Comment identifier les gènes impliqués dans des maladies
publicité
Comment identifier les gènes impliqués dans des maladies ? • Trouver des familles où la maladie ségrège • Trouver le gène candidat • Confirmer le gène candidat Analyse des familles Principe: transmission plus fréquente de la maladie avec un marqueur génétique Analyse des malades Malades non malades Principe: la maladie apparaît avec une fréquence plus élevée pour un allèle spécifique d’un marqueur donné Les différents cas de recherche du gène candidat Approche biochimique : la fonction de la protéine impliquée est connue exemple du facteur VIII de coagulation et de l’hémophilie Cascade d’activation lorsqu’un vaisseau sanguin est lésé Techniques utilisée pour trouver le gène impliqué dans l’hémophilie de type A Fig. 11.16 d Approche positionnelle avec l’aide d’accidents chromosomiques Recherche du gène de la DMD On récupère de l'ADN d'une lignée cellulaire XXXXY et d'une lignée correspondant à l’individu BB décrit précédemment. L'ADN XXXXY est coupé par l'enzyme de restriction MboI et l'ADN BB est découpé aux ultrasons pour obtenir une taille de 1 kb. Les deux ADN sont dénaturés et mis à hybrider avec un large excès d'ADN BB. On utilise la technique PERT (phénol enhanced reassociation technique) qui permet d’accélérer très fortement la réaction. On obtient des duplex : BB homoduplex BB/X+ hétéroduplex X+/X+ extrêmités compatibles avec d'autres enzymes de restriction comme BamHI devant correspondre à la zone délétée chez BB. Ces ADN sont clonés dans un plasmide. Total 125 pas de signal 12 répétés 32 uniques 81 sur l’X 18 absent chez BB 4 Ils vont récupérer ainsi 125 clones dont 4 se révèlent spécifiques de la région délétée chez BB. Réactions de PCR multiplex 1 2 3 4 5 N 45 19 1ère réaction 48 17 51 8 12 44 4 1 2 3 4 5 N 3 2ème réaction Patients: 1,2,3,4 et 5 individu normal : N 43 50 13 6 47 60 52 Approche positionnelle Le clonage positionnel identifiera un gène à partir d’une localisation approximative sur les chromosomes. Cette approche est utilisée lorsque la nature du produit du gène candidat est inconnue. Le gène candidat sera identifié par la combinaison de sa localisation, son expression et sa qualité chez les malades. Les différentes étapes 1 – Collection d’un grand nombre de famille avec des malades 2 – Identification d’une région candidate la plus petite possible par cartographie génétique 3 – Rechercher à partir de la séquence du génome humain les gènes de la région 4- Identifier les candidats potentiels 5 – confirmer le gène candidat Identification de la région candidate La carte génétique Les marqueurs utilisés : RFLPs, SSLPs, SNPs Analyse de liaison (Lod scores) Carte des Halpotypes HapMap 2005 Nature Exemple de la recherche du gène de la mucoviscidose Localisation du gène Une des retombées de ce type de travail : le test génétique Confirmation du gène candidat Recherche des mutations chez les maladesUtilisation des souris transgéniques Ko du gène : phénotype ?
