Analyse structurale de l`ADN en phase condensée

Analyse structurale de l'ADN en phase condensée
Lucas
Serrano
Stage d'initiation à la Recherche
27 Mai 2013 28 Juin 2008
Table des matières
1 Les laboratoires
2
2 Sujet du stage
3
3 Travail réalisé
5
4 Bilan
7
2.1
2.2
2.3
3.1
3.2
3.3
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Structure de l'ADN en milieu dense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Problématiques actuelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Préparation des phages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cryo-microscopie électronique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Analyse de données . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
3
4
5
5
5
1
Les laboratoires
Mon stage s'est principalement déroulé au Laboratoire de Physique des Solides d'Orsay (UMR 8502). Ce laboratoire emploie environ 200 personne et comprend 15 équipes de
recherche. Il s'intéresse à la matière condensée d'une manière générale et ses activités sont
divisées en 3 axes :
Nouveaux états électroniques de la matière
Phénomènes physiques aux dimensions réduites
Matière molle et interface physique-biologique
C'est dans ce dernier axe que prend place mon stage. Cet axe est spécialisé sur l'étude des
systèmes ayant des propriétés liquides à l'échelle moléculaire mais présentant une organisation à l'échelle supramoléculaire. Les objets étudiés sont des systèmes allant des plastiques
industriels aux matériaux biologiques.
Au sein de cette structure j'ai pris place dans l'équipe Structure et dynamique d'objets
biologiques autoassemblés (SOBIO), équipe composée de 10 personnes. Cette équipe s'intéresse
aux propriétés d'auto-assemblage des macromolécules biologiques et des cellules vivantes. Elle
étudie notamment leurs fonctions, structures et propriétés mécaniques et dynamiques.
Le sujet de mon stage se situe dans le cadre du projet DNA nancé par l'Agence Nationale
de la Recherche. Ainsi j'ai travaillé avec une équipe de l'Institut de Biochimie et Biophysique
Moléculaire et Cellulaire (UMR 8619) et eectué là-bas mes manipulations de préparations
d'échantillons et de diraction de rayons X.
Durant toute la durée de mon stage je fus principalement encadré par une équipe mixte
provenant du LPS et de IBBMC, avec notamment :
Dominique Durand (Directrice de recherche CNRS), pour l'analyse de données et les
manipulations de diractions de rayons X
Marta de Frutos (Chargé de recherche CNRS), pour la préparations d'échantillons
biologiques
Amélie Leforestier (Chargé de recherche CNRS), pour les préparations et observations de cryo-microscopie électronique
Francoise Livolant (Directrice de recherche CNRS), pour la coordination, la planication et le suivi de mon stage
2
2
Sujet du stage
2.1
Introduction
Dans les systèmes biologiques virus, chromosome, etc l'ADN
est toujours présent à de très fortes concentrations (de 50 à
500 mg/mL). On pense que l'organisation de l'ADN à un impact
et joue un rôle important lors de l'exploitation de l'ADN par des
objets biologiques.
C'est par exemple le cas des bactériophages (virus à ADN double brin infectant des bactéries). Ces virus comportent une capside
protéique, perméable à l'eau et aux ions, qui renferme une longue
chaîne d'ADN (10 000 à 100 000 paires de bases). La concentration
intra-capside en ADN est d'environ 500 mg/mL. Les phages se x- Figure 1 Bactérioent sur un récepteur localisé sur la bactérie et injectent leur ADN. phage
Il est possible en solution de contrôler l'éjection partielle de l'ADN
et ainsi d'étudier l'ADN conné.
Il est également possible d'obtenir les mêmes échelles de concentration avec de l'ADN en
solution. Il existe pour cela diérentes méthodes pour condenser l'ADN :
l'ultraltration ; l'eau est enlevée progressivement de la solution
le stress osmotique, mélange avec un polymère neutre comme le PolyÉthylène Glycol
qui réduit le volume disponible pour l'ADN
l'utilisation de cations multivalents, qui provoquent un eet de repliement de la chaîne
sur elle-même, i.e. la condensation de l'ADN
2.2
Structure de l'ADN en milieu dense
Il a été observé que, à ces concentrations, l'ADN forme des structures ordonnées cristallines
liquides 1 . On cherche donc à caractériser et à étudier ces structures, an de mieux comprendre
les interactions de l'ADN dans les systèmes biologiques.
Les structures de l'ADN concentré ont été caractérisées à l'aide de la diraction de rayons
X 2 . Cette étude portait sur de l'ADN court (146 paires de bases), en solution, concentré par
évaporation et sans contrôle de la concentration en sel monovalent. À partir d'une solution
isotrope, l'ADN s'organise progressivement sous plusieurs phases ordonnées, dépendantes de
la concentration en ADN, et apparaissant dans cet ordre (Fig. 2 page 4) :
Cholestérique → Hexagonale 2D → Hexagonale 3D → Orthorhombique
Ces structures ont également été observé en cryo-microscopie électronique 3 où l'on peut
voir la présence d'un réseau hexagonal de l'ADN en solution mais également pour l'ADN
dans les capsides pleines(Fig. 3a). On peut également observer, dans le cadre de capsides
partiellement vidées où l'ADN est secondairement condensé avec des ions multivalents, la
formation de structures toroïdales dont la coupe transverse présente un réseau hexagonal
(Fig. 3b et Fig. 3c).
