Web 8 Fiche 8

Web 8 Fiche 8.1
LES MULTIPLES RÔLES DE DNAA
L. Paolozzi
De nombreuses études montrent que la protéine DnaA intervient dans d’autres fonctions que
celle, bien documentée, d’initiateur de la réplication. En effet, cette protéine participe aussi à la
régulation de la division cellulaire, et la régulation de l’expression de son propre gène ainsi que
de nombreux autres gènes. Enfin, un certain nombre de données, en particulier son homologie
fonctionnelle avec le complexe ORC (Origin of Replication Complex) des eucaryotes, soulève
la question d’un possible rôle de DnaA dans l’organisation et la ségrégation du chromosome.
UN RÉGULATEUR DU CYCLE CELLULAIRE
Chez les Bactéries, la réplication et la division cellulaire sont des fonctions interdépendantes
intimement liées (Chap. 5 ; 8). Il a été établi depuis longtemps qu’un blocage de la réplication,
par exemple celui produit par un dommage de l’ADN, conduit à un arrêt de la division, lequel
dure jusqu’à ce que la réplication puisse reprendre son cours. Un rôle direct de DnaA dans la
division a commencé à émerger depuis quelques années. Chez B. subtilis, la synthèse de la
protéine de division FtsL est régulée au niveau transcriptionnel par DnaA. FtsL, une protéine
très instable, est la cible de protéases qui en réduisent la quantité dans la cellule. La transcription
du gène ftsL est réprimée suite à un blocage de la réplication. L’analyse de la séquence du
promoteur de ce gène a mis en évidence la présence de sites de liaison à DnaA, très conservés.
Cette forme de régulation de l’expression d’un gène de division par une protéine qui contrôle
l’initiation de la réplication permet de coordonner ces deux fonctions importantes du cycle
cellulaire, et assure en outre une protection de la cellule contre une ségrégation aberrante de
génomes non répliqués ou non entièrement répliqués. Un autre exemple de participation de
DnaA dans la régulation du cycle cellulaire est celui de l’activation de la transcription de ftsZ
chez Caulobacter crescentus. Chez cette bactérie, les protéines FtsZ sont dégradées au terme de
1
chaque cycle, et de nouvelles molécules doivent être synthétisées pour permettre un nouveau
cycle. Des sites de liaison à DnaA ont été trouvés au niveau du promoteur du gène ftsZ.
RÉGULATION DE L’EXPRESSION GÉNIQUE
L’expression de nombreux gènes impliqués dans une vaste gamme d'activités est régulée par
DnaA. En font partie les gènes de synthèse de nucléotides, des enzymes de biosynthèse des
glucides, de l'homéostasie du fer, de la synthèse d'acides aminés et des ribosomes. Un exemple
intéressant est celui de l’opéron nrd, dont la régulation par DnaA a été observée chez E. coli, C.
crescentus et B. subtilis. Ce processus assure la disponibilité en substrats nécessaires pour la
réplication du chromosome.
Chez E. coli, l’opéron nrdAB est impliqué dans la synthèse de la ribonucléotide-diphosphateréductase, enzyme qui catalyse l’étape finale de la synthèse des désoxyribonucléotides, la
réduction de ribonucléotides en désoxyribonucléotides. Plusieurs données suggèrent que DnaA
et la protéine FIS régulent d’une façon précise l’opéron nrd. La liaison de ces deux protéines au
promoteur en augmente l’expression, ce qui permet de coordonner le taux de synthèse des
désoxyribonucléotides au taux de polymérisation de l'ADN. La synthèse de l’ARNm nrdAB est
couplée à l’initiation de la réplication. Elle augmente lorsque la synthèse de l'ADN est inhibée.
Une augmentation du niveau de ribonucléotide-diphosphate réductase est observée au cours de
conditions de croissance dans lesquelles le rapport ADN/masse cellulaire diminue.
Chez B. subtilis des sites potentiels de liaison de DnaA ont été repérés dans plus de 20
opérons, représentant un nombre total d’au moins 50 gènes. Le rôle précis de DnaA dans la
régulation de ces opérons et son mécanisme d’action sont inconnus. Chez C. crescentus, DnaA,
en plus de son rôle de coordinateur de l’initiation de la réplication, est un régulateur global de la
transcription. La protéine joue un rôle primordial dans la transcription du régulateur GcrA, qui
agit à son tour en cascade sur CtrA, le régulateur de transcription global du cycle cellulaire
(Chap. 15). Le nombre de gènes contrôlés directement ou indirectement au cours du cycle
cellulaire par CtrA a été estimé à 25 % du génome de C. crescentus, soit 553 gènes, dont 95
directement. Des sites de fixation de DnaA sont présents dans beaucoup de ces gènes, et
l’absence de DnaA conduit à un blocage de l’activité de CtrA.
