(megaptera novaeangliae)de madagascar

Rapport de stage de Master 2
Océanographie, spécialité Biologie Ecologie Marine
Institut Méditerranéen d’Océanologie
Aix- Marseille Université
Campus de Luminy – case 901
13288 Marseille Cedex 9
ANALYSE GENETIQUE DES BALEINES A BOSSE
(MEGAPTERA NOVAEANGLIAE) DE MADAGASCAR
©Bryce Groark
Loriane MENDEZ
Janvier - Juin 2013
Encadrants : Jean-Luc Jung et Eléonore Méheust
Laboratoire BioGeMME
(Biologie et Génétique des Mammifères Marins dans leur Environnement)
Université de Bretagne Occidentale
29200 Brest
SOMMAIRE
Remerciements ............................................................................................................................ 3
Introduction ................................................................................................................................. 4
Matériel et méthodes ................................................................................................................... 9
Collecte des prélèvements .................................................................................................................. 9
Extraction de l'ADN ........................................................................................................................... 11
Sexage moléculaire ........................................................................................................................... 11
Amplification et séquençage de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial .............................. 12
Analyse du polymorphisme de la région de contrôle de l’ADN mitochondrial ................................ 13
Amplification des microsatellites ...................................................................................................... 14
Analyse du polymorphisme des microsatellites ............................................................................... 15
Mise en relation avec les formations sociales .................................................................................. 15
Résultats .................................................................................................................................... 16
Echantillonnage................................................................................................................................. 16
Extraction de l'ADN ........................................................................................................................... 16
Sexage moléculaire ........................................................................................................................... 16
Polymorphisme de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial ................................................... 17
Polymorphisme des microsatellites .................................................................................................. 21
Mise en relation avec les formations sociales .................................................................................. 22
Contrôles qualité expérimentaux ..................................................................................................... 23
Discussion .................................................................................................................................. 25
Echantillonnage................................................................................................................................. 25
Biais du sex-ratio en faveur des mâles.............................................................................................. 25
Diversité génétique élevée ............................................................................................................... 25
Structure génétique d'après la région de contrôle de l'ADN mitochondrial .................................... 27
Pas de structure génétique d'après les microsatellites .................................................................... 28
Fidélité au site de reproduction et flux de gènes ............................................................................. 29
Génétique et structure sociale.......................................................................................................... 30
Conclusion & Perspectives .......................................................................................................... 31
Bibliographie .............................................................................................................................. 33
Résumé ...................................................................................................................................... 38
Abstract ..................................................................................................................................... 38
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier en tout premier lieu Jean-Luc Jung d'avoir eu foi en ma candidature pour intégrer
l'équipe de recherche qu'il dirige. Ce stage m'a énormément appris et restera pour toujours un excellent
souvenir.
Merci à Eléonore, une personne pleine de qualités, qui m'a pris sous son aile à mon arrivée. Je remercie
aussi Eric, roi des marsouins, qui s'est toujours montré disponible pendant la rédaction de sa thèse.
Merci à François-Gilles pour les aspects statistiques.
Cette étude fait partie d'un projet pluridisciplinaire intitulé BaoBab et mené par Olivier Adam (Centre de
Neurosciences, CNRS-Université Paris Sud), auquel participent notamment Laurène Trudelle et JeanBenoit Charrassin (LOCEAN UMR 7159, MNHN Université Paris VI), Francois Xavier Mayer (association
Cétamada, Madagascar) et Salvatore Cerchio et Howard Rosenbaum (Wildlife Conservation Society, NY,
USA). Ce projet est basé sur des observations visuelles et acoustiques et des suivis par balise Argos.
Toutes ces données sont complétées par des campagnes de prélèvements de biopsies afin de permettre
des analyses de génétique, menées par le Laboratoire BioGeMME. Je remercie Olivier Adam, à la base du
projet. Merci aussi à Laurène d'être venue une semaine au laboratoire afin de recouper les résultats
génétiques avec les informations comportementales notées sur le terrain. Merci à l'association
Cetamada et l'association SPM Frag'Iles pour les prélèvements.
Merci à Joelle Creff, Cédric Le Maréchal et Claude Ferec de m'avoir accueillie pour les séquençages des
microsatellites.
Merci également à tous les enseignants de la licence "Biologie des Organismes et des Ecosystèmes" de
Nice et du master "Biologie Ecologie Marine" de Marseille. Leurs cours ont renforcé jour après jour ma
volonté de travailler dans la recherche en milieu marin.
Une grande dédicace pour mes collègues stagiaires. Sabrina, je n'oublierai pas nos "tea time" ! Charlène,
pour nos discussions "diététique et sport" et tout simplement pour ta présence et ton soutien pendant
ces 5 mois. Et enfin Maeva, nouvelle source d'énergie et de bonne humeur pour la fin de mon stage !
Une énorme pensée pour toute ma famille. Merci infiniment aux personnes les plus exceptionnelles qu'il
soit : mes parents, qui me soutiennent jour après jour et me permettent de poursuivre mes rêves.
Enfin, merci à mon chéri. Mon parcours ne facilite pas notre relation et pourtant cette dernière est la
plus belle que l'on puisse imaginer.
INTRODUCTION
Le taux d'extinction actuel des espèces excède largement celui constaté jusqu'alors dans
l'histoire de l'évolution de la planète (Smith et al., 1993). On parle de "sixième extinction
massive" (Leakey & Lewin, 1995). Contrairement aux extinctions précédentes, celle-ci est
principalement due aux activités humaines (IUCN, 2012). Dans un contexte de préservation de la
diversité biologique, l'étude de l'écologie des espèces est alors nécessaire à la mise en place de
mesures de gestion adaptées pour leur conservation. Les études géographiques ciblées
représentent des pièces du puzzle de la compréhension globale de l'écologie des espèces. Elles
permettent de mieux comprendre certains mécanismes à fine échelle et facilitent la
concentration des moyens, permettant le déploiement simultané de différentes approches
scientifiques. La mise en perspective des données complémentaires les unes avec les autres
favorise une meilleure interprétation et compréhension des résultats.
La baleine à bosse Megaptera novaeangliae (Borowski, 1781) est une espèce de cétacés
cosmopolite appartenant au sous-ordre des mysticètes et à la famille des Balaenopteridae
(Gray, 1864). Elle mesure en moyenne 13 à 15 mètres de long (Chittleborough, 1965 ; Mikhalev,
1997) et se distingue par de longues nageoires pectorales, une coloration dorsale sombre, une
face ventrale de la nageoire caudale propre à chaque individu et un chant très élaboré
(Clapham, 2002). Le rostre et la mâchoire inférieure sont couverts de follicules pileux formant
de petites protubérances. La baleine à bosse doit son nom à la manière dont elle arque le dos
avant de plonger, en ne laissant apparaitre que la forme bossue de sa nageoire dorsale. Il s'agit
d'une espèce très mobile qui effectue des migrations annuelles entre les hautes latitudes où elle
se nourrit et les eaux tropicales et subtropicales où elle se reproduit et met bas (Mackintosh,
1942). Lors de ces migrations, elle parcourt des distances considérables pouvant atteindre plus
de 8 000 kilomètres (Stone et al., 1990 ; Stevick et al., 2010). Il semble que les individus
reviennent chaque année sur le site d'alimentation où ils se sont rendus la première année
auprès de leur mère (Clapham & Mayo, 1987). Sur les sites d'alimentation, les individus
semblent privilégier des hot-spots et sont observés seuls ou dans des petits groupes qui se
forment et se dispersent rapidement (Whitehead, 1983 ; Weinrich & Kuhlberg, 1991). Des
comportements de nourrissage collectif sont parfois observés (Sharpe, 2001). Sur les sites de
reproduction, leur comportement est dirigé par un système reproducteur de type "polygynie"
4
(Clapham, 1996) où les mâles peuvent s'accoupler avec plusieurs femelles. Celles-ci donnent
naissance à un baleineau tous les 2-3 ans (Chittleborough, 1958), généralement de pères
différents (Clapham & Palsbøll, 1997). Les femelles ne migrent apparemment pas
systématiquement chaque année vers les sites de reproduction (Craig & Herman, 1997). Il en
résulte un sex-ratio en faveur des mâles, qui se retrouvent en compétition pour un accès aux
femelles en nombre limité (Tyack & Whitehead, 1982). En période de reproduction, les baleines
à bosse sont observées dans différents types de groupes pouvant aller de 2 individus (Mobley &
Herman, 1985) à une dizaine d’individus. Les groupes de plus de 2 individus sont constitués
d'une femelle (individu focal) et d'un ou plusieurs mâles qui peuvent entrer en compétition pour
la femelle. L'escorte principale est le mâle le mieux placé auprès de la femelle et les autres sont
les escortes secondaires, appelés challengeurs dès lors qu'ils essaient de prendre la place de
l'escorte principale (Clapham et al., 1992). Toutes les associations (hormis celles des mères et de
leur baleineau) sont temporaires (Mobley & Herman, 1985). Les baleines à bosse d'un
hémisphère ne semblent pas se mélanger avec celles de l'autre hémisphère. Les individus de
l'hémisphère sud se reproduisent dans les eaux tropicales pendant que ceux de l'hémisphère
nord se nourrissent dans les hautes latitudes. La situation inverse est observée 6 mois plus tard
avec le changement de saisons. On parle alors de "distribution antitropicale" (Davies, 1962).
