TFG josepsalaradua

Teràpiaadenoviral enelcàncerdepròstata
UAB
Treballdefinaldegrau2013
Grauenmicrobiologia
JosepSalaRaduà
1.INTRODUCCIÓ
1.INTRODUCCIÓ:
Elcàncerdepròstataéseltumormalignemésfreqüentilasegonacausaprincipaldemortpercàncerenhomesensocietatsoccidentals1.Elsmillorstractamentsdisponiblescomportenlaregressió
deltumoraixí comlamilloradelssímptomesclínics.Arabé enl'actualitat,nohihacaptractamenteficaç disponiblepelscasosavançats2.Ésenelscasosavançatsonlateràpiagènicaamb adenovirus
brinda l’oportunitat d’obtenir una eina alternativa de lluita. A diferència de les teràpies tradicionals, aquesta pot ser dissenyada i adaptada utilitzant els coneixements de la malaltia a nivell
molecular,laqualcosaenspermetferuntractamentmésespecíficiefectiusobreaquestscàncers3.Adiad’avui lamajoriad’estudisd’aquestatemàticavanenfocatsacrearimodificarvectors
adenovirals,pertalqueaquestssiguinméseficientsal’horadereactivargensambefecteantitumoral1. Enelcasconcretdelcàncerdepròstata,elsesforçosvanenfocatssobretotenaconseguirla
reactivació delgenPTEN,lapresènciaoabsènciadelqualresultacrucialenlaprogressió d’aquestcàncer2.
2.L’
,ONCOL
ONCOLÍÍTIC,REPLICATIUI
2.L’OBJECTIUDEGENERARUNVECTORADENOVIRAL
OBJECTIUDEGENERARUNVECTORADENOVIRAL,
TIC,REPLICATIUI
• La primera estratègia és eliminar un element viral el qual és necessari per a la replicació del
ESPECÍ
ESPECÍFICAMBEFECTEANTITUMORALENELCÀ
FICAMBEFECTEANTITUMORALENELCÀNCERDEPRÒSTATA
virus en cèllules normals. Un gen comunament deleccionat és el E1B55k. És prescindible en
Peraconseguirunvectoradenoviral eficaç,estreballaenbaseunadenoviruswildtype
cèllules canceroses degut a la compensació de mecanismes5. Sense E1B55k el virus no pot
i sobre aquest es fan diverses modificacions per aconseguir un vector que compleixi
replicarse entotesaquellescèllulesambp53normal,demaneraqueelvectoradenoviral només
l’objectiu.Al’horadetreballarambadenovirus enteràpiagènicacontraelcàncer,es
espodrà replicarenlescèllulestumorals,lesqualstenenp53alterada.
vol que aquest tingui una replicació eficient amb un alt nivell d'expressió del gen
terapèutic4. A més, és absolutament necessari que la replicació del vector sigui
específicadelcànceratractar. Ésclauqueelvectorcompleixielsdosfactorsanteriors
per fer l’efecte desitjat. Hi ha una àmplia varietat d’opcions per tal d’aconseguirlos.
Arabé,enelsestudismésrecentsencàncerdepròstataessegueixenduesestratègies:
• La segona estratègia consisteix en reemplaçar el promotor d'un gen clau en la replicació de
l’adenovirus per un promotor específic del tumor. Concretament es treballa amb el promotor
DD3altamentespecíficdelcàncerdepròstata,isotaelseucontrolté elgen E1A,queté funcions
com activar la transcripció vírica, i unirse a supressors de creixement cellular. Ara bé, estudis
recents han demostrat que l’expressió del gen E1A sota el promotor DD3 és insuficient. Per
resoldreaquesttipusdeproblemas’utilitzenelementsqueaugmentinl’expressió.Unrecentment
Construcció
Construcció adenoviral ambdobleregulació
ambdobleregulació igenPTEN
igenPTEN
aplicat, i que fins ara mai s’havia utilitzat en teràpia amb adenovirus és WPRE (Woodchuck
Fig.1.