AUTORÉGULATION DE LA SYNTHÈSE DE DNAA
La transcription du gène dnaA chez E. coli est régulée à partir de deux promoteurs, dnaAP1 et
dnaAP2. La région comprise entre ces deux promoteurs contient plusieurs sites de liaison à la
protéine DnaA. Il a été montré que cette région joue un important rôle d’autorégulation du
niveau d’expression du gène dnaA. On savait depuis longtemps que la transcription de dnaA
était autorégulée négativement ; plus récemment il a été montré que ce gène est aussi autorégulé
positivement. Le niveau d’expression de dnaA en fonction de la température est assez
complexe : une diminution de la température fait perdre l’autorégulation au niveau de dnaAP1,
tandis que les contrôles exercés au niveau de dnaP2, positif et négatif, sont conservés. Cette
régulation pourrait intervenir dans l’adaptation de la bactérie aux variations de température.
2
QUESTIONS OUVERTES SUR L’ACTIVITÉ DE DNAA
Un certain nombre de questions restent ouvertes dans la compréhension du/des mécanisme(s)
d’action de la protéine DnaA. L'une d'elles (pour nous limiter aux rôles de la protéine exposés
ici) concerne le processus de régulation, positive ou/et négative, de la transcription de nombreux
gènes. L’analyse des séquences des promoteurs concernés n’a pas fourni d'éléments permettant
d’élaborer un schéma unitaire. Ainsi ces promoteurs diffèrent par le nombre de sites de liaison à
la protéine DnaA (de quelques-uns à plus de 10), la localisation de ces séquences (en amont ou
en aval du promoteur), ainsi que leur orientation par rapport à la direction de la transcription.
Dans quelques cas individuels, il a été proposé un mécanisme d’occlusion du promoteur, la
liaison au promoteur de molécules de DnaA empêchant l’ARN polymérase de reconnaître ce
dernier. Mais aucun modèle ne permet actuellement d'expliquer la totalité des mécanismes
d’action de DnaA dans la régulation de la transcription.
Un certain nombre de travaux basés sur des données de génomique suggèrent que la protéine
DnaA pourrait aussi réguler des gènes impliqués dans la recombinaison, la réparation, la
sécrétion de protéines, ainsi que la production d’antibiotiques. Des données expérimentales
consolidant ces hypothèses seront importantes.
Une autre question importante est liée à l’idée que la protéine DnaA pourrait participer à
l’organisation du nucléoïde et à sa ségrégation. Cette idée naît de la comparaison des activités
de DnaA avec celles des protéines eucaryotes ORC, les homologues fonctionnels des protéines
initiatrices de la réplication des procaryotes. Tout comme DnaA, les protéines ORC lient l’ATP,
et contiennent un motif AAA (Chap. 8). Des études structurales et fonctionnelles indiquent que
la liaison de l’ATP à ces deux familles de protéines induit un changement de conformation qui
les active au moment de l’initiation de la réplication. Chez les eucaryotes des rôles des protéines
ORC additionnels à ceux strictement liés à la réplication ont été découverts. Ces protéines
interviennent en effet dans la régulation de l’expression génique, dans la cytokinèse, mais aussi
dans la ségrégation des chromosomes. Des mutations des protéines ORC chez S. cerevisiae et
Drosophila affectent la ségrégation des chromosomes, indépendamment de l’initiation de la
réplication. Par analogie l’idée que DnaA puisse avoir un rôle dans l’organisation et la
ségrégation du nucléoïde a ainsi été soulevée. Des données expérimentales en faveur de cette
hypothèse manquent pour l’instant.
3
Web 8 Fiche 8.2
COORDINATION DE LA SYNTHÈSE DES DEUX BRINS
DE L’ADN
: UN PROBLÈME ENCORE ACTUEL
L. PAOLOZZI
Une coordination de la synthèse des deux brins d’ADN a été mise en évidence in vitro en 1998
par C.C. Richardson et collaborateurs. Ces auteurs ont construit une molécule d’ADN circulaire
bicaténaire de 70 pb comprenant l'origine de réplication du bactériophage M13, ouverte sur un
brin, l'extrémité 5’ étant prolongée d'une queue simple-brin. La terminaison 3’ de cette queue
porte un site de reconnaissance (5′-TGGTC-3′) pour la primase. Le mini-cercle « ouvert » ainsi
obtenu a été utilisé comme substrat de synthèse pour la machine de réplication du bactériophage
T7, qui présente l’avantage, pour des études in vitro, de ne nécessiter que quatre protéines (la
polymérase, l’hélicase-primase gp4, les protéines SSB et un facteur de processivité, la
thiorédoxine d’E. coli) (Chap. 8) La protéine gp4 se fixe à l’extrémité 3’-OH de la queue du
mini-cercle, et démarre la synthèse d'une amorce commençant par le tétranucléotide 5'pppACCA-3', en présence d’ATP et de CTP. L’extrémité 3’ de l'autre brin du mini-cercle est
utilisée comme site de départ de synthèse pour la polymérase de T7. Ce système a permis de
répliquer le mini-cercle in vitro. Les caractéristiques de la réplication ainsi obtenues sont en
plein accord avec les prévisions du modèle trombone (Chap. 8). La microscopie électronique a
permis de déceler la formation d’une anse sur un des brins d’ADN. Les études cinétiques ont
montré un couplage de la synthèse des brins continu et discontinu. La polymérase fonctionnant
sur le filament discontinu est recyclée d’un fragment d’Okazaki au suivant. La longueur des
fragments d’Okazaki est constante. La protéine SSB de T7 est indispensable à cette régulation.
