regulation des transporteurs vesiculaires du glutamate chez les

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS XII
Spécialité
Neurosciences
Présentée par
Jacqueline GILCHRIST-VINATIER
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR de l’UNIVERSITE PARIS XII
Sujet de la thèse :
REGULATION DES TRANSPORTEURS
VESICULAIRES DU GLUTAMATE
CHEZ LES RONGEURS
Soutenue le 9 janvier 2006
Devant le jury composé de :
Dr Bruno Giros
Dr Bruno Gasnier
Dr Nicole Ropert
Dr Dominique Aunis
Pr Romain Gherardi
Dr Anne Schmidt
Directeur de Thèse
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
REMERCIEMENTS
Le travail présenté dans cette thèse a été réalisé dans le laboratoire de Bruno Giros, sous sa
direction scientifique. Il est donc naturel de commencer avec celui par qui tout a commencé…
Je tiens à te remercier pour la grande confiance que m’a témoignée depuis le début sur ce projet
ambitieux, ainsi que pour ta créativité qui fût le moteur de cette grande aventure.
Bruno Gasnier, Nicole Ropert, Anne Schmidt, Dominique Aunis et Romain Gherardi m’ont fait
l’honneur de juger ce travail, malgré un emploi du temps souvent surchargé. Je vous suis
reconnaissante de votre participation à mon jury de thèse et de vos commentaires, qui ne
pourront qu’enrichir mon travail.
Mes débuts dans la recherche et dans l’unité 513 ont été encadrés par Marie-Pascale Martres. Je
tiens à te témoigner toute ma gratitude pour ta disponibilité au cours de mon DEA et pour ta
relecture attentive de ce manuscrit lorsqu’il était en préparation.
Salah El Mestikawy m’a adoptée pour me faire découvrir l’univers des VGLUTs et m’a fourni
un encadrement tout au cours de ces années. Merci d’avoir su m’intégrer dans ton équipe et me
faire profiter de ta grande expérience de la paillasse. Etienne Herzog, Christelle Gras, Margot
Bournaud, Bénédicte Amilhon, Eve Lepicard et Odile Poirel ont tous contribué au succès de
mes travaux sur les VGLUTs. Je remercie également Marie-Aude Plamont, sans qui mon projet
« endophiline » n’aurait sans doute pas abouti…
De nombreuses collaborations ont permis de faire avancer mes projets, et je suis reconnaissante
à tous ceux avec qui j’ai travaillé, de près ou de moins près, pour mener à bien ces études. En
particulier, je tiens à remercier Laurent Daviet de la societé Hybrigenics, Anne Schmidt, Bruno
Gasnier, Agnès Hémar, Véronique Bernard, Patricia Gaspar, Sonja Wojcik, Nils Brose pour leur
aide.
RESUME
Les transporteurs vésiculaires du glutamate, VGLUT1, -2 et -3, sont des protéines localisées sur
la membrane des vésicules synaptiques des neurones glutamatergiques. Ils sont responsables de
l’accumulation du neuromédiateur dans les vésicules. VGLUT1 et VGLUT2 sont les sous-types
majoritaires dans le cerveau et ils sont exprimés dans la totalité des neurones glutamatergiques
avec des profils d’expression complémentaires. VGLUT3 est exprimé de façon plus discrète,
dans des populations de neurones contenant d’autres neuromédiateurs dont on ne suspectait pas
jusqu'alors qu'ils pouvaient être glutamatergiques.
Au cours de cette thèse, j’ai participé à la description détaillée de la localisation de VGLUT3
dans le cerveau adulte de rat, ainsi qu’à l’étude de l’ontogenèse des trois sous-types. Alors que
l'expression de VGLUT2 est assez précoce, l'ARNm et la protéine VGLUT1 sont exprimés plus
tardivement puisque le profil d’expression adulte n’apparaît que vers le 21ème jour post-natal.
Pour VGLUT3, nous avons pu mettre en évidence des expressions ectopiques très élevées dans
des territoires dont il est totalement absent à l'âge adulte, comme les cellules de Purkinje du
cervelet.
Avec pour lointain objectif de pouvoir identifier des différences fonctionnelles entre VGLUT1,
-2 et -3, j’ai également réalisé un crible double-hybride avec l'extrémité C-terminale
cytoplasmique de VGLUT1. J’ai ainsi caractérisé l’interaction entre VGLUT1 et l’endophiline,
une protéine impliquée dans l’endocytose des vésicules synaptiques. Cette interaction se fait
entre l’un des deux domaines riches en prolines de VGLUT1 et le domaine SH3 de
l'endophiline. Les territoires d'expression dans le cerveau, ainsi que les compartiments
cellulaires dans lesquels sont présents VGLUT1 et l'endophiline sont compatibles avec une
interaction in vivo. Cette interaction suggère un lien fonctionnel entre l’accumulation de
neuromédiateur et le recyclage des vésicules synaptiques dans la terminaison nerveuse.
L'ensemble de ces résultats nous permet de considérer que, loin d'être des acteurs passifs de la
neurotransmission, les transporteurs vésiculaires du glutamate, chacun avec ses caractéristiques
spécifiques, interviennent de manière contrôlée au cours du développement, puis établissent des
profils d'expression prédéterminés chez l'adulte. De plus, ils jouent un rôle important dans la
dynamique synaptique générale, même si ce rôle n'est pas encore totalement élucidé.
PREAMBULE
En 1999, dans une revue sur les vésicules synaptiques, T. Südhof expliquait son approche de la
neurobiologie de la synapse en ces termes : « We discuss nerve terminal function from the
perspective of synaptic vesicles (…) The overall goal is a systematic analysis of an eukaryotic
organelle to completion (…) The working hypothesis is that synaptic vesicles are composed of a
limited number of proteins that perform distinct, identifiable functions. » (Fernandez-Chacon et
Sudhof, 1999). Des progrès considérables sur la compréhension de la transmission synaptique
ont découlé de l’ensemble des travaux décrits dans cette revue.
Après avoir disséqué d’un point de vue moléculaire la synapse et avoir cloné et muté la plupart
des protéines impliquées dans la transmission synaptique, le défi du 21ème siècle sera d’avoir une
vision dynamique de la synapse. Il faut désormais relier les molécules synaptiques avec la
physiologie de la synapse.
Lorsque j’ai démarré ce travail de thèse, la caractérisation moléculaire des transporteurs
vésiculaires du glutamate venait d’être réalisée. L’existence de trois sous-types a tout de suite
suscité de nombreuses questions, dont celles sur sont les différences fonctionnelles entre
VGLUT1, -2 et-3 qui n’étaient pas des moindres. Jusqu’à présent, aucune différence notable n’a
été trouvée dans les proprietés de transport de glutamate, ni dans les caractéristiques
bioénergétiques ou pharmacologiques. Par contre, il existe d’importantes différences de
localisation entre les transporteurs : VGLUT1 et VGLUT2 ont une répartition largement
complémentaire dans le cerveau et sont exprimés dans tous les neurones connus pour utiliser le
glutamate comme neuromédiateur. La découverte de VGLUT3 a donc été une surprise puisque
ce dernier sous-type n’est pas exprimé dans des neurones considérés jusqu’alors comme
glutamatergiques.
Le travail entrepris au cours de ces quatres années a donc eu pour objectif de comprendre les
régulations de la transmission synaptique apportées par les transporteurs vésiculaires du
glutamate et aurait pu s’intituler : « à la recherche d’une diversité fonctionnelle entre les
neurones glutamatergiques ».
Plusieurs axes d’étude ont été entrepris :
- l’étude de VGLUT3, sous-type atypique car il n’est pas exprimé dans neurones considérés
comme glutamatergiques : étude de sa localisation détaillée et étude de son expression au cours
du développement. Les travaux présentés dans les parties I et II sont des études anatomiques des
VGLUTs dans le cerveau de rat.
- la recherche de partenaires protéiques pour VGLUT1. La partie III concerne donc la biologie
cellulaire des VGLUTs et établit un lien avec le recyclage des vésicules synaptiques.
SOMMAIRE
INTRODUCTION _____________________________________________________________ 8
I/ La synapse chimique ________________________________________________________ 9
I.1/ La structure de la synapse chimique__________________________________________________9
I.2/ Les principaux neuromédiateurs du système nerveux central _____________________________11
I.3/ Les étapes de la transmission synaptique _____________________________________________14
I.4/ La clathrine et les protéines accessoires ______________________________________________19
II/ Les transporteurs vésiculaires du glutamate comme marqueurs de la
transmission glutamatergique ________________________________________________ 24
II.1/ Le métabolisme du glutamate _____________________________________________________24
II.2/ Les récepteurs et les transporteurs plasmiques du glutamate _____________________________25
II.3/ Les transporteurs vésiculaires du glutamate __________________________________________30
II.4/ Anatomie des systèmes glutamatergiques ____________________________________________36
III/ Les modulations de la transmission nerveuse : la plasticité synaptique à
l'échelle d'une synapse ______________________________________________________ 45
III.1/ Plasticité pré-synaptique et plasticité post-synaptique__________________________________45
III.2/ Régulation de la quantité de neuromédiateur dans les vésicules synaptiques ________________46
III.3/ Régulation du type de neuromédiateur : co-transmission _______________________________49
III.4/ Régulation du recyclage des vésicules synaptiques ____________________________________50
RESULTATS _________________________________________________________________ 58
Partie I :étude de la répartition anatomique de VGLUT3 dans le cerveau de
rat adulte
Contexte de l’étude _________________________________________________________________60
Principaux résultats_________________________________________________________________60
Conclusion _______________________________________________________________________61
Partie II : étude de l’ontogenèse des VGLUTs au cours du développement
post-natal
Contexte de l’étude _________________________________________________________________82
Principaux résultats_________________________________________________________________82
Conclusion _______________________________________________________________________83
Partie III : étude de l’interaction entre VGLUT1 et une protéine impliquée
dans l’endocytose, l’endophiline
Contexte de l’étude _________________________________________________________________96
Principaux résultats_________________________________________________________________96
Résultats complémentaires ___________________________________________________________97
Conclusion _______________________________________________________________________98
DISCUSSION GENERALE ___________________________________________________ 120
1) VGLUT1 et VGLUT2 sont les principaux transporteurs vésiculaires du
glutamate ________________________________________________________________ 121
1) VGLUT1 et VGLUT2 peuvent-ils être adressés sur les mêmes vésicules ?___________________121
2) VGLUT1 et VGLUT2 sont-ils exprimés dans des terminaisons qui diffèrent par
leur probabilité de libération ?_____________________________________________________125
3) VGLUT1 : un transporteur vésiculaire impliqué dans la biogenèse des vésicules
synaptiques ? __________________________________________________________________127
2) VGLUT3 est un transporteur vésiculaire du glutamate atypique __________________ 129
1) Expression de VGLUT3 avec d’autres transporteurs vésiculaires et possible colibération _____________________________________________________________________129
2) Spécificité des outils utilisés pour les techniques d’anatomie _____________________________131
3) Expression ectopique de VGLUT3__________________________________________________132
4) Expression transitoire de VGLUT3 dans les cellules de Purkinje et le système
auditif _______________________________________________________________________133
PERSPECTIVES _____________________________________________________________ 137
1) VGLUT1, -2 et -3 : des transporteurs de phosphate inorganique ? _________________ 137
2) Exploration de VGLUT1, -2 et -3 dans différentes pathologies_____________________ 138
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES __________________________________________ 140
INTRODUCTION
INTRODUCTION
INTRODUCTION
Dans les organismes pluricellulaires l’activité des différentes cellules doit être coordonnée pour
assurer les processus vitaux et permettre une homéostasie. L’organisme des mammifères est
sensible à son environnement et capable de répondre à des stimulus environnementaux de
manière adaptée. Ceci nécessite une communication intercellulaire de longue distance qui peut
être soit hormonale et transiter par la circulation sanguine, soit nerveuse.
Dans le système nerveux central, deux catégories de cellules assurent les fonctions essentielles à
la communication nerveuse :
- les cellules nerveuses, ou neurones, responsables de la propagation et de la transmission du
message nerveux;
- les cellules gliales, dont le rôle principal est d’assurer un soutien et apport énergétique aux
cellules nerveuses. Parmi celles-ci, on distingue la macroglie (astrocytes et oligodendrocytes) et
la microglie (cellules microgliales).
Les neurones sont des cellules spécialisées dans la transmission de l’information et la
communication intercellulaire entre un neurone et sa cellule cible. Ils sont capables de conduire
un message sous forme d’influx nerveux, un signal électrique qui se propage le long de leur
axone. Ce sont des cellules polarisées constituées d’un corps cellulaire (ou soma) et de deux
types de prolongements fonctionnellement distincts : un axone et plusieurs dendrites. Le type de
signal qui permet le passage de l’information d’un neurone à un autre a été le sujet de débats
animés (pour revue voir Cowan et Kandel, 2001).
Les partisans de la théorie réticulaire pensaient que les neurones étaient en continuité les uns
avec les autres et que le message nerveux était purement électrique. A l’inverse, la théorie
neuronale postule que les neurones sont des entités bien séparées, capables de communiquer les
unes avec les autres. Le message nerveux peut ainsi être modifié lors de la transmission d’une
cellule à une autre, sous forme de synapse.
Le terme « synapse » a été introduit par le physiologiste Charles Sherrington en 1897, après
plusieurs décennies de controverse sur la nature de l’information nerveuse et la manière dont
elle se transmettait le long d’un réseau de neurones. Voici ce qu’il en disait : « Each synapsis
offers an opportunity for a change in the character of nervous impulses, such that the impulse
as it passes over from the terminal arborescence of an axon into the dendrite of another cell,
starts in that dendrite an impulse having characters different from its own ».
Chaque neurone est donc une cellule excitable, capable de conduire un message nerveux le long
de son axone et capable d’intégrer les différents messages qu’elle reçoit. La synapse représente
ainsi un site de transmission et de modification du message nerveux.
8
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
I/ LA SYNAPSE CHIMIQUE
Il existe deux types de synapses :
- la synapse électrique, où les neurones sont en continuité physique par l’intermédiaire de
jonctions communicantes (pour revue voir Connors et Long, 2004);
- la synapse chimique, où le message nerveux est transmis par l’intermédiaire de molécules
chimiques spécialisées, les neuromédiateurs. Ce type de synapse est largement majoritaire dans
le système nerveux central. Dans la suite de cet exposé, je ne parlerai que des synapses
chimiques.
Après une brève description de la structure des synapses chimiques, je passerai en revue les
différentes catégories de neuromédiateurs. Les différentes étapes de la transmission synaptique
seront alors examinées plus en détail, en mettant l’accent sur le rôle des protéines de l’élément
présynaptique.
I.1/ La structure de la synapse chimique
La synapse est une jontion intercellulaire assurant la transmission polarisée d’un message d’un
neurone émetteur vers une cellule cible avec une grande précision spatio-temporelle. Malgré la
diversité des synapses, des études de microscopie électronique dans les années 1950 ont permis
de mieux comprendre l’ultrastructure d’une synapse et de dégager les caractérisques communes
à toute synapse (pour revue voir De Camilli et coll., 2000a).
La synapse est constituée de 3 éléments (voir Figure n°1A) :
- L’élément présynaptique, qui est une spécialisation de la terminaison axonale du neurone
émetteur. La zone active est formée d’un large réseau protéique, enrichi en cytosquelette et en
protéines de structure. C’est dans cette zone que sont accumulés des saccules remplis de
neuromédiateur. Ces saccules peuvent être soit de petites vésicules claires d’environ 50 nm de
diamètre (vésicules synaptiques, appelées SSV pour small synaptic vesicle) soit des granules à
cœur dense aux électrons, de diamètre environ 100 à 200 nm, appelés également granules de
sécrétion (ou LDCV pour large dense core vesicle). Notons que l’élément présynaptique est
enrichi en mitochondries, assurant un bon couplage énergétique.
- L’élément post-synaptique, qui fait face à la zone active, appartient à la cellule cible (qui peut
être soit un autre neurone, soit une cellule musculaire dans le cas des jonctions
neuromusculaires ou encore la circulation sanguine dans le cas des neurones neuroendocrines.).
Dans le cas d’une synapse neuro-neuronale, il s’agit le plus souvent d’un dendrite ou du corps
9
A
Terminaison
(élément présynaptique)
Mitochondrie
Granule à cœur dense
Vésicule synaptique
Zone active
Fente synaptique
Pied astrocytaire
Densité post-synaptique
Réticulum
endoplasmique lisse
Epine dendritique
(élément postsynaptique)
B
Jonction adhérente
C
*
*
Figure n°1 : Structure des synapses dans le SNC de rat.
A, Représentation schématique de la structure d’une synapse asymétrique. B, La flèche rouge représente une
synapse axo-dendritique asymétrique (type I de Gray) dans l’hippocampe, avec une densité post-synaptique
prononcée (*) et des vésicules sphériques (flèche verte). C, La flèche rouge représente une synapse symétrique
(type II de Gray) dans l’hippocampe, avec une très fine densité post-synaptique (*) et des vésicules ovoïdes et
irrégulières (flèche verte).
Source : www.synapse.bu.edu
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
cellulaire du neurone cible. En microscopie électronique, on distingue la densité postsynaptique, région enrichie en protéines d’ancrage et protéines du cytosquelette et nécessaire à
une bonne transduction du signal. Il s’agit d’un domaine membranaire situé en vis-à-vis du site
de libération présynaptique.
- Entre les deux se situe la fente synaptique, espace intercellulaire légèrement élargi (20 à 30
nm) dans lequel diffuse le neuromédiateur. Cet espace extracellulaire est également délimité par
des expansions des cellules gliales environnantes, qui jouent un rôle majeur dans la régulation
de la quantité de neuromédiateur disponible dans la fente synaptique (voir Danbolt, 2001 pour
une revue sur la concentration en glutamate disponible en fonction de la géométrie de la
synapse).
Il existe cependant une grande diversité structurale des synapses, en fonction de la nature de
l’élément présynaptique et de la localisation de la synapse sur la cellule cible. Ainsi, on pourra
distinguer pour un même neurone cible, des contacts axosomatique, axodendritique, ou
axoaxonique, selon que la synapse contacte le corps cellulaire, un dendrite ou l’axone du
neurone-cible (Cowan et Kandel, 2001). On distinguera également, en fonction de l’épaisseur de
la densité postsynaptique, les synapses asymétriques (classification de Colonnier) ou synapses
de type I selon la terminologie de Gray (densité postsynaptique importante) et les synapses
symétriques ou de type II (densité postsynaptique peu développée, voir Figure n°1B et C). On
considère généralement que les synapses asymétriques sont excitatrices et que les synapses
symétriques sont inhibitrices (voir la partie I des résultats). Il faut noter cependant qu’il existe
un continuum entre ces deux extrêmes, et que toute classification des synapses selon des critères
morphologiques, si elle aide à la compréhension générale des différents systèmes, a tout de
même ses limites.
Les synapses peuvent également être classées en fonction de la nature du message chimique
libéré dans l’espace synaptique, appelé neuromédiateur. Voyons à présent quels sont les
principaux neuromédiateurs du système nerveux central.
I.2/ Les principaux neuromédiateurs du système nerveux central
Selon Paton, plusieurs critères doivent être remplis pour qu’une molécule soit considérée
comme neuromédiateur (Paton, 1958). Il doit exister un mécanisme de synthèse locale de la
substance dans les neurones présynaptiques. La libération de cette substance doit être
11
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
dépendante de l’influx nerveux et du Ca2+. La substance doit être reconnue par des récepteurs
sélectifs. Enfin, il doit exister des mécanismes de catabolisme en produits inactifs et
d’élimination pour mettre fin à la transmission synaptique.
