SEA - Prodinra
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Les nouvelles techniques de dénombrement et de détection des micro-organismes dans les aliments : généralités et exemple du développement d’un immunocapteur Michel Gautier, Souhir Boujday, Romain Briandet, Michèle Salmain, ClarisseTecher, Florence Val et Claire Marie Pradier 2ndCongrès Maghrébin sur les Toxi-infections Alimentaires Hammamet 14 et 15 décembre 2011 UMR STLO Que doit-on rechercher dans les aliments? Certains pathogènes doivent être absents Certains groupes bactériens doivent se trouver en quantité limitée Certaines bactéries pathogènes doivent se trouver en quantité limitée Il faut détecter Il faut dénombrer Il faut dénombrer I Le Dénombrement et la détection: les méthodes de référence La méthode de référence: la culture sur milieu nutritif (CEN, AFNOR, ISO…) Le Dénombrement 1 ml de chaque dilution dans une boîte de pétri Ajout du milieu nutritif anaérobiose (pas d’oxygène) L ’échantillon (fromage) est broyé et dilué Ex des bactéries propioniques dans l’emmental 1 colonie= Présomption et non identification 1 bactérie dans le fromage incubation ( 30°C , 5 jours) La détection Enrichissement : Multiplication du microorganisme Culture sur milieu sélectif Identification biochimique ou sérologique Dénombrement et détection sur milieux gélosés Limite de dénombrement très basse Avantages 10 cellules/gr d’aliment solide 1 cellule/ml de liquide Faible coût (matériel) Peu de matériel sophistiqué (matériel de base d’un labo de microbiologie) Croissance des cellules vivantes et non des mortes Techniques validées depuis très longtemps Pas d’extraction des bactéries à partir de la matrice alimentaire Dénombrement et détection sur milieux gélosés • temps de réponse très long • technique lourde Diminue la DLC Inconvénients Pertes économiques Moins d’échantillons analysés • erreurs dues aux manipulations humaines • absence de certains milieux sélectifs • sous estimation du nombre de micro-organismes Haut coûts d’invention micro-organismes « abîmés » (formes viables non cultivables) • Pas de détection des virus ni des toxines bactériennes II Les méthodes alternatives de détection et dénombrement Principes semblable aux méthodes de référence Pétrifilm Ensemenceur spiral Microméthode Milieux chromogènes Principes différents des méthodes de référence Quantification directe des cellules Quantification indirecte -de l’ADN -des antigènes spécifiques Les méthodes alternatives de détection et dénombrement la cytométrie de flux Broyage de l’aliment Tampon de solubilisation Marquage Filtration des bactéries Centrifugation Quantification directe des cellules Passage en cytomètre de flux Comptage Viability substrate Enzyme Free fluorochrome Bacteria Dénombrement: -flore totale -levures Détection: -entérobactéries -salmonelles (viande) Utilisable sur tous les aliments La cytométrie à balayage laser filtrations Activation marquage Comptage des bactéries sur le filtre 1 cellule/unité de volume filtré Utilisable surtout sur aliments filtrables Peut dénombrer la flore totale Utilisée pour: eau, air, contrôle des fermentations Avec des anticorps peut dénombrer des flores plus spécifiques (gardia, cryptosporidium) Cytométrie de flux ou à balayage Avantages Inconvénients Dénombrement de la flore totale Investissement de départ élevé Dénombrement des cellules vivantes Difficulté de dénombrer spécifiquement une espèce donnée Détection rapide de certains groupes microbiens Technique très rapide (1h30 à 3h) Très efficace sur les liquides: limite de dénombrement de 1cellule/unité filtrée Souvent nécessité d’extraire les bactéries de la matrice alimentaire Limite de détection 102 à 103:pour les aliments solides: -dépend des matrices alimentaires -trop élevée pour de nombreux pathogènes Pas de détection des virus ni des toxines Les méthodes alternatives de détection et dénombrement Quantification indirecte des cellules: -quantification de l’ADN la PCR en temps réel Broyage Récupération des bactéries Lyse des bactéries Extraction de l’ADN PCR Lecture des résultats en temps réel 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 0 Bax, Bio-Rad, ADNucleis, Pall GeneSystems… 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Signal d'amplification PCR Fluorescence mesurée Analyse de trois échantillons 12000 11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 + contaminé - contaminé seuil 0 10 20 Ct 30 Ct 2 40 Dénombrement et/ou détection de toutes les espèces Nombre de1 cycles PCR