D’autres études conduites in vivo chez E. coli concernent les effets sur la réplication de
lésions qui bloquent la progression de la fourche. De telles lésions sur le brin retardé, qui
bloquent la synthèse des fragments d’Okazaki, n’affectent pas la progression de la fourche du
4
brin continu. À l’opposé, des lésions sur ce dernier bloqueraient le fonctionnement des
réplisomes. Toutefois, d’après d'autres études toujours chez E. coli, suite à un blocage sur le
brin continu, la progression sur le brin retardé pourrait être transitoirement découplée, et la
réplication continuer. Dans ce cas l’activité d’ADN polymérases spécialisées pourrait permettre
de passer outre à certaines lésions.
Bibliographie
Lee J., Chastain P.D. 2nd, Kusakabe T., Griffith J.D., Richardson C.C. 1998. Coordinated
Leading and Lagging Strand DNA Synthesis on a Minicircular Template. Mol. Cell 1(7): 10011010
Park K., Debyser Z., Tabor S., Richardson C.C., Griffith J.D. 1998. Formation of a DNA Loop
at the Replication Fork generated by Bacteriophage T7 Replication Proteins. J. Biol. Chem.
273(9): 5260–5270
5
Web 8 Fiche 8.3
COUPLAGE DES POLYMÉRASES AU NIVEAU
D'UNE MÊME FOURCHE DE RÉPLICATION
L. Paolozzi
Le modèle trombone permet un couplage des synthèses sur les deux brins de la molécule
d’ADN. Au cours d'une réplication bidirectionnelle, ce modèle, associé à celui de l'usine,
permettrait un strict couplage des quatre polymérases, et donc une vitesse de synthèse d’ADN
globale similaire sur les quatre brins. Dans un tel système, toutefois, un blocage sur un brin
continu devrait inhiber la réplication sur les trois autres brins. Une alternative à ce couplage
obligé pourrait être celui d’un couplage facultatif des réplisomes, similaire à celui décrit pour
les deux polymérases d’un même réplisome (fig. F8.3-1). Une troisième possibilité pourrait être
une usine à réplisomes indépendants, malgré leur co-localisation, ceux-ci pouvant procéder à
des vitesses de synthèse différentes.
Un ensemble de résultats est en accord avec le modèle d’un mouvement indépendant des
réplisomes des chacune des deux fourches de réplication.
Dans des chromosomes individuels d’E. coli portant un site ter ectopique, la fourche de
réplication est bloquée par l'expression transitoire de la protéine Tus, qui se lie au site ter. Dans
ces conditions, le blocage d’une fourche n’empêche pas le réplisome frère de continuer son
chemin.
6
Figure F8.3-1. Modèles de couplages des polymérases. (D’après A.M. Breier, 2005).
Enfin, une expérience ingénieuse de N.R. Cozzarelli et collaborateurs (2005) plaide aussi en
faveur d'une indépendance des réplisomes dans l'usine. L’expérience a consisté à examiner les
réplisomes, chez des bactéries E. coli à réplication synchronisée, au niveau de molécules
d’ADN uniques, en utilisant la méthode du peignage de l’ADN (Encart F8.3-1) combinée à
l’hybridation avec des puces à ADN, pour positionner les deux réplisomes durant la réplication.
Cette technique a permis d'observer, sur 46 molécules d’ADN nouvellement initiées pour la
réplication, que la progression des deux réplisomes sur chaque molécule d'ADN individuelle
était très variable. Dans la plupart des cas l'un des réplisomes était plus éloigné (d’environ 50 à
130 kpb selon les souches considérées) que l'autre de l’origine de réplication. Les deux fourches
de réplication se déplacent en moyenne avec la même vitesse, soit 610 nucléotides par seconde à
30 °C, et terminent leur cycle approximativement ensemble, malgré le biais de progression des
deux réplisomes.