Les molécules qui remplissent tous ces critères sont les neuromédiateurs dits « classiques » et
les neuropeptides. Elles se répartissent dans les catégories suivantes :
- les acides aminés excitateur (glutamate) et inhibiteurs (GABA, glycine) ;
- l’acétylcholine ;
-les amines biogènes : trois catécholamines (dopamine, noradrénaline, adrénaline), une
indolamine (sérotonine ou 5-hydroxytryptamine, 5HT) et un imidazole (histamine) ;
-les neuropeptides (plus de cent, dont la substance P, la cholécystokinine, l’enképhaline) qui
sont produits à partir de précurseurs polypeptidiques de plus grande taille et libérées par
exocytose de vésicules à cœur dense. Ceux-ci ne sont pas recyclés mais sont dégradés par
différentes peptidases dans la fente synaptique. Nous ne nous intéresserons pas aux
neuropeptides dans ce qui suit, mais il faut tout de même signaler que de nombreux peptides
sont co-libérés avec des neuromédiateurs « classiques » (Hokfelt, 1991).
Un autre type de neuromédiateur, que nous ne ferons qu’évoquer ici, est la classe de
neuromédiateurs qualifiés d’ « atypiques ». Certains gaz diffusibles comme le NO ou le CO
peuvent en effet transmettre de l’information d’un neurone à un autre, mais ce transfert
d’information n’est pas polarisé, ne satisfait pas à la théorie quantique de la neurotransmission
(voir plus loin) et il n’existe pas de récepteurs membranaires spécifiques de ces substances
(Baranano et coll., 2001). Il faut citer également un dérivé de l’acide arachidonique (qui
compose les membranes lipidiques) : l’anandamide, qui se fixe sur les récepteurs aux
cannabinoïdes (Devane et coll., 1992).
Le Tableau n°1 récapitule les caractéristiques des principaux neuromédiateurs cités ci-dessus
ainsi que les protéines impliquées dans leur métabolisme.
Dans la suite de cet exposé, je m’intéresserai uniquement aux premières classes de
neuromédiateurs dits « classiques ».
12
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
Tableau n°1 :
Quelques caractéristiques des neuromédiateurs de différentes classes du système nerveux
Classe
neurochimique
Neuromédiateur
Biosynthèse
Transport
vésiculaire
Transport
plasmique
Dégradation
Amines
biogènes
Dopamine
TH
VMAT2
DAT
MAO et
COMT
Noradrénaline
DbH
VMAT2
NET
MAO et
COMT
Sérotonine
TPH
VMAT2
SERT
COMT
Acétylcholine
ChAT
VAChT
CHT1
AChE
GABA
GAD65 et
GAD67
VIAAT/VGAT GAT1,
GAT2 et
GAT3
GABAT
Glycine
Pas de voie
spécifique
VIAAT/VGAT GLYT1 et
GLYT2
Pas de voie
spécifique
Glutamate
PAG et autres VGLUT1, -2 et EAAT1-5
voies
-3
GS, AAT et
GDH
Neuropeptides
Endorphines,
Substance P,
Neuropeptide Y
etc.
Synthèse de
Pas de capture
précurseurs et vésiculaire
maturation
Pas de
recapture
plasmique
Protéases
Gaz
Oxyde nitrique
(NO)
nNOS
Pas de capture
vésiculaire
Pas de
recapture
plasmique
Spontanée
Anandamide
Pas de voie
spécifique
Pas de capture
vésiculaire
Site de
capture
non
identifié
Pas de voie
spécifique
Acides aminés
Dérivés de
l’acide
arachidonique
iNOS
(réactivité
chimique)
Abréviations – AAT : Aspartate Amino Transferase, AChE : AcetylCholine Esterase ; ChAT : Choline
Acetyl Transferase ; CHT : Choline High affinity Transporter ; COMT : Catechol-O-Methyl Transferase ;
DAT : DopAmine Transporter ; DbH : Dopamine b-Hydroxylase ; EAAT : Excitatory Amino Acid
Transporter ; GABA : g-Amino Butyric Acid ; GABAT : GABA Transaminase ; GAD : Glutamic Acid
Decarboxylase ; GAT : GABA Transporter ; GDH : Glutamate DeHydrogenase ; GS : Glutamine
Synthetase ; MAO : MonoAmine Oxydase ; NET : NorEpinephrine Transporter ; PAG : PhosphateActivated Glutaminase ; SERT : SERotonine Transporter ; TH : Tyrosine Hydroxylase ; TPH :
TryptoPhane Hydroxylase ; VIAAT/VGAT : Vesicular Inhibitory Amino-Acid Transporter/Vesicular
GABA Transporter ; VGLUT : Vesicular GLUtamate Transporter ; VMAT : Vesicular MonoAmine
Transporter.
13
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
I.3/ Les étapes de la transmission synaptique
Nous avons aujourd’hui une vision assez claire des différentes étapes impliquées dans la
transmission synaptique (Zucker et coll., 1999). Les travaux pionniers de Fatt et Katz (Fatt et
Katz, 1951) ont ouvert la voie à la découverte de la nature quantique de la libération de
neuromédiateur. En étudiant les jonctions neuromusculaires, ils ont observé l’existence
d’événements électrophysiologiques spontanés, d’amplitude constante, appelés « quantum ».
Chaque quantum correspond à la réponse postsynaptique à un « paquet » de neuromédiateur
libéré spontanément par l’élément présynaptique. Il s’agit ici du corrélat physiologique des
vésicules observées grâce à des techniques de microscopie électronique.
Le déroulement de la transmission synaptique peut ainsi être décomposé en différentes étapes
(voir Figure n°2) :
1) Transport des constituants vésiculaires depuis le corps cellulaire vers la terminaison ;
2) Regroupement des vésicules en amas ;
3) Synthèse du neuromédiateur dans la terminaison axonale par des enzymes de
biosynthèse ;
4) Accumulation par un mécanisme de transport actif à l’intérieur des vésicules
synaptiques grâce à un transporteur vésiculaire ;
5) Arrimage des vésicules synaptiques à la zone active (docking) ;
6) Amorçage de la fusion de la membrane vésiculaire avec la membrane plasmique ;
7) Arrivée d’un potentiel d’action qui provoque l’ouverture de canaux calciques et l’entrée
d’ions Ca2+ dans la terminaison nerveuse ;
8) Libération d’une vésicule par exocytose et diffusion du neuromédiateur dans la fente
synaptique ;
9) Action du neuromédiateur sur des récepteurs membranaires pré- et post-synaptiques ;
10) Arrêt du signal par diffusion, recapture, ou dégradation enzymatique. La dégradation
enzymatique ne concerne que l’acétylcholine qui est dégradée au sein de la fente
synaptique par l’acétylcholine-estérase. La recapture des autres neuromédiateurs
classiques est assurée par les transporteurs plasmiques de neuromédiateurs ;
11) Recyclage de la membrane vésiculaire par endocytose.
Pour pouvoir assurer plusieurs événements de libération successifs, il faut que la terminaison
nerveuse coordonne un double cycle des molécules (Zucker et coll., 1999).
14
Trans-Golgi
1
NM Neuromédiateur
Potentiel d’action
Vésicule Synaptique
Canal calcique voltage dépendent
Transporteur plasmique de NM
Cargo de transport axonal
Transporteur vésiculaire de NM
Récepteur métabotropique
Manteau de clathrine
G Protéine G hétérotrimérique
Récepteur ionotropique
1
Terminaison
e
om
s
o
End
1
NM
2
7
4
3
C
B
11
A
?
Ca2+
7
7
NM 8
6
5
Na+
Ca2+
G
10
9
densité
postsynaptique
Na+
Ca2+
Na+ Ca2+
Modifications
à long terme
Na+ Ca2+
Ca2+
Na+
9
Modifications
à long terme
G
G
Seconds
messagers
Astrocyte
dendrite
Figure n°2 : Modèle de la synapse chimique et des différentes étapes de la neurotransmission.
Ce schéma décrit en onze grandes étapes le fonctionnement d’une synapse chimique.1) Transport des constituants
jusqu’à la terminaison; 2) Regroupement des vésicules en amas; 3) Biosynthèse du neuromédiateurs; 4) Stockage
vésiculaire du neuromédiateur; 5) Arrimage des vésicules synaptiques à la zone active; 6) Amorçage de la fusion
vésiculaire; 7) Arrivée du potentiel d’action et ouverture des canaux calciques; 8) Libération et diffusion du
neuromédiateur; 9) Activation des récepteurs pré-, post-synaptiques ou gliaux; 10) Elimination du neuromédiateur de
la fente synaptique; 11) Recyclage de la membrane vésiculaire par endocytose.
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
D’une part, le neuromédiateur libéré doit être ré-internalisé par la terminaison pré-synaptique.
Ceci se fait soit directement, lorsque le transporteur plasmique est exprimé par le neurone présynaptique (c’est le cas pour la dopamine, la noradrénaline, la sérotonine, le GABA), soit
indirectement, après transformation du neuromédiateur lorsqu’il n’existe pas de transporteur
plasmique présynaptique. Dans le cas de l’acétylcholine, celle-ci est dégradée en choline dans le
fente synaptique et c’est la choline qui est ensuite internalisée dans le neurone présynaptique.
Dans le cas du glutamate, le système de recapture majeur se situe sur les cellules gliales
environnantes, qui transforment le glutamate en glutamine qui sera libérée et internalisée par les
neurones (voir plus loin). Nous allons revenir en détail sur les différents acteurs de ce cycle du
neuromédiateur dans la partie II de l’Introduction, en nous concentrant particulièrement sur le
glutamate.
D’autre part, la libération vésiculaire de neurotransmetteur résulte en l’incorporation d’une
certaine surface membranaire vésiculaire au sein de la membrane plasmique. Cet « excès » de
membrane doit ensuite être internalisé par endocytose pour reformer de nouvelles vésicules. Ce
cycle d’exocytose-endocytose ou cycle des vésicules synaptiques fait intervenir des mécanismes
de trafic membranaires universels, commun à toutes les cellules eucaryotes. Cependant, dans le
cas de la synapse, ces mécanismes sont ultra-spécialisés afin de permettre une plus grande
rapidité et une plus grande efficacité, tout en introduisant différents niveaux de régulation.
Voyons en détails quels sont les mécanismes et les acteurs moléculaires de ce cycle.
Exocytose des vésicules synaptiques
L’exocytose des vésicules synaptiques correspond à la fusion entre deux bicouches lipidiques :
la membrane vésiculaire et la membrane plasmique (pour revue, voir Seagar et coll., 2001). La
fusion entre ces deux couches est favorisée par un complexe ternaire très stable formé par les
protéines SNARE (Solube N-ethyl maleimide [NEM ] – sensitive factor [NSF] Attachment
protein REceptor) sur la membrane plasmique (syntaxine 1 et SNAP-25 synaptosomal
associated protein of 25 kDa) et sur la membrane vésiculaire (synaptobrévine ou vesicleassociated membrane protein VAMP). Ce complexe appelé complexe SNARE est la cible des
neurotoxines botuliques et tétaniques. La formation de ce complexe entraînerait un
rapprochement des deux membranes suffisant pour provoquer une hémi-fusion. Lorsque la
concentration en calcium intracellulaire est élevée, le complexe changerait de conformation
pour permettre une fusion totale. L’identité du senseur calcique a longtemps été source de
controverse, mais il se pourrait qu’il s’agisse de la synaptotagmine, une protéine
transmembranaire des vésicules dont les domaines C2 sont capables de lier les phospholipides
de manière dépendante du calcium (voir Rosenmund et coll., 2003 pour revue).
16
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
Endocytose par la voie de la clathrine
L’endocytose, longtemps considérée comme phénomène purement compensatoire à l’exocytose
et à l’apparition d’une certaine surface de membrane à la membrane plasmique, apparaît
aujourd’hui comme un mécanisme dont la régulation est assez complexe. (voir partie III de
l’Introduction). Plus qu’une simple problématique d’homéostasie, il s’agit ici d’un point de
contrôle permettant de réguler l’efficacité d’une synapse donnée.
Après la libération de neuromédiateur par fusion d’une vésicule synaptique, l’excédent de
membrane incorporé dans la membrane plasmique doit être retiré par endocytose : c’est ce que
l’on appelle l’endocytose compensatoire. Cette endocytose se fait en recouvrant la membrane
d’un manteau protéique composé de clathrine et est ainsi appelée « endocytose par la voie de la
clathrine ». Cependant, un grand nombre d’autres protéines est impliqué dans ce phénomène,
comme nous allons le détailler ci-dessous. Nous verrons que les lipides membranaires jouent
également un rôle important de régulation.
Ce mode d’endocytose est aussi nécessaire à la biogenèse des vésicules synaptiques. En effet,
plusieurs études ont montré que les composants des vésicules ne sont pas directement adressés
aux vésicules, mais doivent transiter par la membrane plasmique (Nakata et coll., 1998; Hannah
et coll., 1999).
L’endocytose par la voie de la clathrine est une voie d’endocytose commune à toutes les cellules
et que l’on retrouve dans des phénomènes aussi variés que l’internalisation de récepteurs
(GPCR) ou l’absorption de nutriments (fer grâce au récepteur à la transferrine, lipoprotéines via
le récepteur au LDL etc.) (Mellman, 1996).
La Figure n°3 décrit les cinq étapes nécessaires à la formation des vésicules par endocytose
médiée par la clathrine : nucléation, invagination, constriction, fission et démantèlement (voir
De Camilli et coll., 2000b pour revue). Tout d’abord, les protéines adaptatrices AP2 et AP180
sont recrutées à la membrane et s’oligomérisent, en reconnaissant certains motifs protéiques et
les phosphoinositides. Ce pré-complexe recrute les protéines du manteau de clathrine sous
forme de lattice. Suite au réarrangement du réseau de clathrine et à l’action de l’endophiline
(Ringstad et coll., 1999; Schmidt et coll., 1999), la membrane plasmique se courbe. La réaction
de fission nécéssite ensuite l’action de la GTPase dynamine. Enfin, le démantelement de la
vésicule nouvellement formée donne naissance à une vésicule qui peut être incorporée dans le
pool de vésicules synaptiques.
17
démantèlement
fission
constriction
initiation
invagination
Figure n°3 : Les différentes étapes de l’endocytose par la voie de la clathrine.
L’initiation de l’endocytose a lieu par le recrutement de la clathrine (en bleu) par les protéines adaptatrices. La
membrane (en jaune) est alors invaginée, sous l’effet de la déformation du manteau de clathrine et de modifications
des lipides. Après une étape de constriction, la vésicule en formation est séparée de la membrane plasmique par
fission. La dynamine (en rouge) agit à cette étape en formant un collier autour du cou de la vésicule. Enfin, le
démantèlement de la clathrine donne naissance à une vésicule libre.
Source: userpage.chemie.fu-berlin.de/biochemie/aghaucke/cme.html
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
I.4/ La clathrine et les protéines accessoires
Bien que les adaptateurs et la clathrine soient capables de former des puits faiblement invaginés
sur des liposomes in vitro, d’autres protéines dites « accessoires » sont nécessaires aux étapes
ultérieures aboutissant au détachement d’une vésicule. L’ensemble de ces protéines est enrichi
dans les neurones et, plus particulièrement, dans les terminaisons nerveuses.
La dynamine est une GTPase dont le rôle essentiel dans l’endocytose a été découvert grâce au
mutant thermosensible shibire chez la drosophile (Sever, 2002). Lorsque les mutants sont placés
à température restrictive, on observe une accumulation de puits recouverts de clathrine
fortement invaginés et entourés d’un collier dense aux électrons. Il existe chez les mammifères
plusieurs isoformes de dynamine exprimées dans différents tissus. La dynamine 1 est la forme la
plus étudiée car elle est exprimée dans le système nerveux central, où elle est fortement enrichie
au niveau des terminaisons nerveuses.
Toutes les dynamines sont des protéines à plusieurs domaines (voir Figure n°4) : un domaine Nterminal responsable de l’activité GTPase, un domaine de reconnaissance des phospholipides
PH (pour pleckstrin homology), un domaine régulateur GED (GTPase Effector Domain) et un
domaine riche en prolines
(PRD, pour Proline-Rich Domain), responsable d’interactions
protéiques.
Deux modèles sont proposés pour le mode d’action de la dynamine dans la réaction de fission
membranaire :
- la dynamine pourrait jouer un rôle de garrot moléculaire, qui serait contrôlé par l’activité
GTPase intrinsèque (pinchase model)
- la dynamine pourrait réguler un effecteur en aval, en fonction de son état de liaison au
GTP/GDP (molecular switch model). Ce dernier modèle est suggéré par les expériences de
Sever et collaborateurs qui ont montré une stimulation de l’endocytose lorsque l’état lié au GTP
est favorisé (Sever et coll., 1999). L’endophiline a été proposée comme effecteur (voir plus loin
et Huttner et Schmidt, 2000 pour revue).
La synaptojanine est une polyphosphoinositide phosphatase, capable de déphosphoryler le
phosphatidyl-inositol4,5-bisphosphate
(PtdIns(4,5)P2)
et
le
phosphatidyl-inositol3,4,5-
triphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), deux phosphoinositides qui interagissent avec les motifs PH.
Elle contient dans sa partie C-terminale un motif PRD capable d’interagir avec l’amphiphysine
et l’endophiline. L’invalidation du gène codant la synaptojanine 1 (isoforme majeure du
système nerveux) chez la souris provoque une mort précoce associée à des défauts de la
19
GED
GTPase
Sac1
5’-Pase
Figure n°4 : Les protéines accessoires de l’endocytose par la voie de la clathrine.
Les protéines accessoires de l’endocytose par la voie de la clathrine sont représentées ici de manière schématique pour
faire figurer les différentes domaines protéiques et les interactions qu’ils permettent. L’amphiphysine et l’endophiline
possèdent un domaine N-BAR N-terminal capable de se dimériser en formant des superhélices coiled-coil (C-C), de lier
et de courber les membranes lipidiques. Elles possèdent également un domaine SH3 (Src Homology domain type 3)
capable d’interagir avec les domaines riches en prolines (PRD) de la dynamine et de la synaptojanine. La dynamine
possède un domaine doté d’une activité d’hydrolyse du GTP (GTPase) qui est lui même régulé par le domaine GED
(GTPase Effector Domain). La synaptojanine possède deux domaines capables de déphosphoryler les
phosphoinositides: un domaine d’homologie avec la protéine de levure Sac1 et un domaine 5’-phosphatase.
Source: Schmid et coll., 1999)
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
transmission synaptique (Cremona et coll., 1999). L’ultrastructure des terminaisons nerveuses
révèle une accumulation de vésicules recouvertes de clathrine, suggérant que la synaptojanine
joue un rôle dans le démantelement de ce manteau. Des mesures électrophysiologiques ont
montré une dépression synaptique plus importante et plus prolongée pour les synapses mutantes
que pour les synapses sauvages (Cremona et coll., 1999; Luthi et coll., 2001) L’injection
d’anticorps dirigés contre la synatojanine dans la synapse réticulo-spinale de la lamproie
provoque des défauts morphologiques similaires (Gad et coll., 2000). Le mutant de l’orthologue
de la synaptojanine chez le nématode C. elegans, unc-26, est également caractérisé par une
déplétion des vésicules synaptiques et l’accumulation concomittante de figures intermédiaires
de l’endocytose comme des puits invaginés et des vésicules recouvertes de clathrine (Harris et
coll., 2000). Une analyse approfondie des neurones en culture issus des souris synaptojanine -/montre une diminution de 40% du pool de vésicules libérables mesuré par FM1-43 due à une
incorporation ralentie des vésicules dans le pool des vésicules libérables (Kim et coll., 2002).
