matériaux composites, collagène,
etc.
Moulés, machinés, recouvrement (coatings), fibres, films, mousses, gels…
Ratner et al. (2004)
22
Biomatériaux – conception
● La conception des biomatériaux est intrinsèquement liée à leur application
●
●
Demande d’incorporer des informations physiques, chimiques et biologiques
Exemples:
● Pour guider les cellules dans des tissus fonctionnels via migration cellulaire, adhésion ou
différentiation
● Pour se dégrader à une vitesse équivalente à la formation et à la régénération de nouveaux
tissus fonctionnels
● Pour offrir un support mécanique approprié, à niveau avec le développement d’un tissu
fonctionnel
● On doit connaître les caractéristiques d’un matériau (propriétés de volume et de
surface) AVANT toute application médicale, et anticiper les changements qui se
●
produiront in vivo pendant son utilisation
Importance de la recherche sur les biomatériaux, de leur caractérisation
●
●
●
●
Propriétés mécaniques
Biocompatibilité
Biodégradabilité
Bioactivité
Ratner et al. (2004)
23
Biocompatibilité
● Défi important pour les applications biologiques
● Premières études de biocompatibilité remontent à 1829
●
Matériaux d’or, argent, plomb, platine implantés dans le chien
●
1949: on trouve que le téflon montre peu de réactions biologiques contrairement au
polyéthylène, nylon, Lucite et cellophane
● Celles sur les matériaux en plastique = années ’40
● 1949 = Première observation de la biocompatibilité telle que définie de nos jours
●
Implantation de lentilles intraoculaires en PMMA
● Sir Harold Ridley, M.D.
●
« Guérison stable sans irritation ou inflammation »
●
« Capacité d’un matériau à remplir une application spécifique avec une réponse
immune de l’hôte appropriée » (Williams, 1987)
● Définition:
●
●
●
●
Résistance à la formation de caillots de sang
Résistance à la colonisation bactérienne
Sans réponse immunogène
Guérison sans complications
Ratner et al. (2004)
24
Biodégradation
● Définition:
●
Détérioration d’un matériau par l’action d’un organisme vivant conduisant à des
changements de propriétés physiques
● Détérioration dépend de la structure chimique, de la morphologie et des dimensions d’un
matériau, de même que de son environnement biologique
● Bien que le corps offre un environnement de pH neutre, faible concentration de sel
et température relativement peu élevée, un matériau doit faire face aux
mécanismes qui ont évolué pour débarrasser un organisme vivant de substances
étrangères
●
●
●
Augmentation de la vitesse de corrosion de métaux par protéines adsorbées
Dégradation oxydative par des agents oxydants et enzymes secrétés par les cellules
Dégradation hydrolytique
● Réaction avec H2O catalysée par des acides, bases, sels ou enzymes
Ratner et al. (2004)
25
Biodégradation
● Échelle de temps:
●
De minutes à années
●
Peut être prévue après un temps déterminé après implantation
● Exploitable
● Contrôle de la biodégradation afin de restaurer la structure intégrale d’un tissu et sa fonction
● Le taux de dégradation doit correspondre au taux de croissance tissulaire
●
Les produits de dégradation peuvent être toxiques mais aussi conçus avec une action
spécifique
Importance de comprendre les mécanismes de dégradation, l’environnement
direct du biomatériau et ses propriétés physico-chimiques pour contrôler sa
biodégradation
Ratner et al. (2004)
26
Bioactivité
● Certains biomatériaux doivent jouer un rôle biologique
●
Promouvoir la migration, l’adhésion ou la différentiation de cellules, la croissance
cellulaire et la liaison aux tissus environnants
Human bone marrow cells growing on a
Spidrex® tissue scaffold.