La chasse à la baleine durant le 20ème siècle a réduit la population mondiale de baleines à bosse
à moins de 10 % de sa taille originale (Tønnessen & Johnsen, 1982). Au total, plus de 200 000
individus ont été tués dans l'hémisphère sud (Clapham & Baker, 2002). La Commission
Baleinière Internationale (CBI), établie en 1948 afin de réglementer la chasse à la baleine,
encouragea la chasse industrielle durant ses 30 premières années. Ce n'est qu'en 1966 que la
baleine à bosse fut classée en tant qu'espèce protégée, à la demande de la CBI. En 1985, un
moratoire international interdisant la chasse des grands cétacés à des fins commerciales fut mis
en œuvre. La mise en place par la CBI en 1994 d'un sanctuaire baleinier sur 50 millions de km²
autour de l’Antarctique s'est avérée d’une importance capitale pour le rétablissement des
populations de baleines. En 2008, la baleine à bosse est passée de la catégorie "vulnérable" à
celle de "préoccupation mineure" d'après l'évaluation de l'Union Internationale pour la
Conservation de la Nature (UICN), à l'exception des populations d’Océanie et du golfe Persique.
Malgré un cycle de reproduction long, les baleines à bosse répondent positivement aux mesures
de protection et à l'arrêt de la chasse, et la tendance de la population mondiale est en hausse
(UICN, 2012). Cependant, la population mondiale est encore loin de ses effectifs initiaux et reste
5
menacée par la chasse dans certains secteurs (Stoett et al., 2011). Le Japon pratique une chasse
très controversée dans le cadre de permis spéciaux pour la recherche scientifique. La Norvège et
l'Islande chassent exclusivement au large de leurs côtes, et quelques populations continuent à
pratiquer une chasse aborigène de subsistance. D'autres menaces pèsent sur l'espèce telles que
la dégradation de l'habitat, dont les effets sont difficiles à quantifier, la pollution chimique et
sonore, les captures accidentelles et les risques de collision avec les navires (Reeves et al.,
2003).
Dans l'hémisphère sud, la distribution des baleines à bosse sur leurs sites d'alimentation a
donné lieu à la définition historique de 6 secteurs autour du pôle Sud (aires I à VI) basés sur les
données de chasse (Tonnessen & Johnsen, 1982). Ces secteurs ont ensuite été repris par la CBI
en tant qu'unités de gestion pour la chasse commerciale (Gambell, 1976). Les sites de
reproduction de l'hémisphère sud ont été définis par la CBI en 7 stocks, nommés de A à G (IWC,
2007). Un huitième, le stock X, concerne la population de la mer d'Oman qui n'effectue pas de
migration vers les eaux polaires pour se nourrir (Mikhalev, 1997). Certains sous-stocks ont
également été définis. Le stock B au sud-est de l'Atlantique est ainsi divisé en 2 sous-régions B1
et B2 (Pomilla, 2005). Au sud-ouest de l'océan Indien, le stock C se divise en 3 sous-régions,
définies d'après les données de captures historiques et les observations à terre et à bord de
bateaux (Best et al., 1998) : C1 (côte est de l’Afrique du Sud au Mozambique), C2 (canal du
Mozambique jusqu’à l’archipel des Comores) et la région C3 (eaux côtières de Madagascar) dont
traite cette étude. La sous-région C4, incluant les îles Mascareignes et l'île de la Réunion, a
récemment été proposée (Dulau-Drouot et al., 2011).
De récentes recherches suggèrent une différenciation génétique entre le stock C1 et C3,
contrairement au stock C2 et C3 (Rosenbaum et al., 2009). La recapture photographique et
génétique d'individus échantillonnées à Mayotte (C2) et dans la baie d'Antongil à Madagascar
(C3) suggère un échange important voire un chevauchement entre C2 et C3 (Ersts et al., 2006).
D'autre part, un individu a été détecté la même année au niveau de la côte est de l'Afrique du
Sud (C1) et la baie d'Antongil à Madagascar (C3) au cours de la même année (Pomilla, 2005),
signifiant donc qu'il existe clairement des échanges qui n'ont pas encore été quantifiés. A
l'échelle des stocks, les analyses génétiques ont montré que le stock B et C étaient différenciés
mais que les populations pouvaient échanger 1 à 2 migrants par an (Rosenbaum et al., 2009).
6
Cette étude génétique des baleines à bosse de Madagascar fait partie d'un projet collaboratif et
pluridisciplinaire. Les objectifs sont d'estimer la population de baleines à bosse fréquentant l'île
de Sainte-Marie à Madagascar pendant la période de reproduction et de mise bas, de
caractériser la structure de la population et les interactions sociales, et de déterminer la
distribution et l’utilisation de leurs habitats. Des suivis par photo-identification ont pour but
d’estimer des paramètres démographiques et d’obtenir des informations sur les déplacements
des individus. L’utilisation d’hydrophones augmente l'efficacité de détection et de comptage à
distance des baleines acoustiquement actives, et des suivis télémétriques par balises Argos ont
pour rôle la mise en évidence des trajectoires des individus. Treize balises ont déjà été posées
avec succès entre fin juillet et début août 2012 (Cerchio et al., 2013). L’ensemble des
paramètres environnementaux disponibles le long des trajets ou associés aux observations
visuelles est également utile pour expliquer la présence des baleines à bosse dans certains types
d’habitats. En addition, toutes ces approches sont complétées par des campagnes de
prélèvements de biopsies permettant la réalisation d'analyses génétiques à 2 niveaux. Un
premier niveau consiste, en plus de déterminer le sexe des individus échantillonnés, à décrypter
les éventuels liens familiaux entre les individus, notamment au sein des groupes, et à coupler
l'identification génétique et la photo-identification. Un deuxième niveau a pour but d'analyser la
diversité génétique des individus fréquentant le site étudié, de la comparer à plus grande
échelle géographique et d'essayer d'estimer les liens avec les individus des sous-stocks et stocks
voisins (Best et al., 1998 ; Rosenbaum et al., 2009).
Les liens familiaux entre individus et la structure de la population peuvent être étudiés à l'aide
de différents marqueurs génétiques tels que l'ADN mitochondrial et les microsatellites. L'ADN
mitochondrial est une molécule double brin, circulaire, transmise uniquement par la mère et
mesurant 16 298 paires de bases chez la baleine à bosse (Sasaki et al. ,2005). Son taux de
mutation est 10 fois plus grand que celui de l'ADN nucléaire (Brown et al., 1979). En considérant
les coûts nécessaires au séquençage du mitogénome complet et la volonté d'obtenir des
données comparables entre études, la plupart des analyses se concentrent sur le séquençage de
portions spécifiques relativement petites (Duchêne et al., 2011). La région de contrôle de l'ADN
mitochondrial, également appelée "D-loop", est une région non-codante fortement variable
chez la plupart des vertébrés, et représente un marqueur puissant pour décrire la structure
génétique des lignées maternelles au sein des populations (Avise et al., 1987). De précédentes
études ont montré que ce marqueur est généralement bien adapté aux questions de structure
7
de population chez les cétacés (Hoelzel & Dover, 1991 ; Baker et al., 1993 ; Alfonsi et al., 2012).
Les microsatellites sont quant à eux des marqueurs nucléaires très variables correspondant à
des successions en répétition directe de motifs de doublets, triplets ou quadruplets de
nucléotides (Litt & Luty, 1989). Le nombre de répétitions à chaque locus est susceptible de
changer à chaque réplication de l’ADN, avec une probabilité largement supérieure au taux
moyen de mutation du génome (Litt & Luty, 1989). Les microsatellites sont particulièrement
utiles pour détecter les faibles niveaux de variations génétiques et sont beaucoup utilisés chez
les cétacés (Bourret et al., 2008). Chez la baleine à bosse, les microsatellites ont par exemple été
utilisés lors de tests de paternité (Clapham & Palsbøll, 1997) ou pour élucider les stratégies de
reproduction et les relations sociales (Pomilla & Rosenbaum, 2006). Ils ont également permis de
révéler de nombreuses informations sur les individus du nord de l'océan Atlantique telles que
l'estimation de leur abondance, leurs mouvements locaux et migratoires, ainsi que la présence
d'échanges limités dans les sites d'alimentation et de mélanges dans les sites de reproduction
(Palsbøll et al., 1997). Tandis que l'ADN mitochondrial est uniquement transmis par
l'ascendance maternelle, les microsatellites, d'origine nucléaire, sont transmis par les 2 parents.