L’amphiphysine est une protéine à plusieurs domaines capable d’interagir avec la dynamine et
la synaptojanine par son domaine SH3 (Src Homology domain type 3) de lier les bicouches
lipidiques par sa partie N-terminale et de se lier à l’AP2 (protéine adaptatrice n°2) et à la
clathrine. Ces nombreuses interactions suggèrent que cette protéine pourrait avoir un rôle
d’adaptateur au sein de la terminaison nerveuse. L’importance de l’amphiphysine dans
l’endocytose a été démontrée par l’injection de peptides entrant en compétition pour le domaine
SH3 de l’amphiphysine et provoquant l’accumulation de puits fortement invaginés recouverts
de clathrine (voir Slepnev et De Camilli, 2000 pour revue).
Les endophilines forment une famille de protéines multidomaines découvertes par leur capacité
à lier des motifs riches en prolines. Elles ont été clonées simultanément par plusieurs équipes, ce
qui explique une nomenclature quelque peu complexe. Nous les appelerons endophilines A1,
A2 et A3, comme le suggère la revue de Huttner et Schmidt (Huttner et Schmidt, 2000). Elles
ont été clonées par criblage d’une banque d’expression pour la recherche de ligands de peptides
riches en prolines (Sparks et coll., 1996), par PCR avec des amorces dégénérées pour la
recherche de protéines à domaine SH3 (Giachino et coll., 1997), en tant que gène transloqué
dans certaines leucémies avec translocation chromosomique (So et coll., 1997) et par criblage
double-hybride utilisant comme appât une protéine virale responsable du syndrome
d’immunodéficience murin (Torrey et coll., 1998). Les trois protéines présentent un fort degré
d’identité mais diffèrent par leur répartition anatomique, comme le précise le Tableau n°2.
21
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
Tableau n°2 : Clonage des endophilines A
Endophiline
Localisation
Souris
Homme
Homme
Souris
A1
Cerveau
SH3p41
SH3GL22
EEN-B13
SH3D2A4
A2
Ubiquitaire
SH3p8
SH3GL1
EEN
SH3D2B
A3
Cerveau et testicules
SH3p13
SH3GL3
EEN-B2
SH3D2C
Abréviations : SH3px : SH3-containing protein x ; SH3GLx : SH3-containing Grb2-like transcript x ;
EEN : Extra Eleven Nineteen ; SH3Dx : SH3 domain-containing protein x.
Références : 1 : (Sparks et coll., 1996) ; 2 : (Giachino et coll., 1997) ; 3 : (So et coll., 1997) ; 4 (Torrey et
coll., 1998)
Il existe également une autre sous-famille de protéines présentant une forte homologie avec les
endophilines. Celles-ci sont appelées endophilines B1 et B2 dans la nomenclature unifiée
(Modregger et coll., 2003), mais ont également été appelés SH3GLB1 et SH3GLB2 (Pierrat et
coll., 2001) et Bif-1 (Cuddeback et coll., 2001). Leur rôle éventuel dans l’endocytose n’est pas
connu, mais il semblerait qu’elles soient plutôt impliquées dans l’apoptose (Pierrat et coll.,
2001) (Cuddeback et coll., 2001) et dans la préservation de la morphologie des mitochondries
(Karbowski et coll., 2004).
La partie N-terminale des endophilines comporte un domaine N-BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs),
en hélices a, capable de lier les lipides membranaires et de les courber (Peter et coll., 2004).
Cette partie N-terminale comporte également une activité lysophosphatidic acyl transférase
(LPAAT) (Schmidt et coll., 1999) qui transforme l’acide lysophosphatidique en acide
phosphatidique. Les formes de ces deux phospholipides étant des cones de géométrie opposée,
cette activité LPAAT pourrait modifier la forme globale de la bicouche lipidique et ainsi
favoriser la courbure nécessaire à l’endocytose. L’extrémité C-terminale de l’endophiline est un
domaine SH3, impliqué dans la liaison de domaines riches en prolines d’autres protéines de
l’endocytose telle que la dynamine (Ringstad et coll., 1997 ; Micheva et coll., 1997a),
l’amphiphysine (Micheva et coll., 1997b) et la synaptojanine (Ringstad et coll., 1997) (de
Heuvel et coll., 1997; Micheva et coll., 1997a). Ces interactions ont été montrées par différentes
techniques de protéomique (criblage double-hybride) et de biochimie (GST pulldown, coimmunoprécipitation, overlay).
L’implication de l’endophiline A1 dans l’endocytose par la voie de la clathrine a été montrée
dans différents modèles acellulaires et cellulaires. Schmidt et Huttner ont montré dans un
système in vitro de cellules sécrétrices PC12 perforées que l’ajout d’endophiline recombinante
stimule la formation de microvésicules de type synaptique, tandis que la déplétion d’endophiline
endogène l’inhibe (Schmidt et Huttner, 1998). Il a été montré, toujours à partir de cellules
perforées, que le domaine SH3 de l’endophiline inhibe l’endocytose. Cette action a été attribuée
à l’interaction de l’endophiline avec la synaptojanine, puisque le domaine ne liait que
22
INTRODUCTION- I/ La synapse chimique
faiblement la dynamine (Simpson et coll., 1999). L’équipe de P. De Camilli a utilisé la synapse
géante de la lamproie pour des expériences d’interférence : la microinjection d’anticorps antiendophiline bloque l’endocytose à un stade précoce (puits faiblement invaginés) (Ringstad et
coll., 1999), tandis que l’injection d’une protéine de fusion GST avec le domaine SH3 de
l’endophiline provoque l’accumulation de puits recouverts de clathrine et de vésicules
recouvertes de clathrine (Gad et coll., 2000). La capacité de l’endophiline à lier et à modifier les
phospholipides a été montrée in vitro par différentes équipes : A. Schmidt et coll. ont montré
que l’endophiline possédait une activité LPAAT (Schmidt et coll., 1999), alors que K. Farsad et
coll. ont montré qu’il existait une hélice amphipatique N-terminale capable d’induire la
tubulation de liposomes in vitro indépendamment de l’activité LPAAT (Farsad et coll., 2001).
Ainsi, la partie N-terminale de l’endophiline contient à la fois une activité enzymatique LPAAT
et un motif N-BAR capable de lier les lipides.
Plusieurs expériences de génétique dans des organismes modèles (Drosophile et C. elegans) ont
démontré l’implication de l’endophiline in vivo dans le processus endocytotique. L’analyse de la
transmission à la jonction neuromusculaire de drosophiles invalidées pour l’endophiline révèle
que la transmission nerveuse est fortement réduite (seulement 20% de transmission résiduelle),
que les terminaisons sont déplétées en vésicules synaptiques et que les synapses sont incapables
d’incorporer le FM1-43, un marqueur de l’endocytose (Guichet et coll., 2002). La transmission
résiduelle observée est interprétée comme étant liée à du recyclage de type kiss-and-run (voir
partie III.3 de l’Introduction). L’examen de doubles mutants pour l’endophiline et la
synaptojanine chez la drosophile (Verstreken et coll., 2003) et chez le nématode (Schuske et
coll., 2003) suggère que l’endophiline agit en aval de la synaptojanine et que son rôle principal
dans l’endocytose serait de recruter la synaptojanine vers son site d’action pour démanteler les
vésicules.
Il est clair d’après le descriptif ci-dessus que les interactions protéine-protéine, d’une part, et
protéine-lipide, d’autre part, jouent un rôle essentiel dans le processus de l’endocytose par la
voie de la clathrine. L’ensemble de ces interactions est récapitulé dans la Figure n°4.
L’ensemble des étapes décrites ci-dessus sont, contrairement à l’endocytose constitutive de
certains récepteurs ou nutriments, soumises à de très importantes régulations, décrites dans la
partie III.
Dans la partie II, nous allons étudier plus spécifiquement la transmisson glutamatergique. Le
rôle majeur du glutamate dans le système nerveux central, les protéines impliquées dans cette
transmission et, enfin, les transporteurs vésiculaires du glutamate, seront passés en revue.
23
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
II/ LES TRANSPORTEURS VESICULAIRES DU GLUTAMATE
COMME
MARQUEURS
DE
LA
TRANSMISSION
GLUTAMATERGIQUE
II.1/ Le métabolisme du glutamate
Le glutamate (ou acide glutamique sous sa forme protonée) est le neuromédiateur excitateur
majeur du système nerveux central, utilisé par environ 40% des neurones. Le glutamate est
également un élément nutritif fondamental, qui est impliqué dans de nombreuses voies
anaboliques (synthèse des protéines, glyconéogenèse) et cataboliques (cycle de Krebs). Il est
donc présent dans toutes les cellules de l’organisme. Les travaux visant à démontrer le rôle de
cet acide aminé dans la neurotransmission ont donc dû distinguer deux compartiments de
glutamate : le compartiment métabolique, présent dans toute cellule, et le compartiment
neuronal, plus spécifiquement impliqué dans la neurotransmission. Ainsi, dans le cerveau, le
taux tissulaire moyen est d’environ 10 mM, mais les vésicules synaptiques glutamatergiques
contiennent 50 à 100 mM de glutamate (voir Tableau n°3).
Tableau n°3 :
Concentration en glutamate et son affinité pour ses différentes cibles du système nerveux
Concentrations approximatives
Plasma sanguin
Liquide céphalo-rachidien
Liquide intercellulaire cérébral
Homogénat de cerveau
Cytoplasme
Vésicules synaptiques
Fente synaptique
Affinité pour les récepteurs et transporteurs
EAAT
NMDAR
mGluR2, -3, -4 et –8
mGluR1, -5
AMPAR
mGluR7
VGLUT
30 à 100 mM
< 1 mM
0,5 à 2 mM
10 mM
1 à 10 mM
50 à 100 mM
2 à 1000 m
1 à 30 mM
2,5 à 3 mM
5 mM
10 mM
200 à 500 mM
1 mM
0,5 à 2 mM
Ce tableau est tiré de la revue de Meldrum(Meldrum, 2000). Il permet de mettre en perspective le rôle
fondamental des transporteurs plasmiques et vésiculaires dans la régulation de la concentration en
glutamate à la synapse. La concentration en glutamate dans la fente synaptique varie dans une gamme
permettant le contrôle de l’activation des récepteurs.
Abréviations – AMPAR : AMPA Receptor ; EAAT : Excitatory Amino Acid Transporter; mGluR :
metabotropic Glutamate Receptor ; NMDAR : NMDA Receptor ; VGLUT : Vesicular GLUtamate
Transporter.
24
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
Les taux circulants de glutamate sont relativement élevés, mais cette molécule ne franchit pas
bien la barrière hémato-encéphalique (Smith, 2000). Le glutamate cérébral est donc synthétisé
de manière locale à partir de différents précurseurs. Le glutamate peut être synthétisé dans les
neurones à partir de différentes sources (voir Figure n°5A). Il peut être obtenu à partir du
glucose via l’a-céto-glutarate produit par le cycle de Krebs. Une autre voie est la transamination
de la glutamine. Cette source de glutamate fait appel à la « navette glutamate/glutamine »
décrite dans la Figure n°5B et met en évidence un rôle primordial des cellules gliales
environnantes. D’après des études de marquage métabolique avec des radioisotopes, cette voie
serait la principale source de glutamate pour les neurones (Bonvento et coll., 2002). Enfin, la
GABA-amino-transférase permet la synthèse de glutamate partir du GABA.
Les deux sources principales sont le glucose (via l’a-céto-glutarate) et la glutamine (provenant
des astrocytes), mais la quantification de la contribution in vivo de chacune des voies n’a jamais
pu être évaluée de manière précise, en raison de difficultés techniques. Il est d’ailleurs probable
que la part relative de chaque précurseur varie en fonction des conditions physiologiques.
Outre les enzymes de biosynthèse du glutamate, d’autres protéines sont importantes pour la
fonction de neuromédiateur de cet acide aminé. Il s’agit des récepteurs, dont le rôle est d’assurer
la transduction du signal en détectant le glutamate dans la fente synaptique, et des transporteurs.
Parmi les transporteurs, il faut distinguer les transporteurs plasmiques qui sont à la membrane
plasmique et qui participent à l’arrêt du signal en recapturant le glutamate à l’intérieur des
cellules, des transporteurs vésiculaires qui permettent d’accumuler le glutamate dans les
vésicules synaptiques avant sa libération. Nous parcourrons successivement ces grandes
familles de protéines.
II.2/ Les récepteurs et les transporteurs plasmiques du glutamate
L’identification pharmacologique puis le clonage moléculaire des différentes classes de
récepteurs du glutamate ont non seulement permis d’affirmer que le glutamate a bien un rôle de
messager en plus de son rôle métabolique, mais ont aussi ouvert la voie à un grand nombre
d’études. On distinguera dans un premier temps les récepteurs ionotropiques, qui sont des
canaux ioniques dont l’ouverture est dépendante de la fixation du neuromédiateur. Puis nous
passerons en revue ce que nous savons sur les récepteurs métabotropiques, récepteurs à sept
segments transmembranaires et couplés à des protéines G (voir Figure n°6).
25
Figure n°5: Les principales voies de biosynthèse du glutamate.
A, L’α-céto-glutarate, l’aspartate, la glutamine et le GABA sont les principaux précurseurs directs du glutamate
dans le cerveau. Le rôle prédominant de l’α-céto-glutarate, intermédiaire du cycle de Krebs, est remarquable.
Quelques autres réactions de trans-amination permettent de générer du glutamate (non montré). B, Représentation
schématique de la navette glutamate/glutamine. Une cellule gliale est représentée avec à sa gauche, une synapse
glutamatergique et à sa droite, une synapse GABAergique.
Source: Palmada et Centelles, 1998.
A
B
Milieu extracellulaire
Cytoplasme
Figure n°6 : Représentation schématique des récepteurs du glutamate.
A, Représentation schématique d’une sous-unité de récepteur ionotropique. Les domaines de reconnaissance du
ligand, les sites d’épissage alternatif et d’édition de l’ARN sont représentés. B, Représentation schématique d’une
sous-unité de récepteur métabotropique. Les domaines de reconnaissance du ligand et le site de liaison à des
protéines de la densité post-synaptique telle que Homer sont représentés.
Source : www.bris.ac.uk/Depts/Synaptic/info/glutamate.html
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
Récepteurs ionotropiques
Les récepteurs-canaux médient la réponse rapide au glutamate, puisqu’ils peuvent s’ouvrir dans
les quelques millisecondes qui suivent la libération d’un quantum de glutamate et laisser passer
des cations qui vont directement moduler le potentiel membranaire du neurone postsynaptique,
en provoquant une dépolarisation (voir Ozawa et coll., 1998 pour revue).
Il en existe trois classes différentes, initialement définies en fonction de leur pharmacologie,
puis par famille de gènes lorsque les sous-unités composant les récepteurs ont été clonées. Un
récepteur fonctionnel est constitué de l’assemblage de plusieurs sous-unités. Les récepteurs
AMPA et kaïnate sont des canaux à Na+ et K+ dont la durée d’ouverture lors de la fixation de
l’agoniste est limitée par un phénomène de désensibilisation, qui provoque la fermeture des
canaux après quelques millisecondes même si l’agoniste est toujours présent. Les récepteurs
NMDA ne s’ouvrent que si le neurone est déjà dépolarisé, soit par l’ouverture de canaux
AMPA/kaïnate, soit par d’autres phénomènes, car il existe un blocage dépendant du voltage par
les ions Mg2+ extracellulaires. De plus, il existe un site de régulation par la glycine, qui agit
comme co-agoniste. Les récepteurs NMDA sont la cible d’antagonistes dépendant de l’activité
du récepteur comme le MK-801. Les principales caractéristiques des récepteurs ionotropiques
sont récapitulées dans le Tableau n°4-A
Tableau n°4-A : Récepteurs ionotropiques du glutamate
Récepteur Agonistes
AMPA
Glu, AMPA,
KA
KA
Glu, KA
Antagonistes Canal
CNQX
Na+, K+
Proprieté
Désensibilisation
Sous-unités
GluR1-4
CNQX
Na+, K+
Désensibilisation
NMDA
APV,
CNQX
Na+, K+,
Ca2+
Blocage par le
Mg2+
GluR5-7
KA1,2
NR1
NR2A-D
NR3A-B
Glu, NMDA
Abréviations – AMPA : a-Amino-3-hydroxy-5-Methyl-4-isoxazole Propionic Acid ; APV : D-2-amino5-phophovanerate ; CNQX : 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione ; Glu : glutamate ; KA : kaïnate ;
NMDA : N-Methyl-D-Aspartic acid.
Récepteurs métabotropiques
Les récepteurs métabotropiques sont des récepteurs à sept segments transmembranaires, couplés
aux protéines G. Ils médient les réponses modulatrices au glutamate, sur des temps
généralement plus longs que les récepteurs ionotropiques puisqu’elles nécessitent la génération
de seconds messagers intracellulaires. Les récepteurs métabotropiques se répartissent également
en trois classes (voir Tableau n°4-B). Le très grand domaine N-terminal est extracellulaire et est
responsable de la reconnaissance du ligand (Parmentier et coll., 1998).
28
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
Tableau n°4-B : Récepteurs métabotropiques au glutamate
Groupe
Groupe I
Sous-unité
Couplage
Agoniste
Localisation
mGluR1
3,5-DHPG
↑PLC (Gq)
mGluR5
Groupe II
mGluR2
LY354740
ØAC (Gi/Go)
mGluR3
Groupe III
mGluR7
L-AP4
Présynaptique (autorécepteur)
ØAC (Gi/Go)
mGluR4
mGluR8
mGluR6
Cellules bipolaires de la rétine
Abréviations : 3,5-DHPG : 3,5-digydrohyphenylglycine ; AC : adénylate cyclase ; L-AP4 : L(+)-2-Amino-4-phosphonobutyric acid ; PLC : phospholipase C
Le glutamate extracellulaire peut se révéler toxique pour les cellules en activant de manière trop
importante les récepteurs ionotropiques et en provoquant une augmentation de la consommation
d’énergie de la cellule, ainsi que la formation de radicaux libres (pour revue voir Danbolt,
2001).
Plusieurs mécanismes existent pour contrer cette excitotoxicité du glutamate : désensibilisation
des récepteurs AMPA, diffusion du glutamate dans la fente synaptique et surtout système de
recapture très efficace. Comme l’indique le Tableau n°3, l’affinité des transporteurs plasmiques
pour leur substrat est relativement faible (Km entre 1-30 mM), mais c’est surtout l’abondance
des sites de recapture et la rapidité de leur vitesse de fonctionnement (Vmax) qui en font un
mécanisme efficace.
Transporteurs plasmiques du glutamate
Il existe cinq sous-types de transporteurs plasmiques du glutamate, isolés par clonage
moléculaire depuis les années 1990. Ils appartiennent tous à une même famille de gènes,
catalysent un transport de glutamate couplé aux ions Na+ et K+ et diffèrent surtout par leur
localisation dans le système nerveux central. Certains sous-types sont spécifiquement exprimés
à la membrane des cellules gliales, alors que d’autres sont présents sur les neurones
postsynaptiques. Jusqu’à présent, il n’a pas été trouvé de transporteur plasmique spécifique des
neurones glutamatergiques qui ne serait exprimé que par l’élément présynaptique
glutamatergique. Les travaux récents de Schmitt et coll. (Schmitt et coll., 2002) suggèrent qu’un
variant d’épissage de EAAT2 pourrait être spécifiquement exprimé par les neurones
glutamatergiques.