7
Encart F8.3-1 - La technique du peignage des molécules d’ADN
Le peignage d'un brin d'ADN (DNA molecular combing) permet une analyse de molécules
individuelles d’ADN étirées. La technique utilise un appareillage automatisé qui plonge
rapidement, et pour une durée fixée, des lamelles de verre traitées avec du silane de vinyle dans
un réservoir contenant la solution d’ADN à étudier. L’ADN se fixe à la lamelle de verre par une
ou deux de ses extrémités. Les lamelles sont ensuite automatiquement retirées du réservoir à une
vitesse constante. Durant cette phase la force de capillarité qui s’exerce sur les molécules
d’ADN est suffisante pour les étirer individuellement, perpendiculairement au ménisque air-eau
de la lamelle ; les filaments se déposent parallèlement l’un par rapport à l’autre. Cette technique,
associée à des marquages de l’ADN avec des fluorochromes, permet d’examiner des molécules
individuelles en microscopie à fluorescence.
Dans le travail cité ci-dessus, cette technique a été associée à celle des puces à ADN. Le
principe de la technologie des puces à ADN (microarrays, Chap. 6) consiste à déposer sur des
lames en verre des sondes à ADN, qui peuvent être des produits de PCR ou des oligonucléotides
longs de 50 à 70 mer. L’ADN des lames est ensuite hybridé avec des cibles fluorescentes
d’ADN génomique. Les signaux émis par l’hybridation sont détectés avec un scanner à
fluorescence.
Bibliographie
Breier A.M., Weier H.U., Cozzarelli N.R. 2005. Independence of Replisomes in Escherichia
coli Chromosomal Replication. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 102(11): 3942-7
8
Web 8 Fiche 8.4
ARCHITECTURE DU RÉPLISOME :
DU MODÈLE CLASSIQUE AUX DONNÉES RÉCENTES
L. Paolozzi
Selon le modèle classique du réplisome, adopté depuis environ quarante ans, les deux noyaux
catalytiques de Pol III (un pour chaque brin à synthétiser) sont reliés aux 5 sous-unités du
chargeur. Les deux pinces β interagissent avec chacun des deux sous-assemblages du noyau. Le
complexe interagit avec l'hélicase DnaB à travers les sous-unités τ. Ce modèle, quoique devenu
classique pour expliquer le fonctionnement de la réplication chez E. coli, ne fournit pas
d'indications sur l’organisation du réplisome in vivo. En outre certaines études récentes de
reconstruction in vitro l'ont fortement remis en question. Ainsi en 2007 P. McInerney et
collaborateurs ont montré qu’il était possible de reconstituer des réplisomes fonctionnels à
différentes stœchiométries des composants. Ainsi un complexe ’ lié à trois noyaux de
Pol III (et non deux), s’assemble à l’hélicase, la primase et l'anneau Ces réplisomes à trois
noyaux de polymérase sont plus processifs que ceux à deux. Ceux à deux noyaux associés au
complexe ’sont par contre incapables de répliquer un brin retardé présentant des
interruptions.
La structure de la fourche de réplication in vivo (stœchiométrie, présence d’autres facteurs
non exigés dans les tests in vitro et exclus par le modèle classique) a ainsi été remise en
question. Les tests in vitro pourraient ne révéler que les composants liés par des interactions
fortes. La stœchiométrie in vitro pourrait aussi sous-estimer certains composants sensibles à la
protéolyse.
9
Une approche prometteuse pourrait permettre d'appréhender l’architecture de la machine de
réplication in vivo. R. Reyes-Lamothe, D. J. Sherratt et M. C. Leake (2010) ont étudié la
structure du réplisome in vivo grâce à des dérivés de leurs composants liés à des fluorochromes,
par examen des cellules en microscopie à fluorescence avec capture et analyse d'images. Le
réplisome actif de cellules d’E. coli contiendrait bien trois molécules de Pol III, associées à trois
molécules de la sous-unité τ. Seulement deux des trois anneaux coulissants  restent toujours
associés au noyau du réplisome. La proportion de SSB serait de cinq à onze tétramères par
réplisome.
Bibliographie
McInerney P., Johnson A., Katz F., O'Donnell M. 2007. Characterization of a Triple DNA
Polymerase. Mol. Cell. 27(4): 527-38
Reyes-Lamothe, R., Sherratt D. J., Leake M.C. 2010. Stoichiometry and Architecture of Active
DNA Replication Machinery in Escherichia coli. Science 328(5977): 498-501
10
Web 8 Fiche 8.5
LE LOCUS PAR ET LA MIGRATION DES ORIGINES
L. Paolozzi
La ségrégation des chromosomes chez les procaryotes est une question complexe, loin d’être
comprise. Cependant un certain nombre de faits et de concepts établis au cours de cette dernière
décennie est en train de changer radicalement notre perception sur cette importante fonction
biologique. Les faits sans doute les plus importants sont la mise en évidence de la compaction et
l'architecture du nucléoïde et des protéines qui lui sont associées, la notion que les différentes
régions du chromosome ont une disposition précise dans la cellule, qui change de façon
dynamique au cours du cycle cellulaire, ainsi que la découverte de sites de type centromère sur
le nucléoïde. Dans cette fiche, nous aborderons exclusivement le problème de la migration des
origines au cours du cycle cellulaire.