Cette différence de transmission pouvant parfois mener à des conclusions complètement
différentes, leur étude est donc d'intérêt complémentaire (Toews & Brelsford, 2012).
L'objectif de mon stage était de mesurer la diversité génétique d'un échantillonnage typique de
la population de baleines à bosse de Madagascar, de décrire sa structure génétique et d'essayer
d'émettre des hypothèses sur la composition génétique des groupes sociaux. Pour cela, 67
prélèvements récoltés à Madagascar entre début juillet et début septembre 2012 ont été
analysés : le sexe des individus a été déterminé, ainsi que les polymorphismes de la région de
contrôle de l'ADN mitochondrial et de 5 microsatellites. Les résultats ont ensuite été mis en
relation avec les différentes formations sociales auxquelles les individus échantillonnés
appartenaient.
8
MATERIEL ET METHODES
Collecte des prélèvements
Soixante-sept prélèvements de tissus de baleines à bosse (figure 1A) ont été prélevés lors d'une
campagne de prélèvements réalisée de début juillet à début septembre 2012 dans le canal de
l'île Sainte-Marie, situé au nord-est de Madagascar (figure 2). Cinquante-sept prélèvements sont
des biopsies et 10 sont des squames. Les biopsies ont été réalisées à l’aide d’arbalètes Bamett
Panzer 7 ou RC-150, équipées de flèches et d’embouts spéciaux (M8, 40 mm de longueur, 7 mm
de diamètre) fabriqués par CETA-DART® (L. Trudelle, comm. pers.). La zone ciblée pour la
biopsie est située sous la nageoire dorsale. Les squames sont des fragments de peau se
détachant de l'animal lors d'un saut qui sont ensuite récupérés à l'aide d'une épuisette (figure
1B). Aucun prélèvement sur baleineau n'a été réalisé. Plusieurs informations ont été collectées
pour chaque individu dont le sexe supposé d'après le comportement, le type de formation
sociale auquel il appartenait et son rôle au sein de cette formation (tableau 1). Des clichés
photographiques (face ventrale de la nageoire caudale et côtés gauche et droit de la nageoire
dorsale) ont également été effectués afin d’obtenir une documentation complète pour chaque
animal.
A
B
©Cetamada
Figure 1. A) Echantillon de peau issu d'une biopsie. B) Prélèvement de squames.
D'autre part, 5 biopsies de baleines à bosses de Saint-Pierre-et-Miquelon (archipel français
d'Amérique du Nord) ont été fournies au laboratoire et ont permis d'intégrer un groupe
extérieur (outgroup) dans l'étude. Ces biopsies ont été réalisées en 2012 dans le cadre d'un
programme scientifique qui vise à étudier les différentes espèces de cétacés évoluant autour de
Saint-Pierre-et-Miquelon.
9
Île
Sainte
-Marie
Figure 2. Carte de la zone d'étude. Les prélèvements ont été réalisés dans le canal de l'île SainteMarie, au nord-est de Madagascar. Les cercles représentent la localisation géographique des
prélèvements.
Google
Tableau 1. Nomenclature des formations sociales observées et des rôles des individus
échantillonnés (d’après Tyack & Whitehead, 1982). L'individu focal est la femelle convoitée par
les mâles d'un groupe compétitif. Le prétendant le mieux placé auprès de la femelle est appelé
escorte principale, les autres sont les challengeurs.
Types de formations sociales
Groupe compétitif (GC)
Mère - baleineau - escorte (MBE)
Rôles des individus
Individu focal (IF)
Escorte principale (EP)
Challengeur (C)
Mère (M)
Escorte (E)
Mère - baleineau (MB)
Mère (M)
Paire d'adultes (PA)
-
Paire de juvéniles (PJ)
-
Adulte solitaire (AS)
-
Juvénile solitaire (JS)
10
Extraction de l'ADN
Les prélèvements ont été conservés dans de l’éthanol absolu ou dans du DMSO 20 % saturé en
sel jusqu’à leur analyse en laboratoire. Toutes les extractions ont été réalisées à l’aide du kit
"DNeasy Blood & Tissue Kit" (QIAGEN®) selon le protocole standard. La qualité et la quantité de
l’ADN extrait ont été vérifiées par électrophorèse sur gel d'agarose 2 % et coloration au
bromure d’éthidium (Sambrook et al., 1989). Les gels ont été photographiés sous éclairage UV
grâce à un Gel Doc 2000 (Biorad®) et le logiciel Quantity One (Biorad®). Les concentrations en
ADN des solutions et les rapports A260/A280 ont été déterminés par spectrophotométrie grâce à
un NanoDrop ND-1000® (NanoDrop Technologies®).
Sexage moléculaire
La détermination du sexe de chaque individu a été réalisée selon une méthode de sexage
moléculaire dérivée de Jayasankar et al. (2008). Un fragment d’environ 225 pb du gène SRY
,spécifique du chromosome Y, est amplifié en parallèle dans une même PCR (réaction de
polymérisation en chaine de l’ADN) avec un fragment de 445 pb des gènes ZFX et ZFY, présents
respectivement sur les chromosomes X et Y. Ce dernier fragment sert de témoin du bon
fonctionnement de la réaction, tandis que le fragment du gène SRY permet de déterminer le
sexe : sa présence implique que le prélèvement provient d'un male et son absence indique que
le prélèvement a été fait sur une femelle.
Deux couples d'amorces ont été utilisés : SRYs (5'-CCCATGAACGCTTTCATTGTGTGG-3') / SRYas
(5'-TCTTTGGCCTTCCGACGAGGTCGATA-3') et ZFX-ZFYs (5'-ACAACCACCTGGAGAGCCACAAGCT-3')
/ ZFX-ZFYas (5'-GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAGT-3'). Les amplifications ont été réalisées dans
un volume final de 20 µL contenant environ 20 ng d'ADN, 5 pmole de chaque amorce, 1,5 mM
de MgCl2, 200 µM de chaque dNTP et 0,4 unité de HotGoldStar DNA polymerase (Eurogentec®)
dans le tampon standard de réaction. Les cycles de température sont les suivants : une
dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min, suivie de 30 cycles constitués chacun de 3 étapes
[dénaturation à 94 °C 45 sec, hybridation à 62 °C 45 sec, extension à 72 °C 1 min], puis une
élongation finale à 72 °C pendant 10 min. Un témoin négatif où l'ADN a été remplacé par de
l'eau a été inclus dans chaque PCR. Les amplicons ont été séparés par électrophorèse sur gel
d’agarose 2 % et révélés au bromure d’éthidium.
11
Amplification et séquençage de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial
Le couple d'amorces et les cycles PCR avaient été optimisés avant le début de mon stage. Le
fragment amplifié entre les amorces, d'une taille de 650 paires de bases, correspond à la
position 15 522 à 16 172 de l'ADN mitochondrial complet de la baleine à bosse (Sasaki et al.,
2005
;
ref.
Genbank
:
AP006467.1).
Le
couple
d'amorces utilisé
est
L_Dlp1.5
(5'-ACCCAAAGCTGRARTTCTA-3') / H_Dlp8G (5'-GGAGTACTATGTCCTGTAACCA-3'), dérivé de
Garrigue et al. (2004). Les amplifications ont été réalisées dans un volume final de 50 µL
contenant environ 50 ng d'ADN, 50 pmole de chaque amorce, 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de
chaque dNTP et 1 unité de HotGoldStar DNA polymerase (Eurogentec®) dans le tampon
standard de réaction. Les cycles de température sont les suivants : une dénaturation initiale à
95 °C pendant 10 min, suivie de 30 cycles constitués chacun de 3 étapes [dénaturation à 95 °C
1 min, hybridation à 58 °C 30 sec, extension à 72 °C 1 min], puis une extension finale à 72 °C
pendant 10 min. Les réactions ont été réalisées dans un thermocycleur GeneAmp PCR System
9700 (Applied Biosystem®). Un témoin négatif où l'ADN a été remplacé par de l'eau a été inclus
dans chaque PCR. Les résultats des amplifications ont été contrôlés par électrophorèse sur gel
d'agarose 2 % et coloration au bromure d’éthidium.
Les fragments d'ADN amplifiés ont ensuite été purifiés à l’aide du kit "MinElute PCR Purification
Kit" (Qiagen®) afin d’éliminer les amorces et autres réactifs résiduels de la PCR qui
perturberaient la réaction de séquençage. La qualité et la quantité des extraits d'ADN ont été
déterminées
par spectrophotométrie
grâce à
un
NanoDrop ND-1000®
(NanoDrop
Technologies®) et par électrophorèse sur gel d'agarose 2 %.