29
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
Tableau n°4-C : Transporteurs plasmiques du glutamate
Soustype
GLAST
Homologue
humain
EAAT1
Type cellulaire
GLT1
EAAT2
Astrocytes et neurones
EAAC1
EAAT3
Neurones
EAAT4
EAAT4
Cellules de Purkinje
EAAT5
EAAT5
Photorécepteurs et
cellules bipolaires
Astrocytes
Localisation
anatomique
Cervelet > cortex,
moelle épinière
Ubiquitaire
Hippocampe, cervelet,
striatum
Cervelet
Retine
Clonage
Strock et coll.,
1992
Pines et coll.
1992
Kanai et
Hediger, 1992
Fairman et
coll., 1995
Arriza et coll.,
1997
Ce tableau est tiré de Maragakis et Rothstein, 2004.
Abréviations : GLAST : glutamate transporter ; EAAT : excitatory amino-acid transporter ; GLT :
glutamate transporter ; EAAC : excitatory amino-acid carrier .
II.3/ Les transporteurs vésiculaires du glutamate
Comme nous venons de le voir, ni les enzymes de biosynthèse, ni les transporteurs plasmiques,
ne peuvent servir de marqueur sélectif des neurones glutamatergiques, puisqu’ils sont également
exprimés dans d’autres populations cellulaires. Pourtant, un tel marqueur serait un outil
précieux pour l’étude des voies glutamatergiques dans des situations normales ou
pathologiques. De nombreuses équipes se sont donc lancées dans la recherche du transporteur
vésiculaire du glutamate pour obtenir ce marqueur. L’activité de transport vésiculaire de
glutamate était connue depuis les années 1980, mais l’identité moléculaire du transporteur est
restée inconnue jusqu’en 2000, lorsque deux équipes ont décrit la protéine BNPI («Brainderived NaPi Transporter type 1) comme étant responsable de l’accumulation de glutamate dans
les vésicules synaptiques (Bellocchio et coll., 2000; Takamori et coll., 2000).
BNPI avait initialement été caractérisé comme un gène dont l’expression était augmentée dans
des cellules granulaires cérébelleuses par un traitement au NMDA (Ni et coll., 1994). La
comparaison de la séquence de BNPI avec les bases de données a montré qu’il s’agissait d’un
nouveau membre de la famille des transporteurs sodium/phosphate (NaPiT). En effet, son
expression dans les ovocytes permet l’accumulation de phosphate inorganique radiomarqué.
Quelques années plus tard, l’équipe de R. Edwards a montré que l’expression de BNPI était
restreinte à certaines populations de neurones et se situait sur les vésicules synaptiques de
certaines synapses asymétriques (Bellocchio et coll., 1998), suggérant que BNPI pouvait jouer
un rôle présynaptique dans la transmission glutamatergique. Ceci a été confirmé par le
phénotype observé chez le nématode C.elegans portant une mutation dans le gène eat-4,
l’homologue de BNPI (Dent et coll., 1997; Lee et coll., 1999). En effet, ce mutant a des
30
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
difficultés à s’alimenter liées à un défaut de la libération de glutamate. Ces auteurs avaient alors
pensé que le rôle de BNPI dans les neurones glutamatergiques pouvait être de réguler l’enzyme
de biosynthèse, la PAG (phosphate-activated glutaminase), sensible au Pi, en contrôlant l’entrée
de phosphate inorganique dans ces cellules. En 2000, deux équipes ont montré que BNPI
pouvait fonctionner comme transporteur vésiculaire de glutamate et le rebaptisèrent VGLUT1
(Bellocchio et coll., 2000; Takamori et coll., 2000). Les caractéristiques de transport de
glutamate par des vésicules purifiées à partir de cellules exprimant VGLUT1 sont les mêmes
que celles décrites pour des vésicules natives. De plus, Takamori et coll. ont montré que la
transfection de cellules sécrétrices et de neurones permettait bien la libération de glutamate.
BNPI est donc bien un transporteur vésiculaire du glutamate et confère un phénotype
glutamatergique aux neurones qui l’expriment.
Simultanément à ces études, une séquence homologue à BNPI a été découverte. Il s’agit de
DNPI (pour « Differenciation-Associated Na Pi transporter »), dont l’expression est augmentée
lors de la différenciation de cellules pancréatiques en cellules neuronales (Aihara et coll., 2000).
Le fort degré d’identité entre les protéines codées par BNPI et DNPI, ainsi que le fait que BNPI
ne soit exprimé que par une sous-population de neurones glutamatergiques du cerveau (voir plus
loin), ont fait de DNPI un candidat immédiat pour être un second sous-type de transporteur
vésiculaire de glutamate. En effet, six articles sont parus dans l’année suivante pour démontrer
que DNPI pouvait bien être considéré comme VGLUT2 (Bai et coll., 2001; Fremeau et coll.,
2001; Hayashi et coll., 2001; Herzog et coll., 2001; Takamori et coll., 2001; Varoqui et coll.,
2002).
A eux deux, VGLUT1 et VGLUT2 couvrent l’ensemble des voies glutamatergiques connues
(voir plus bas). Cependant, un troisième sous-type, plus surprenant par sa localisation, fut
identifié par la suite par les mêmes équipes (Fremeau et coll., 2002; Gras et coll., 2002; Schafer
et coll., 2002; Takamori et coll., 2002).
Je vais tout d’abord décrire les caractéristiques moléculaires des protéines VGLUT1, -2 et –3,
puis préciser les propriétés fonctionnelles de ces transporteurs (caractéristiques de transport et
régulations de ce transport). La répartition anatomique des trois sous-types sera décrite dans le
chapitre suivant, ainsi que dans les articles qui sont issus de mon travail de thèse.
Structure moléculaire
Les protéines VGLUT1, -2 et –3 sont des polypeptides de 560 à 589 acides aminés qui ont une
mobilité électrophorétique d’environ 60 kDa sur gel de polyacrylamide. L’analyse des profils
d’hydropathicité
prédit
des
protéines
polytopiques
contenant
6
à
10
domaines
transmembranaires (voir Figure n° 7-A).
31
A
R G D A S L E L T E A G E Q R K E L L R H L R G L A R G A L K R F E E Q R F E M NH2
P
V
COOH
Y D R V P P P P R P P Q V T S H
T
A
G
Y
T T H T
R
D
P
D V V P
C
T
E E V
F
C
F
Y
G
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A
F
G
P
E
L
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L
A
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K
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Q
Q
V
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V F G
L V G A S S V F
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G F S I
V I I A
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V
P
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L
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Y L F W
F S G H
P V Y
A I Q G
G V A I
V G L
G L I
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A T T A
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D
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F
L
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Y
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G
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S
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P
S
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P
V
D
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G
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N
N
V
F
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P
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L
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V
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A
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P
P
T
K
T
T
S
N
K
I
A
S
H R G G H V V V Q
I
T
M
L
E
W
Q
S
N
L
M
I
G
E
V
K
G
E
L
G
R K L M N C G G F
A
E
V
R K Y I E D A I G E S
H
E G V T Y P A C
cytoplasme
cytoplasme
E V E P P G A P P A P P P
D
E
M E S E D S G A L Q D H G V
S
F
Q P W A E P E E M S E E
K
S
E
I
G
L
S
M G I S
A F V G
V G N
V I F Y
G T L S
G G Y
S L V H
V M G
A I L
C P I I
M A G V
Q Y V F
W
T
E
K
H K T R E
G
C
K
lumière
lumière vésiculaire
vésiculaire
B
Figure n°7 : Structure moléculaire des transporteurs vésiculaires du glutamate.
A, Modèle de structure secondaire des transporteurs VGLUT1 et -2 à dix passages transmembranaires positionnant
les parties N- et C-terminales dans le compartiment cytoplasmique. Un site potentiel de glycosylation est
représenté dans la première boucle intra-vésiculaire. La séquence présentée est celle de VGLUT1 et les résidus
marqués en rouge divergent entre VGLUT1 et VGLUT2. B, Alignement des séquences protéiques de VGLUT1, -2
et -3. Les résidus conservés sont encadrés en noir. Notez la grande conservation dans les domaines
transmembranaires et la divergence des extrêmités N- et C-terminales.
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
Les parties N- et C-terminales sont vraisemblablement cytoplasmiques car :
- on ne retrouve pas de peptide signal en amont des protéines ;
-des sites putatifs de glycosylation (motif NNST) sont localisés dans la première boucle
intraluminale ;
-l’accessibilité aux anticorps dirigés contre des peptides supposés être cytoplasmiques est bonne
in situ.
La possibilité d’une oligomérisation de VGLUT1 a été évoquée d’après l’aspect des bandes
observées en Western blot par différents auteurs. Kotani et coll., ainsi que Sakata-Haga et coll.
observent en Western blot des bandes pour des masses moléculaires apparentes à des multiples
de 60kDa (Kotani et coll., 2000; Sakata-Haga et coll., 2001).
L’alignement des séquences peptidiques de VGLUT1, -2 et -3 montre qu’il s’agit de protéines
très conservées, présentant un pourcentage d’identité de 75 % (voir Figure n°7-B). De manière
frappante, la partie centrale des protéines est la plus conservée (jusqu’à 95% d’identité si l’on
n’aligne que les parties correspondant aux domaines transmembranaires). Les parties N- et Cterminales des protéines sont, au contraire, beaucoup plus divergentes. Il est tentant de spéculer
que la partie centrale conservée est responsable de caractéristiques fonctionnelles similaires
entre les trois sous-types, alors que les parties N- et C-terminales divergentes pourraient être
responsables de propriétés différentes entre les trois transporteurs. Cette hypothèse, qui sera
développée plus loin, est à l’origine de mon travail de thèse décrit dans la partie III des Résultats
et fera l’objet d’une publication.
Revenons dans un premier temps sur les caractéristiques communes des trois sous-types dans le
transport vésiculaire de glutamate.
Caractéristiques de transport
Le transport vésiculaire de glutamate assuré par VGLUT1, -2 et -3 présente des propriétés
bioénergétiques et pharmacologiques similaires pour les trois-types et similaires à ce qui avait
été démontré pour des vésicules synaptiques purifiées à partir de cerveau. Le transport
vésiculaire de glutamate possède les propriétés suivantes (voir Shigeri et coll., 2004 pour une
revue sur la pharmacologie des VGLUTs) :
- un transport dépendant de la v-ATPase (pompe à protons présente à la membrane des vésicules
et dépendante du Mg2+) ;
- une dépendance plus importante de la composante électrique (DY) que de la composante
chimique (DpH) du gradient de protons ;
33
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
- une courbe biphasique de dépendance au Cl-, avec un transport maximal pour 2-4 mM ; (voir
Wolosker et coll., 1996 pour l'analyse de cet effet complexe) ;
- une faible affinité pour le glutamate (Km de l’ordre du millimolaire) ;
- une forte spécificité pour le glutamate . En effet, ni l’aspartate, ni le GABA ou la glycine ne
peuvent entrer en compétition avec le glutamate tritié ;
- une inhibition par le bleu Evans en concentration micromolaire.
Il est intéressant de noter que les mécanismes du transport vésiculaire du glutamate semblent
être conservés non seulement entre les trois sous-types chez les mammifères mais également au
sein des vertébrés (mammifères, oiseaux, reptiles, amphibiens et poissons) (Tabb et Ueda,
1991). Cette conservation importante de la fonction principale des transporteurs se retrouve au
niveau moléculaire par une importante conservation de la séquence des transporteurs
vésiculaires du glutamate dans leur partie centrale. Au contraire, la grande divergence des
extrémités N- et C-terminales suggère une spécialisation des fonctions secondaires de chaque
protéine (régulations de l’adressage, interactions avec différentes protéines).
Régulation du transport vésiculaire de glutamate
Différentes régulations physiologiques et pharmacologiques de l’activité de transport des
VGLUT ont été montrées et sont décrites brièvement ci-dessous.
Les travaux de T. Ueda et ses collaborateurs ont permis d’identifier un facteur soluble
cytoplasmique qui inhibe l’activité de transport vésiculaire du glutamate par des vésicules de
cerveau de bœuf (Lobur et coll., 1990; Ozkan et coll., 1997; Tamura et coll., 2001), qu’ils ont
nommé IPF (pour inhibitory protein factor). Après purification et séquençage partiel, il s’est
avéré que l’IPF est un produit de la protéolyse de la fodrine a (Lobur et coll., 1990; Ozkan et
coll., 1997; Tamura et coll., 2001) L’IPF inhibe le transport vésiculaire de glutamate ainsi que
sa libération par des synaptosomes, alors que la fodrine elle-même n’a aucun effet. Les auteurs
suggèrent donc que le clivage de la fodrine pourrait être un mode de régulation qui modifierait
la quantité de neuromédiateur libérable. Cette action de l’IPF n’est cependant pas spécifique du
glutamate puisque la libération de GABA et de sérotonine est aussi altérée (Lobur et coll., 1990;
Ozkan et coll., 1997; Tamura et coll., 2001).
Les mêmes auteurs ont montré que le transport vésiculaire de glutamate est couplé
énergétiquement à la glycolyse (Ikemoto et coll., 2003). En effet, le complexe GAPDH/3-PGK
est associé à la membrane vésiculaire et permet de synthétiser de manière locale de l’ATP qui
34
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
sert à établir le gradient de protons. Ainsi, le glucose, en plus de son rôle de précurseur du
glutamate, a un rôle énergétique primordial dans les neurones glutamatergiques.
Bole et coll. montrent que la capacité de stockage de glutamate dans les vésicules synaptiques
est augmentée après une dépolarisation des synaptosomes de 20 minutes, suggérant que le
niveau d’activité des neurones aurait une influence sur l’activité des VGLUTs (Bole et Ueda,
2005).
Les travaux élégants du laboratoire de G. Ahnert-Hilger sur VMAT2, d’une part, et sur les
VGLUTs, d’autre part, suggèrent que le niveau de remplissage des vésicules synaptiques
pourrait être régulé par des protéines G hétérotrimériques présentes à la membrane des vésicules
(Ahnert-Hilger et coll., 2003). En effet, ils ont montré, par une étude de microscopie
électronique associée à une analyse statistique, que la sous-unité Gao était associée aux
vésicules synaptiques portant VGLUT1 et VGLUT2 (Pahner et coll., 2003). Une analyse
biochimique sur des vésicules synaptiques préparées à partir de cerveau de souris invalidées
pour les différentes sous-unités Gao, ou à l’aide d’anticorps spécifiquement dirigés contre Gao2,
a ensuite permis de démontrer que Gao2 régule négativement l’activité des transporteurs
vésiculaires du glutamate en modifiant leur sensibilité aux ions chlorure (Winter et coll., 2005).
Le « senseur » permettant de faire le lien entre le niveau de remplissage des vésicules et la
protéine G n’est pas encore connu, tout comme le mécanisme précis par lequel la protéine G
régule le transporteur. Si les deux transporteurs sont associés à la même sous-unité a, la
composition en sous-unités b et g semble différer et pourrait être le siège d’une régulation
différentielle entre VGLUT1 et VGLUT2 (Pahner et coll., 2003).
Plusieurs toxines métaboliques ou exogènes ayant un effet sur le transport vésiculaire de
glutamate ont été identifiées.
L’acide méthylmalonique, mais pas l’acide propionique, inhibe partiellement l’accumulation de
glutamate dans les vésicules synaptiques et augmente sa libération induite par le K+, provoquant
ainsi une augmentation du glutamate libre dans le fente synaptique (à vérifier par
microdialyse…) et une excitotoxicité du glutamate (Brusque et coll., 2001).
La leucinose (ou maladie du sirop d’érable) est une maladie génétique métabolique aboutissant
à l’accumulation d’a-céto-acides dans l’organisme et associée à une réduction de la
concentration cérébrale de glutamate. Reis et ses collaborateurs. ont montré que les a-cétoacides inhibent le transport de glutamate en perturbant la sensibilité au chlorure, sans modifier
le gradient électrochimique de protons (Reis et coll., 2000).
35
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
Porciuncula et coll. (Porciuncula et coll., 2003) proposent que le transport vésiculaire du
glutamate est la cible de la neurotoxicité du mercure. Cependant, l’effet du mercure sur
l’accumulation de glutamate est indirect, puisque, aux concentrations utilisées, le mercure abolit
également le gradient de pH et l’activité de la v-ATPase. Cette inhibition n’est pas observée si
les vésicules sont incubées au préalable avec du glutathion réduit et semble donc liée au
potentiel d’oxydo-réduction du milieu.
Enfin, une étude récente montre que VGLUT1 et le transporteur du zinc ZnT3 sont co-adressés
dans une sous-population de microvésicules semblables aux vésicules synaptiques dans des
cellules PC12 (Salazar et coll., 2005). Le mécanisme d’adressage est dépendant de l’adaptateur
AP3 et insensible à la bréfeldine A (qui bloque la biogenèse des vésicules issues des endosomes
sans affecter la voie qui passe par la membrane plasmique). Lorsque les deux transporteurs sont
présents sur les mêmes vésicules, l’activité de transport de glutamate et celle de zinc sont toutes
deux potentialisées.
La Figure n°8 reprend schématiquement les principales caractéristiques du transport vésiculaire
de glutamate et ses régulations. Voyons à présent quels sont les neurones capables d’accumuler
du glutamate au sein de vésicules synaptiques et quelles sont les principales voies qu’ils
décrivent.
II.4/ Anatomie des systèmes glutamatergiques
La démonstration que le glutamate joue bien un rôle de neuromédiateur a été tardive, par rapport
aux autres neuromédiateurs dits « classiques ». En 1959, Curtis et coll. ont montré que
l’application de glutamate par micro-iontophorèse provoque l’excitation des neurones de la
moelle épinière (Curtis et coll., 1959), mais pendant plusieurs décennies, certains chercheurs
pensaient que ceci était dû à un effet non spécifique du glutamate. Ce n’est qu’avec le
développement de nouveaux outils pharmacologiques et avec la mise au point de techniques de
microscopie électronique permettant d’observer l’enrichissement du glutamate dans certaines
terminaisons que la communauté scientifique a été convaincue du rôle majeur du glutamate
comme neuromédiateur excitateur. Il est désormais bien établi que le glutamate est le
neuromédiateur excitateur principal du cerveau des mammifères, utilisé par environ 30 à 40 %
des neurones.
Malgré le manque de marqueur moléculaire exclusif de ces neurones avant la découverte des
transporteurs vésiculaires du glutamate, de nombreuses études ont permis l’identification des
36
ADP + Pi
2H+
V-ATPase
++
+
+
+
ATP
H+
ADP
Glu-
3PGK
3-PG
+
+
+ Δψ
H+
T
?
glucose
+
Cl-
Figure
n°8
:
Biochimie
et
pharmacologie
du
transport
IPF
-
LU
Cl-
α-céto-acides
VG
H+
GAP
gly
co
lys
e
GAPDH
-
-
H+
Glu- Asp-
Bleu Evans
Bleu Trypan
Rose Bengale
DIDS
Méthyl malonate
3-nitro propionate
Quinolinate
vésiculaire
de
glutamate.
Le transport de glutamate dépend majoritairement du gradient électrique (Δψ). La présence d’ions chlorure (2-10mM)
dans le milieu réactionnel stimule le transport par un mécanisme encore inconnu. Malgré sa faible affinité pour le
glutamate, le transporteur est très sélectif si bien que l’aspartate n’est pas un substrat du VGLUT. Un certain nombre
d’inhibiteurs compétitifs et non compétitifs ont été identifiés, ainsi qu’un facteur protéique inhibiteur. Enfin, il semble
que l’ATP consommé pour générer le gradient de protons provient de la glycolyse par le biais d’enzymes associées à la
membrane vésiculaire. Abréviations : 3PGK: 3-Phospho-Glycerate-Kinase; 3PG: 3-Phospho-Glycerate; Asp: Aspartate;
DIDS: acide 4,4’-DIiso-thiocyano-2,2’-DiSulphonique; GAP: GlycerAldéhyde Phosphate: GAPDH: GlycerAldéhyde
Phosphate DésHydrogénase; Glu: Glutamate; IPF: Inhibitory Protein Factor.