http://www.orthox.co.uk/Technology
27
Biomatériaux – historique
●
Après la WWII, les céramiques, métaux et matériaux polymériques de haute performance
ont attiré l’attention des chirurgiens
●
●
●
●
Possibilité d’utiliser ces matériaux durables, nouveaux, inertes pour remplacer des parties du corps
malades ou endommagées
Ingénieurs et scientifiques collaborent avec les médecins
Protection des patients et réglementations gouvernementales minimales
●
●
Tests sur les animaux / exigence vs biomatériaux
Cette époque a permis d’établir les fondations des idées et matériaux pour le domaine des
biomatériaux
Les premiers biomatériaux:
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
Implants dentaires (1809 or – 1964 titane)
Lentilles intraoculaires (1949)
Valves vasculaires (1952)
Pacemaker (1959)
Valve cardiaque (1960)
Prothèse de hanche (1958-1961)
Prothèse de genou (1968-1972)
Rein articifiel
Cœur artificiel (1969)
Implants mammaires en silicone (début ’60)
Stents (fin 1980’s)
Ratner et coll. (2004) http://www.sjmprofessional.com/EN-US/ProductLibrary/Pages/Regent-Valve-HP-Series-Standard-Valve.aspx
http://dentalimplantbasics.net
28
Fibres naturelles et matériaux – pourquoi?
Une question de force et d’élasticité
● Les fibres naturelles offrent une gamme de propriétés mécaniques, de structures
chimiques et de fonctions biologiques pouvant être exploitées pour fabriquer de
nouveaux matériaux structuraux biotechnologiques
● Les fibres protéiniques naturelles sont généralement fortes et élastiques
Une question de ressemblance
● Les biopolymères sont très similaires et parfois identiques aux macromolécules
que l’environnement biologique est préparé à reconnaître et à gérer d’un point de
vue métabolique
●
●
Pourrait supprimer les problèmes de toxicité, d’inflammation et de reconnaissance
cellulaire souvent provoqués par les matériaux synthétiques
Introduit la possibilité de concevoir des biomatériaux qui fonctionnent biologiquement
au niveau moléculaire plutôt que macroscopique
Gosline et al. (2002), Marcotte et al. (2007)
29
Fibres naturelles et matériaux – pourquoi?
● Biodégradabilité par les enzymes naturellement présents, garantissant la
métabolisation de l’implant par des mécanismes physiologiques
●
●
Désavantage pour la durabilité d’un implant
Avantage pour un matériau devant remplir une fonction spécifique dans un temps donné
● On peut contrôler la durée de vie et la dégradation d’un biopolymère par réticulation ou autre
modification chimique
● Plusieurs applications possibles en tant que fibres naturelles ou modifiées
● Désavantages:
●
●
●
Souvent immunogènes
Se décomposent à haute température
● Problème potentiel de mise en œuvre du matériau
Variabilité naturelle (intraspécifique, interspécifique, d’un tissu à l’autre)
● Difficile de garantir des spécifications rigides pour le manufacturier
Gosline et al. (2002), Ratner (2004)
30
Assemblage de protéines in vitro – quelques méthodes
● Pour utiliser des fibres protéiniques dans la conception de biomatériaux, on doit
pouvoir les assembler dans des conditions contrôlées in vitro
● Auto-assemblage
●
●
●
Méthode la plus courante
Formation de fibres par polymérisation ou agrégation
Dépend de la structure moléculaire de la fibre, du pH, de la force ionique, de la
température
● Électrofilage (electrospinning)
●
●
●
Utilise un champ électrique pour filer des
fibres très fines (typiquement à l’échelle du
micro ou du nano) à partir d’un liquide
Réalisé avec soie, collagène, élastine,
fibrinogène
Fabrication de treillis pour membranes,
génie tissulaire, pansements
Scheibel (2005)
31
Assemblage de protéines in vitro – quelques méthodes
● Filage humide (wet spinning)
●
●
●
●
Technique qui mime le processus naturel de production de la fibre
Protéine surexprimée dans un organisme
● Soie d’araignée en bactéries ou baculovirus
La solution de protéine est pompée à travers une filière et extrudée dans un bain de