Les 2 brins d'ADN des produits amplifiés et purifiés ont été séquencés par des prestataires
(GATC® et Beckman Coulter®) sur un séquenceur ABI 3730xl® (Applied Biosystems®) ou un
appareil similaire. Les chromatogrammes ont été analysés à l’aide du logiciel Sequence Scanner
1.0® (Applied Biosystems®). Chaque séquence a été vérifiée visuellement, éventuellement
modifiée puis enregistrée en format FASTA. La séquence obtenue a ensuite été comparée avec
les données contenues dans la base de données Genbank (accessible à www.ncbi.nlm.nih.gov)
en utilisant l'outil BLAST® (Altschul et al., 1990), permettant notamment de confirmer l'espèce
dont provient le prélèvement. Les séquences ont ensuite été alignées grâce au programme
Clustal W (Thompson et al., 1994) intégré au logiciel BioEdit 7.0 (Hall, 1999).
12
Analyse du polymorphisme de la région de contrôle de l’ADN mitochondrial
Le nombre de sites polymorphes (S), le nombre d’haplotypes (h), la diversité haplotypique (Hd)
et la diversité nucléotidique (π) ont été déterminés grâce au logiciel DnaSP 5.10 (Librado &
Rozas, 2009). Un haplotype correspond à une combinaison donnée de nucléotides constituant
une séquence pouvant être commune à plusieurs individus. Plus la diversité haplotypique est
élevée au sein de l’échantillonnage, plus il y a de chances d’observer des haplotypes différents
lorsque l'on sélectionne 2 individus au hasard (Nei, 1987). La diversité nucléotidique mesure le
nombre moyen de différences entre 2 séquences choisies aléatoirement dans l'échantillonnage
(Nei & Li, 1979). Plus les séquences sont distantes en terme de nombres de sites
polymorphiques les différenciant, plus la diversité nucléotidique sera élevée.
En testant l'hypothèse de l'équilibre mutation-dérive, les tests de neutralité peuvent détecter
un phénomène de sélection ou un écart à l'équilibre démographique de la population tel qu'un
goulot d'étranglement ou une expansion de population. Les tests du D de Tajima (Tajima, 1989),
de Fu & Li (Fu & Li, 1993) et du Fs de Fu (Fu, 1997) ont été effectués grâce à DnaSP 5.10. Les
significativités ont été testées à l’aide de 10 000 simulations en coalescence sous l’hypothèse
nulle d’équilibre et basées sur la valeur du paramètre mutationnel θ = 4Neμ (observée dans le
jeu de données).
Les relations entre les séquences des individus ont été représentées à l’aide d’un arbre réalisé
grâce à la plateforme accessible sur www.phylogeny.fr (Dereeper et al., 2008 ; consulté en avril
2013) selon la méthode du maximum de vraisemblance à l’aide de l'algorithme du logiciel
PhyML (Guindon & Gascuel, 2003). Une approche par parcimonie (Goloboff et al., 2008) et par
neighbor-joining (Gascuel, 1998) ont également été testées pour vérifier la cohérence des
résultats. L'arbre a été représenté à l'aide de TreeDyn (Chevenet et al., 2006) et sa robustesse a
été testée à l’aide de 1 000 bootstraps (Felsenstein, 1985).
Un réseau d’haplotypes a été construit grâce au logiciel Network 4.6. (disponible sur :
www.fluxus-technology.com). Chaque cercle correspond à un haplotype et sa taille est
proportionnelle à la fréquence de l’haplotype dans la population étudiée. La longueur des
segments entre chaque haplotype est proportionnelle au nombre de mutations qui les sépare.
13
Les valeurs de différenciation génétique par paires de sous-populations hypothétiques calculées
avec le paramètre FST (Wright, 1965) ainsi que les probabilités associées ont été estimées grâce
au logiciel Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010). L’hypothèse nulle d’absence de différence
génétique a été testée à l’aide de 10 000 permutations.
Amplification des microsatellites
Cinq microsatellites ont été utilisés dans le cadre de mon stage parmi 8 sélectionnés dans la
littérature. GT023, GT053, G7575 sont des dinucléotides de séquence (GT) n et GATA053 et
GATA417 sont des tétranucléotides de séquence (GATA)n. Les amorces ont été commandées
chez Eurogentec®. Un fluorochrome a été ajouté en 5' aux amorces sens (6-FAM, HEX ou
Dragonfly Orange). Les amorces sens avec fluorochrome ont été purifiées par le prestataire à
l'aide de la méthode "HPLC", basée sur la différence d'interaction avec la matrice entre les
amorces et les séquences tronquées plus petites. Les amorces anti-sens ont été purifiées à l'aide
de la méthode "SePOP desalting", basée sur un processus de précipitation différentielle.
Les amplifications ont été réalisées dans un volume final de 20 µL contenant environ 20 ng
d'ADN, 20 pmole de chaque amorce, 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de chaque dNTP et 0,4 unité de
HotGoldStar DNA polymerase (Eurogentec®) dans le tampon standard de réaction. Les cycles de
température sont les suivants : une dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min, suivie de X
cycles constitués chacun de 3 étapes [dénaturation à 95 °C 30 sec, T °C d'hybridation 30 sec,
extension à 72 °C 1 min], puis une extension finale à 72 °C pendant 30 min. Le nombre de cycles
X et la température d'hybridation étaient de 30 cycles et 55 °C pour GT023, 35 cycles et 60 °C
pour GT211, 30 cycles et 60 °C pour GT575, 29 cycles et 61 °C GATA053 et 33 cycles et 57 °C
pour GATA417. Un témoin négatif sans ADN a été inclus dans chaque PCR. Après dilution au
1/18e dans de la formamide, les tailles des produits PCR fluorescents ont été déterminées grâce
à un séquenceur à capillaire 3130 xl Genetic Analyser (Applied Biosystems®) au laboratoire
INSERM U 613 (Brest) en présence d’un marqueur de taille fluorescent (GeneScan-500®). Les
différents allèles ont été identifiés visuellement et caractérisés sur la base de leur taille en
paires de base à l'aide du logiciel GeneMarker 2.4 (SoftGenetics®).
14
Analyse du polymorphisme des microsatellites
Lorsque 2 prélèvements présentaient le même génotype pour tous les microsatellites analysés,
la probabilité que cela soit du au hasard a été déterminée d'après la formule
P = [ 2 f(A1) f(A2) ] x [ 2 f(B1) f(B2) ] x (...) x [ 2 f(N1) f(N2) ], avec f(N1) = la fréquence de l'allèle 1 au
locus N. Le nombre moyen d’allèles par locus, l'hétérozygotie attendue (HE) sous les hypothèses
d'Hardy-Weinberg (Nei, 1987) et observée (HO) ont été calculés avec le logiciel Genetix (Belkhir
et al., 2004). La richesse allélique a été estimée avec FSTAT 2.9 (Goudet, 2001). La déviation par
rapport aux proportions d’Hardy-Weinberg attendues dans une population panmictique a été
évaluée grâce au calcul de FIS (Wright, 1969). FIS = 1 signifie la fixation complète d'un allèle, FIS <
1 = hétérozygotie excédentaire, FIS > 1 = homozygotie excédentaire (consanguinité) et FIS = 0
signifie que la population est à l'équilibre de Hardy-Weinberg. Les déséquilibres de liaison entre
locus ont également été calculés à l'aide d'un test de 100 000 permutations intégré dans FSTAT
2.9. L'équilibre d'Hardy-Weinberg a été évalué à chaque locus avec Genepop 4.2 (Raymond &
Rousset, 1995) à l'aide d'un test de probabilité basé sur la méthode de Monte-Carlo par chaînes
de Markov (Guo & Thompson, 1992). Les niveaux de différenciation génétique entre sousgroupes ont été quantifiés avec l'estimateur de FST de Weir & Cockerham (1984) sur FSTAT 2.9.
Un algorithme de groupement basé sur l'inférence bayésienne, mis en place dans le logiciel
Structure 2.3 (Pritchard et al., 2000 ; Hubisz et al., 2009), a été utilisé pour chercher l’occurrence
de groupes génétiques indépendants (K). Le nombre de groupes (K) a été testé de 1 à 5 ainsi que
divers paramètres. Les résultats obtenus sont les probabilités a posteriori qu’un individu
appartienne à chaque groupe. Le nombre de groupes K s’appliquant le mieux au jeu de données
était celui pour lequel la probabilité postérieure LnP(D) était maximisée (Evanno et al., 2005).