HepatitisVirusPosttranscriptional Regulatory Element).
Solucionat l’aspecte de l’especificitat i replicació del vector, per últim falta inserir un gen amb
efecteterapèutic. Ungensupressordetumorsqueenelsúltimanysquehaaugmentatmoltíssim
el seu ús en viroteràpia contra el càncer de pròstata és el gen PTEN. Aquest s’insereix a la
construcció amb un promotor de citomegalovirus que en regula l’expressió. D’aquesta manera
s’obté unvectoradenoviral ambdobleregulació contraencàncerdepròstata(Fig.1).
Caracterització delaconstrucció delvectoradenoviral ambdobleregulació presentat.(Modificatde 3).
3.RESULTATSMÉ
3.RESULTATSMÉSRELLEVANTS:
Citotoxicitatespecíficaencàncerdepròstatainvitro
Inducció d’apoptosi encèllulesdecàncerdepròstatainvitro Supressió delcreixementtumoralinduintapoptosi invivo,enuna
mitjançantl’assaigMTT:
mitjançant citometria deflux:
líniacellulardecàncerdepròstatainjectadaenratolí:
Els resultats mostren una citotoxicitat específica per part del Respecte al vector presentat, els resultats indiquen que hi ha S’observa que el creixement del tumor és nul després de
vector
adenoviral
amb
doble
regulació
presentat. inducció d’apoptosi.Amésescorroboradenouquelainserció l’administració del vector adenoviral amb doble regulació i el gen
Addicionalment,s’observaquelainserció delgenPTEN provoca del gen PTEN fa l’efecte desitjat i l’especificitat del vector, al PTEN,inclúsesredueix (Fig.4A).AlhoraambqPCR esquantificael
l’efecteantitumoraldesitjat(Fig.2).
Línia cellular decàncer depròstata
nomésactuarenlíniacellulardecàncerdepròstata(Fig.3).
contingutdevectorentumordurantelprocés(Fig.4B).
Línia cellular decàncer debufeta
Línia cellular decàncer depròstata
Fig.2.Resultatsdel’assaigMTT.Esveulacitotoxicitatespecíficadelvectoradenoviral ambdobleregulació,encontraposició almateixvectorsenseelgenPTEN,enlíniescellularsdecàncer
depròstataicàncerdebufeta.Comacontrols’utilitzaPBS (Phosphate Buffered Saline).Laviabilitatcellularesmesuracada24horesdesprésdelainfecció delsvectorsenleslíniescellulars.
Figura2: Modificatde(3i6).
Línia cellular decàncer debufeta
Fig.3.Resultatsdel’anàlisiambcitometria deflux.Esveulacitotoxicitatespecíficadelvectoradenoviral ambdobleregulació,encontraposició al
mateixvectorsenseelgenPTEN,enlíniescellularsdecàncerdepròstataicàncerdebufeta,48horesdesprésdelainfecció delsvectorsenleslínies
cellulars.Comacontrols’utilitzaelPBS.Figura3: Modificatde(3).
4.VISIÓ
4.VISIÓ ACTUALSOBREELTEMA
A
Línia cellular decàncer depròstata
injectada enratolí
B
Línia cellular decàncer depròstata
inseridaenratolí
Fig. 4A. Resultatsde l’efecteantitumoraldel vector adenoviral ambdoble regulació,encontraposició al mateix vector senseel gen PTEN, en una líniacellular decàncerde
pròstatainseridaalratolí.Elvolumdeltumoresmesuraendiferentsdiesdesprésdelainfecció.Comacontrols’utilitzaelPBS.Fig.4B.ResultatsdelaqPCR (quantitative realtime
polymerase chain reaction).Esveulavariació dequantitatdeDNAdelvectoradenoviral dobleregulatambelgenPTEN,enlalíniacellulardecàncerdepròstatainseridaenratolí.
Esfandiferentsmesurescada3diesdesprésdelainfecció. Figura4Ai4B: Modificatde(1i3).