coagulation pour former une fibre
La fibre est tirée vers une solution de réticulation
●
●
●
●
●
L’élongation du fil stimule le développement de régions cristallines
La réticulation et la cristallinité modulent, entre autres, la résistance des fibres
La réticulation dépend des acides aminés présents dans la protéine et des conditions de filage
Demande que la protéine soit sous forme étendue en solution
Réticulation spontanée entre les chaînes
voisines de certains acides aminés
●
cystéine
● Agents de réticulation peuvent être employés
●
●
●
Photo-réticulation des Tyrosine interchaînes
par catalyse métallique
Transglutaminase pour créer liens entre lysine
et glutamate (laine)
Glutaraldéhyde entre lysine et tyrosine
Kim et al. (2005), Scheibel (2005), Poole et al. (2009)
32
Biomatériaux de fibroïne – introduction
●
La soie du ver à soie et de l’araignée ont des propriétés qui en font des fibres de choix pour
des applications non textiles
●
●
●
●
●
●
Stabilité environnementale
Biocompatibilité in vitro/in vivo
Biodégradabilité protéolytique contrôlée
Flexibilité morphologique
Possibilité de traitements en solvants aqueux ou organiques
Surface modifiable
● Adsorption
●
La surface hydrophobe des matériaux de soie attire ou repousse les protéines selon le PI et l’hydrophobicité de la
protéine, et le pH de la solution
–
Adsorption de BMP-2
● Chimiquement
●
●
●
Fibroïne peut être fonctionnalisée par réaction chimique avec les chaînes latérales des acides aminés
Chimie du carbodiimide qui utilise les groupes amine ou carboxyle
Limitée par le contenu en acides aminés modifiables
–
●
●
●
Ex.: Seuls 3.3% des acides aminés contiennent des groupes carboxyliques dans la chaîne latérale (Ex.: glutamate, aspartate)
Modification au RGD, au BMP-2
La sériciculture permet d’obtenir la fibre en grande quantité (400 000 tonnes/an)
La fibroïne peut être régénérée sous différentes formes:
●
Fibre, éponge, gel, film
Sofia et al. (2001), Karageorgiou et al. (2004), Vepari & Kaplan (2007)
33
Biomatériaux de fibroïne – applications
● La soie de ver à soie est utilisée depuis des
siècles pour les sutures
●
Tendons surtout
● Utilisée avec succès pour:
●
●
Pansement, génie tissulaire d’os, cartilages,
tendons et ligaments
On a également utilisé la fibroïne comme matrice
pour des applications biomédicales impliquant la
culture cellulaire, l’immobilisation d’enzymes, et des
gels pour dosage oral
Vepari & Kaplan (2007)
34
Biomatériaux de fibroïne – formes
● Silk III = soie assemblée à l’interface air/eau = structure en hélice
● Silk II = sous forme de fibre = structure en feuillet-
●
●
Structure qui exclut les molécules d’eau
Insoluble dans plusieurs solvants incluant des acides et bases faibles et des chaotropes
● Silk I = soie sous forme soluble = sans structure
●
●
In vitro en solution aqueuse
Se convertit en Silk II lorsqu’exposée à la chaleur ou en passant à l’état de fibre
(physical spinning), ou si exposée au MeOH ou au KCl
Vepari & Kaplan (2007)
35
Biomatériaux de fibroïne – mise en œuvre
●
●
Conception de matériaux de différentes morphologies à partir de formulations aqueuses ou
en solvants organiques des fibres naturelles de soie
On doit d’abord dissoudre les fibres en milieu aqueux avant de les transformer dans le
format souhaité
dégommage/purification/décreusage
moulinage
dissolution
autres
formes
solubilisation
partielle
Vepari & Kaplan (2007)
36
Biomatériaux de fibroïne – mise en œuvre
●
Autres morphologies obtenues à partir de fibroïne dissoute
tapis non tissés
films
éponges aqueuses ou
traitées au solvant
hydrogels
Vepari & Kaplan (2007)
37
Biomatériaux de fibroïne – tapis non tissés
● Deux types de tapis
●
●
Non homogènes
● Solubilisation partielle des fibres de soie dans l’acide formique avec un peu
de CaCl2
Homogènes
● Obtenues par électrofilage
● Fibres d’un diamètre de quelques nm à quelques m tout dépendant du
traitement
