Web 8 Fiche 8

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Web 8 Fiche 8.1
LES MULTIPLES RÔLES DE DNAA
L. Paolozzi
De nombreuses études montrent que la protéine DnaA intervient dans d’autres fonctions que
celle, bien documentée, d’initiateur de la réplication. En effet, cette protéine participe aussi à la
régulation de la division cellulaire, et la régulation de l’expression de son propre gène ainsi que
de nombreux autres gènes. Enfin, un certain nombre de données, en particulier son homologie
fonctionnelle avec le complexe ORC (Origin of Replication Complex) des eucaryotes, soulève
la question d’un possible rôle de DnaA dans l’organisation et la ségrégation du chromosome.
UN RÉGULATEUR DU CYCLE CELLULAIRE
Chez les Bactéries, la réplication et la division cellulaire sont des fonctions interdépendantes
intimement liées (Chap. 5 ; 8). Il a été établi depuis longtemps qu’un blocage de la réplication,
par exemple celui produit par un dommage de l’ADN, conduit à un arrêt de la division, lequel
dure jusqu’à ce que la réplication puisse reprendre son cours. Un rôle direct de DnaA dans la
division a commencé à émerger depuis quelques années. Chez B. subtilis, la synthèse de la
protéine de division FtsL est régulée au niveau transcriptionnel par DnaA. FtsL, une protéine
très instable, est la cible de protéases qui en réduisent la quantité dans la cellule. La transcription
du gène ftsL est réprimée suite à un blocage de la réplication. L’analyse de la séquence du
promoteur de ce gène a mis en évidence la présence de sites de liaison à DnaA, très conservés.
Cette forme de régulation de l’expression d’un gène de division par une protéine qui contrôle
l’initiation de la réplication permet de coordonner ces deux fonctions importantes du cycle
cellulaire, et assure en outre une protection de la cellule contre une ségrégation aberrante de
génomes non répliqués ou non entièrement répliqués. Un autre exemple de participation de
DnaA dans la régulation du cycle cellulaire est celui de l’activation de la transcription de ftsZ
chez Caulobacter crescentus. Chez cette bactérie, les protéines FtsZ sont dégradées au terme de