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
principales voies glutamatergiques dès les années 1980. L’équipe dirigée par O.P. Ottersen a
développé une technique d’immunocytochimie utilisant des anticorps sélectifs contre le
glutamate (Storm-Mathisen et coll., 1983; Ottersen et Storm-Mathisen, 1984). Grâce à celle-ci,
ces chercheurs ont décrit avec une grande précision les terminaisons enrichies en glutamate.
D’autres études ont démontré une baisse de la recapture de glutamate tritié par les transporteurs
plasmiques après lésion de voies présumées glutamatergiques (Fonnum, 1984).
Aujourd’hui, l’existence des VGLUTs en tant que marqueurs moléculaires permet de préciser
ces voies. Je décrirai brièvement les principales voies glutamatergiques du cerveau chez les
rongeurs, telles qu’elles ont été décrites dans les travaux de Storm-Mathisen et coll., avant de
revenir sur la localisation des différents transporteurs vésiculaires du glutamate.
VGLUT1 et VGLUT2 sont exprimés dans la plupart des voies glutamatergiques
connues
Les voies glutamatergiques dans le cerveau des rongeurs peuvent être regroupées
schématiquement en cinq catégories (Storm-Mathisen, 1981; Ottersen et coll., 1995). (voir
Figure n°9) :
Les voies corticofuges :
Le néocortex envoie des projections glutamatergiques vers de nombreuses structures souscorticales et spinales . Ces projections corticofuges ont pour cibles principales le striatum
(Figure n°9A-1), l’amygdale (Figure n°9A-2) le thalamus, les noyaux pontins, la substance
noire (Figure n°9A-3), et la moelle épinière (Figure n°9A-4). Dans le cortex postérieur, le cortex
entorhinal innerve le noyau rouge (Figure n°9A-6) et les couches superficielles du collicule
supérieur (Figure n°9A-7).
Les voies cortico-corticales :
Il existe un grand nombre de connections réciproques au sein du néocortex (Figure n°9A-5). Il
peut s’agir de projections joignant des régions d’un même hémisphère (fibres associatives) ou
des deux hémisphères (fibres commissurales).
Les voies hippocampiques :
Au sein de la formation hipppocampique, il existe un système de projection unidirectionnel
utilisant le glutamate comme neuromédiateur. La voie perforante provenant du cortex entorhinal
constitue l’entrée majeure du cortex cérébral vers l’hippocampe. La voie perforante cible
38
A
B
Figure n°9: Les principales voies glutamatergiques connues.
A, Les voies corticofuges et cortico-corticales. Ces voies comprennent des neurones qui partent du cortex et projettent
sur des structures comme: le striatum (1), le noyau accumbens, les noyaux amygdaliens, les tubercules olfactifs (2), le
thalamus, la substance noire, les noyaux pontins (3), la moelle épinière (4), le cortex (5), les noyaux rouges (6), les
collicules supérieurs (7) et l’hippocampe (8). B, Les voies hippocampiques, sous-corticales et cérébelleuses. Ces voies
comprennent: les projections intrahippocampiques (1 à 4), les projections hippocampofuges (3 et 4), les projections
thalamofuges (5 à 7), les voies cérébelleuses (9, 11, 12 et 13), la voie innervant la substance noire et le globus pallidus à
partir du noyau sous-thalamique (8) et la voie partant du cortex piriforme et projetant dans les bulbes olfactifs (10).
Abréviations: AcbC: Core de l’Accumbens; AcbSh: Shell de l’Accumbens; Amy: Amygdale; CA1-3: champs 1 à 3 de la Corne
d’Ammon; cc: corps calleux; DG: Gyrus Dentelé; fi: fimbria de l’hippocampe; GP: Globus Pallidus; HDB: partie Horizontale de la
bande Diagonale de Broca; Hil: Hile du gyrus dentelé; H: Hypothalamus; OI: Olive Inférieure; Pir: cortex Piriforme; Pn: noyau
Pontin; R: noyau Rouge; S: Subiculum; SC: Collicule Supérieur; SNC: Substance Noire Compacte; SNR: Substance Noire
Réticulée; STh: noyau Sous-Thalamique; Tu: Tubercule olfactif.
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
majoritairement les dendrites des cellules granulaires du gyrus dentelé, mais aussi ceux des
cellules pyramidales de la corne d’Ammon (CA1-CA3) et le subiculum (Figure n°9A-8).
Les fibres moussues projettent des cellules granulaires du gyrus dentelé vers les cellules
pyramidales de la région CA3 de l’hippocampe (Figure n°9B-1) Il s’agit de fibres non
myélinisées portant de grosses varicosités (3 à 6 mm) qui parcourent la couche CA3
transversalement et innervent dans leur ensemble les strata lucidum et oriens de CA3. Les
collatérales de Schaffer sont des projections glutamatergiques projetant des cellules pyramidales
de CA3 vers les dendrites des cellules pyramidales de CA1 (Figure n°9B-2). Elles ont été très
étudiées dans le cadre de la potentialisation à long terme (voir plus loin). Les projections
extrinsèques des cellules de la couche CA1 forment la sortie majeure de l’hippocampe (Figure
n°9B-3) et ciblent des régions sous-corticales (septum latéral, bande diagonale de Broca, bulbe
olfactif, noyau accumbens, amygdale basale, hypothalamus antérieur et dorso-médian). La
projection intrinsèque de la couche CA1 vers le subiculum (Figure n°9B-3) est organisée
topographiquement et est suivie des projections du subiculum vers différentes régions corticales
(Figure n°9B-4).
Les voies sous-corticales :
Le striatum reçoit, en plus de la projection glutamatergique massive du néocortex, une
importante innervation provenant du thalamus (Figure n°9B-5). Le thalamus innerve également
l’amygdale (Figure n°9B-6) et le néocortex (Figure n°9B-7). Une autre voie glutamatergique
très importante est la projection du noyau sous-thalamique vers la substance noire, le globus
pallidus et le noyau entopédonculaire (Figure n°9B-8), qui fait partie du circuit des ganglions de
la base. Les neurones glutamatergiques des noyaux profonds du cervelet projettent vers le
thalamus (Figure n°9B-9). Différents relais des systèmes sensoriels (visuel, auditif et olfactif) et
des systèmes de régulation autonome sont aussi probablement glutamatergiques. Enfin, les
connections réciproques entre le bulbe olfactif et le cortex piriforme ont été bien décrites
(Figure n°9B-10).
Les voies cérébelleuses :
Les principales voies afférentes au cortex cérébelleux sont glutamatergiques. Les fibres
moussues provenant de différents noyaux du tronc cérébral (noyau vestibulaire médian, noyau
réticulaire latéral) projettent sur la couche granulaire du cervelet (Figure n°9B-11) et forment de
nombreux contacts simultanés avec les dendrites des cellules granulaires, mais aussi les cellules
de Golgi GABAergiques. Le système de fibres intrinsèques au cortex cérébelleux utilise
également le glutamate comme messager. Les cellules granulaires envoient des fibres parallèles
au contact des dendrites des cellules de Purkinje, au niveau de la couche moléculaire (Figure
40
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
n°9B-12). Les fibres grimpantes issues des neurones glutamatergiques de l’olive inférieure
entourent l’axone et l’arborisation dendritique des cellules de Purkinje GABAergiques (Figure
n°9B-13). Enfin, il faut noter que la seule voie de sortie du cortex cérébelleux est inhibitrice et
utilise le GABA. En effet, les seules projections sortantes proviennent des cellules de Purkinje.
Le clonage des transporteurs vésiculaires du glutamate VGLUT1 et VGLUT2 a permis de
confirmer et de préciser les voies glutamatergiques dans le système nerveux central, grâce à
l’obtention de sondes nucléiques (permettant de localiser les ARN messagers par hybridation in
situ) et d’anticorps spécifiques (servant aux études d’immunocytochimie qui localisent les
protéines dans les tissus). Un grand nombre d’études ont été publiées sur la répartition
anatomique de VGLUT1 et VGLUT2 (pour revue voir Hisano, 2003; Fremeau et coll., 2004b et
Tableau n°5). Je ne donnerai ici qu’un résumé des principales données, la répartition des
VGLUTs dans le cerveau de rat faisant l’objet des parties I et II des résultats de ma thèse.
VGLUT1 est exprimé fortement dans des neurones du cortex cérébral, de l’hippocampe, du
cortex cérébelleux (Ni et coll., 1994; Ni et coll., 1996; Hisano et coll., 2000; Fremeau et coll.,
2001; Herzog et coll., 2001). L’ARN messager de VGLUT2 est quant à lui abondant dans un
continuum sous-cortical, comprenant le thalamus, le tronc cérébral et les noyaux profonds du
cervelet (Hisano et coll., 2000; Fremeau et coll., 2001; Herzog et coll., 2001).
Au niveau protéique, les deux sous-types sont présents dans la totalité du cerveau, mais avec des
profils différents. Ainsi, l’immunoréactivité VGLUT1 est très forte dans les régions
télencéphaliques : cortex, hippocampe, noyau caudé-putamen, noyau accumbens, cortex
piriforme, septum et tubercule olfactif (Bellocchio et coll., 1998; Fremeau et coll., 2001;
Fujiyama et coll., 2001; Sakata-Haga et coll., 2001; Kaneko et coll., 2002). VGLUT1 est aussi
présent au niveau de terminaisons nerveuses dans le thalamus (Sakata-Haga et coll., 2001) et
dans certains noyaux hypothalamiques. Dans le cervelet, certaines fibres moussues de la couche
granulaire contiennent VGLUT1, ainsi que les abondantes fibres parallèles de la couche
moléculaire. La protéine VGLUT2 présente un profil d’expression plus laminaire. Dans le
cortex cérébral par exemple, les couches IV et VI sont les plus fortement marquées. Dans le
diencéphale, l’immunoréactivité VGLUT2 est abondante dans le thalamus, l’habénula et
l’hypothalamus. Dans le cervelet, VGLUT2 est présent dans certaines fibres moussues de la
couche granulaire ainsi que dans les fibres grimpantes de la couche moléculaire.
Ainsi, la découverte de VGLUT1 et VGLUT2 a permis de diviser les neurones
glutamatergiques en deux systèmes : l’un majoritairement cortical et utilisant VGLUT1, et
l’autre plutôt sous-cortical et exprimant VGLUT2. VGLUT1 et VGLUT2 ont ainsi une
répartition complémentaire et, à eux deux, couvrent l’ensemble des neurones glutamatergiques
41
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
(voir Figure n°10). Pourtant, en 2002-2003, plusieurs équipes, dont l’équipe de S. El Mestikawy
dans notre laboratoire, ont rapporté l’identification d’un troisième sous-type, VGLUT3.
VGLUT3 est un sous-type inattendu
La localisation du troisième sous-type, VGLUT3, est plus inattendue. En effet, l’ARN messager
codant VGLUT3 a été décrit non seulement dans le cerveau mais également dans le foie et le
rein (Fremeau et coll., 2002; Gras et coll., 2002).
De plus, ce sous-type est fréquemment co-exprimé avec des marqueurs d’autres
neuromédiateurs, suggérant que certains neurones puissent avoir un double phénotype
chimique. VGLUT3 a en effet été détecté dans :
- les neurones sérotoninergiques du raphé (Gras et coll., 2002) ;
- les neurones cholinergiques du noyau caudé-putamen (Gras et coll., 2002) ;
- des interneurones GABAergiques de l’hippocampe (Fremeau et coll., 2002).
Un autre fait notable est que, contrairement à VGLUT1 et VGLUT2 qui sont majoritairement
présents dans les terminaisons nerveuses, VGLUT3 a aussi été détecté dans certains corps
cellulaires et dendrites.
La répartition anatomique détaillée de VGLUT3, par rapport aux deux autres sous-types, a fait
l’objet d’une partie de mon travail de thèse et sera présentée dans la partie I des Résultats.
Tableau n°5 :
Distribution régionale des transporteurs vésiculaires du glutamate dans le cerveau de rat
adulte
Région
Rétine
Bulbe olfactif
Néocortex
Striatum
Noyau accumbens
Septum
Cortex piriforme
Amygdale
Hippocampe
Habénula
Noyaux dorsaux thalamiques
Noyau sous-thalamique
Hypothalamus
Mésencéphale
Cortex cérébelleux
VGLUT1
ARN protéine
++
+
++
+++
+++
+++
+++
+++
++
+
+++
++
+
+++
+++
+
+
+++
+
+ à ++
+ à ++
++
+++
VGLUT2
ARN protéine
+
+
+
++
+
++
++
+++
+
++
+
+
++
+
+
+
++
++
+++
++
+++
+
++
++
+++
++
+
VGLUT3
ARN Protéine
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+++
+
+
Tableau tiré de la revue de Hisano (2003)
+ : peu abondant, ++ : intermédiaire, +++ : très abondant.
42
Système 1 ( VGLUT1)
Système 2 (VGLUT2)
Système 3 (VGLUT3)
Figure n°10: Représentation schématique des trois grands systèmes glutamatergiques.
VGLUT1 et VGLUT2 sont les sous-types majoritaires du cerveau. VGLUT1 (en bleu) est exprimé principalement dans
le cortex cérébral, l’hippocampe, le cortex cérébelleux et le thalamus. VGLUT2 (en rouge) est présent dans les neurones
sous-corticaux du diencéphale, du tronc cérébral et des noyaux profonds du cervelet. VGLUT3 (en jaune) a une
expression plus restreinte dans certaines neurones du striatum, des noyaux du raphé, du cortex cérébral et de
l’hippocampe.
INTRODUCTION- II/ La transmission glutamatergique
Libération non-conventionelle de glutamate
Hormis le rôle bien connu et bien caractérisé des VGLUTs dans la libération de glutamate par
les terminaisons glutamatergiques, le clonage de ces transporteurs a permis de mettre en
évidence deux types de libération non-conventionelle de glutamate.
Il est bien établi que les astrocytes sont capables de libérer du glutamate (Araque et coll., 1999),
mais le mode de libération n’était pas clairement identifié jusqu’au clonage des VGLUTs :
renversement du fonctionnement des transporteurs plasmiques, libération par un canal anionique
non déterminé et une libération vésiculaire étaient trois mécanismes possibles pour expliquer
cette libération. En 2004, quatre équipes ont publié indépendamment que les astrocytes, aussi
bien in situ qu’en culture, peuvent exprimer un ou plusieurs sous-types de transporteur
vésiculaire de glutamate (Bezzi et coll., 2004; Montana et coll., 2004; Zhang et coll., 2004;
Anlauf et Derouiche, 2005) et que cette expression est responsable de l’exocytose régulée par le
calcium de vésicules contenant du glutamate. Ces travaux soulignent le rôle majeur des
astrocytes dans la transmission nerveuse en leur attribuant un rôle non seulement dans la
recapture du glutamate et le cycle glutamate-glutamine, mais également en tant qu’acteurs à part
entière dans la modulation de la transmission nerveuse. Cependant, la nature des vésicules
responsables de cette libération astrocytaire reste controversée. Selon une étude très récente
(Chen et coll., 2005), il s’agirait de vésicules de 310 nm de diamètre, alors que Bezzi et coll. ont
détecté VGLUT1 et VGLUT2 sur une population de vésicules de 30 nm de diamètre (Bezzi et
coll., 2004).
Un autre mode de libération non conventionnelle de glutamate qui a été étudié grâce au clonage
des VGLUTs est la libération rétrograde de glutamate au niveau des dendrites. Harkany et coll.
proposent que les VGLUTs seraient impliqués dans la libération dendritique de glutamate et la
signalisation rétrograde. En effet, VGLUT3 serait présent dans les dendrites de certains
neurones striataux (Fremeau et coll., 2002; Harkany et coll., 2003) et corticaux (Harkany et
coll., 2004). Cependant, ces observations n’ont pas été répliquées par d’autres équipes et la
spécificité du marquage immunocytochimique observé a été remise en cause (voir Discussion
Générale).
44
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
III/ LES MODULATIONS DE LA TRANSMISSION NERVEUSE : LA
PLASTICITE SYNAPTIQUE A L'ECHELLE D'UNE SYNAPSE
III.1/ Plasticité présynaptique et plasticité postsynaptique
La plasticité synaptique correspond à la modulation de l’intensité ou de l’efficacité d’une
synapse en fonction de son histoire. D’un point de vue théorique, chacune des étapes décrites
dans la Figure n°2 est susceptible d’être modifiée et ainsi d’être la source d’une modification de
l’efficacité d’une synapse. Ainsi, on pourra envisager des modifications (physiologiques ou
non) de différents paramètres : concentration cytoplasmique de neuromédiateur, nombre de
transporteurs vésiculaires et leur activité, taille des vésicules synaptiques, probabilité de
libération d’une vésicule en réponse à l’arrivée d’un potentiel d’action, vitesse et durée de
relargage du neuromédiateur dans la fente synaptique, diffusion du neuromédiateur dans la
fente, nombre de récepteurs post-synaptiques ou propriétés fonctionnelles des récepteurs.
La forme de plasticité synaptique la plus étudiée dans le cerveau des mammifères est la
potentialisation à long terme (ou LTP pour Long Term Potentiation), initialement décrite sur des
tranches d’hippocampe au niveau de la voie perforante (Bliss et Lomo, 1973). Ce phénomène a
par la suite été étudié le plus souvent au niveau des synapses entre les collatérales de Schaffer
(issues des neurones pyramidaux de CA3) et les dendrites des cellules pyramidales de CA1. Il
s’agit de l’augmentation de force d’une synapse en réponse à une stimulation répétée à
fréquence élevée (stimulation tétanique). Si l’induction de la LTP implique forcément des
phénomènes postsynaptiques (entrée d’ions Ca2+ par des récepteurs NMDA qui entraîne
l’activation de la CaMKII), les mécanismes de son expression peuvent être pré- ou postsynaptiques. Au niveau postsynaptique, le phénomène le plus étudié concerne des modulations
de l’excitabilité de la cellule cible avec modification post-traductionnelle des récepteurs AMPA
(phosphorylation de la sous-unité GluR1) et régulation du trafic de ces récepteurs
(internalisation par endocytose, puis recyclage vers la membrane ou dégradation) (Sheng et
Kim, 2002). Au niveau présynaptique, les mécanisme moléculaires sont moins bien caractérisés
(Choi et coll., 2003; Malenka et Bear, 2004).
Une régulation présynaptique de l’efficacité d’une synapse résulte en une modification de la
quantité de neuromédiateur libéré pour une stimulation donnée. Pour que cette modification se
traduise par une activation différente des récepteurs post-synaptiques, il faut que ceux-ci ne
soient pas saturés dans des conditions normales de stimulation (Liu, 2003). Le grand nombre de
molécules de glutamate libéré par chaque vésicule synaptique, la taille réduite de la fente
45
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
synaptique et la très forte affinité des récepteurs ionotropiques pour leur ligand ont laissé
supposer que les récepteurs post-synaptiques étaient saturés dans des conditions normales de
stimulation et que, par conséquent, d’éventuelles variations de la quantité de glutamate libéré
seraient sans conséquence sur la réponse post-synaptique (Frerking et Wilson, 1996).