● Électrofilage possible avec PEO; donne des fibres plus solides
● Traitement au MeOH des tapis de soie
●
●
Pour augmenter le contenu en feuillets-
Changement de porosité dû à la déshydratation
●
●
●
Grand rapport surface/aire et rugosité propices à l’adhésion cellulaire
Prolifération cellulaire
Guident la formation de tissu connecteur vascularisé et réticulaire
● Intérêt:
● Ex.: ajout BMP-2 + hydroxyapatite pour promouvoir différentiation de hMSC
Vepari & Kaplan (2007)
38
Biomatériaux de fibroïne – films
● Préparation:
●
Films moulés à partir de solution aqueuse ou de solvants organiques
●
Par mélange à d’autres polymères
● Modification des propriétés mécaniques et de la biodégradabilité
● On a avantage à générer des microstructures dans les films pour augmenter leur rugosité
propice à l’adhésion cellulaire
●
●
●
●
●
Mélange avec PEO + traitement au MeOH pour augmenter la cristallinité
Contenu en PEO directement relié à la rugosité
Mélange avec cellulose augmente la résistance mécanique
Par traitement au MeOH
● Perméabilité des films de fibroïne pure à H2O et O2 dépend du contenu en Silk I et Silk II
Recouvrement sur polymères comme polyuréthane et polycarbonate
● Augmente la prolifération et l’adhésion de fibroblastes
● Applications exploitent le capacité à permettre l’adhésion cellulaire
●
●
Bandages
Formation de tissu osseux
● Modification au RGD / couplage au BMP-2
Vepari & Kaplan (2007)
39
Biomatériaux de fibroïne – hydrogels
●
●
●
Réseaux 3D de polymères qui gonflent en solution aqueuse sans s’y dissoudre
Formés de structures en feuillets-
Préparation:
●
●
À partir de solution aqueuse de fibroïne
La gélation est accélérée par:
●
●
●
●
●
●
Augmentation de la concentration en fibroïne
Augmentation de la température
Augmentation de la concentration en Ca+2
Diminution de pH
La température et la concentration en fibroïne permettent de contrôler la taille des pores
Propriétés modifiables par combinaison à d’autres polymères
● Silk–elastin-like protein polymers (SELPs)
●
●
●
Contenu en eau de l’hydrogel dépend uniquement du temps de gélation et de la concentration en biopolymère
Propriétés non affectées par le pH, la force ionique et la température
Applications:
●
●
●
Vectorisation de cellules et de cytokines
Promotion de la prolifération cellulaire
Dosage oral contrôlé de médicaments
● Dépend de la concentration en fibroïne
Kim et al. (2004), Vepari & Kaplan (2007)
40
Biomatériaux de fibroïne – éponges
● A.K.A. scaffolds, treillis tridimensionnels, échafaudages
● Applications en génie tissulaire pour:
●
●
●
200 m
Adhésion, prolifération et migration cellulaire
Transport de nutriments et de déchets
Remplacement d’os
● Nouvel os en 8 semaines
● Préparation:
-20oC, 250 mM NaCl
●
●
À partir de solution de fibroïne (aqueuse et solvants)
Au moyen de porogènes, par moussage ou lyophilisation
●
●
●
Porogènes = sel (ex.: NaCl) ou sucres
Peut fabriquer des gradients de pores en empilant des porogènes de tailles différentes
Solvant = hexafluroisopropanol (HFIP) qui ne solubilise pas le sel ou les sucres
● Éponges à base de solvant
● Ainsi, l’éponge reflète la taille des porogènes
● Peuvent aussi être préparées par addition d’une petite quantité de solvant (comme MeOH et
EtOH) avant le moulage et la congélation
Vepari & Kaplan (2007), Byette et al. (2009),
41
Biomatériaux de fibroïne – éponges
A) Empilement des
porogènes solubles
B) Ajout de la solution de
fibroïne dans un solvant
C) Diffusion de la solution
entre les interstices
D) Lavage à l’eau pour
dissoudre le porogène,
produisant des éponges
avec gradients de pores
Vepari & Kaplan (2007)
42
Biomatériaux de fibroïne – éponges
● Éponges à base d’eau
●
●
Préparées à partir de prorogènes et en variant la concentration en fibroïne
Porogènes = sels
● Solution supersaturée en sels
● Les sels donnent des tailles de pores de 500 – 940 mm
●
Porogènes insolubles