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chaque cycle, et de nouvelles molécules doivent être synthétisées pour permettre un nouveau
cycle. Des sites de liaison à DnaA ont été trouvés au niveau du promoteur du gène ftsZ.
RÉGULATION DE L’EXPRESSION GÉNIQUE
L’expression de nombreux gènes impliqués dans une vaste gamme d'activités est régulée par
DnaA. En font partie les gènes de synthèse de nucléotides, des enzymes de biosynthèse des
glucides, de l'homéostasie du fer, de la synthèse d'acides aminés et des ribosomes. Un exemple
intéressant est celui de l’opéron nrd, dont la régulation par DnaA a été observée chez E. coli, C.
crescentus et B. subtilis. Ce processus assure la disponibilité en substrats nécessaires pour la
réplication du chromosome.
Chez E. coli, l’opéron nrdAB est impliqué dans la synthèse de la ribonucléotide-diphosphate-
réductase, enzyme qui catalyse l’étape finale de la synthèse des désoxyribonucléotides, la
réduction de ribonucléotides en désoxyribonucléotides. Plusieurs données suggèrent que DnaA
et la protéine FIS régulent d’une façon précise l’opéron nrd. La liaison de ces deux protéines au
promoteur en augmente l’expression, ce qui permet de coordonner le taux de synthèse des
désoxyribonucléotides au taux de polymérisation de l'ADN. La synthèse de l’ARNm nrdAB est
couplée à l’initiation de la réplication. Elle augmente lorsque la synthèse de l'ADN est inhibée.
Une augmentation du niveau de ribonucléotide-diphosphate réductase est observée au cours de
conditions de croissance dans lesquelles le rapport ADN/masse cellulaire diminue.
Chez B. subtilis des sites potentiels de liaison de DnaA ont été repérés dans plus de 20
opérons, représentant un nombre total d’au moins 50 gènes. Le rôle précis de DnaA dans la
régulation de ces opérons et son mécanisme d’action sont inconnus. Chez C. crescentus, DnaA,
en plus de son rôle de coordinateur de l’initiation de la réplication, est un régulateur global de la
transcription. La protéine joue un rôle primordial dans la transcription du régulateur GcrA, qui
agit à son tour en cascade sur CtrA, le régulateur de transcription global du cycle cellulaire
(Chap. 15). Le nombre de gènes contrôlés directement ou indirectement au cours du cycle
cellulaire par CtrA a été estimé à 25 % du génome de C. crescentus, soit 553 gènes, dont 95
directement. Des sites de fixation de DnaA sont présents dans beaucoup de ces gènes, et
l’absence de DnaA conduit à un blocage de l’activité de CtrA.
AUTORÉGULATION DE LA SYNTHÈSE DE DNAA
La transcription du gène dnaA chez E. coli est régulée à partir de deux promoteurs, dnaAP1 et
dnaAP2. La région comprise entre ces deux promoteurs contient plusieurs sites de liaison à la
protéine DnaA. Il a été montré que cette région joue un important rôle d’autorégulation du
niveau d’expression du gène dnaA. On savait depuis longtemps que la transcription de dnaA
était autorégulée négativement ; plus récemment il a été montré que ce gène est aussi autorégulé
positivement. Le niveau d’expression de dnaA en fonction de la température est assez
complexe : une diminution de la température fait perdre l’autorégulation au niveau de dnaAP1,
tandis que les contrôles exercés au niveau de dnaP2, positif et négatif, sont conservés. Cette
régulation pourrait intervenir dans l’adaptation de la bactérie aux variations de température.

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QUESTIONS OUVERTES SUR L’ACTIVITÉ DE DNAA
Un certain nombre de questions restent ouvertes dans la compréhension du/des mécanisme(s)
d’action de la protéine DnaA. L'une d'elles (pour nous limiter aux rôles de la protéine exposés
ici) concerne le processus de régulation, positive ou/et négative, de la transcription de nombreux
gènes. L’analyse des séquences des promoteurs concernés n’a pas fourni d'éléments permettant
d’élaborer un schéma unitaire. Ainsi ces promoteurs diffèrent par le nombre de sites de liaison à
la protéine DnaA (de quelques-uns à plus de 10), la localisation de ces séquences (en amont ou
en aval du promoteur), ainsi que leur orientation par rapport à la direction de la transcription.
Dans quelques cas individuels, il a été proposé un mécanisme d’occlusion du promoteur, la
liaison au promoteur de molécules de DnaA empêchant l’ARN polymérase de reconnaître ce
dernier. Mais aucun modèle ne permet actuellement d'expliquer la totalité des mécanismes
d’action de DnaA dans la régulation de la transcription.
Un certain nombre de travaux basés sur des données de génomique suggèrent que la protéine
DnaA pourrait aussi réguler des gènes impliqués dans la recombinaison, la réparation, la
sécrétion de protéines, ainsi que la production d’antibiotiques. Des données expérimentales
consolidant ces hypothèses seront importantes.
Une autre question importante est liée à l’idée que la protéine DnaA pourrait participer à
l’organisation du nucléoïde et à sa ségrégation. Cette idée naît de la comparaison des activités
de DnaA avec celles des protéines eucaryotes ORC, les homologues fonctionnels des protéines
initiatrices de la réplication des procaryotes. Tout comme DnaA, les protéines ORC lient l’ATP,
et contiennent un motif AAA (Chap. 8). Des études structurales et fonctionnelles indiquent que
la liaison de l’ATP à ces deux familles de protéines induit un changement de conformation qui
les active au moment de l’initiation de la réplication. Chez les eucaryotes des rôles des protéines
ORC additionnels à ceux strictement liés à la réplication ont été découverts. Ces protéines
interviennent en effet dans la régulation de l’expression génique, dans la cytokinèse, mais aussi
dans la ségrégation des chromosomes. Des mutations des protéines ORC chez S. cerevisiae et
Drosophila affectent la ségrégation des chromosomes, indépendamment de l’initiation de la
réplication. Par analogie l’idée que DnaA puisse avoir un rôle dans l’organisation et la
ségrégation du nucléoïde a ainsi été soulevée. Des données expérimentales en faveur de cette
hypothèse manquent pour l’instant.