Mise en relation avec les formations sociales
Les résultats génétiques obtenus ont été mis en relation avec le type de formations sociales
auxquelles appartenaient les individus échantillonnés. L'arbre phylogénétique des individus,
réalisé à partir des séquences de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial, a été mis en
parallèle avec les différents groupes compétitifs échantillonnés dans le but de visualiser
graphiquement si une proximité génétique existait entre les individus au sein d'un même
groupe. Le test de Fischer a été utilisé afin de détecter une répartition des individus au sein de
sous-groupes différente que celle attendue d'après le hasard.
15
RESULTATS
Echantillonnage
Soixante-sept prélèvements récoltés à Madagascar entre le début du mois de juillet et le début
du mois de septembre 2012 ont été conservés dans l'alcool et transportés jusqu'au laboratoire
BioGeMME à Brest pour les analyses. D'après les données de terrain, 2 individus ont été
échantillonnés 2 fois. L'analyse génétique, notamment des microsatellites, a démontré avec une
probabilité extrêmement forte l'existence de 5 autres doublons. Soixante individus ont donc été
considérés tout au long des analyses. L'exploitation en parallèle de 5 biopsies de baleines à
bosse provenant de Saint-Pierre-et-Miquelon a permis la comparaison avec un groupe éloigné
géographiquement.
Extraction de l'ADN
Les extractions de l'ADN de 58 prélèvements avaient déjà été effectuées. L'extraction de l'ADN
du reste des prélèvements, ainsi que ceux de Saint-Pierre-et-Miquelon, a donc été réalisée (14
prélèvements). Toutes les biopsies et squames ont permis d'extraire de l'ADN de qualité a priori
équivalente mais en quantité très variable : 0,4 à 77,2 ng/µl dans 200 µl d'extrait total. Les
concentrations les plus faibles correspondaient le plus souvent à des extractions à partir de
squames. Au total, 72 extraits d'ADN génomiques ont été obtenus, correspondant à 60 individus
de Madagascar (dont 7 en double) et à 5 individus de Saint-Pierre-et-Miquelon.
Sexage moléculaire
Le sexage moléculaire a pu être réalisé à partir de tous les extraits d'ADN. La figure 3 montre un
résultat d'expérience typique. Après analyse, 51 prélèvements de Madagascar provenaient
d'individus mâles (dont 6 doublons) et 16 d'individus femelles (1 doublon). En terme d'individus,
45 étaient des mâles et 15 des femelles, soit un sex-ratio de 3:1 en faveur des mâles.
Concernant les 5 biopsies de Saint-Pierre-et-Miquelon, 2 provenaient de mâles et 3 de femelles.
16
Figure 3. Visualisation sur gel d'agarose du sexage moléculaire de 6 individus. T- : témoin négatif
(réaction PCR sans ADN). Le marqueur de taille (M) a été déposé dans les 2 puits extérieurs.
Polymorphisme de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial
Les 72 extraits d'ADN ont permis d'amplifier des fragments dont la longueur des séquences
variait de 649 nt à 652 nt. La taille de la séquence commune à tous les échantillons était de 648
nt. Toutes les séquences ont été alignées et comparées entre elles. L'échantillonnage provenant
de Madagascar se caractérisait par une diversité génétique très importante (tableau 2). Sur les
60 individus étudiés, 49 sites variables ont permis de définir 36 haplotypes partagés par 1 à 4
individus (tableau 3). Vingt-et-une séquences n'étaient possédées que par un seul individu. La
diversité haplotypique était très élevée (Hd = 0,980).
Tableau 2. Nombre d’individus (N), nombre de sites polymorphes (S), nombre d’haplotypes (h),
diversité haplotypique (Hd) et diversité nucléotidique (π) pour l'échantillonnage de la
population de Madagascar et de Saint-Pierre-et-Miquelon. L'écart-type est entre parenthèses.
Populations
N
S
h
Hd
π
Madagascar
60
49
36
0,980 (0,007)
0,016 (0,001)
Saint-Pierre-et-Miquelon
5
20
4
0,900 (0,161)
0,014 (0,004)
17
Tableau 3. Positions variables des 40 haplotypes de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial définis dans
cette étude (H1 à H36 : Madagascar, HSPM1 à HSPM4 : Saint-Pierre-et-Miquelon). La séquence de l'haplotype 1
est prise en référence. Un nucléotide identique est indiqué par un point. N : nombre d'individus partageant
l'haplotype. Les positions ont été établies en fonction de la séquence déterminée dans cette étude. La position 1
correspond à la position 15 522 de la séquence complète du génome mitochondrial de la baleine à bosse (Sasaki
et al., 2005).
N
Haplotypes
25
32
38
45
53
54
56
67
69
71
95
96
97
104
105
116
117
131
132
137
141
143
153
159
163
207
215
216
217
218
223
224
229
231
233
234
235
236
238
243
254
255
256
276
286
317
350
407
417
418
462
650
Position
18
H1 G
H2 .
H3 .
H4 A
H5 .
H6 .
H7 .
H8 .
H9 .
H10 .
H11 .
H12 .
H13 .
H14 .
H15 .
H16 .
H17 .
H18 .
H19 .
H20 .
H21 .
H22 .
H23 .
H24 .
H25 .
H26 .
H27 .
H28 .
H29 .
H30 .
H31 .
H32 .
H33 .
H34 .
H35 .
H36 .
HSPM1 .
HSPM2 .
HSPM3 .
HSPM4 .
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2
2
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1
4
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3
4
3
4
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1
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1
1
1
1
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1
1
1
1
2
1
1
1
Haplogroupe 1
Haplogroupe 2
Figure 4. Réseau haplotypique de l'échantillonnage de la population de baleines à bosse de
Madagascar (H1 à H36) et de Saint-Pierre-et-Miquelon (HSPM1 à HSPM4). Les femelles sont
représentées en rose et les mâles en jaune. Les nœuds gris symbolisent des haplotypes non
détectés durant l’étude mais nécessaires à la construction la plus parcimonieuse du réseau.
Aucun haplotype de Madagascar n'est retrouvé chez les baleines à bosse de Saint-Pierre-et
Miquelon.
19
Deux haplogroupes significativement différents ont pu être distingués sur le réseau
haplotypique (figure 4). Les mâles et les femelles de l'étude sont légèrement différenciés mais
de façon significative (FST = 0,052, p = 0,033). Les femelles sont significativement plus
nombreuses dans l'haplogroupe 2 que dans l'haplogroupe 1 (χ2 = 5,122, p = 0,020, df = 1).
Les séquences déterminées chez les baleines à bosse de Saint-Pierre-et-Miquelon ne sont pas
partagées avec les séquences de Madagascar, mais 3 des 4 haplotypes apparaissent dans
l'haplogroupe 1 (HSPM1, HSPM2, HSPM4), tandis que HSPM3 apparait dans l'haplogroupe 2
(figure 4).
Tableau 4. Valeurs des différents tests de neutralité (D de Tajima, Fu & Li's D* et F*, Fs de Fu)
pour l'échantillonnage complet de la population de Madagascar, l'haplogroupe 1 et
l'haplogroupe 2. Les valeurs significatives sont en gras.
Populations
D de Tajima
Fu & Li's D*
Fu & Li's F*
Fs de Fu
Madagascar
-0,196 (ns)
0,355 (ns)
0,176 (ns)
-12,568 (p = 0,005)
Haplogroupe 1
-0,131 (ns)
0,310 (ns)
0,199 (ns)
-2,238 (ns)
Haplogroupe 2
-0,117 (ns)
0,227 (ns)
0,132 (ns)
-5,115 (p = 0,039)
Aucune des valeurs du D de Tajima et de Fu & Li n'étaient significatives (tableau 4). Le test de
neutralité Fs de Fu présentait en revanche des valeurs négatives et significatives pour
l'échantillonnage de la population de Madagascar (Fs = -12,568, p = 0,005) et pour l'haplogroupe
2 de Madagascar (Fs = -5,115, p = 0,039).
20
Polymorphisme des microsatellites
Les réactions d'amplification des 5 microsatellites ont été effectuées pour les 72 prélèvements
de baleines à bosse (67 de Madagascar et 5 de Saint-Pierre-et-Miquelon). Sur les 360 profils au
total, 343 ont pu être exploités, soit 95 %. Certains microsatellites présentaient un signal très
intense qui pouvait se retrouver de manière très atténuée dans les profils des autres
fluorochromes. Cet artefact technique n'a pas gêné l'exploitation. Les profils de GT023
présentaient une contamination d'intensité faible et donc non ambigüe. Sur les 72
prélèvements, 14 possédaient les mêmes profils 2 à 2 pour les 5 loci analysés. Il s'agissait de 2
doublons notés pendant la campagne de biopsies, et, selon de très fortes probabilités, de 5
doublons non identifiés pendant la campagne de biopsie. Les probabilités de partager le même
génotype par hasard allaient de 4,5.10-9 à 1,4.10-5 selon les 7 paires de prélèvements concernés.