MIGRATION DES ORIGINES ET SÉGRÉGATION CHROMOSOMIQUE
Le mécanisme de la réplication bidirectionnelle à partir d’une origine conduit à disposer les
deux réplichores, au cours de leur réplication, dans chacune des moitiés de la cellule. Les
origines de réplication sœurs ainsi sont situées aux premier et troisième quarts de la cellule mère
en prédivision. Cette translocation des origines est un fait important qui témoigne d’un
mécanisme de ségrégation active du chromosome.
Les bases des modèles de cette ségrégation prennent naissance d’observations faites, dans les
années 1980, sur la ségrégation des plasmides à bas nombre de copies (Web 8 Fiche 8.6),
corroborées par l'étude de mutants présentant des ségrégations anormales de leurs réplicons, et
par des observations en microscopie à fluorescence. Ces notions, appliquées aux chromosomes
des Bactéries, ont permis de mettre en évidence chez de nombreuses espèces une région, proche
de ori, soumise à une translocation active durant le cycle cellulaire. Cette région est rapidement
dupliquée après initiation de la réplication. Les deux copies, qui se comportent comme des
11
centromères, ségrègent séparément au cours du cycle cellulaire. L’analyse de la séquence
impliquée a conduit à l’identification d’un locus, par, codant pour un système de partition,
retrouvé dans environ 65 % de tous les génomes bactériens séquencés, mais absents chez
d’autres, comme E. coli. Un orthologhe (SegA) de la protéine bactérienne ParA a été identifié
chez l’Archée Sulfolobus solfataricus. Ces loci par codent pour des orthologues des protéines de
partition des plasmides, et sont la contrepartie bactérienne du système mitotique des eucaryotes,
mais fonctionnent différemment. Ils contiennent deux gènes, parA et parB, et un site
fonctionnant en cis, parS, l'équivalent du centromère. Ce site, souvent présent en plusieurs
copies, est presque toujours situé à proximité de ori. Les gènes par codent, respectivement, pour
une ATPase (ParA) qui se lie non spécifiquement à l'ADN, et une protéine de liaison de l'ADN
(ParB), reconnaissant le site parS. La liaison ParB-parS génère ainsi un grand complexe
centromérique adjacent à ori. ParA agit sur le complexe ParB-parS pour tirer les origines
nouvellement répliquées vers les pôles opposés de la cellule. Ce seraient donc les origines qui
entraîneraient avec elles la masse compacte du chromosome.
MIGRATION DES ORIGINES INDÉPENDANTE DU SYSTÈME PAR
Malgré le fort degré de conservation des loci par, de nombreuses Bactéries en sont dépourvues.
D’autre part chez les espèces qui en sont pourvues, la délétion de ce locus se traduit seulement,
dans beaucoup de cas, par des défauts modestes de ségrégation. D’autres mécanismes de
partition doivent donc être disponibles. Un modèle intéressant, proposé récemment par N.
Kleckner et collaborateurs, postule que les régions ori seraient extrudées vers les pôles suite à
une poussée engendrée par des forces internes aux nucléoïdes. Les origines répliquées
resteraient transitoirement associées au niveau d’un site proche de celui de leur réplication
(appelé snapS) pendant que la réplication du reste chromosome continuerait. Ce compactage de
l’ADN dans un espace limité engendrerait une force interne qui, lorsqu'elle excéderait celle de
cohésion au niveau des snapS, repousserait les chromosomes, extrudant brusquement les
origines vers les pôles opposés. Cependant, B. Di Ventura et collaborateurs (2013) ont montré
que, dans le cas d’E. coli, les forces internes aux chromosomes sont insuffisantes pour porter à
terme la ségrégation, et ont proposé un modèle selon lequel la protéine MinD, qui coordonne la
division (Chap. 5), jouerait le rôle essentiel dans ce processus. Une liaison non-spécifique de
MinD à l’ADN et en même temps à la membrane, pourrait créer une sorte de gradient
dynamique de régions de l’ADN attachées à la membrane. À chaque tour d’oscillation de MinD,
un segment d’ADN serait déplacé vers un pôle. Ce modèle, basé sur de nombreuses données,
pourrait être étendu à d’autres espèces dépourvues du système par.
Bibliographie
Di Ventura B., Knecht B., Andreas H., Godinez W.J., Fritsche M., Rohr K. et al. 2013.
Chromosome Segregation by the Escherichia coli Min System. Mol. Syst. Biol. 9 :686: 1-12
Joshi M.C., Bourniquel A., Fisher J., Ho B.T., Magnan D., Kleckner N., Bates D. 2011.
