TFG josepsalaradua
Ter
Terà
àpia
piaadenoviral
adenoviral enelc
enelcà
àncerdepròstata
ncerdepròstata
UAB
Treballdefinaldegrau2013
Grauenmicrobiologia
JosepSalaRaduà
1.INTRODUCCI
1.INTRODUCCIÓ
Ó:
:
Elcàncerdepròstataéseltumormalignemésfreqüentilasegonacausaprincipaldemortpercàncerenhomesensocietatsoccidentals1.Elsmillorstractamentsdisponiblescomportenlaregressió
deltumoraixí comlamilloradelssímptomesclínics.Arabé enl'actualitat,nohihacaptractamenteficaç disponiblepelscasosavançats2.Ésenelscasosavançatsonlateràpiagènicaamb adenovirus
brinda l’oportunitat d’obtenir una eina alternativa de lluita. A diferència de les teràpies tradicionals, aquesta pot ser dissenyada i adaptadautilitzant els coneixements de la malaltia a nivell
molecular,laqualcosaenspermetferuntractamentmésespecíficiefectiusobreaquestscàncers3.Adiad’avui lamajoriad’estudisd’aquestatemàticavanenfocatsacrearimodificarvectors
adenovirals,pertalqueaquestssiguinméseficientsal’horadereactivargensambefecteantitumoral1.Enelcasconcretdelcàncerdepròstata,elsesforçosvanenfocatssobretotenaconseguirla
reactivació delgenPTEN,lapresènciaoabsènciadelqualresultacrucialenlaprogressió d’aquestcàncer2.
2.L
2.L’
’OBJECTIUDEGENERARUNVECTOR
OBJECTIUDEGENERARUNVECTORADENOVIRAL
ADENOVIRAL,
,ONCOL
ONCOLÍ
ÍTIC
TIC,REPLICATIUI
,REPLICATIUI
ESPEC
ESPECÍ
ÍFICAMBEFECTEANTITUMORALENELC
FICAMBEFECTEANTITUMORALENELCÀ
ÀNCERDEPRÒSTATA
NCERDEPRÒSTATA
Peraconseguirunvectoradenoviral eficaç,estreballaenbaseunadenoviruswildtype
i sobre aquest es fan diverses modificacions per aconseguir un vector que compleixi
l’objectiu.Al’horadetreballarambadenovirus enteràpiagènicacontraelcàncer,es
vol que aquest tingui una replicació eficient amb un alt nivell d'expressió del gen
terapèutic4. A més, és absolutament necessari que la replicació del vector sigui
específicadelcànceratractar. Ésclauqueelvectorcompleixielsdosfactorsanteriors
per fer l’efecte desitjat. Hi ha una àmplia varietat d’opcions per tal d’aconseguirlos.
Arabé,enelsestudismésrecentsencàncerdepròstataessegueixenduesestratègies:
•Laprimeraestratègiaéseliminarunelementviralelqualésnecessariperalareplicació del
virus en cèllules normals. Un gen comunament deleccionat és el E1B55k. És prescindible en
cèllules canceroses degut a la compensació de mecanismes5. Sense E1B55k el virus no pot
replicarse entotesaquellescèllulesambp53normal,demaneraqueelvectoradenoviral només
espodrà replicarenlescèllulestumorals,lesqualstenenp53alterada.
•La segona estratègia consisteix en reemplaçar el promotor d'un gen clau en la replicació de
l’adenovirus per un promotor específic del tumor. Concretament es treballa amb el promotor
DD3altamentespecíficdelcàncerdepròstata,isotaelseucontrolté elgen E1A,queté funcions
com activar la transcripció vírica, i unirse a supressors de creixement cellular. Ara bé, estudis
recents han demostrat que l’expressió del gen E1A sota el promotor DD3 és insuficient. Per
resoldreaquesttipusdeproblemas’utilitzenelementsqueaugmentinl’expressió.Unrecentment
aplicat, i que fins ara mai s’havia utilitzat en teràpia amb adenovirus és WPRE (Woodchuck
HepatitisVirusPosttranscriptional Regulatory Element).