1. Robinson C. (1961)
Tetrahedron
13, 219-234
2. Durand D., Doucet J., Livolant F. (1992)
3. Leforestier A., Livolant F. (2009)
J.Physique
PNAS
3
2, 1769-1783
(a) Cholestérique
(b) Hexagonale 2D
(c) Hexagonale 3D
(d) Orthorhombique
Figure 2 Les diérentes phases de l'ADN condensé en solution
(a) Capside pleine
(b) ADN condensé par la spermine après éjection partielle
(c) Vue de coté
Figure 3 Observation de phages en cryo-microscopie électronique
2.3
Problématiques actuelles
Il reste néanmoins de nombreuses questions ouvertes sur l'organisation de l'ADN en milieu
dense, comme par exemple :
La méthode de condensation a-t-elle une inuence sur la structure de l'ADN ?
La longueur de la chaîne d'ADN intervient-t-elle dans sa structure ?
Quel est l'inuence du milieu ionique ?
Pour répondre aux questions citées, une expérience de diraction de rayons X a été menée
à l'European Synchrotron Radiation Facility, un accélérateur de particules situé à Grenoble.
Cette expérience visait à analyser la structure de l'ADN à diérentes concentrations, sur 4
types d'échantillons, dont les caractéristiques sont données ci-dessous :
1
2
3
4
Méthode de condensation
ADN sec réhydraté
ADN sec réhydraté
PolyÉthylène Glycol
PolyÉthylène Glycol
Solution réhydratante
Eau distillée
NaCl 300 mmol/L
Longueur de la chaîne
146 pb
146 pb
146 pb
de 146 à 8000 pb
Mon stage fait suite à ces manipulations. Il m'a été demandé deux tâches :
1. L'analyse et le dépouillement des données de l'ESRF. Peut-on répondre aux questions
précédemment posées à l'aide des données obtenues ?
2. Un essai de faisabilité sur de l'ADN conné dans des bactériophages T5. Peut-on différentier, avec l'analyse par diraction de rayons X, deux populations de bactériophages
de concentration en ADN diérentes ? Cette tâche inclura la préparation des échantillons ainsi que leur observation par diraction de rayons X sur un appareil de laboratoire
et en cryo-microscopie électronique pour comparaison.
4
3
3.1
Travail réalisé
Préparation des phages
J'ai préparé des solutions de bactériophages T5 ayant éjecté une partie de leur ADN, en
vue des manipulations de rayons X et de cryo-microscopie.
Le principe consiste à faire éjecter ces phages à l'aide de FhuA, récepteur normalement
présent sur les bactéries qu'ils infectent. On ajoute également de l'ADNase, enzyme qui digère
l'ADN, an de ne conserver que l'ADN à l'intérieur des capsides. De plus on rajoute de la
spermine dans la solution, qui permet de condenser l'ADN à l'intérieur de la capside et
d'arrêter ainsi l'éjection de ce dernier lorsque la pression d'éjection et la pression exercé par
la spermine sont égales.
La réalisation de ces échantillons a nécessité pour moi l'apprentissage de manipulations
avec des volumes de l'ordre du microlitre et l'utilisation des outils associés.
3.2
Cryo-microscopie électronique
J'ai eectué quelques mesures à l'aide du microscope électronique et appris certains réglages, comme celui du focus notamment. Les échantillons biologiques étant très sensibles aux
dégradations par le faisceau d'électrons, ils requièrent de ce fait
une utilisation particulière du microscope. On travaille la plupart du temps en l'aveugle et on eectue les réglages hors des
zones intéressantes, pour ne pas détruire l'échantillon.
J'ai également eu a développer les photos des acquisitions
que j'avais eectués sur le microscope. En eet utiliser un lm
photo permet d'obtenir une bien meilleure résolution que celle
du capteur CCD.
3.3
Analyse de données
La majeure partie de mon temps a été consacrée au traitement des données de diraction
de rayons X provenant de l'ESRF. Le labo n'ayant aucune préférence en ce qui concerne les
logiciels de traitement de données, j'ai choisi de travailler sous MatLab.