Escherichia coli Sister Chromosomes Separation includes an Abrupt Global Transition with
Concomitant Release of Late-splitting Intersister Snaps. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108(7) :
2765-2770
12
Web 8 Fiche 8.6
LA SÉGRÉGATION DES PLASMIDES
L. Paolozzi
La ségrégation des plasmides, comme celle des chromosomes, est une fonction importante pour
ces entités. Elle conduit les cellules qui en sont hôtes à hériter de ces éléments génétiques de
façon régulière. Les mécanismes de ségrégation diffèrent selon qu’il s’agit de plasmides à haut
ou bas nombre de copies et, même chez ces derniers, plusieurs mécanismes sont connus.
SÉGRÉGATION DES PLASMIDES À BAS NOMBRE DE COPIES
Nos connaissances sur la ségrégation des plasmides dérivent de l’étude d’un nombre restreint de
ces éléments génétiques, essentiellement présents chez E. coli, qui peuvent être considérés
comme des prototypes. Ces derniers sont représentés principalement par le bactériophage P1
(type I), le plasmide R1 (type II), le plasmide pBToxis (type III), et le plasmide R388.
Les plasmides à bas nombre de copies (1 à 5 environ) ont stabilisé des systèmes qui assurent
leur ségrégation au terme de leur réplication, en relation avec la division de la cellule hôte. Ce
contrôle est assuré, pour la majorité des plasmides étudiés, par un module présent sur leur ADN,
dénommé locus par (partition), responsable de ce processus. L’organisation génétique des loci
par est caractéristique de chaque classe de plasmides ; mais ils comprennent dans tous les cas
trois éléments : une protéine adaptatrice se liant à l'ADN (DNA-binding protein), nommée
différemment selon les plasmides (souvent ParB), une protéine moteur, une ATPase (ParA), et
une séquence centromérique sur l’ADN, parS, reconnue par la protéine adaptatrice pour former
à ce niveau un complexe nucléo-protéique.
La formation de ce complexe et son interaction avec ParA constituent le noyau central du
processus de ségrégation (voir ci-dessous). La région centromérique, liée à l’adaptateur, joue le
rôle de noyau pour la polymérisation de la protéine moteur, laquelle forme un long filament qui
peut conduire le plasmide ailleurs dans la cellule.
13
LES MODÈLES DE SÉGRÉGATION
On connaît actuellement trois types principaux de mécanismes de ségrégation. Ceux des types I
et II se distinguent par la dynamique du mouvement du plasmide. Dans le type I, dit du rochet
(diffusion-ratchet mechanism), le plasmide est tiré ailleurs, tandis que dans le système II, dit de
la poussée (pushing model), le plasmide est poussé vers les pôles de la cellule. La protéine ParA
fait partie de la famille des ATPases Par. Cette famille peut être sous-divisée en deux groupes
phylogénétiques distincts : les protéines ParA de type I contiennent un motif conservé leur
permettant de se lier à l’ADN ; les protéines appartenant au type II ressemblent structuralement
à l’actine des eucaryotes. L'un ou l'autre des types I ou II de ces ATPases ParA est présent dans
diverses classes de plasmides. Des ATPases ParA de type I sont aussi codées par certains
chromosomes bactériens. In vitro elles forment des polymères filamenteux en présence d’ATP.
Le système de type III, dit du tirant (pulling model), diffère des deux premiers par le fait qu’il
exploite une tubuline (TubZ). Enfin un cas particulier est constitué par le plasmide R388, pour
lequel aucun système de partition est connu ; ce système, dit du « poisson-pilote » (pilot-fish),
pourrait constituer un quatrième type de ségrégation.
a) Le système de type I
Ce système, dit aussi basé sur la protéine ParA, est très courant. Il est composé d’une protéine à
activité motrice, ParA, d’une protéine adaptatrice (PC, ou ParB) et d’un centromère (parS),
noms qui varient d’un plasmide à l’autre. ParB forme un gros complexe avec le centromère
parS. Un polymère ParA-ATP, en forme de filament, s'associe par une de ses extrémités au
complexe ParB-centromère, tandis que l’autre extrémité est en contact avec le nucléoïde. Le
mécanisme par lequel ParA conduit à la ségrégation des plasmides n’est pas bien connu. Un
double processus pourrait en être la base : l'un comprendrait un mouvement du nucléoïde qui
tirerait avec lui le plasmide, associé au filament de ParA (fig. F8.6-1) ; l’autre pourrait être du
type du système II, ou ParMRC, du plasmide R1 (voir ci-dessous).
b) Le système de type II
Ce système de ségrégation, le mieux connu, est celui de R1, un plasmide d’E. coli porteur de
plusieurs gènes de résistances à des antibiotiques. Il est constitué des deux gènes parM (960 pb)
codant pour une protéine du type actine constituant le moteur de la ségrégation, et parR (355
pb) codant pour une protéine adaptatrice, et d'une séquence centromérique, parC (160 pb),
localisée en amont du gène parM (fig. F8.6-2) Cette séquence est formée de deux séries de cinq
brèves répétitions organisées en tandem, qui flanquent les séquences -35 et -10 du promoteur de
parMR. ParR se lie à parC sur l’ADN surenroulé.
