ahr1de1

Tesi doctoral
Anàlisi de l’expressió i dels mecanismes
d’acció del receptor d’estrògens beta
en el càncer de pròstata
Antoni Hurtado Rodríguez

1
ÍNDEX
ABREVIATURES.......................................................................................................7
ÍNDEX DE FIGURES..................................................................................................8
ÍNDEX DE TAULES...................................................................................................10.
1. INTRODUCCIÓ.....................................................................................................11
1.1. LA PRÒSTATA HUMANA...........................................................................13
1.1.1. Estructura anatòmica i desenvolupament embrionari...........................13
1.1.2. Histologia..............................................................................................15
1.1.3. Funció....................................................................................................16
1.2. PATOLOGIA PROSTÀTICA.........................................................................16
1.2.1. Hiperplàsia Benigna de Pròstata...........................................................16
1.2.2. Lesions precursores del carcinoma de pròstata.....................................17
1.2.3. Càncer de pròstata hormono-dependent................................................18
1.2.4. Càncer de pròstata hormono-independent.............................................19
1.2.5. Estadi clínic del carcinoma de pròstata.................................................20
1.2.6. Grau histològic del carcinoma de pròstata............................................21
1.3. ESTRÒGENS I LA GLÀNDULA PROSTÀTICA........................................21
1.4. EL GEN D’ER?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????
1.4.1. Estructura gènica...................................................................................23
1.4.2. Isoformes d’ER??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????
1.4.2.1. Splicing alternatiu de l’últim exó codificant.................................25
1.4.2.2. Skipping d’exons...........................................................................25
1.4.2.3. ER?503..........................................................................................26
1.4.2.4. Exons alternatius 5'UTR................................................................27
1.4.2.5. Mutacions puntuals d’ER???????????????????????????????????????????????????????????????
1.5. METILACIÓ DEL GEN D’ER????????????????????????????????????????????????????????????????????????

2
1.6. ESTRUCTURA PROTEICA D’ER................................................................29
1.6.1. La regió A/B..........................................................................................30
1.6.2. La regió C..............................................................................................31
1.6.3. La regió D..............................................................................................32
1.6.4. Les regions E i F....................................................................................32
1.7. INTERACCIÓ D’ER AL DNA.......................................................................35
1.8. PROTEÏNES CORREGULADORES D’ER????????????????????????????????????????????????????
1.8.1 Coactivadors...........................................................................................37
1.8.2. Corepressors...........................................................................................39
1.9. ACTIVACIÓ LLIGAND DEPENENT...........................................................39
1.10. ACTIVACIÓ LLIGAND INDEPENDENT..................................................41
1.11. EXPRESSIÓ I FUNCIÓ DELS RECEPTORS D’ESTRÒGENS A
LA PRÒSTATA HUMANA.................................................................................42
1.11.1. Expressió en els períodes del desenvolupament i la pròstata adulta...42
1.11.2. Expressió en càncer de pròstata..........................................................43
1.11.3. Fenotip de la pròstata pels ratolins knockout dels
receptors d’estrògens......................................................................................44
1.12. EL CICLE CEL·LULAR..............................................................................44
1.12.1. Regulació de la progressió del cicle pels complexes ciclina/CDK.....45
1.12.2. Sistemes de vigilància o de checkpoint...............................................48
1.12.3. El cicle cel·lular i càncer.....................................................................48
1.12.4. Estrògens i cicle cel·lular....................................................................50
2. OBJECTIUS.............................................................................................................51
3. MATERIAL I MÈTODES.......................................................................................55
3.1. MATERIAL....................................................................................................57
3.1.1. Mostres de pròstata humana..................................................................57
3.1.2. Línies cel·lulars.....................................................................................57

3
3.1.3. Conservació i manteniment de les línies cel·lulars................................58
3.2. MÈTODES......................................................................................................58
3.2.1. Cultius bacterians..................................................................................59
3.2.1.1. Creixement i conservació dels cultius bacterians..........................59
3.2.1.2. Obtenció de bactèries competents.................................................59
3.2.1.3. Transformació bacteriana per xoc tèrmic......................................59
3.2.1.4. Expressió i purificació de proteïnes recombinants en bactèria......60
3.2.2. Mètodes d’anàlisi del DNA...................................................................60
3.2.2.1. Purificació del DNA plasmídic.....................................................60
3.2.2.2. Digestió del DNA plasmídic amb enzims de restricció................61
3.2.2.3. Aïllament de fragments de DNA en gel d’agarosa.......................61
3.2.2.4. Lligació de productes de PCR......................................................62
3.2.2.5. Lligació de fragments de DNA digerits........................................62
3.2.2.6. Construcció de vectors..................................................................63
3.2.3. Mètodes d’anàlisi amb el RNA.............................................................63
3.2.3.1. Extracció de RNA.........................................................................64
3.2.3.2. Expressió gènica per RT-PCR semicuantitativa...........................64
3.2.3.3. Anàlisi de seqüències....................................................................65
3.2.4. Mètodes d’anàlisi de le proteïnes..........................................................66
3.2.4.1. Extracció de proteïna.....................................................................66
3.2.4.2. Western blot..................................................................................67
3.2.4.3. Inmunohistoquímica en seccions de teixit en parafina..................68
3.2.4.4. Immunofluorescència en línies cel·lulars.......................................69
3.2.4.5. Disseny i obtenció d’un anticòs de la isoforma d’ER?2...............70
3.2.4.6. Síntesi de la proteïna recombinant GST-ER?2.............................70
3.2.5. Mètodes de les línies cel·lulars..............................................................71
3.2.5.1. Transfecció transitòria...................................................................71

4
3.2.5.2. Disseny i transfecció transitòria amb oligonucleòtids antisentit...72
3.2.5.3. Anàlisi per citometria de flux i separació cel·lular........................72
3.2.5.4. Sincronització de la línia cel·lular LNCaP....................................73
3.2.5.5. Fraccionament subcel·lular............................................................73
3.2.5.6. Transfecció transitòria i determinació de l’activitat luciferasa.....74
3.2.5.7. Lectura de l’activitat luciferasa.....................................................75
3.2.5.8. Cicle cel·lular amb Hoescht 33342, sorter i determinació
de l’activitat luciferasa.................................................................76
3.2.5.9. Detecció de la incorporació de BrdU en cèl·lules
LNCaP transfectades transitòriament amb ER?1
per microscopia confocal..............................................................76
3.2.5.10. Detecció de la incorporació de BrdU en cèl·lules
LNCaP transfectades transitòriament amb ER?1 per
citometria de flux........................................................................77
3.2.5.11. Assaig de co-inmunoprecipitació................................................78
3.2.6. Anàlisi estadístic...................................................................................78
4. RESULTATS...........................................................................................................81
4.1. EXPRESSIÓ I LOCALITZACIÓ DELS RECEPTORS NUCLEARS
EN TEIXIT I EN LÍNIES DE PRÒSTATA HUMANA................................83
4.1.1. Expressió del missatger de les isoformes d’ER?? en teixit i en
línies cel·lulars de pròstata humana......................................................83
4.1.1.1. Expressió del missatger de la isoforma d’ER???????????????????????????????
4.1.1.2. Expressió del missatger de la isoforma d’ER?????????????????????????????
4.1.1.3. Expressió de la isoforma d’ER?503 humana...............................84
4.1.2. Expressió i localització de la proteïna d’ER?1 en teixit i en
línies cel·lulars de pròstata humana.....................................................88
4.1.2.1. Expressió de la proteïna d’ER?1 per western blot......................88
4.1.2.2. Determinació de l’especificitat de l’anticòs PA1-313 i de la