Déduction du nombre de copies du génome dans l’échantillon Déduction du nombre de bactéries dans l’échantillon 350 Unité de fluorescence La valeur du CT est utilisée et comparée avec une gamme d’étalonnage 300 250 5 copies 200 50 copies 150 500 copies 100 5000 copies 50000 copies 50 0 -50 0 5 10 15 20 25 30 Nombre de cycle 35 40 45 Peut être automatisée: ex de PALL- GeneSystems la PCR en temps réel Avantages Dénombrement d’un microorganisme pour lequel il n’existe pas de milieu sélectif Technique facile à développer sur un nouveau microorganisme Inconvénients Souvent nécessité d’extraire les bactéries de la matrice alimentaire Seuil de détection assez élevé dans les aliments solides: 102/g d’aliment Technique très rapide Seuil de détection assez bas dans les liquides alimentaires Technique très spécifique Détection des bactéries intègres mais mortes Problèmes posés par les inhibiteurs de la PCR Difficile de dénombrer la flore totale Détection des viables non cultivables Demande du personnel technique spécialisé Possibilité de dénombrement simultané de plusieurs µ Pas de détection des toxines Les méthodes alternatives de détection et dénombrement L’immunologie: le test ELISA Quantification indirecte des cellules: -capture par des anticorps Anticorps poly ou monoclonal lié à une enzyme Anticorps polyclonaux Y Y Y YY Y Y Y YY Y Y Y Substrat enzymatique YY Y Y Y Réaction colorimétrique Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y YY Y Y Y YY Y Y Y IFA: avec fluorescence YY Y Y Y Détection automatique de microorganismes par immunologie VIDAS Biomérieux les techniques immunologiques (ELISA, ELFA) Avantages Extraction moindre des bactéries à partir de la matrice alimentaire Rapide et facile d’emploi (pas d’extraction d’ADN) Inconvénients Seuil de sensibilité trop élevé Nécessité d’avoir des anticorps spécifiques: le développement de nouveaux tests est long Variabilité entre lots Pas besoin de matériel sophistiqué Ne détectent pas toutes les souches Peut être facilement automatisé Des données génétiques ne sont pas nécessaires Possibilité de détecter les toxines et les virus ARN Assez peu de kits commerciaux Détection des bactéries intègres mais mortes 2 freins à une utilisation optimale de ces techniques Extraction de tous les microorganismes à partir de la matrice alimentaire Seuil de sensibilité des méthodes -Dégradation d’un substrat par une enzyme -Lecture de la fluorescence etc Dépend du nombre de microorganismes dans le volume final de l’extraction Nouveaux Biocapteurs 3D et nouveaux anticorps pour la détection de toxines et bactéries en milieu alimentaire Projet « BIOCAPTOX » ANR PCV-O7_187055 Détection de SEA,l’entérotoxine A de S.aureus, dans les aliments Michel Gautier 1, Souhir Boujday 2, Romain Briandet 5, Michèle Salmain 3, Clarisse Techer 1,Florence Val 4 et Claire Marie Pradier 2 1 INRA, Agrocampus ouest, Lab. Microbiologie, F-35042 Rennes, France; 2 UPMC, Univ. Paris VI, Lab. Réactivité de Surface, CNRS, UMR 7197F-75005 Paris, France; 3 ENSCP, Chimie ParisTech, Lab. Charles Friedel, CNRS, UMR 7223-75005 Paris, France; 4 INRA, Agrocampus ouest, Lab. Ecologie et sciences phytosanitaires, F-35042 Rennes, France; 5 INRA, Unité de Bioadhésion et Hygiène des Matériaux, Massy, France Principe du biocapteur Technique très rapide: Lecture du signal quasi immédiate Régénérable Détection du signal: Techniques de transduction: IR (infra rouge) SPR (résonnance des plasmons de surface) QCM (microbalance à quartz) Possibilité d’une utilisation en ligne SEA SEA SEA Capture et quantification SEA Bactérie ou toxine bactérienne à détecter SEA SEA Anticorps spécifiques SEA Immunocapteurs nanostrucurés 3 étapes dans la construction du capteur 3D 1. Obtention d’anticorps spécifiques Construction d’un test ELISA de référence SEA SEA SEA SEA SEA S S S 2. Elaboration des immunocapteurs nanostructurés 3. Validation: Détection de la toxine dans un milieu complexe 1. Obtention d’anticorps spécifiques Anticorps du commerce -qualité variable -couteux -dépendance d’un fournisseur (étranger) -sensibilité ? Production de nouveaux anticorps anti SEA A partir des peptides? Sérum polyclonaux? À partir de la Protéine entière? Anticorps monoclonaux? Production de nouveaux anticorps anti SEA P2 A partir de la protéine entière A partir des peptides P1 Si:Immunogène, spécifique, en position externe, linéaire, bien exposé SEA native (Schad, EMBO J., 1995) Intérêts: plus immunogène Plus facile à mettre en place Inconvénient: dangereux pour l’animal