14
Figure F8.6-1. Système de ségrégation de type I, dit du tirant. La protéine adaptatrice (PC) est associée d'une
part au centromère du plasmide et d'autre part au polymère ParA-ATP.
Figure F8.6-2. Organisation génétique du locus parMRC du plasmide R1.
parC, centromère ; parR, gène de l'adaptateur lié à parC, et répresseur de la transcription à partir du
promoteur pRM.(D’après J. Salje, 2010).
15
ParM s'organise en oligomères, formant un filament qui constitue un centre de nucléation
favorisant son activité ATP-ase (fig. F8.6-3). L’allongement du filament se fait par
polymérisation des monomères ParM à une extrémité des filaments, sous forme liés à l'ATP.
Cette extrémité est coiffée du complexe ParR-parC. C’est la polymérisation de ParM qui
pousserait les copies du plasmide, en sens opposé l’une de l’autre, vers chacun des deux pôles.
Figure F8.6-3.
Système de ségrégation de type II, dit de la poussée. Formation du filament de ParM, et son
association au complexe ParR-centromère. L'allongement du filament jouerait le rôle de moteur de poussée.
16
c) Le système de type III
Connu chez deux plasmides, pBToxis de B. subtilis et pX01 de B. anthracis, ce système est basé
sur l’activité d’une tubuline du type FtsZ (TubZ81) (fig. F8.6-4). Des dimères de TubR se lient
au centromère du plasmide, et interagissent avec l’extrémité C-terminale du polymère de
TubZ81. La tubuline migre vers un pôle de la cellule, entraînant le complexe, donc le plasmide,
vers ce pôle. Arrivé au pôle, le complexe TubR-plasmide est relâché, et le filament de TubZ81
se dirige vers le pôle opposé. Durant cette migration, il se lie à un autre complexe TubRplasmide, qu’il entraîne jusqu'au pôle opposé.
Figure F8.6-4. Le système de ségrégation de type III. (D’après L. Ni et al., 2010).
d) Un nouveau système de ségrégation ? Le cas du plasmide R388
R388 est un plasmide conjugatif d’E. coli à bas nombre de copies et à très large spectre d’hôtes.
Son mécanisme de ségrégation est inconnu ; on sait uniquement qu’il est dépourvu de système
par. Une protéine, StbA, codée par ce plasmide et nécessaire pour sa stabilité intracellulaire,
agirait comme système de partition. L’opéron codant pour StbA présente plusieurs
ressemblances avec le système Par. La protéine StbA se lie à l’ADN au niveau d’une séquence
(stbDRs) agissant en cis, tout comme ParB avec parC ; mais, contrairement aux systèmes qui
utilisent ParA, StbB est non essentielle. Soit qu'elle puisse être remplacée par une autre fonction
encore non identifiée, soit que la ségrégation de ce plasmide n’exige pas de protéine moteur.
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LA MORT PROGRAMMÉE DES CELLULES DÉPOURVUES DE
PLASMIDE
En l'absence d'une pression sélective pour des marqueurs génétiques portés par un plasmide (par
exemple, absence d’antibiotique pour un plasmide codant pour la résistance à ce produit), une
culture de bactéries porteuses de ce plasmide et une culture de cellules qui en sont dépourvues
ne révèlent pas de différences appréciables de leur capacité de croissance. La présence du
plasmide, en absence de pression de sélection, constitue une charge énergétique pour la cellule
hôte, qui devrait se révéler, à long terme, par une croissance plus lente. Or, paradoxalement, les
cellules qui, suite à une ségrégation anormale, se retrouvent dépourvues de plasmides, meurent
ou ont une croissance ralentie. Il s’agit d’une mort programmée par le plasmide. Les plasmides,
même s’ils ne sont pas toujours indispensables à la cellule, sont donc précieusement maintenus
une fois acquis par celle-ci.
On connaît trois classes de systèmes permettant d’éviter la perte d’un plasmide. Le premier,
que nous venons de décrire, contrôle la distribution des plasmides ; un autre implique une
recombinaison aboutissant à une réduction du nombre de formes multimériques des plasmides
présents dans la cellule, lesquelles pourraient conduire à la ségrégation de cellules sans
plasmides. Le dernier est l’addiction, qui élimine de la population bactérienne les cellules sans
plasmides.
a) La résolution des multimères
Au cours de leur réplication les plasmides peuvent former des multimères suite à des
événements de recombinaison homologues entre monomères. Généralement ces multimères sont
réduits, c'est-à-dire dépolymérisés, par un système de recombinaison site-spécifique codé par le
plasmide, permettant ainsi aux monomères du plasmide de ségréger individuellement. Une
cellule qui hérite d’un multimère risque, au moment de sa division, de produire une cellule
portant le multimère et une cellule sans plasmide. En outre, la présence d’un multimère réduit la
probabilité de répliquer des monomères. En effet, les origines de réplication étant choisies au
hasard, un multimère, porteur de plusieurs origines, a une plus forte probabilité de voir une de
ses origines choisie par le complexe de réplication, qu'un monomère qui n'en a qu'une.