● Ajout de la solution de fibroïne sur les billes de paraffine, lyophilisation, immersion dans
MeOH, séchage à l’air
● Billes lavées avec hexane et éponges séchées sous vide
●
●
L’augmentation de la concentration en fibroïne améliore la résistance de l’éponge
Surface plus rugueuse que les éponges à base de solvant
● Explicable par solubilisation partielle du sel
● Meilleure adhésion cellulaire
●
●
Plus grande porosité et meilleure résistance mécanique
Meilleure dégradation enzymatique
Vepari & Kaplan (2007), Uebersax et al. (2008)
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Biomatériaux de fibroïne – propriétés non mécaniques
● Biodégradation
●
●
●
●
●
●
Les fibres de fibroïnes conservent plus de 50% de leurs propriétés mécaniques après 2
mois d’implantation in vivo
● Définie comme biomatériau non dégradable par l’United States Pharmacopeia
Se dégrade par l’action des protéases
La vitesse de biodégradation des biomatériaux de soie peut être reliée à leur traitement,
à leur contenu en feuillets- cristallins et aux conditions mécaniques et biologiques au
site d’implantation
Les films se biodégradent plus rapidement que les fibres de fibroïne
● Pour les films = perte de masse et augmentation de la cristallinité
Pour une taille de pores similaires, la biodégradation des éponges aqueuses est ralenti
avec l’augmentation de la concentration en fibroïne
Pour une taille de pores similaires, les éponges à base de solvant se dégradent plus
lentement que les éponges aqueuses
● 65% en masse après 21 jours contre dégradation complète en 4 jours pour les éponges
aqueuses
●
●
Attribuable à la rugosité et différences de cristallinité
On pourrait réguler la biodégradation des matériaux de soie en contrôlant:
● Structure (masse molaire, cristallinité) et morphologie (porosité, taille des pores, rugosité)
Vepari & Kaplan (2007)
44
Biomatériaux de fibroïne – propriétés non mécaniques
● Stérilisation
●
●
●
Caractéristique particulière aux biomatériaux de soie
Se fait par autoclavage sans changement de morphologie ou de cristallinité
Se fait au moyen d’oxyde d’éthylène, de radiation- ou avec 70% éthanol
Vepari & Kaplan (2007)
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Biomatériaux de fibroïne – dans l’avenir
● Fibres protéiniques naturelles comme source d’inspiration à la conception de
biomatériaux synthétiques
● Commercialisation des biomatériaux et implantation chez l’humain
●
●
●
Déjà: sutures, éponges
Remplacement osseux?
Réparation moelle épinière, nerfs, …
Nerve cells growing along fibres (purple) produced from a specially modified silk.
The supporting Schwann cells, whose nuclei are shown in blue, attach to the
fibres and support the growth of the nerve cells.
http://news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/5172422.stm
46
Bibliographie
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Articles:
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vol. 4, New York, Elsevier.
48
Annexe 1 – spider farming
49
Annexe 2 – sutures de fibroïne
● Suture de fibroïne
http://www.demetech.us/sil_suture.php
50
Annexe 3 – modification de la fibroïne
Covalent coupling versus adsorption of
proteins on silk surfaces.
(A) Modifiable amino acid side chains;
presence of amine, carboxyl and hydroxyl
groups.
(B) Carboxyl side groups activated by 1ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimide (EDC) for 10–15 min. A
protein like BMP-2 can be introduced via
amine groups reacting with the activated
silk to form amide bonds. Cyanuric
activated polyethylene glycol (PEG) reacts
with amine and hydroxyl groups on silk
fibroin surface.
(C) Coupling of PEG on silk fibroin
films generates a more hydrophilic surface
and reduced attachment of human
mesenchymal stem cells (hMSCs).
(D) Coupling BMP-2 to silk fibroin films via
carbodiimide coupling results in increased
calcium deposition (increased calcein
labeling) by differentiated hMSCs.
Vepari & Kaplan (2007)
51