Solucionat l’aspecte de l’especificitat i replicació del vector, per últim falta inserir un gen amb
efecteterapèutic. Ungensupressordetumorsqueenelsúltimanysquehaaugmentatmoltíssim
el seu ús en viroteràpia contra el càncer de pròstata és el gen PTEN. Aquest s’insereix a la
construcció amb un promotor de citomegalovirus que en regula l’expressió. D’aquesta manera
s’obté unvectoradenoviral ambdobleregulació contraencàncerdepròstata(Fig.1).
3.RESULTATSM
3.RESULTATSMÉ
ÉSRELLEVANTS:
SRELLEVANTS:
5.CONCLUSIONS:
5.CONCLUSIONS:
9Laviroteràpia entermesgenerals,hapassatd’entelèquiaarealitat.
9Encara queda molta feina a fer pel que fa a la comprensió de molts mecanismes a nivell
moleculars.També endisminuirelsefectestòxicsquepottenirsobreelpacient, així comlamillora
demodelsperobtenirmillorsresultats.Isobretotpredirelsefectesallargtermini.
9Lesinvestigacionsactualsvanenlalíniademodificarelsvectorsd'origenadenoviral perreduirla
sevatoxicitatiimmunogenicitat, incrementar l'especificitat dels vectors,i controlar elsnivells i la
duradadel'expressió delsgensenlescèllulesdianauncoptransferits.
9Lamilloropció peral'avanç delateràpiagènicaadenoviral pelcàncerdepròstata,éslaposada
en marxa de protocols clínics on es combinin aspectes de teràpia prou contrastats a nivell
preclínic ambaltresmodalitatsdetractamentcontraelcàncer.
9Lateràpiagènicaadenoviral enelcàncerdepròstata,es pot trobarenlaconsecució dels seus
millorsèxits.
Construcci
Construcció
óadenoviral
adenoviral ambdobleregulaci
ambdobleregulació
óigen
igenPTEN
PTEN
Citotoxicitatespecíficaencàncerdepròstatainvitro
mitjançantl’assaigMTT:
Els resultats mostren una citotoxicitat específica per part del
vector adenoviral amb doble regulació presentat.
Addicionalment,s’observaquelainserció delgenPTEN provoca
l’efecteantitumoraldesitjat(Fig.2).
Inducció d’apoptosi encèllulesdecàncerdepròstatainvitro
mitjançant citometria deflux:
Respecte al vector presentat, els resultats indiquen que hi ha
inducció d’apoptosi.Amésescorroboradenouquelainserció
del gen PTEN fa l’efecte desitjat i l’especificitat del vector, al
nomésactuarenlíniacellulardecàncerdepròstata(Fig.3).
Supressió delcreixementtumoralinduintapoptosi invivo,enuna
líniacellulardecàncerdepròstatainjectadaenratolí:
S’observa que el creixement del tumor és nul després de
l’administració delvector adenoviral amb doble regulació i el gen
PTEN,inclúsesredueix (Fig.4A).AlhoraambqPCR esquantificael
contingutdevectorentumordurantelprocés(Fig.4B).
4.VISI
4.VISIÓ
ÓACTUALSOBREELTEMA
ACTUALSOBREELTEMA
•MoltsdelspromotorsutilitzatssóndetipusPSA.Aquests dependentsdeformaendògena
d’andrògens.Pertant al’horad’augmentarl’especificitat delvectorambpromotors,només
es pot plantejar utilitzarlos en càncers de pròstata androgen independents. Pelscàncers
andrògen dependents,menysgreus,encaranohihapromotorsespecíficseficaços.
•En estudis clínics s’aposta per intentar potenciar l’efecte mitjançant la combinació de
diferentsmètodes,jaqueelsnivellsdemortcellularquecausenelsvectorsadenovirals,no
sóncomparablesambelsd’altresestratègiescontraelcàncer.
•S’hadetectatquel’eficàciadel’adenovirus ambelgenPTEN,variasegonslalíniacellular
ques’utilitzi. Laraó noesconeix,peròescreuqueelvectorté unmajorefectecitotòxicen
cèllules on l’expressió de PTEN és negativa, que correspon amb els casos més greus de
càncerdepròstata.Seriaenaquestsonhihauriaunmajorpotencialterapèutic3.