5.CONCLUSIONS:
• MoltsdelspromotorsutilitzatssóndetipusPSA.Aquests dependentsdeformaendògena
9 Laviroteràpia entermesgenerals,hapassatd’entelèquiaarealitat.
d’andrògens.Pertant al’horad’augmentarl’especificitat delvectorambpromotors,només
9 Encara queda molta feina a fer pel que fa a la comprensió de molts mecanismes a nivell
es pot plantejar utilitzarlos en càncers de pròstata androgen independents. Pels càncers
moleculars.També endisminuirelsefectestòxicsquepottenirsobreelpacient, així comlamillora
andrògen dependents,menysgreus,encaranohihapromotorsespecíficseficaços.
demodelsperobtenirmillorsresultats.Isobretotpredirelsefectesallargtermini.
• En estudis clínics s’aposta per intentar potenciar l’efecte mitjançant la combinació de
9 Lesinvestigacionsactualsvanenlalíniademodificarelsvectorsd'origenadenoviral perreduirla
diferentsmètodes,jaqueelsnivellsdemortcellularquecausenelsvectorsadenovirals,no
seva toxicitat i immunogenicitat, incrementar l'especificitat dels vectors, i controlar els nivells i la
sóncomparablesambelsd’altresestratègiescontraelcàncer.
duradadel'expressió delsgensenlescèllulesdianauncoptransferits.
• S’hadetectatquel’eficàciadel’adenovirus ambelgenPTEN,variasegonslalíniacellular
9 Lamilloropció peral'avanç delateràpiagènicaadenoviral pelcàncerdepròstata,éslaposada
ques’utilitzi. Laraó noesconeix,peròescreuqueelvectorté unmajorefectecitotòxicen
en marxa de protocols clínics on es combinin aspectes de teràpia prou contrastats a nivell
cèllules on l’expressió de PTEN és negativa, que correspon amb els casos més greus de
preclínic ambaltresmodalitatsdetractamentcontraelcàncer.
càncerdepròstata.Seriaenaquestsonhihauriaunmajorpotencialterapèutic3.
9 La teràpia gènica adenoviral en el càncer de pròstata, es pot trobar en la consecució dels seus
• La replicació de l’adenovirus pateix una desacceleració, després de la injecció, però el
millorsèxits.
tumor no creix de forma significativa6. Això està en estudi, es postula que les cèllules
restantsdeltractamentquedeninhibides,totiquelataxadevirussiguimoltbaixa.
6.Referències:
1.Lu,Y.,Zhang,Y.,etal.(2013). Comparison ofprostatespecific promoters andthe use ofPSPdriven virotherapy forprostate cancer.BioMed research international,2013,624632. 2.Nicholson,TM.,Ricke, WA., etal. (2011).Androgens and estrogens in benign prostatic
4.Flint,SJ.,etal. Principles of
hyperplasia:past,present and future.Differentiation 82:184–199. 3.Ding,M.,Cao,X.,etal.(2012). Prostate cancerspecific andpotentantitumor effect ofaDD3controlledoncolytic virusharboring the PTENgene.PloS one,7(4),e35153.
virology:molecularbiology, pathogenesis,andcontrol.Washington:ASMPress,2000.828pags.ISBN1555811272.5.Zhang,ZL.,Zou,WG.,etal.(2003) An armed oncolytic adenovirussystem,ZD55gene,demonstrating potentantitumoralefficacy.CellRes13:481–489.
6.Xu,HN.,Huang,WD.,etal.(2011).HCCS1armed,quadrupleregulated oncolytic adenovirusspecific forliver cancer asacancer targeting genevirotherapy strategy.Molecularcancer,10(1),133. 7.Chahal,JS.,Flint,SJ.,etal.(2012). Timely Synthesis ofthe Adenovirus
Type 5E1B55KilodaltonProtein IsRequired forEfficient Genome Replication inNormalHuman Cells,3064–3072.