Cependant, des études électrophysiologiques récentes suggèrent le contraire. McAllister et
Stevens ont analysé la variabilité des composantes AMPA et NMDA de courants postsynaptiques excitateurs miniatures (mEPSC) au niveau de synapses individuelles de neurones
hippocampiques en culture. Ils ont montré que celle-ci était attribuable à des modifications dans
la concentration de glutamate présent dans l’espace synaptique plutôt qu’à des modifications
dans les propriétés de récepteurs puisque les variations mesurées sont fortement corrélées entre
composantes AMPA et NMDA et qu’elles ne sont pas reproduites lors de l’application locale de
glutamate par iontophorèse (McAllister et Stevens, 2000).
D’un point de vue théorique, il y a plusieurs moyens d’altérer la transmission nerveuse du côté
présynaptique, en modifiant la probabilité de libération, la taille du quantum, le mode de
libération (durée d'ouverture et conductivité du pore de fusion) et le type de recyclage des
vésicules synaptiques (Krupa et Liu, 2004). Nous allons examiner successivement des exemples
de la littérature de modifications de la taille du quantum et de modifications du recyclage des
vésicules.
III.2/ Régulation de la quantité de neuromédiateur dans les vésicules
synaptiques
L’accumulation de neuromédiateur au sein des vésicules synaptiques est liée à la présence, sur
la membrane des vésicules, de deux protéines : la v-ATPase, pompe à protons qui permet
d’établir un gradient de protons entre l’intérieur de la vésicule et le cytoplasme et le transporteur
vésiculaire de neuromédiateur, qui utilise l’énergie du gradient de protons pour transporter le
neuromédiateur dans les vésicules. Des modifications du nombre et du fonctionnement de ces
deux protéines vésiculaires sont donc susceptibles de modifier la quantité de neuromédiateur
présent dans chaque vésicule.
Song et coll. ont surexprimé le transporteur vésiculaire de l’acétylcholine VAChT dans des
embryons de xénope et montré que la taille des quantums libérés à la jonction neuromusculaire
était augmentée de manière significative (Song et coll., 1997).
46
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
Plusieurs études sur la jonction neuromusculaire de grenouille utilisant des traitements
pharmacologiques qui diminuent la taille du quantum libéré (Van der Kloot et coll., 2000; Van
der Kloot et coll., 2002) montrent qu’une stimulation en présence d’hémicholinium (inhibiteur
de la recapture de choline à la membrane plasmique), de (-)-vésamicol (inhibiteur du transport
vésiculaire d’acétylcholine) ou de NH4+ (qui diminue le gradient de protons nécessaire au
transport vésiculaire) diminuent significativement la quantité d’acétylcholine libérée par la
suite, lors d’événements spontanés. De manière surprenante, le vésamicol, mais pas
l’hémicholinium ou le NH4+, entraîne une diminution de la taille des vésicules.
Colliver et coll. montrent que la L-DOPA, précurseur de la dopamine, et la réserpine, inhibiteur
compétitif de VMAT2, augmentent et diminuent respectivement la taille du quantum (Colliver
et coll., 2000). Les variations du quantum sont accompagnées de variations dans la taille de
vésicules à cœur dense, suggérant que la concentration vésiculaire en dopamine reste constante.
D’après l’étude de Pothos et coll. l’expression de VMAT2 dans des cellules PC12 ou sa
surexpression dans des neurones de l’aire tegmentale ventrale en culture augmente la taille du
quantum libéré et la fréquence des événements (Pothos et coll., 2000).
A l’inverse, l’invalidation de VMAT2 chez la souris résulte en l’incapacité des neurones à
libérer des monoamines, ce qui est létal pour l’animal puisque les souris knock-out meurent
dans les jours qui suivent la naissance (Fon et coll., 1997; Wang et coll., 1997). Chez les souris
hétérozygotes, il y a deux fois moins de protéine VMAT2 que chez les souris sauvages, et la
quantité de dopamine libérée par des neurones mésencéphaliques en culture est réduite de
moitié (Fon et coll., 1997), ce qui suggère que la taille du quantum est directement corrélée à la
quantité de transporteur vésiculaire (voir Discussion).
De même, les souris knock-out pour VGLUT1 ont un niveau très réduit de transmission
glutamatergique (Fremeau et coll. ont observé une diminution de 80%) et ont une mortalité
importante vers 21 jours (Fremeau et coll., 2004a; Wojcik et coll., 2004). La surexpression de
VGLUT1 dans des cultures de neurones permet de rétablir la transmission glutamatergique, à
des niveaux supérieurs à ceux des neurones sauvages témoins, prouvant ainsi que les récepteurs
post-synaptiques ne sont pas saturés (Wojcik et coll., 2004). Une donnée qui reste inexpliquée
est que les souris VGLUT1 +/- ont un phénotype identique aux souris sauvages dans tous les
tests réalisés jusqu’à présent, alors que les vésicules portant VGLUT1 devraient contenir deux
fois moins de glutamate (Fremeau et coll., 2004a; Wojcik et coll., 2004).
Il existe un homologue des VGLUTs chez la drosophile, DVGLUT, qui possède 41% d’identité
avec la protéine VGLUT1 humaine (Daniels et coll., 2004). La surexpression de DVGLUT dans
les neurones de drosophile conduit à une augmentation de l’amplitude des potentiels excitateurs
47
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
spontanés à la jonction neuromusculaire, indiquant une augmentation de la quantité de
glutamate accumulé dans les vésicules. Cette augmentation est associée à une augmentation de
la taille des vésicules synaptiques, plutôt qu’à une concentration accrue. De manière
surprenante, les potentiels évoqués ne sont pas modifiés de manière significative, en raison
d’une modification compensatoire du taux d’échec de libération d’une vésicule. Ainsi, il existe
des mécanismes assurant une certaine homéostasie de la transmission glutamatergique.
Les travaux de Wilson et coll. montrent que l’augmentation de la quantité de glutamate
extravésiculaire, comme l’augmentation du nombre de transporteurs fonctionnels, permet
d’augmenter la quantité de glutamate capturé par des vésicules synaptiques purifiées (Wilson et
coll., 2005). Ils montrent également que la surexpression de VGLUT1 dans des neurones en
culture augmente la taille du quantum.
Les travaux cités précédemment montrent que, lorsque la concentration en neuromédiateur, la
quantité de transporteur, ou la fonction du transporteur sont altérés, la taille du quantum est
altérée. Cependant, il ne s’agit pas de modifications physiologiques.
Plusieurs études ont montré que les niveaux d’expression des transporteurs vésiculaires du
glutamate pouvaient être modifiés in vivo ou in vitro en réponse à des traitements
pharmacologiques. BNPI/VGLUT1 est surexprimé dans les cellules granulaires du cervelet lors
d’exposition à des concentrations sub-toxiques de NMDA (Ni et coll., 1994), et DNPI/VGLUT2
est surexprimé lors de la différenciation neurale d’une lignée pancréatique (Aihara et coll.,
2000). Une augmentation de l’ARNm codant VGLUT1 et de la protéine VGLUT1 a été observé
suite à des traitements chroniques par des antidépresseurs de différentes classes et suite à des
chocs électroconvulsifs, mais pas lors de traitements par des neuroleptiques (Moutsimilli et
coll., 2005; Tordera et coll., 2005).
Le niveau d’expression de VGLUT1 est soumis à une régulation bidirectionnelle liée à l’activité
des réseaux neuronaux, puisqu’il peut être augmenté par un traitement à la bicuculline
(inhibiteur GABA qui provoque une hyperexcitation des réseaux) et diminué par un traitement
par l’agoniste glutamatergique AP-5 (Wilson et coll., 2005). VGLUT1 d’une part, et VIAAT et
VGLUT2 d’autre part subissent des régulations opposées en réponse à des changements
d’activité des réseaux neuronaux lors de la maturation. En effet, De Gois et coll. ont montré
que, lorsque des cultures de neurones néocorticaux sont soumis à un traitement par la
bicuculline, l’ARN et la protéine VGLUT1 sont réduits, alors que l’ARN et la protéine VIAAT
sont augmentés. L’effet inverse est observé lorsque l’activité des neurones est bloquée pendant
un traitement à la tétrodotoxine (qui bloque les canaux Na+ nécessaires à la dépolarisation) (De
Gois et coll., 2005). Ces régulations couplées permettent de conserver un ration
excitation/inhibition stable durant le développement des synapses et constitue donc un exemple
48
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
de régulation physiologique du niveau d’expression de transporteurs vésiculaires ayant un rôle
crucial dans l’homéostasie des systèmes.
L’immunoréactivité VGLUT1 est réduite dans le cortex péritumoral de patients épileptiques
(Alonso-Nanclares et De Felipe, 2005). Il faut noter cependant que la spécificité de cette
altération n’est pas démontrée, puisqu’elle est associée à une diminution du marqueur neuronal
NeuN, ainsi qu’une diminution du nombre de corps cellulaires marqués par la coloration de
Nissl. La perte de VGLUT1 est vraisemblablement secondaire à la maladie plutôt que causale.
Dans un modèle d’épilepsie hypoxique unilatérale, l’immunoréactivité VGLUT1 est augmentée
dans l’hippocampe, sans altération ni de VGLUT2, ni du marqueur vésiculaire SV2 (Kim et
coll., 2005). L’expression de VGLUT2 est augmentée dans le système hypothalamoneurohypophysaire par des traitements hyperosmotiques (Kawasaki et coll., 2005). Il reste à
examiner si ces modifications se traduisent par des altérations du quantum du glutamate.
III.3/ Régulation du type de neuromédiateur : co-transmission
Le phénotype chimique d’un neurone, c’est-à-dire le type de neuromédiateur qu’il est capable
de libérer, est déterminé notamment par le type de transporteur vésiculaire exprimé. Les
VGLUTs représentent à ce titre un marqueur moléculaire spécifique des terminaisons
glutamatergiques. Cependant, des travaux récents suggèrent que le dogme « un neurone – un
neuromédiateur » ne reflète pas la réalité de la transmission glutamatergique. De nombreux cas
de co-transmission par plusieurs neuromédiateurs ont été rapportés. Si l’existence de cette cotransmission est connue depuis longtemps dans le cas d’un messager classique associé à un
neuropeptide (Hokfelt, 1991), des études récentes suggèrent que certains neurones ont la
possibilité de co-libérer deux neuromédiateurs classiques (pour revue, voir Trudeau, 2004).
Citons pour le glutamate quelques exemples
- les fibres moussues de la couche stratum lucidum de l’hippocampe (qui font des contacts sur
les neurones pyramidaux de CA3) seraient immunoréactives à la fois pour le GABA et le
glutamate (Sandler et Smith, 1991). Cette co-expression semble être soumise à des régulations,
comme par exemple, après un protocole d’induction de crises d’épilepsie (Gutierrez, 2002).
- l’expression de la glutaminase activée par le phosphate inorganique (PAG) par des neurones
cholinergiques du cerveau antérieur basal qui projettent vers le cortex entorhinal suggère que
ceux-ci pourraient également libérer du glutamate (Manns et coll., 2001).
- certains neurones monoaminergiques ont la possibilité de co-libérer du glutamate in vitro. En
effet, dans des cultures autaptiques de neurones de raphé, 60% des cellules produisent des
réponses excitatrices sensibles au CNQX, un antagoniste glutamatergique (Johnson, 1994). De
49
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
même, Sulzer et coll. ont observé une réponse électrophysiologique de type glutamatergique
dans des cultures de neurones dopaminergiques (Sulzer et coll., 1998). La question se pose de
savoir si cette co-transmission est également possible in vivo ou s’il s’agit seulement d’une dédifférenciation des cellules en culture.
III.4/ Régulation du recyclage des vésicules synaptiques
Régulations de l’endocytose par la voie de la clathrine
Pour assurer un maintien de la libération de neuromédiateur lors de stimulations répétées, il faut
que la terminaison nerveuse effectue de manière efficace l’internalisation des différents
constituants (lipides et protéines) de la membrane vésiculaire afin de régénérer le stock de
vésicules libérables. Comme nous l’avons déjà vu, ce recyclage est réalisé principalement par
endocytose par la voie de la clathrine. Or cette endocytose est sujette à différentes régulations.
Plusieurs protéines impliquées dans l’endocytose par la voie de la clathrine sont régulées par
phosphorylation. Ces protéines ont été regroupées sous le terme de déphosphines, car elles
doivent être déphosphorylées par la calcineurine pour être actives (Cousin et Robinson, 2001;
Cousin et coll., 2001). Il s’agit de la dynamine, les amphiphysines 1 et 2, la synaptojanine,
l’epsine, et des protéines eps15 et AP180. La calcineurine est activée par le calcium et
déphosphoryle ces protéines, stimulant ainsi l’endocytose. Un inhibiteur de la calcineurine,
appelé Cain, régule négativement l’endocytose (Lai et coll., 1998; Lai et coll., 2000). La kinase
Cdk5 (Cycle-Dependant Kinase 5) est responsable de la phosphorylation de la dynamine entre
deux cycles d’endocytose. Son inhibition a un effet stimulateur de l’endocytose lors du premier
cycle des vésicules (Tomizawa et coll., 2003), mais inhibiteur lors des cycles suivants (Tan et
coll., 2003) car il faut que les déphosphines soient phosphorylées à nouveau pour mettre fin à
l’endocytose et revenir au point de départ. La Cdk5 phosphoryle également la synaptojanine sur
un résidu sérine du motif riche en prolines et régule négativement son interaction avec
l’endophiline (Lee et coll., 2004). Une autre équipe rapporte que le récepteur à l’éphrine B
phosphoryle la synaptojanine sur trois résidus tyrosine du domaine riche en prolines, ce qui
diminue l’interaction avec l’endophiline et réduit l’activité 5’-phosphatase de la synaptojanine.
(Irie et coll., 2005). Le rôle des équilibres de phosphorylation/déphosphorylation pendant
l’endocytose médiée par la clathrine est récapitulé dans la Figure n°11.
Les phosphoinositides, et plus particulièrement le PIP2, sont régulés au cours du cycle
endocytique (De Camilli et coll., 1996). Des altérations dans des enzymes modifiant les
phospholipides sont donc susceptibles d’influer significativement sur l’efficacité de
l’endocytose (Cremona et De Camilli, 2001; Osborne et coll., 2001)
50
(Cdk5, EphB)
Figure n°11: Régulations des protéines impliquées dans l’endocytose par la voie de la clathrine.
L’ensemble des protéines endocytotiques régulées par phosphorylation, appelées «! déphosphines! », doit être
déphosphorylé par la calcineurine pour permettre leur assemblage et ainsi promouvoir l’endocytose.
Abréviations: adp: protéines adaptatrices; amph: amphiphysine; cain: inhibiteur de la calcineurine; cla: clathrine;
Cdk5: cell cycle-dependant kinase;
synaptojanine; -P: forme phosphorylée.
Source: Lai et coll., 2000.
Cn: calcineurine; dyn: dynamine; EphB: Ephrin B receptor;
syj:
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
Autres voies d’endocytose
Dans le système nerveux central, la petite taille des synapses et la fréquence de décharge impose
des contraintes d’efficacité sur le recyclage des vésicules synaptiques. En effet, le volume d’une
terminaison nerveuse centrale est d’environ 1mm3 et le nombre de vésicules est limité à quelques
dizaines ou une centaine seulement (pour revue voir Harata et coll., 2001). Les études portant
sur ce type de synapse (à partir de cultures de neurones d’hippocampe de rat par exemple) ont
fait émerger l’idée qu’il existe différents pools de vésicules synaptiques et différentes voies de
recyclage de ces vésicules, qui diffèrent par leur vitesse, par les mécanismes moléculaires mis
en jeu et par le type de stimulation nécessaire pour les mettre en œuvre.
L’existence possible de plusieurs voies de recyclage des vésicules synaptiques fait l’objet de
nombreux débats depuis les toutes premières études de microscopie électronique, au début des
années 1970. Sur un même type de préparation (la jonction neuromusculaire de grenouille),
deux équipes ont réalisé des expériences ayant abouti à des conclusions radicalement opposées.
En effet, Heuser et Reese ont proposé que la membrane des vésicules fusionne totalement avec
la membrane plasmique et est internalisée dans un deuxième temps par une endocytose médiée
par la clathrine (Heuser et Reese, 1973). Les vésicules d’endocytose fusionnent ensuite avec les
endosomes et de nouvelles vésicules synaptiques se forment à partir de l’endosome. Ceccarelli
et Fesce ont proposé qu’au contraire, la fusion avec la membrane plasmique n’est que transitoire
et que les vésicules se reforment directement à la membrane plasmique par des phénomènes
inverses à l’exocytose (kiss-and-run) (Ceccarelli et coll., 1973). D’autres voies sont aujourd’hui
également proposées : un mécanisme classique impliquant la clathrine mais sans étape dans les
endosomes, ou l’internalisation en masse de grosses parties de membranes pour former des
citernes à partir desquelles les vésicules bourgeonnent après formation d’un manteau de
clathrine (Royle et Lagnado, 2003) (voir Figure n°12).
Il semblerait que toutes ces voies puissent exister à un moment ou à un autre et que les
discordes entre les différentes expériences viennent du type de préparation utilisé, du protocole
de stimulation ou de la technique de mesure. En effet, d’importants progrès techniques ont
permis aujourd’hui de relancer l’hypothèse du kiss-and-run, qui était tombée en défaveur
pendant les années 1980 et 1990.
De nouveaux outils, développés depuis la fin des années 1980, permettent d’étudier à nouveau
la question de mode de recyclage des vésicules synaptiques, avec des résolutions spatiales et
temporelles améliorées. Citons, parmi ceux-ci :
- le clonage de protéines synaptiques et la génération d’anticorps fluorescents qui sont
internalisés après passage des antigènes à la membrane (Valtorta et coll., 1988; Matteoli et coll.,
1992) ;
52
(2b)
(2a)
(1)
Figure n°12: Représentation schématique des différentes voies de recyclage des vésicules synaptiques.
Après exocytose du contenu des vésicules synaptiques, celles-ci peuvent se reformer directement par la fermeture
du pore de fusion par un mécanisme appelé «! kiss-and-run! » (1). Alternativement, la membrane vésiculaire peut
fusionner totalement avec la membrane plasmique. La vésicule est alors reformée par endocytose médiée par la
clathrine, soit directement (2a), soit après un passage par les endosomes précoces (2b). Une troisième voie, qui ne
figure pas sur ce schéma, est la formation, directement à partir de la membrane plasmique, de grosses citernes à
partir desquelles peuvent bourgeonner des vésicules.
Source: Fernandez-Chacon et Südhof, 1999.
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
- l’utilisation de colorants amphipatiques (FM1-43 et dérivés) qui s’incorporent dans les
bicouches lipidiques et ont différents coefficients de répartition, donc différentes cinétiques
d’association / dissociation (Ryan, 2001). Ces molécules ont la propriété de fluorescer beaucoup
plus fortement lorsqu’elles sont incorporées dans une membrane que lorsqu’elles sont libres et
permettent ainsi de suivre le devenir de bicouches lipidiques marquées.
- la photoconversion de FM1-43 rend les compartiments ayant internalisé le marqueur denses
aux électrons (voir Harata et coll., 2001 pour revue).
- l’utilisation de la synaptopHluorine, un variant de la GFP sensible au pH, en fusion avec la
partie luminale de protéines synaptiques, telles que la synaptobrévine (VAMP), permet de
suivre, avec une bonne résolution temporelle et spatiale, le devenir de protéines vésiculaires. En
effet, lorsque la synaptopHluorine est à pH acide (à l’intérieur de la vésicule) elle ne fluoresce
pas, mais lorsqu’elle est exposée à la membrane plasmique, elle émet un signal intense. Les
travaux de Sankaranarayanan et Ryan ont permis d’établir que l’étape de ré-acidification des
vésicules après internalisation était bien plus rapide que l’internalisation elle-même et donc
négligeable (Sankaranarayanan et Ryan, 2000).