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Web 8 Fiche 8.2
COORDINATION DE LA SYNTHÈSE DES DEUX BRINS
DE L’ADN : UN PROBLÈME ENCORE ACTUEL
L. PAOLOZZI
Une coordination de la synthèse des deux brins d’ADN a été mise en évidence in vitro en 1998
par C.C. Richardson et collaborateurs. Ces auteurs ont construit une molécule d’ADN circulaire
bicaténaire de 70 pb comprenant l'origine de réplication du bactériophage M13, ouverte sur un
brin, l'extrémité 5’ étant prolongée d'une queue simple-brin. La terminaison 3’ de cette queue
porte un site de reconnaissance (5′-TGGTC-3′) pour la primase. Le mini-cercle « ouvert » ainsi
obtenu a été utilisé comme substrat de synthèse pour la machine de réplication du bactériophage
T7, qui présente l’avantage, pour des études in vitro, de ne nécessiter que quatre protéines (la
polymérase, l’hélicase-primase gp4, les protéines SSB et un facteur de processivité, la
thiorédoxine d’E. coli) (Chap. 8) La protéine gp4 se fixe à l’extrémité 3’-OH de la queue du
mini-cercle, et démarre la synthèse d'une amorce commençant par le tétranucléotide 5'-
pppACCA-3', en présence d’ATP et de CTP. L’extrémité 3’ de l'autre brin du mini-cercle est
utilisée comme site de départ de synthèse pour la polymérase de T7. Ce système a permis de
répliquer le mini-cercle in vitro. Les caractéristiques de la réplication ainsi obtenues sont en
plein accord avec les prévisions du modèle trombone (Chap. 8). La microscopie électronique a
permis de déceler la formation d’une anse sur un des brins d’ADN. Les études cinétiques ont
montré un couplage de la synthèse des brins continu et discontinu. La polymérase fonctionnant
sur le filament discontinu est recyclée d’un fragment d’Okazaki au suivant. La longueur des
fragments d’Okazaki est constante. La protéine SSB de T7 est indispensable à cette régulation.
D’autres études conduites in vivo chez E. coli concernent les effets sur la réplication de
lésions qui bloquent la progression de la fourche. De telles lésions sur le brin retardé, qui
bloquent la synthèse des fragments d’Okazaki, n’affectent pas la progression de la fourche du

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brin continu. À l’opposé, des lésions sur ce dernier bloqueraient le fonctionnement des
réplisomes. Toutefois, d’après d'autres études toujours chez E. coli, suite à un blocage sur le
brin continu, la progression sur le brin retardé pourrait être transitoirement découplée, et la
réplication continuer. Dans ce cas l’activité d’ADN polymérases spécialisées pourrait permettre
de passer outre à certaines lésions.
Bibliographie
Lee J., Chastain P.D. 2nd, Kusakabe T., Griffith J.D., Richardson C.C. 1998. Coordinated
Leading and Lagging Strand DNA Synthesis on a Minicircular Template. Mol. Cell 1(7): 1001-
1010
Park K., Debyser Z., Tabor S., Richardson C.C., Griffith J.D. 1998. Formation of a DNA Loop
at the Replication Fork generated by Bacteriophage T7 Replication Proteins. J. Biol. Chem.
273(9): 5260–5270