Tableau 5. Bilan des 5 loci microsatellites utilisés, par locus et en moyenne, pour la population
de Madagascar. N = nombre d'individus, nA = nombre d'allèles, A = richesse allélique,
HE = hétérozygotie attendue sous les hypothèses d'Hardy-Weinberg, HO = hétérozygotie
observée, FIS = indice de fixation d'après Weir & Cockerham (1984).
Locus
Référence
Taille allèles
N
nA
A
HE
HO
FIS
GT023
Berube et al. (2003)
105-117
59
7
7,00
0,797
0,831
-0,033
GT211
Berube et al. (2003)
193-211
53
9
9,00
0,825
0,849
-0,020
GT575
Berube et al. (2003)
140-168
60
12
11,86
0,823
0,883
-0,058
GATA053
Palsbøll et al. (1997)
232-276
59
8
7,90
0,812
0,780
0,048
GATA417
Palsbøll et al. (1997)
185-277
57
15
14,92
0,914
0,895
0,030
57,6 10,2 10,14
0,835
0,848
-0,006
Tous
Sept à 15 allèles ont été observés selon les microsatellites (tableau 5). La richesse allélique
variait de 7,00 (GT023) à 14,92 (GATA417). L'hétérozygotie observée et attendue allaient de Ho
= 0,780 à Ho = 0,895 et He = 0,797 à He = 0,914. Aucun locus ne présentait de déséquilibre de
liaison (p > 0,05). Les fréquences alléliques n'ont pas montré d'écart à l'équilibre d'HardyWeinberg significatif, ni pour l'échantillonnage global (FIS = -0,006, p = 0,410), ni pour chaque
sous-groupe basé sur les haplogroupes mitochondriaux (haplogroupe 1 : FIS = 0,009, p = 0,610 et
haplogroupe 2 : FIS = -0,020, p = 0,300).
21
Aucune différence significative des fréquences alléliques des loci nucléaires n'a été détectée
entre les 2 haplogroupes mitochondriaux (FST = -0,001, p = 0,290), entre les mâles et femelles
(FST = -0,002, p = 0,450) et entre les individus de Madagascar et ceux de Saint-Pierre-etMiquelon (FST = -0,006, p = 0,750). Les valeurs de FST négatives reflètent l'imprécision de
l'algorithme utilisé par le logiciel pour estimer cette valeur.
D'éventuelles sous-divisions de la population ont également été recherchées par une analyse
bayésienne de groupement à l'aide du logiciel Structure 2.3. Les données n'ont révélé aucune
sous-division de la population pour tous les paramètres testés (figure 5A). Chaque individu
possédait une probabilité égale d'appartenance à chaque groupe pour tous les nombres de
groupes (K) testés, et celui expliquant le mieux les données était K = 1 (figure 5B).
(K)
A
B
NOADM-AFC
ADM-AFC
K=2
ADM-AFI
[LnP(D)]
NOADM-AFI
K=3
Figure 5. A) Probabilités des individus d'être assignés à chaque groupe génétique sans aucune
information a priori pour K = 2 et K =3. Chaque individu est représenté par une barre verticale
au sein de K groupes génétiques. B) Probabilités postérieures moyennes [LnP(D)] en fonction du
nombre de groupes K et de 4 paramètres : ADM = Admixture Model, NOADM = No Admixture
Model, AFC = Allele Frequencies Correlated, AFI = Alleles Frequencies Independant.
Mise en relation avec les formations sociales
Les biopsies ont été réalisées dans le canal Sainte-Marie à Madagascar, entre le 05 juillet et le
05 septembre 2012, lors d'une même saison de reproduction et de mise bas. Les individus
échantillonnés appartenaient le plus souvent à un groupe compétitif (n = 31) ou à une paire
d'adultes (n = 15). Aucun lien particulier entre l'appartenance à un groupe social et à un
haplogroupe n'apparaissait (figure 6).
22
35
Nombre d'individus
30
Haplogroupe 1
25
20
15
Haplogroupe 2
10
5
0
GC
PA
PJ
MBE
MB
Types de formations sociales
AS
JS
Figure 6. Comparaison entre l'appartenance à l'un des 2 haplogroupes mitochondriaux et les
formations sociales des individus échantillonnés à Madagascar. GC = groupe compétitif, PA =
paire d'adultes, PJ = paire de juvéniles, MBE = mère-baleineau-escorte, MB = mère-baleineau,
AS = adulte solitaire, JS = juvénile solitaire.
Un arbre phylogénétique a été construit à partir des séquences mitochondriales des individus
selon la méthode du maximum de vraisemblance afin d'être mis en correspondance avec les
différentes formations sociales échantillonnées (figure 7). Les mâles des 7 groupes compétitifs
pour lesquels au moins 2 individus ont été échantillonnés sont représentés sur la figure 7. On
voit que les mâles d'un même groupe compétitif sont répartis de façon égale entre les 2
haplogroupes mitochondriaux (F-test, p = 0,910).
Contrôles qualité expérimentaux
Des contrôles ont été effectués à chaque étape des analyses. Le principal contrôle expérimental
a consisté à répéter l'analyse (réextraction de l'ADN, sexage moléculaire et séquençage de la
région de contrôle de l'ADN mitochondrial) de 7 échantillons de baleines à bosse (6 en contrôle
à l'aveugle et un volontairement sélectionné). Les mêmes résultats ont été obtenus. Les 2 brins
d'ADN de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial ont été séquencés pour tous les
prélèvements. De plus, une fraction significative (au moins 10 %) des chromatogrammes de
séquences et des profils de microsatellites ont été réanalysés par un autre membre du
laboratoire et aucune différence n'a été détectée.
23
Haplogroupe 1
Haplogroupe 2
Figure 7. Arbre construit selon la méthode du maximum de vraisemblance montrant les liens
entre les mâles des différents groupes compétitifs et leurs séquences de la région de contrôle
de l'ADN mitochondrial. Les ronds de couleur indiquent le groupe compétitif auquel les individus
appartenaient. La barre d’échelle représente 0,6 % de divergence. Les chiffres au-dessus des
branches représentent les pourcentages de bootstrap pour le nœud situé à droite (seules les
valeurs supérieures à 60 % sont indiquées). Les arbres construits par parcimonie et neighborjoining avaient des structures très similaires.
24
DISCUSSION
Echantillonnage
La campagne de prélèvements a permis de récolter 72 biopsies et squames sur des individus
constituant le plus souvent des groupes compétitifs ou des paires d'adultes. Les autres types de
formations sociales étaient des paires de juvéniles, des associations de type mère-baleineauescorte ou mère-baleineau, ainsi que des adultes et des juvéniles solitaires. Tous les
prélèvements ont permis d'extraire de l'ADN en qualité suffisante pour mener à bien les
analyses de sexage et de polymorphismes de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial et de
microsatellites. Sept individus échantillonnés 2 fois lors des campagnes de biopsies ont pu être
détectés, dont 5 individus biopsiés 2 fois au cours d'une même observation. Ces individus sont
donc restés accessibles après le premier prélèvement, suggérant un dérangement minime induit
par le prélèvement de biopsies.
Biais du sex-ratio en faveur des mâles
Le sex-ratio observé en faveur des mâles est similaire à celui reporté durant la chasse
commerciale (Mackintosh, 1942 ; Chittleborough, 1965) et dans les études contemporaines
portant sur d'autres sites de reproduction (e.g. Brown et al., 1995 ; Craig & Herman, 1997 ;
Baker et al., 1998 ; Olavarria et al., 2007). Ce biais peut s'expliquer par une proportion de
femelles qui, en vue des coûts énergétiques élevés liés à la migration et à la reproduction, ne
migrent apparemment pas systématiquement chaque année vers les sites de reproduction
(Craig & Herman, 1997). Le sex-ratio sur les sites d'alimentation est par contraste généralement
équilibré, proche de 1:1 (e.g. Clapham et al., 1995 ; Palsbøll et al., 1997, Smith et al., 1999).