•La replicació de l’adenovirus pateix una desacceleració, després de la injecció, però el
tumor no creix de forma significativa6. Això està en estudi, es postula que les cèllules
restantsdeltractamentquedeninhibides,totiquelataxadevirussiguimoltbaixa.
Caracterització delaconstrucció delvectoradenoviral ambdobleregulació presentat.(Modificatde 3).
Fig.1.
6.Referències:
1.Lu,Y.,Zhang,Y.,etal.(2013). Comparison ofprostatespecific promoters andthe use of PSPdriven virotherapy forprostate cancer.BioMed research international, 2013,624632. 2.Nicholson,TM.,Ricke, WA.,et al. (2011).Androgens and estrogens inbenign prostatic
hyperplasia:past,present and future.Differentiation 82:184–199. 3.Ding,M.,Cao,X.,etal.(2012). Prostate cancerspecific andpotentantitumor effect ofaDD3controlledoncolytic virusharboring the PTENgene.PloS one,7(4),e35153. 4.Flint,SJ.,et al. Principles of
virology:molecularbiology, pathogenesis,andcontrol.Washington:ASMPress,2000.828pags.ISBN1555811272.5.Zhang,ZL.,Zou,WG.,etal.(2003) An armed oncolytic adenovirussystem,ZD55gene,demonstrating potentantitumoralefficacy.CellRes13: 481–489.
6.Xu,HN.,Huang,WD.,etal.(2011).HCCS1armed,quadrupleregulated oncolytic adenovirusspecific forliver cancer asacancer targeting genevirotherapy strategy.Molecularcancer,10(1),133. 7.Chahal,JS.,Flint,SJ.,etal.(2012). Timely Synthesis ofthe Adenovirus
Type 5E1B55KilodaltonProtein IsRequired forEfficient Genome Replication inNormalHuman Cells,3064–3072.
Fig.4A.Resultats del’efecteantitumoraldelvector adenoviral ambdobleregulació, encontraposició almateix vectorsenseel genPTEN,en una línia cellular de càncerde
pròstatainseridaalratolí.Elvolumdeltumoresmesuraendiferentsdiesdesprésdelainfecció.Comacontrols’utilitzaelPBS.Fig.4B.ResultatsdelaqPCR (quantitativ e realtime
polymerase chain reaction).Esveulavariació dequantitatdeDNAdelvectoradenoviral dobleregulatambelgenPTEN,enlalíniacellulardecàncerdepròstatainseridaenratolí.
Esfandiferentsmesurescada3diesdesprésdelainfecció. Figura4Ai4B: Modificatde(1i3).
Fig.3.Resultatsdel’anàlisi ambcitometria deflux.Esveula citotoxicitatespecíficadelvectoradenoviral ambdobleregulació,encontraposició al
mateixvectorsenseelgenPTEN,enlíniescellularsdecàncerdepròstataicàncerdebufeta,48horesdesprésdelainfecció delsvectorsenleslínies
cellulars.Comacontrols’utilitzaelPBS.Figura3: Modificatde(3).
Fig.2.Resultatsdel’assaigMTT.Esveulacitotoxicitatespecíficadelvectoradenoviral ambdobleregulació,encontraposició almateixvectorsenseelgenPTEN,enlíniescellularsdecàncer
depròstataicàncerdebufeta.Comacontrols’utilitzaPBS (Phosphate Buffered Saline).Laviabilitatcellularesmesuracada24horesdesprésdelainfecció delsvectorsenleslíniescellulars.
Figura2: Modifi catde( 3i6).
Línia cellular decàncer depròstata Línia cellular decàncer debufeta
Línia cellular decàncer depròstata Línia cellular decàncer debufeta Línia cellular decàncer depròstata
injectada enratolí
Línia cellular decàncer depròstata
inseridaenratolí
AB
1
/
1
100%
![MicroRNAs (miRNAs) are tiny, regulatory ... length that post-transcriptionally modulate gene expression [1–3]. They regulate genes... Int. J. Mol. Sci. 13415](http://s1.studylibfr.com/store/data/008933426_1-7a72e817976c53cf5bf9125e885b7920-300x300.png)