Dépouillement
Le premier travail que j'ai dû eectuer a été d'écrire des fonctions MatLab d'importation
et de visualisation des données brutes présentes sous la forme de tableaux intensité/vecteur
de diusion. Je me suis familiarisé avec les spectres et ai appris à reconnaître les diérentes
phases. Les critères retenus pour la plage de vecteur de diusion q mesurée(Voir Fig. 4) :
Phase Cholestérique = Une bosse large aux faibles valeurs de q
Phase Hexagonale 2D = Un pic n aux valeurs moyennes de q
Phase Hexagonale 3D = 5 pics ns dont un semblable à celui de l'hexagonale 2D
Indexation
La seconde étape fut l'indexation des pics de diraction. J'ai d'abord eectué le calcul
théorique de l'emplacement des pics de diraction, dans le cadre d'un réseau hexagonal bidimensionnel et tridimensionnel. Puis j'ai procédé à une première indexation à la main à
l'aide d'un tableur et d'un solveur des pics de diraction de l'hexagonale 3D, en m'aidant
5
Cholesterique
0
10
Hexagonale 2D
Intensite
Hexagonale 3D
−1
10
−2
10
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
−1
q (nm )
Figure 4 Exemple de spectre de diraction de rayons X
des valeurs de paramètres de structure ici la distance entre deux hélices et le pas de l'hélice
trouvés en 1991. Le calcul nous donne un écart moyen entre la position théorique et expérimentale des pics, de l'ordre du pas d'échantillonnage. J'ai, de ce fait, conclu à une indexation
correcte des pics.
J'ai ensuite procédé a une indexation automatique des pics de diraction, à l'aide de
fonctions de t et recherche de maximum. Seul le pic de plus forte intensité des réseaux
hexagonaux a été indexé de manière automatique. En eet malgré des tentatives d'élimination
du fond, le rapport signal sur bruit n'était pas susamment bon pour indexer, de manière
automatique, les autres pics. Ce pic nous renseigne toutefois sur la distance entre deux brins
d'ADN et permet de faire des observations intéressantes.
Observations et résultats
Contrairement aux manipulations de 1991 nous n'observons pas de corrélations entre le pas
de l'hélice et la distance inter-hélices. Le seul paramètre changeant étant la concentration en
sel nous pensons que celle-ci à une inuence non négligeable sur le pas de l'hélice.
Nous avons observé les plages d'existence des phases hexagonales, en terme de distances
inter-hélices, très diérentes selon la méthode de condensation utilisée (Voir Fig.5). Celle-ci
joue un rôle dans la structure qu'adopte l'ADN en milieu dense, contrairement à ce qui avait
été armé auparavant dans la littérature. La connaissance seule de la distance inter-hélices
n'est donc pas un bon critère pour connaître la structure de l'ADN.
Figure 5 Comparaison des distances inter-hélices observées (a) pour les deux phases hexagonales
6
4
Bilan
J'ai beaucoup apprécié mon stage d'initiation à la recherche et je dois avouer que je regrette
qu'il soit déjà terminé. Ce stage m'a permis de comprendre comment s'organise la vie d'un
chercheur et d'un laboratoire.
J'ai pu voir ce qu'était vraiment le travail de recherche, nalement très éloigné du cadre
scolaire, et je que trouve très passionnant. J'ai particulièrement apprécié les aspects d'initiatives personnelles et de communication auprès des collègues. Sur ce dernier point, je regrette
néanmoins ne pas avoir pu aller à plus de conférences organisées par le laboratoire, et cela
principalement par manque de temps.
J'ai également découvert à quel point la collaboration dans le monde de la recherche
était un aspect important, chose que je ne soupçonnais pas. En eet, j'ai dans le cadre de
mon stage été présent dans diérents laboratoires : le LPS, l'IBBMC pour la préparation
des bactériophages et les manipulations diraction de rayons X, et l'Institut Pasteur pour
l'observation en cryo-microscopie électronique. J'ai donc eu le plaisir de collaborer avec de
nombreuses personnes sans lesquelles la réalisation de mes objectifs aurait été tout bonnement
impossible.
Ce stage m'a aussi permis d'acquérir de l'expérience sur de nombreux domaines théoriques
comme expérimentaux. J'ai ainsi pu comprendre les problèmes de traitement de données
comme l'élimination du bruit ou la recherche d'une modélisation correcte et pertinente. J'ai
pu mettre en pratique des notions vues en cours et les appliquer, je pense notamment à la
recherche de structures sur les diagrammes de diraction de rayons X. J'ai aussi d'un autre
coté acquis des techniques expérimentales très variées. Je sais par exemple, quels sont les bons
réglages à eectuer pour s'assurer d'avoir une image correcte en microscopie électronique, et
d'un autre coté, je sais également utiliser correctement des micropipettes (pas facile quand
l'on a jamais fait de biologie !).
Je tiens à remercier toute l'équipe encadrante : Françoise Livolant, Amélie Leforestier, Marta de Frutos et Dominique Durand pour m'avoir accueilli, fait découvrir le
domaine de la biophysique, et d'avoir partagé avec moi leur passion durant ces 5 semaines.
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