- l’utilisation de FM1-43 associée à la technique de microscopie à onde évanescente (TIRF)
pour les cellules sécrétrices ou les synapses géantes (Zenisek et coll., 2000) permet de suivre
uniquement les événements proches de la membranes (< 100nm). Jusqu’à présent cette
technique est impossible à mettre en œuvre sur les neurones, car cela nécessite de cultiver les
cellules directement sur les lamelles de verre et d’avoir une synapse au niveau de la lamelle.
- les mesures de capacitance (dans les terminaisons d’une certaine taille). En effet, la
capacitance d’une membrane est proportionnelle à sa surface. On peut ainsi suivre les variations
de la surface membranaire et démontrer que l’incorporation et la disparition de surface
membranaire se fait suivant des multiples discrets d’une certaine valeur qui doit correspondre à
la surface membranaire d’une vésicule. Le changement de capacitance associé à l’addition
d’une vésicule synaptique (environ 30 à 70 aF) est en-dessous du seuil de détection actuel et
cette technique n’est donc utilisée que pour étudier l’exocytose et l’endocytose de vésicules
multiples (synapses en ruban des terminaisons géantes telles que les cellules bipolaires).
- les mesures ampérométriques permettent de suivre directement la libération de catécholamines
(cellules sécrétrices et granules à cœur dense).
L’ensemble de ces techniques, appliquées à différents types de préparation, a permis de
démontrer l’existence de plusieurs modes de recyclage des vésicules synaptiques et des granules
à cœur dense. Cependant, il est très difficile de dégager une vision unique de la transmission
synaptique à partir de ces différentes études, car le type de modèle cellulaire utilisé, tout comme
le protocole de stimulation, ou encore la technique d’observation, sont très variés et empêchent
54
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
une comparaison directe. Je me suis concentrée dans ce qui suit sur les études démontrant
l’existence d’un mécanisme d’endocytose rapide à partir de neurones hippocampiques en
culture. Il faut noter que le manque de définitions claires et consensuelles des voies de recyclage
et des pools de vésicules entre les différents chercheurs entraîne un risque de confusion (Rizzoli
et Betz, 2005).
En utilisant le FM1-43 et en quantifiant les variations de fluorescence au cours d’une
stimulation prolongée, Murthy et coll ont montré qu’il n’y avait pas forcément d’étape de fusion
avec les endosomes après internalisation de la membrane. En effet, le FM1-43 internalisé était
de nouveau présenté à la membrane, sans que le colorant n’ait été dilué par une étape de tri dans
les endosomes (Murthy et Stevens, 1998).
La même année, Klingauf et coll. ont analysé la cinétique de décoloration de plusieurs colorants
à chaîne aliphatique de longueurs différentes et ont démontré qu’il existe une composante rapide
de l’endocytose (moins de 2 secondes) (Klingauf et coll., 1998). Cette composante rapide n’est
cependant pas du kiss-and-run (qui serait trop rapide pour être détecté par cette technique) mais
une forme accélérée de l’endocytose classique médiée par la clathrine.
Pyle et coll. ont marqué des synapses en présence de FM1-43 pendant différentes durées de
stimulation à 20 Hz et ont comparé la fluorescence lorsque le colorant était laissé uniquement
pendant le temps de stimulation ou également pendant les 30 secondes suivant la stimulation. Ils
ont ainsi montré que la vitesse et la durée de l’endocytose étaient différentes en fonction de la
durée de stimulation. En cas de stimulation intense, une endocytose rapide et une endocytose
plus longue peuvent être observées. Lors d’une stimulation plus faible, seule l’endocytose
rapide est utilisée pour internaliser la membrane (Pyle et coll., 2000).
L’originalité de l’étude de Stevens et coll. réside dans l’utilisation simultanée de techniques de
microscopie (décoloration de FM1-43) et d’électrophysiologie (Stevens et Williams, 2000). Ils
ont ainsi démontré que la libération de neuromédiateur et l’accessibilité de la membrane
vésiculaire au milieu extracellulaire étaient décorrélées. Dans 20% des événements, la libération
de neuromédiateur ne permettait pas au FM1-43 de s’échapper, ce qui signifie que l’intérieur de
la vésicule était exposé pendant moins de 6 millisecondes. Les auteurs appellent ce type
d’événement du kiss-and-run.
En 2003, deux études, utilisant deux approches différentes, ont permis de suivre le devenir de
vésicules uniques après exocytose. Jusqu’alors, toutes les études de fluorescence devaient
moyenner les données obtenues à partir de plusieurs vésicules. L’approche de Gandhi et Stevens
a été d’utiliser la synaptopHluorine pour démontrer l’existence de trois types d’événements.
Dans certains cas, le signal fluorescent disparaissait au bout de 400 à 860 millisecondes, ce qui
correspond à du kiss-and-run. Une autre fraction des vésicules étaient internalisées au bout de 8
55
INTRODUCTION- III/ La plasticité synaptique
à 21 secondes, par un processus appelé « endocytose compensatoire ». Enfin, un faible
pourcentage des vésicules n’étaient pas ré-internalisées dans les 45 secondes d’enregistrement et
correspondent vraisemblablement à des vésicules qui doivent attendre une prochaine stimulation
pour être internalisées à nouveau. Un fait marquant est que la proportion de kiss-and-run et
d’endocytose compensatoire dépend de la probabilité de libération des synapses. Dans les
synapses à faible probabilité de libération, l’endocytose de type kiss-and-run prédomine. Dans
leur étude, Aravanis et coll., ont utilisé le FM1-43, mais avec un protocole de marquage
minimal de manière à ne marquer statistiquement que 0 ou 1 vésicule par synapse, et ils ont
ensuite appliqué une analyse quantique aux variations de fluorescence (Aravanis et coll.,
2003b). L’intérêt de cette approche est de pouvoir suivre une seule et même vésicule au cours
de plusieurs cycles d’exocytose-endocytose. Ils ont ainsi pu montrer que la majorité des
vésicules ne relâchaient pas tout leur colorant en un seul événement, mais nécessitaient au
contraire plusieurs cycles. Cette étude a été poursuivie pour montrer que 85% des vésicules
avaient ce type de comportement de kiss-and-run (avec un temps de présence à la membrane
inférieur à 1,4 secondes) (Aravanis et coll., 2003a).
En conclusion, il existe au moins deux voies de recyclage qui sollicitent différents pools de
vésicules synaptiques et qui sont mises en jeu lors de différentes conditions de stimulation (voir
Galli et Haucke, 2004; Wilkinson et Lin, 2004; Rizzoli et Betz, 2005) :
Lors d’une faible stimulation, la synapse utilise de manière préférentielle les vésicules issues du
pool immédiatement libérable et ces vésicules sont recyclées de manière locale (soit par
endocytose médiée par la clathrine en zone péri-active soit par kiss-and-run).
Lors d’une forte stimulation, le pool de réserve est sollicité et les vésicules sont recyclées par
macropinocytose pour former des citernes à partir desquelles bourgeonnent des vésicules
recouvertes de clathrine. Il est possible que l’on trouve également dans ce cas des exemples
d’endocytose par la voie de la clathrine directement à la membrane plasmique, en zone périactive.
De manière intéressante, l’endophiline semble impliquée uniquement dans la voie plus lente
médiée par la clathrine. En effet, chez des mutants nuls de l’endophiline chez la drosophile, la
neurotransmission est fortement réduite mais il existe une transmission résiduelle attribuée à un
mécanisme de kiss-and-run (Verstreken et coll., 2002). L’interaction de VGLUT1 avec
l’endophiline, décrite dans la partie III des Résultats, soulève donc la possibilité que les
synapses VGLUT1, -2 et –3 diffèrent dans leurs propriétés de recyclage.
56
`
RESULTATS
RESULTATS
RESULTATS
Dans les chapitres qui suivent, je vais présenter succinctement trois articles qui ont découlé de
mon travail de thèse. Pour chacun d’eux, je situerai brièvement le contexte dans lequel l’étude a
été initiée, puis j’en exposerai les résultats principaux. Ces résultats seront ensuite discutés dans
un contexte plus global (dans la partie intitulée Discussion Générale) et non à la suite de chaque
article.
La première partie concerne la localisation anatomique détaillée de VGLUT3, en
comparaison avec celle de VGLUT1, et –2, dans le cerveau de rat adulte (Herzog et coll.,
Neuroscience, 2004).
Le deuxième article traite de l’ontogenèse des VGLUTs. Il s’agit de l’étude de leur expression
post-natale dans le cerveau de rat (Vinatier et coll., Neuropharmacology, 2005).
Enfin, je présenterai dans la troisième partie les résultats d’un article qui sera soumis
prochainement et qui décrit une nouvelle interaction entre VGLUT1 et une protéine de la
machinerie endocytotique, l’endophiline (Vinatier et coll., soumis).
58
PARTIE I :
ETUDE DE LA REPARTITION ANATOMIQUE DE VGLUT3 DANS
LE CERVEAU DE RAT ADULTE
(Herzog et coll., Neuroscience, 2004)
RESULTATS – Localisation de VGLUT3
Contexte de l’étude
VGLUT1 et –2 sont les transporteurs vésiculaires majoritaires dans le système nerveux central
et ont des répartitions largement complémentaires. VGLUT3 est un sous-type peu abondant et
tout à fait atypique, car il est exprimé dans des neurones non considérés comme
glutamatergiques.
Les travaux précédents de notre laboratoire (Gras et coll., 2002) et d’autres (Fremeau et coll.,
2002; Schafer et coll., 2002; Takamori et coll., 2002) ont permis de montrer que :
- Le gène VGLUT3 chez le rat code une protéine de 588 acides aminés qui possède plus de 70%
d’identité avec VGLUT1 et –2.
- Des vésicules purifiées à partir de cellules transfectées par VGLUT3 transportent le glutamate
avec des caractéristiques similaires à celles de VGLUT1 et –2.
- L’ARNm de VGLUT3 est présent dans un faible nombre de régions du cerveau dont le raphé,
le noyau caudé-putamen, le noyau accumbens, l’hippocampe, l’habénula, le cortex cérébral, et
les cellules épendymaires. Une seule étude non répliquée décrit la présence de VGLUT3 dans le
cervelet et dans les cellules gliales (Fremeau et coll., 2002).
- La protéine VGLUT3 est détectée dans le noyau caudé-putamen, le noyau accumbens, les
tubercules olfactifs, l’hippocampe, l’aire tegmentale ventrale, la substance noire compacte, et le
raphé.
- L’immunoréactivité VGLUT3 est concentrée dans les terminaisons nerveuses asymétriques,
mais aussi symétriques de l’hippocampe et du raphé.
- VGLUT3 est co-exprimé avec des marqueurs sérotoninergique (raphé), cholinergique
(striatum) et GABAergique (hippocampe).
Dans cet article, nous examinons de manière plus exhaustive la localisation de VGLUT3 dans le
cerveau de rat, aussi bien au niveau de l’ARN messager que de la protéine. De plus, la
localisation de la protéine VGLUT3 est comparée de manière systématique à celle de VGLUT1
et –2.
Principaux résultats
L’utilisation d’outils spécifiques de chacun des sous-types de transporteurs vésiculaires du
glutamate (sondes d’ARN complémentaire et oligonucléotidiques pour l’hybridation in situ,
anticorps pour l’immunoautoradiographie, l’immunopéroxidase, et l’immunofluorescence) nous
a permis de préciser la localisation anatomique de VGLUT1, -2 et –3 dans le cerveau de rat
adulte.
60
RESULTATS – Localisation de VGLUT3
Atlas des protéines VGLUT1, -2 et –3 en coupes coronales
Dans les Figures 1 et 2, la répartition régionale de la protéine VGLUT3 a été comparée de
manière systématique à celle de l’ARN messager de VGLUT3 d’une part et aux protéines
VGLUT1 et –2, d’autre part.
Localisation régionale de VGLUT3
L’ARN messager codant VGLUT3 est exprimé dans un faible nombre de régions cérébrales
(cortex, striatum, hippocampe, raphé). Dans ces régions, la protéine VGLUT3 est également
présente, ce qui suggère une expression par des interneurones locaux. La protéine est également
présente dans des régions n’exprimant pas l’ARN messager telles que l’amygdale, la substance
noie compacte, et l’hypothalamus. VGLUT3 est donc également exprimé dans des neurones de
projection (Figures 1 et 2).
Localisation cellulaire de VGLUT3
Les expériences d’immunohistochimie utilisant la péroxydase (Figures 3-9) permettent
d’obtenir une meilleure résolution anatomique que l’immunoautodiographie utilisée dans
l’étude précédente (Gras et coll., 2002). Comme VGLUT1 et –2, VGLUT3 est présent au
niveau de terminaisons nerveuses. Cependant, la protéine VGLUT3 est également détectée au
niveau de corps cellulaires (dans le cortex : Figure 4C, le striatum : Figure 5C et 5D et
l’hippocampe : Figure 6D ) et les dendrites.
Co-localisation de VGLUT3 avec des marqueurs GABAergiques
La technique d’hybridation in situ colorimétrique double permet de mettre en évidence des
neurones co-exprimant VGLUT3 et la GAD (enzyme de biosynthèse du GABA). De telles coexpressions ont été trouvées dans l’hippocampe et le noyau interpédonculaire, mais pas dans le
cortex (Figure 10). Au niveau protéique, nous avons observé des terminaisons doublement
marquées pour VGLUT3 et VIAAT (transporteur vésiculaire du GABA) dans certains neurones
pyramidaux et granulaires de l’hippocampe (Figure 11D-F).
Conclusion
Cette étude a permis de comparer l’expression de VGLUT3 à celle des sous-types majoritaires,
VGLUT1 et –2. Elle a également confirmé et complété un certain nombre d’observations
précédentes sur la localisation sub-cellulaire de VGLUT3 et sur son expression dans des
interneurones GABAergiques. Cet article apporte donc une confirmation du statut atypique de
VGLUT3 parmi les transporteurs vésiculaires du glutamate.
61
PARTIE II :
ETUDE DE L’ONTOGENESE DES VGLUTS AU COURS DU
DEVELOPPEMENT POST-NATAL
Vinatier et coll., Neuropharmacology, 2005
RESULTATS – Ontogenèse des VGLUTs
Contexte de l’étude
Si la répartition anatomique de VGLUT1, -2 et -3 a fait l’objet d’un grand nombre d’études
(pour revue, voir Kaneko et Fujiyama, 2002), peu de choses sont connues sur la mise en place
des différents systèmes glutamatergiques au cours du développement post-natal. Les
transporteurs vésiculaires du glutamate font-ils l’objet de régulations transcriptionnelles au
cours du développement ? Nous avons vu précédemment qu’il existait des régulations de
l’expression des ARNm messagers lors de traitements pharmacologiques, ou lors de la mise en
place de circuits neuronaux in vitro (Introduction III.2).
Chez l’adulte, VGLUT1, -2 et -3 ont des territoires d’expression bien distincts, indiquant qu’il
existe
d’importantes régulations spatiales de leur transcription et suggérant peut-être des
différences de fonctionnement. Dans cette étude, nous explorons l’hypothèse que l’expression
VGLUT1, -2 et -3 pourrait également faire l’objet de régulations temporelles.
Nous avons ainsi examiné les cinétiques d’apparition des ARN messagers et des protéines entre
le jour suivant la naissance (jour post-natal P1) et l’âge adulte (P90) par différentes techniques.
Nous avons ensuite examiné plus en détail l’expression transitoire de VGLUT3 dans un
territoire dont il est totalement absent à l’âge adulte : les cellules de Purkinje du cervelet.
Principaux résultats
Dans cette étude, nous avons utilisé les outils développés précédemment pour l’étude de
l’anatomie des systèmes glutamatergiques dans le cerveau de rat adulte : sondes
oligonucléotidiques et anticorps spécifiques. Des rats de différents âges (P1, P6, P10, P15, P21
et P90) ont été utilisés pour mettre en évidence les caractéristiques de l’ontogenèse de
VGLUT1, -2 et –3.
Profil d’expression des VGLUTs dans le cerveau total
La cinétique d’apparition des protéines VGLUT1, -2 et -3 a été déterminée par Western blot
semi-quantitatif à partir d’échantillons de cerveau total (Figure 1). La protéine VGLUT1 est très
peu abondante à la naissance, mais elle augmente régulièrement jusqu’à P15, où elle atteint le
niveau d’expression adulte. VGLUT2, au contraire, est déjà présent à la naissance (50 % du
niveau adulte) et atteint le niveau adulte dès P15. Le profil de VGLUT3 est tout à fait
inattendu : déjà assez abondant à la naissance, VGLUT3 connaît un pic d’expression aux
alentours de P10, puis augmente progressivement de P15 à l’âge adulte.
82
RESULTATS – Ontogenèse des VGLUTs
Profils d’expression des ARNs déterminés par hybridation in situ
Le profil d’expression des ARN messagers de VGLUT1, -2 et –3 a été analysé par hybridation
in situ sur des séries de coupes coronales adjacentes (Figure 2). A la naissance, on trouve très
peu d’ARN messager codant VGLUT1 (dans l’hippocampe et les bulbes olfactifs) Son
expression augmente ensuite pour atteindre le profil adulte vers P21. VGLUT2 est exprimé de
manière importante à P1, dans le diencéphale et les bulbes olfactifs, mais aussi dans des
territoires qui n’exprimeront pas VGLUT2 à l’âge adulte (comme l’hippocampe et les couches
superficielles du cortex). Cette expression ectopique s’estompe vers P15. VGLUT3 est exprimé
transitoirement, entre P6 et P10 dans le cortex cérébelleux et le complexe olivaire supérieur.
Profils protéiques déterminés par immunoautoradiographie
Le profil d’expression des protéines VGLUT1, -2 et -3 a été analysé sur des séries de coupes
coronales adjacentes (Figure 3). Le pic d’expression de VGLUT3 vers P10 se traduit au niveau
protéique par la présence d’immunomarquage VGLUT3 dans les noyaux profonds du cervelet,
dans le complexe olivaire supérieure, et dans les collicules inférieures.
Expression transitoire de VGLUT3 dans les cellules de Purkinje
L’expression transitoire de VGLUT3 dans les cellules de Purkinje GABAergiques du cervelet a
été analysé par hybridation in situ et immunofluorescence doubles. A P10, VGLUT3 est
exprimé dans des neurones GABAergiques (exprimant la GAD) du cervelet (Figure 4). Au
niveau protéique, VGLUT3 colocalise avec la calbindine (marqueur des cellules de Purkinje) et
VIAAT dans les cellules de Purkinje (Figure 5B et C), et avec VIAAT dans le noyau interposé
(Figure 5D).
Conclusion
Parallèlement à notre étude, trois autres articles ont paru qui traitent de l’expression post-natale
des VGLUTs dans le cerveau (Boulland et coll., 2004) et dans le système auditif (Blaesse et
coll., 2005; Gillespie et coll., 2005). Nos données sont en bon accord avec ces résultats.
Ces différents articles ont permis de mettre en évidence deux grandes caractéristiques de
l’ontogenèse des VGLUTs :
- l’existence de co-expressions VGLUT1/VGLUT2 ;
- l’expression transitoire de VGLUT3 dans des territoires dont il est absent à l’âge adulte.
Ces deux points seront développés dans la discussion générale.