Réactions croisées Intérêts: moins dangereux pour l’animal Plus spécifiques Inconvénient: difficulté de tous les tester Obtention d’Ac polyclonaux chez la souris (laboratoire). Obtention d’Ac monoclonaux : 7 clones, Plateforme Ac INRA Nantes Test des ACorps en ACP ELISA et en DAS ELISA afin de mettre en place un modèle de dosage. Comparaison de la sensibilité et de la spécificité de différents Acs en DAS ELISA 4,0 Sensibilité 3,5 3,0 2,5 antiSEA souris mAb commercial 2,0 antipept1 souris 1,5 1,0 0,5 0,0 500 250 125 64 16 8 Evaluation de32 la Spécificité Concentration en SEAAcs (pg/ml) des différents 4 0 Sélection de l’anti SEA de souris polyclonal 3, 5 3, 0 DO (405nm) DO (405nm) mAb laboratoire Spécificité 2, 5 2, 0 1, 5 1, 0 anti SEA sour i s mAb l abor atoi r e 0, 5 mAb commer ci al 0, 0 anti pept1 sour i s SE A SE B SE C 1 SE D SE E Construction d’un test DAS ELISA Double Antibody Sandwich DAS Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ELISA 1. Ac capture: Polyclonal du commerce, lapin 2. Ac détection: serum polyclonal ou IgG purifiées, souris 3. Ac anti-souris, conjugué phosphatase alcaline, chèvre(Sigma Sensibilité du DAS ELISA : 32 pg SEA/ml (0,5ng/ml dans la biblio) Aucune réaction croisée avec SEA, SEB, SEC1; SED et SEE: dosage très spécifique de la SEA. Détection de la SEA (DAS ELISA), en matrice complexe Dans différents laits Sensibilité de la détection dans différents laits 4 3,5 PB S T 1%B SA 3 U HT 1/ 2 ecr . 2,5 p ast . 1/ 2 ecr. U HT ent ier 2 U HT ecr eme 1,5 1 La limite de détection de la SEA dans les laits étudiés varie de 64 à 125 pg/ml. 0,5 0 500 250 12 5 62,5 32 16 8 4 2 concentration en SEA (pg/m L) 1 0 meilleure que celles décrite dans la littérature (autour de 0.5ng/ml). Exemple de détection dans un fromage contaminé artificiellement Fromage artificiellement contaminé par la SEA Dosage par DAS ELISA : 0,170 (+- 0,03) ng SEA/g fromage Dosage par méthode officielle : 0,168 ng SEA/g fromage 2. Elaborer des immunocapteurs nanostructurés Immunocapteur plan Anticorps anti SEA Protéine de fixation: la protéine A (sur la partie constante des anticorps) S S SAM Self Assembled Monolayer Composée de Cystamine Socle recouvert d’or S N N C N H S S Bille d’or: augmentation de la surface et exaltation du signal S S S C N 2 NH H C N S H S N C N H H S Immunocapteur 3D H S H S N C H S N 2 NH N H N C N 2 NH S Détection de la toxine SEA antigène protéine de blocage (BSA) anticorps de capture protéine de fixation SAM de thiol électrode Au quartz AT-cut Ffond = 5 MHz Mesure des interactions anticorps-antigènes par microbalance à quartz: QCM Sensible à des variations de masse On soumet le biocapteur à une onde de fréquence déterminée On mesure les variations de fréquences dues À un changement de la masse 29 Détection de la toxine SEA, étapes successives de l’élaboration puis du fonctionnement du capteur 10 30 PrA -10 25 PrA BSA PrA -30 PrA PrA BSA PrA Frequency change (Hz) BSA -50 20 SEA -70 15 PrA PrA -90 10 PrA BSA PrA -110 5 -130 ∆ Fréquence -150 0 0 1000 2000 3000 4000 Time (s) 5000 6000 7000 Dissipation change (10^-6) PrA Mesure de la variation de fréquence / concentrations croissantes de toxine SEA Gamme de travail : 50 - 1000 µg/l Saturation à partir de 1000 µg/l LD = 20 ng/ml (25 ng injectés) Amplification du signal par anticorps de révélation 25 SEA Après l’étape de lavage, l’Ac de révélation (mAb anti-SEA à 15 mg/l) est injecté -²F / Hz 20 BSA 15 10 PrA SEA 5 BSA 0 0 500 1000 1500 -1 [SEA] / ng.ml LD = 7 ng/ml , t < 25 min 2000 PrA Et… détection de la toxine en milieu alimentaire (lait écrémé reconstitué à partir de lait en poudre) 9 8 7 SEA in skimmed milk 5% SEA in PBS-BSA F ( Hz) 6 5 4 3 2 1 0 97 194 485 485 970 ng/ m l Détection possible de SEA dans lait Détection un peu moins sensible dans le lait qu’en milieu modèle Il reste encore des améliorations mais: Potentialités intéressantes Régénérable Rapidité de la mesure Seuil de sensibilité bas Utilisation en ligne pour les liquides En Conclusion Le choix de la méthode à utiliser dépend de la décision à prendre suite à l’analyse Les facteurs à considérer sont : -le temps d’obtention des résultats -la limite de dénombrement ou détection -la nature de la matrice alimentaire -le coût de la méthode -La praticabilité de la méthode Ne pas oublier L’analyse microbiologique est un outil de contrôle Elle ne permet pas d’assurer la qualité sanitaire d’une production Seules les méthodes comme l’HACCP tendent à maitriser cette qualité sanitaire Merci de votre attention