b) Les systèmes d’addiction
Ces systèmes, codés par de nombreux plasmides à bas nombre de copies, tuent les cellules qui,
au moment de la division, ne reçoivent pas de copie du plasmide. De tels systèmes ont été
proposés en 1975 par A.H. Kohiyama et T. Yura. Ces systèmes sont connus sous différents
noms (killer system, killing-antikilling, post-segregational killing, toxin-antitoxin, poisonantidote, plasmid addiction system, ou programmed cell death), qui décrivent de nombreuses
situations dans lesquelles une cellule qui n’hérite pas du plasmide est tuée. Ces systèmes
nécessitent au moins deux gènes, l’un codant pour un agent toxique stable et l’autre pour un
facteur instable qui se comporte comme un antidote. Ce facteur peut être un ARN anti-sens ou
une protéine.
Le système hok/sok du plasmide R1 code pour deux ARN, l'ARNm hok (HOst Killing), et
l'ARN anti-sens sok (Suppression Of Killing). Le peptide Hok est létal pour la cellule, mais
l'expression de hok est inhibée par une régulation post-transcriptionnelle contrôlée par l'ARNm
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sok, qui agit en ARN anti-sens. Ce dernier s'hybride, sur une longueur de 67 nucléotides, avec le
messager de hok, empêchant sa traduction par blocage du site de fixation du ribosome. L'ARNm
sok est très labile, avec une demi-vie d’environ 30 s, tandis que celui de hok est stable (plusieurs
heures).
SÉGRÉGATION DES PLASMIDES À HAUT NOMBRE DE COPIES
L’idée courante pour expliquer la ségrégation des plasmides à haut nombre de copies (>15) est
l’hypothèse d’une répartition homogène, passive, des copies dans la cellule mère, et de leur
distribution stochastique entre les cellules filles au moment de la division. D’après un tel
schéma, la probabilité qu’une cellule puisse ne pas hériter d'au moins une copie devrait suivre
une distribution de Poisson. La probabilité qu’une cellule soit dépourvue de plasmide à sa
naissance dépend donc d'une réduction possible du nombre de copies plasmidiques suite à leur
association en multimères. Ces multimères, si non résolus, contribueraient à réduire le nombre
de copies indépendantes de plasmides, et donc à augmenter la probabilité d'apparition de
cellules dépourvues de plasmide au moment de la division. Une ségrégation efficace passe donc
par la résolution des structures multimériques.
Cette conception d'une ségrégation passive des plasmides à haut nombre de copies commence
à être abandonnée, pour faire place à une hypothèse de partition dépendant du chromosome de
l'hôte, ou contrôlée par lui. En effet, le modèle d’une distribution “au hasard” des copies des
plasmides entre cellules filles se base sur deux critères, sans appui expérimental : (i) celui de la
diffusion homogène des plasmides dans la cellule mère, et de leur ségrégation au hasard au
cours de la division ; (ii) celui de l'absence de désavantage au détriment des cellules ayant perdu
leurs plasmides hors conditions de pression sélective. Ni l’un ni l’autre de ces deux critères ne
semblent être vérifiés ; au contraire, certaines données récemment obtenues témoignent contre
ce modèle de distribution passive. Ainsi chez E. coli les copies du plasmide ColE1, visualisées
par un fluorochrome, sont exclues de la région où se trouve le nucléoïde, et sont localisées de
façon préférentielle au niveau du pôle de la cellule, et au centre, région qui deviendra le futur
pôle d’une des deux cellules filles. Une autre ligne de recherche a montré que les copies du
plasmide pUC19 d'E. coli sont localisées au quart de la cellule au moment de la division.
L'ensemble de ces données est favorable à un processus régulé, mais pour lequel on peut
actuellement seulement proposer des spéculations quant à ses acteurs.
Bibliographie
Kohiyama, A.H. & Yura T. 1975. Plasmid Mutations affecting Self-maintenance and Host
Growth in Escherichia coli. J. Bacteriol. 122 : 80-88
Salje J., Gayathri P., Lowe J. 2010. The ParMRC System : Molecular Mechanisms of Plasmid
Segregation by Actin-like Filaments. Nature Reviews Microbiology 8(10) : 683-692
Ni, L., Xu W., Kumaraswami M, Schumacher MA. 2010. Plasmid Protein TubR uses a distinct
Mode of HTH-DNA Binding and recruits the Prokaryotic Tubulin Homolog TubZ to effect
DNA Partition. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107(26) :11763-8
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