Diversité génétique élevée
L'échantillonnage réalisé dans un secteur géographique restreint du canal Sainte-Marie et sur
une période de temps limitée pouvait a priori laisser présager une diversité génétique modeste
avec des individus relativement proches. L’analyse de la région de contrôle de l’ADN
mitochondrial révèle pourtant une diversité génétique très importante : les 60 individus étudiés
25
ont permis de caractériser 36 haplotypes différents. Les diversités haplotypique et nucléotidique
sont donc très élevées au sein de notre échantillonnage pourtant restreint (Hd = 0,980 et
π = 0,016). Dans une étude à l'échelle de l'hémisphère sud, Rosenbaum et al. (2009) avaient
déterminé à partir de prélèvements collectés entre 1996 et 2001 dans 2 régions combinées de
Madagascar (baie d'Antongil et sud de Madagascar) des indices de diversité similaires (Hd =
0,978 et π = 0,021) mais moins d'haplotypes par rapport au nombre d'individus étudiés (N =
511, h = 93). D'autres sites de reproduction précédemment étudiés dans l'hémisphère sud
montraient également une forte diversité génétique. Dans le sud du Pacifique par exemple, 115
haplotypes avaient été obtenus à partir de 1 112 échantillons provenant de différents sites de
reproduction entre 1990 et 2002 (Olavarria et al., 2007), reflétant une diversité génétique
importante (Hd = 0,900-0,974 et π = 0,019-0,0212 selon les sites). Ces résultats sont élevés par
rapport aux populations des autres océans. La diversité génétique de l'hémisphère nord semble
plus faible que celle de l'hémisphère sud. Dans le cadre du programme geneSPLASH (Baker et
al., 2008), une étude menée entre 2004 et 2006 sur 1 856 individus du Pacifique nord (10 sites
d'alimentation et 8 sites de reproduction) a permis de caractériser 28 haplotypes seulement.
Une autre étude portant sur 302 baleines à bosse du golfe du Maine entre 1988 et 1992 au
nord-est des Etats-Unis a révélé 17 haplotypes possédés par 1 à 123 individus avec une diversité
haplotypique égale à 0,795 (Weinrich et al., 2006). Concernant les 5 individus de Saint-Pierre-etMiquelon, utilisés comme outgroup, l'éloignement géographique laissait présager qu'aucun
contact récent n'avait eu lieu avec la population de Madagascar. Aucun individu ne partage en
effet d'haplotype avec Madagascar.
La diversité génétique élevée de la population de Madagascar peut signifier que la chasse
commerciale n'a pas assez réduit la taille de la population ou n'a pas duré assez longtemps pour
se traduire par un impact significatif sur la variabilité génétique (Baker et al., 1993 ; Amos,
1996). Bien que les baleines à bosse aient été chassées à des fins commerciales dès 1611 (Stone
et al., 1987), les prélèvements les plus importants sont récents et ont été de courte durée. Deux
grands épisodes de chasse à la baleine ont eu lieu au 20ème siècle dans les eaux côtières de
Madagascar, de 1937 à 1939 et de 1949 à 1950. Les baleines à bosse représentaient au moins
95 % des captures durant les 2 périodes (Best et al., 1996). En considérant le temps de
génération de la baleine à bosse de 12 à 24 ans (Roman & Palumbi, 2003), il est possible qu'elles
aient subi une diminution des effectifs sans que cela se traduise par une perte majeure de
diversité génétique. Cette diversité génétique élevée pourrait également provenir de
26
mouvements récents d'individus entre populations, où l'arrivée de nouveaux allèles aurait pu
compenser d'éventuelles pertes de diversité liées à la chasse.
Le D de Tajima obtenu pour la population de Madagascar n'est pas significatif. A l'opposé, le Fs
de Fu est significativement négatif (Fs = -12,568). D'après Fu (1997), le Fs est un paramètre plus
sensible pour détecter des phénomènes d'expansions de populations que le D de Tajima, et plus
particulièrement à partir de régions génomiques non-recombinantes (Ramirez-Soriano et al.,
2008). Le D de Tajima compare l'estimation du paramètre de mutation θ = 4Neµ obtenue à
partir du nombre de sites polymorphes à celle obtenue à partir du nombre moyen de
différences entre 2 séquences (π). Il sera significatif si un haplotype majoritaire central est
entouré d'haplotypes proches moins représentés (configuration en étoile), signe d'une
expansion récente. Le réseau haplotypique de cette étude montre une diversité génétique
importante et une absence d'haplotype dominant, ce qui explique le D de Tajima non
significatif. Le Fs de Fu se base sur la relation attendue entre π et le nombre d'haplotypes. La
valeur largement négative du Fs de Fu pour la population de Madagascar pourrait alors indiquer
un apport récent d'haplotypes. Cette observation est cohérente avec l'hypothèse évoquée
précédemment d'un apport de nouveaux allèles par des individus provenant d'autres
populations possédant des haplotypes différents. L'haplogroupe 2, pour lequel le Fs est
significatif, comprend des haplotypes peu divergents les uns des autres et aucun haplotype
dominant. Dans l'haplogroupe 1, où des écarts plus importants sont observés entre les
haplotypes, ni le D ni le Fs ne sont significatifs. Ceci suggère des histoires ancestrales
potentiellement différentes pour ces 2 groupes.
Structure génétique d'après la région de contrôle de l'ADN mitochondrial
L'existence de 2 haplogroupes mitochondriaux significativement différenciés apparaissant
clairement sur le réseau haplotypique n'est pas aisée à expliquer. Elle n’est pas liée à la
répartition géographique des prélèvements car toutes les biopsies ont été réalisées dans un
même secteur du canal Sainte-Marie. Un décalage dans le temps de l'échantillonnage aurait pu
mener à l'étude de 2 groupes qui ne croisent pas et donc ne se mélangent pas. Il est en effet
connu que les baleines n'arrivent pas toutes en même temps sur les sites de reproduction
(Stevick et al., 2003). Néanmoins, les biopsies ont été réalisées sur 2 mois consécutifs lorsque
les baleines étaient déjà présentes sur le site et aucune corrélation n'a été observée entre la
27
date de prélèvement et l'appartenance à un haplogroupe. Les 2 haplogroupes ont aussi été mis
en relation avec le type de formation sociale des individus. Les mâles d'un même groupe
compétitif ne se répartissaient pas significativement plus souvent au sein d'un même
haplogroupe (F-test, p = 0,910). La p-value élevée suggère que ce résultat est robuste et n'est
probablement pas un biais lié à la taille de l'échantillonnage.
Une observation particulièrement intéressante est le faible nombre d'haplotypes partagés entre
les mâles et les femelles et le fait qu'un des 2 haplogroupes comprenne la majorité des femelles
de l'échantillonnage (χ2 = 5,122, p = 0,020). Une hypothèse pourrait être que l’appartenance à
cet haplogroupe est liée à une fidélité plus grande au site de reproduction, tandis que la
présence sur le site du faible nombre de femelles de l'autre haplogroupe serait plus
occasionnelle. Un suivi est nécessaire afin de vérifier si cette situation se répète sur plusieurs
années ou si elle n'est due qu'à un hasard d'échantillonnage. De façon intéressante, les individus
de Saint-Pierre-et-Miquelon, qui ne partagent pas d'haplotypes avec Madagascar, ne forment
pas pour autant un groupe distinct génétiquement éloigné mais se répartissent au sein des
arbres et réseaux. De plus, un des 5 individus ne se situe pas dans l'haplogroupe comprenant les
4 autres individus de Saint-Pierre-et-Miquelon. La proximité génétique entre les baleines à
bosse de ces 2 régions éloignées est un résultat inattendu. L'expansion de l'échelle
géographique de l'étude est envisagée par le laboratoire afin de mieux comprendre la diversité
génétique de l'espèce à l'échelle mondiale.
Pas de structure génétique d'après les microsatellites
L'analyse des polymorphismes des microsatellites a apporté des résultats différents de celle de
l'ADN mitochondrial concernant la structure génétique au sein de l'échantillonnage. Aucune des
analyses basées sur les fréquences alléliques ou sur les essais d’identification de groupes
génétiques par des approches bayésiennes n’ont détecté de sous-divisions génétiques.
L'absence d'écart à l'équilibre d'Hardy-Weinberg semble montrer que la population représente
un ensemble panmictique où les individus se reproduisent théoriquement au hasard (Hardy,
1908). Néanmoins, les données mitochondriales suggèrent l'existence de 2 groupes génétiques.
L'hypothèse d'un mélange récent entre 2 populations distinctes pourrait mener à ces
observations contrastées. L'équilibre d'Hardy-Weinberg peut être restauré après une génération
seulement si la population se comporte réellement comme une unité panmictique (Hartl &
28
Clark, 2007). Sachant que les baleines à bosse femelles atteignent la maturité sexuelle vers l'âge
de 5 ans (Clapham, 1992), quelques années seulement sont nécessaires pour produire des
baleineaux issus du mélange de 2 populations. Une autre hypothèse serait l'observation d'un
comportement différencié entre les males et les femelles (Rosel et al., 1999).
Fidélité au site de reproduction et flux de gènes
Les études génétiques ont montré que la fidélité aux sites d'alimentation et aux routes
migratoires, transmise par la mère, peut maintenir une structure à long terme des populations
de baleines à bosse (Baker et al., 1990). L'observation d'une structure génétique au niveau des
haplotypes mitochondriaux et non pas au niveau des microsatellites nucléaires peut être une
conséquence de cette ségrégation maternelle entre les différents sites d'alimentation reliés à un
site de reproduction commun. Dans l'hémisphère nord par exemple, le site d'alimentation du
sud-est de l'Alaska et celui de la baie du Prince-William sont connectés par une migration
saisonnière à Hawaii et se distinguent par des différences de fréquences haplotypiques. Le
phénomène est similaire entre la Californie et le Mexique (Baker et al., 1998). Il serait alors
possible que les 2 haplogroupes observés à Madagascar dans cette étude correspondent à 2
groupes d'individus qui fréquentent 2 sites d'alimentation distincts et se retrouvent sur le même
site de reproduction. Cependant, il faudrait pouvoir expliquer pourquoi les individus de sites
d'alimentation différents ne se reproduiraient pas entre eux.
Le faible nombre d'haplotypes partagés entre les mâles et les femelles observé ici peut signifier
(1) que très peu de descendants mâles étaient présents sur le site où se trouvaient leurs mères
et sœurs, (2) que les mères et sœurs des individus mâles observés étaient rarement présentes
sur le site. On peut supposer que les mâles puissent se rendre sur des sites de reproduction
différents de celui de leur naissance, permettant un éventuel flux de gène entre les sites de
reproduction. D'après Palumbi & Baker (1994), l'absence de structure des marqueurs nucléaires
peut résulter soit d'une dispersion préférentielle des mâles entre les sites de reproduction, soit
de la taille efficace de la population plus grande pour les gènes nucléaires. Un flux de gènes de
la part des mâles pourrait avoir lieu lors d'accouplements occasionnels avec d'autres
populations distinctes, au cours de la migration par exemple (Baker et al., 1998).
29
Génétique et structure sociale
Sur les sites d'alimentation, la prévalence d'associations à court-terme et le nombre non
significatif d'associations entre individus affiliés observés au nord de l'océan Atlantique
suggèrent que les liens de parenté n'ont pas d'influence sur les regroupements d'individus
(Clapham, 1992). Cependant, une étude récente dans la même région a observé que les
associations entre individus, et plus particulièrement entre femelles partageant le même
haplotype maternel, ne sont pas aléatoires (Weinrich et al., 2006). Une étude des affiliations des
individus au sein des groupes formés sur les routes migratoires, au large de l'est de l'Australie,
n'indiquait quant à elle aucun lien familial (Valsecchi et al., 2002). Sur les sites de reproduction
du Gabon et de Madagascar, aucune association significative entre individus apparentés n'a été
observée, hormis les mères et leur baleineau (Pomilla & Rosenbaum, 2006). L'absence de
relation entre la proximité génétique des individus de Madagascar et leur appartenance à un
même groupe social soutient également l'hypothèse d'une absence de liens familiaux au sein
des groupes présents sur ce site de reproduction. Cependant, le faible nombre d'individus
utilisés dans cette analyse exploratoire liant la génétique aux formations sociales permet
d'émettre une première hypothèse mais ne permet pas de tirer de réelles conclusions.
30
CONCLUSION & PERSPECTIVES
Cette étude génétique se situe au sein d'un projet pluridisciplinaire porté sur la population de
baleines à bosse observée chaque année dans le canal Sainte-Marie à Madagascar, pour laquelle
très peu d'informations sont disponibles. L'analyse génétique de 67 prélèvements de tissus a
permis l'identification de 60 individus dont 7 échantillonnés en double. Quarante-cinq mâles et
15 femelles ont été déterminés par sexage moléculaire, soit un ratio de 3:1 en faveur des mâles,
cohérent avec les valeurs observées sur les autres sites de reproduction. Le polymorphisme de
la région de contrôle de l'ADN mitochondrial a révélé une diversité génétique importante : 36
haplotypes ont été obtenus ainsi que des valeurs élevées de diversité haplotypique et
nucléotidique (Hd = 0,980 et π = 0,016). Il est donc possible que la diminution des effectifs liée à
la chasse industrielle du 20ème siècle n'ait pas induit une perte majeure de diversité génétique.
La valeur du test du Fs de Fu, significativement négative, marquait la présence d'un apport
récent d'haplotypes, peut-être du à des individus provenant d'autres populations. Deux
haplogroupes différenciés ont été caractérisés, dont un haplogroupe comportant la majorité des
femelles de l'étude. A l'inverse, aucune structure génétique n'a été détectée à l'aide des
microsatellites. L'hypothèse d'un mélange récent entre 2 populations distinctes pourrait mener
à ces différentes observations. Le faible nombre d'haplotypes partagés entre les mâles et les
femelles est également cohérent avec l'hypothèse d'un flux de gène de la part des mâles entre
les sites de reproduction, qui semble être de plus en plus privilégiée dans la littérature. La
fidélité aux sites d'alimentation reliés à un même site de reproduction étant transmise par la
mère, l'observation de 2 haplogroupes pourrait être alors liée à la présence d'individus
provenant de 2 sites d'alimentation différents. En considérant leurs valeurs contrastées de Fs de
Fu, ces 2 haplogroupes seraient susceptibles de posséder des histoires ancestrales différentes.
La mise en relation des résultats génétiques et des formations sociales observées allait dans le
sens d'une absence de relation entre la proximité génétique des individus de Madagascar et leur
appartenance à une même formation sociale. Cinq biopsies de Saint-Pierre-et-Miquelon
(Amérique du Nord) ont également été incluses dans les analyses en tant qu'outgroup et n'ont
pas formé de groupe génétique éloigné de Madagascar, entraînant des questionnements quant
à la diversité génétique mondiale de l'espèce.
31
Le projet dans lequel s'inscrit cette étude génétique est d'une durée de 3 ans (2012-2014). Deux
autres campagnes de prélèvements sont prévues et permettront d'agrandir l'échantillonnage.
Les observations et hypothèses posées dans ce rapport pourront alors être confirmées ou
infirmées. L’étude des microsatellites permettant d’identifier individuellement les individus, les
données pourront être utilisées en complémentarité de la photo-identification. Il sera alors
possible de réaliser des estimations d'abondance, d'étudier les liens familiaux et de voir si les
mêmes individus reviennent chaque année sur le site de reproduction. Afin d'étudier les
déplacements individuels, les résultats obtenus seront comparés à ceux des autres régions de
reproduction, ainsi qu’avec des échantillons pouvant être prélevés sur les sites d’alimentation.
En addition, des individus équipés de balises à partir de l'île Sainte-Marie et d'autres localités de
l'océan Indien permettent d'étudier les mouvements entre les sous-divisions du groupe C3 et de
comparer les schémas migratoires vers les sites d’alimentation antarctiques (Cerchio et al.,
2013).
Enfin, le laboratoire a pour projet d'agrandir l'échelle de l'étude génétique en incluant d'autres
biopsies de Saint-Pierre-et-Miquelon, mais également d'Alaska et du Kamtchatka. De plus, les
séquences mitochondriales disponibles sur la base de données Genbank pourront être intégrées
aux analyses afin de permettre une étude de la structure génétique de la baleine à bosse à
l'échelle mondiale.
32
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37
RESUME
Cette étude génétique fait partie d'un projet pluridisciplinaire d'étude des baleines à bosse
(Megaptera novaeangliae) de Madagascar. L'ADN contenu dans 67 prélèvements récoltés en
2012 dans le canal de l'île Sainte-Marie a été analysé : le sexe des individus a été déterminé,
ainsi que les polymorphismes de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial et de 5 loci
nucléaires contenant des microsatellites. Le sex-ratio largement en faveur des mâles est
cohérent avec celui observé sur les autres sites de reproduction. La diversité génétique est très
élevée et 2 haplogroupes différenciés apparaissent d'après l'analyse du marqueur
mitochondrial, alors qu'aucune structure n'est détectée à l'aide des polymorphismes de
microsatellites. Aucune relation entre la proximité génétique des individus de Madagascar et
leur appartenance à une même formation sociale n'est observée. Différentes hypothèses
pouvant expliquer ces résultats sont discutées en regard de la biologie de l'espèce et des
notions classiques de génétique des populations.
ABSTRACT
This genetic study is part of a multidisciplinary project aiming to study humpback whales
(Megaptera novaeangliae) in Madagascar. The DNA of 67 samples, collected in 2012 off the
northeast coast of Madagascar, was analyzed: sex of individuals was determined, as well as
polymorphisms at the mitochondrial DNA control region and at 5 microsatellite-containing
nuclear loci. The sex ratio widely towards males is consistent with that observed in other
breeding sites. Genetic diversity is very high and two differentiated haplogroups appear
according to the mitochondrial marker whereas no genetic structure was detected on the basis
of microsatellite polymorphisms. No relationships were detected between genetic data and
belonging to the different social groups. Different assumptions that could explain these results
are discussed by taking into account the biology of the species and rules of population genetics.