83
PARTIE III :
ETUDE DE L’INTERACTION ENTRE VGLUT1 ET UNE PROTEINE
IMPLIQUEE DANS L’ENDOCYTOSE, L’ENDOPHILINE
Vinatier et coll., soumis
RESULTATS – Interaction VGLUT1/endophiline
Contexte de l’étude
Les travaux décrits précédemment ont souligné le fait que, si aucune différence fonctionnelle
significative n’a été trouvée entre les trois-types, VGLUT1, -2 et -3 diffèrent grandement par
leur profil d’expression spatio-temporel dans le système nerveux central. Dans cette étude, nous
avons cherché à déterminer s’il existait des différences de régulation entre VGLUT1 et
VGLUT2, qui sont les sous-types majoritaires du cerveau adulte.
En effet, VGLUT1 est le sous-type prédominant dans le télencéphale et le cortex cérébelleux,
alors que VGLUT2 est majoritairement exprimé dans le diencéphale et le mésencéphale.
L’analyse de la séquence peptidique de VGLUT1 et VGLUT2 révèle que les extrémités N- et Cterminales des transporteurs sont très divergentes. En outre, VGLUT1 possède, dans sa partie Cterminale, deux motifs riches en prolines, de part et d’autre d’un motif (SYGAT) très conservé
au sein des VGLUTs (Figure 1). Nous avons donc utilisé cette extrémité cytoplasmique comme
appât dans un crible double-hybride, afin de rechercher des partenaires protéiques spécifiques
de VGLUT1 et susceptibles de lui conférer des propriétés fonctionnelles particulières.
Principaux résultats
Découverte et caractérisation de l’interaction VGLUT1/endophiline par double-hybride
Le crible double-hybride a généré un grand nombre de clones positifs, dont la majorité code des
protéines à domaine SH3, connues pour interagir avec les motifs riches en proline. Parmi ceuxci les clones codant l’endophiline étaient les plus abondants (Figure 2A).
Nous avons montré que les résidus proline du deuxième motif riche en proline de VGLUT1 et le
domaine SH3 de l’endophiline sont nécessaires pour l’interaction moléculaire en doublehybride (Figure 2C et D).
Confirmation de l’interaction par chromatographie d’affinité
Le domaine SH3 de l’endophiline est nécessaire et suffisant pour précipiter la protéine
VGLUT1 endogène (Figure 3).
Comparaison des profils d’expression de VGLUT1 et l’endophiline
L’ARN messager de l’endophiline est plus abondant dans les régions qui expriment VGLUT1
que dans celles qui expriment VGLUT2 (Figure 6). De même, la protéine endophiline est
présente dans les terminaisons des fibres VGLUT1-positives du cervelet, mais pas
systématiquement dans les terminaisons des fibres exprimant VGLUT2 (Figure 7).
96
RESULTATS – Interaction VGLUT1/endophiline
Absence d’effet direct de l’interaction sur les activités enzymatiques de VGLUT1 et
l’endophiline
L’interaction entre VGLUT1 et l’endophiline ne modifie ni l’activité de capture de glutamate de
VGLUT1, ni son adressage dans des neurones en culture, ni l’activité LPAAT de l’endophiline
(Figures 4 et 5).
Résultats complémentaires
Ces travaux décrivent pour la première fois l’interaction entre un transporteur vésiculaire de
neuromédiateur et une protéine impliquée dans le recyclage et/ou la biogenèse des vésicules
synaptiques.
J’ai identifié, au niveau moléculaire, quels étaient les motifs impliqués dans cette interaction
entre VGLUT1 et l’endophiline. Il s’agit de la reconnaissance entre le deuxième domaine riche
en prolines de VGLUT1 et le domaine SH3 de l’endophiline. Ce type d’interaction protéineprotéine est fréquemment rencontré dans des voies de signalisation cellulaire et au sein des
molécules du cytosquelette. Si certaines caractéristiques sont communes pour toutes les
interactions de ce type, il existe tout de même une certaine spécificité vis-à-vis des ligands qui
sont reconnus par un domaine SH3 (Kay et coll., 2000).
J’ai donc comparé, de manière systématique, les motifs reconnus par les différents partenaires
de l’endophiline afin de dégager un motif consensuel d’interaction plus précis que le motif PxxP
défini initialement (où P représente un résidu proline et x, n’importe quel acide aminé).
Le tableau ci-dessous récapitule toutes les interactions qui ont été décrites dans la littérature
pour l’endophiline, en distinguant les protéines impliquées dans l’endocytose des autres
partenaires.
Quatre motifs peuvent être dégagés cet alignement : PxRPP, PPRxP, PPPP, PRPP. Il faut noter
qu’aucun de ces motifs n’est conforme ni à un motif de classe I (+xxPxxP, où + correspond à un
acide aminé chargé), ni à un motif de classe II (PxxPx+) (Kay et coll., 2000).
Dans le cas de VGLUT1, le domaine d’interaction avec l’endophiline (PRPPPPP) contient deux
de ces motifs. De manière intéressante, l’endophiline recombinante utilisée pour nos études est
produite par des bactéries puis purifiée sur des colonnes de poly-L-proline. Cette grande facilité
de purification de l’endophiline sur colonne poly-L-proline suggère que le motif PPPP est en
effet un bon candidat pour être reconnu par l’endophiline. Cependant, la substitution des deux
premiers résidus proline du motif PPRPPPP par des résidus alanine a un effet délétère sur
l’interaction entre VGLUT1 et l’endophiline, donc le motif PPPP ne suffit pas, dans les
conditions utilisées pour l’expérience.
97
RESULTATS – Interaction VGLUT1/endophiline
Tableau : protéines à domaine riche en prolines interagissant avec les endophilines
Partenaire
Motif d’interaction
Protéines endocytotiques
amphiphysine
RKGPPVPPLP
dynamine
PPARP
synaptojanine
PKRPPPR
synaptojanine
PPXRP
Protéines non endocytotiques
MDC9 et MDC15
PSRPPPPQP et PAKPPPPRK
PARPPSPSPSPVPARWPPGPPRP
b1AR
GLK
PPRPPPPR mais pas PPPLPPKP ni
PAKP ni PPHKP ou PPTP
Alix
PARPPPP soit PXRPPPP
Référence
(Micheva et coll., 1997b)
(Slepnev et coll., 1998)
(Cestra et coll., 1999)
(Ringstad et coll., 2001)
(Howard et coll., 1999)
(Tang et coll., 1999)
(Ramjaun et coll., 2001)
(Chatellard-Causse et
coll., 2002)
(Soubeyran et coll., 2002)
CIN85
PKKPPPP ou PKKPRPP
(Petrelli et coll., 2002)
Abréviations : Alix : Apoptosis Linked gene 2 interacting protein X ; b1AR : b1-Adrenergic Receptor ;
CIN85 : Cbl-interacting protein of 85 kDa ; GLK : Germinal Center kinase-like Kinase ; MDC :
Metalloprotease, Disintegrin, Cysteine-rich protein ; N-WASP : Neural Wiscott-Aldrich Syndrome
Protein.
Le principal problème de ce type de méta-analyse est de comparer des résultats obtenus par des
techniques très variées, telles que le phage display, le scan de peptides, la coimmunoprécipitation de protéines natives ou sur-exprimées ou le double-hybride. Or, le
contexte autour des motifs décrits ici a certainement une influence sur l’interaction, expliquant
en partie le manque de consensus clair entre les différents résultats.
Une autre possibilité est que l’interaction soit soumise à régulation, par exemple, par
phosphorylation de résidus sérine ou thréonine du PRD, comme cela a été décrit pour le
complexe formé par deux protéines de signalisation de la voie des récepteurs tyrosine kinase,
Sos et Grb2 (Zhao et coll., 1998).
Conclusion
Cette étude a donc fourni un grand nombre d’arguments en faveur d’une interaction in vivo
entre le motif PRPPPPP de l’extremité C-terminale de VGLUT1 et le domaine SH3 de
l’endophiline. L’interaction a été demontrée comme étant possible d’un point de vue
biochimique dans deux situations artificielles : le système double-hybride et la chromatographie
d’affinité. De plus, j’ai montré que les deux partenaires potentiels étaient localisés dans des
régions du cerveau, des cellules, et dans des compartiments subcellulaires compatibles avec une
interaction in vivo. Cependant, il manque une démonstration absolue que l’interaction a bien
lieu in vivo, ainsi que la compréhension de l’effet biologique de cette interaction. D’autres
travaux seront donc nécéssaires pour compléter cette étude.
98
DISCUSSION GENERALE
DISCUSSION GENERALE
DISCUSSION GENERALE
L’ensemble des résultats présentés dans cette thèse souligne l’existence de régulations que
subissent les transporteurs vésiculaires du glutamate. Ces régulations peuvent avoir lieu au
niveau de la transcription, de l’adressage de la protéine et de ses interactions avec d’autres
protéines. Elles sous-tendent vraisembablement des différences physiologiques importantes
entre VGLUT1, -2 et -3 qu’il nous reste encore à découvrir et à comprendre. Dans cette
discussion, j’essaierai de proposer quelques pistes d’exploration pour aller dans ce sens.
1)
VGLUT1
ET
VGLUT2
SONT
LES
PRINCIPAUX
TRANSPORTEURS VESICULAIRES DU GLUTAMATE
1) VGLUT1 et VGLUT2 peuvent-ils être adressés sur les mêmes
vésicules ?
Au cours du développement
VGLUT2 est exprimé très tôt dans ses propres territoires de l’âge adulte, mais aussi de manière
transitoire dans les futurs territoires VGLUT1-positifs. Ainsi, nous avons montré que VGLUT2
est exprimé dans l’hippocampe et les couches superficielles du cortex jusqu’à P10 (et peut-être
même au delà). Vers P21, l’ARN messager n’est plus présent (ou alors à de très faibles niveaux)
dans ces territoires où l’ARN messager de VGLUT1 est apparu (Gras et coll., 2005). Ce type
d’expression ectopique transitoire a déjà été décrite dans le cervelet, où VGLUT2 est d’abord
exprimé dans les fibres parallèles faisant contact sur les cellules de Purkinje, puis est remplacé
par VGLUT1 selon un gradient qui va des parties profondes de la couche moléculaire vers les
parties superficielles (Miyazaki et coll., 2003). Le remplacement progressif de VGLUT2 par
VGLUT1 dans les couches superficielles du neocortex a également été décrit (De Gois et coll.,
2005).
Cette redondance partielle qui existe jusqu’à la troisième ou quatrième semaine post-natale
explique peut-être le fait que l’invalidation du gène VGLUT1 ne soit létale qu’à partir de 21
jours. En effet, l’absence de VGLUT1 ne semble pas perturber significativement le
développement des souris KO VGLUT1 jusqu’au sevrage (Fremeau et coll., 2004a; Wojcik et
coll., 2004).
A l’âge adulte
Il faut noter que, chez l’adulte, certains neurones co-expriment encore VGLUT1 et VGLUT2,
même si les profils d’expression sont généralement complémentaires. Par exemple, De Gois et
121
DISCUSSION GENERALE
coll. ont montré que certains neurones de la couche IV du néocortex co-expriment les deux
ARN messagers à l’âge adulte (De Gois et coll., 2005). Dès la première caractérisation de
VGLUT2, la question de la co-expression de VGLUT1 et –2 par certains neurones a été
soulevée. En effet, Herzog et coll. ont décrit l’existence de neurones exprimant à la fois l’ARN
messager de VGLUT1 et celui de VGLUT2 dans le tractus olfactif latéral et dans le thalamus.
Cependant, aucune colocalisation des deux sous-types n’a été trouvée au niveau des
terminaisons nerveuses (Herzog et coll., 2001).
Trois explications peuvent être proposées :
- l’existence de terminaisons mixtes VGLUT1- et VGLUT2-positives serait trop rare pour que
ces événements aient été détectés ;
- dans les neurones qui co-expriment les deux ARN messagers, seul l’un des deux serait traduit
en protéine ;
- il existerait un mécanisme d’adressage différentiel des VGLUT1 et VGLUT2 à des
terminaisons distinctes d’un même neurone. Ce type de phénomène a également été observé
dans la moelle épinière, où les collatérales récurrentes des motoneurones expriment soit VAChT
soit VGLUT2 au niveau des terminaisons qui contactent les cellules de Renshaw (Herzog et
coll., 2004b).
Une colocalisation des protéines VGLUT1 et VGLUT2 a été observée au niveau de l’habénula
médiane (Sakata-Haga et coll., 2001) et des fibres moussues du cortex cérébelleux (Hisano et
coll., 2002; Hioki et coll., 2003) par double immunofluorescence.
Selon des études microscopie électronique, VGLUT1 et VGLUT2 seraient présents sur les
mêmes terminaisons dans 10% des terminaisons de la stratum radiatum de CA1 et de la couche
moléculaire du gyrus dentelé de l’hippocampe chez l’adulte (Boulland et coll., 2004).
L’étude de souris invalidées pour VGLUT1 par deux équipes indépendantes a généré des
résultats contradictoires sur la possibilité de co-localisation des protéines VGLUT1 et VGLUT2
sur les mêmes vésicules (Fremeau et coll., 2004a; Wojcik et coll., 2004).
Les observations générales de ces deux articles sont similaires. Les animaux VGLUT1 -/- ne
présentent pas de défaut particulier pendant les deux premières semaines après la naissance,
mais à partir de P15, ils présentent un retard de croissance et une posture altérée par rapport aux
souris VGLUT1 +/+. Si aucun soin particulier n’est apporté à ces souris, elles meurent
généralement dans le cours de la troisième semaine (Wojcik et coll., 2004). Cependant, elles
peuvent survivre jusqu’à l’âge adulte (Fremeau et coll., 2004a et S.M. Wojcik, communication
personnelle) lorsque des soins particuliers leur sont apportés. La cytoarchitectonie du cerveau,
122
DISCUSSION GENERALE
observée sur des coupes colorées par la technique de Nissl, semble normale. Aucune
modification de l’expression des protéines VGLUT2 ou VGLUT3 n’est observée.
Les deux études montrent une réduction significative de la transmission excitatrice
glutamatergique chez les souris KO par rapport aux souris contrôles (WT et hétérozygotes),
mais décrivent une transmission résiduelle attribuée à l’expression transitoire de VGLUT2 dans
des neurones exprimant normalement VGLUT1. Cependant, les deux études diffèrent quant à la
persistence de cette co-expression et quant à la possibilité que VGLUT1 et VGLUT2 soient
portés par les mêmes vésicules synaptiques.
Les études de Wojcik et coll. ont été réalisées sur des cultures autaptiques de neurones réalisées
à partir d’hippocampe de souris WT ou KO à P0. Ces neurones sont cultivés sur des micro-îlots
d’astrocytes et développent des connections synaptiques sur elles-mêmes (autapses). Les auteurs
ont comparé la taille et la fréquence des mEPSC (courant post-synaptique excitateur miniature,
correspondant à la libération stochastique d’une vésicule synaptique en l’absence de
stimulation) et observent que, dans les neurones issus des souris KO, il y a un décalage vers de
très faibles courants ainsi qu’une diminution de la fréquence des événements (liée au fait qu’un
plus grand nombre d’événements passe sous le seuil de détection). Deux types de neurones ont
été identifiés : ceux qui avaient une réponse évoquée de taille normale (et exprimant
vraisemblablement des quantités importantes de VGLUT2) et ceux dont la réponse évoquée
était faible (et n’exprimant que de faibles quantités de VGLUT2). Si l’on ne considère que la
première population, l’amplitude des mEPSC est la même que chez les WT. Les auteurs
concluent que dans les neurones KO les vésicules contiennent du glutamate, mais que le
remplissage des vésicules est moindre du fait d’un plus faible nombre de transporteurs par
vésicule (voir Figure n°13). Cette hypothèse est renforcée par le fait que la surexpression de
VGLUT1 dans ces neurones rétablit la taille des mEPSC, à un niveau qui dépasse même celui
observé dans les neurones sauvages. Ainsi, la taille du quantum est déterminée par le nombre de
transporteurs vésiculaires de glutamate, et VGLUT1 et VGLUT2 sont localisés sur les mêmes
vésicules dans les neurones autaptiques. Il est possible que, en l’absence des cibles
physiologiques, les terminaisons nerveuses de ces neurones autaptiques ne soient pas totalement
différenciées et ne reflètent pas parfaitement la situation in vivo. Ainsi, la proportion de
synapses mixtes exprimant VGLUT1 et VGLUT2 sur les mêmes vésicules pourrait être surestimée dans cette étude.
Au contraire, les travaux de Fremeau et coll. ont été menés sur des tranches d’hippocampe, où la
connectivité entre les cellules est mieux préservée. Ces auteurs utilisent des arguments
électrophysiologiques et anatomiques pour conclure que VGLUT1 et VGLUT2 sont présents
dans des terminaisons différentes et sur des vésicules distinctes. Les enregistrements
123
A
Synapse VGLUT1 +/+
glutamate
VGLUT1
e
som
endo
VGLUT2
B
Synapse VGLUT1 -/e
som
endo
3
2
1
Figure n°13: Modèle simplifié de terminaison glutamatergique chez les souris VGLUT1 -/-.
A, Représentation d’une synapseVGLUT1-positive chez un animal sauvage. B, Représentation schématique
d’une synapse chez un animal VGLUT1 -/-. Dans ces terminaisons on observe une diminution du quantum
libérable (1). Certaines vésicules sont vides mais peuvent tout de même être exocytées et le nombre de
vésicules est considérablement diminué (2). Enfin, des structures tubulo-vésiculaires apparaissent dans la
terminaison, suggérant un défaut dans le recyclage ou la biogenèse des vésicules synaptiques (3).
Source: Herzog, 2004b.
DISCUSSION GENERALE
électrophysiologiques ont été réalisés sur des cellules pyramidales de l’aire CA1 de
l’hippocampe. Ici, aucune différence significative dans la taille des mEPSC n’a été trouvée. On
peut supposer que seuls les neurones exprimant de forts niveaux de VGLUT2 ont été enregistrés
(soit seulement environ 12% des neurones) et que la population exprimant de faibles niveaux de
VGLUT2 aurait été écartée. Une autre possibilité est que cette expérience ait été réalisée sur des
tranches prélevées sur des souris adultes, car le protocole expérimental exact n’est pas précisé.
Ainsi, les deux études ne seraient pas forcément contradictoires.
En ce qui concerne les arguments anatomiques en défaveur d’une colocalisation de VGLUT1 et
VGLUT2 sur une même population de vésicules, plusieurs réserves peuvent être émises. Il est
tout à fait possible qu’un faible pourcentage de colocalisation entre VGLUT1 et VGLUT2 au
niveau de certaines terminaisons soit passé inaperçu, surtout si le taux d’expression de l’une des
deux protéines est relativement faible, comme c’est le cas de VGLUT2 dans la couche CA1.
Dans leur article sur les souris VGLUT1-/-, Fremeau et coll. voient ainsi, par double
immunofluorescence, une colocalisation des deux protéines à P8, qui disparaît à l’âge adulte.
Pourtant, les mêmes auteurs décrivent la co-existence d’immunoréactivité VGLUT1 et
VGLUT2 dans des terminaisons glutamatergiques de CA1 à l’âge adulte, par microscopie
électronique (Boulland et coll., 2004). Il est possible que les deux techniques diffèrent dans leur
sensibilité ou que les épitopes n’aient pas la même accessibilité en fonction des protocoles
utilisés pour la préparation des tissus. En effet, l’équipe du Pr. Kaneko rapporte qu’un
prétraitement à l’acide citrique à 80°C pendant une heure augmente significativement le signal
des anticorps (Nakamura et coll.). De manière intéressante, ils ne détectent pas de colocalisation
de VGLUT1 et VGLUT2 dans la stratum radiatum, mais dans la stratum lacunosum-moleculare
et suggèrent que l’apparente contradiction entre les études de Boulland et coll. et de Fremeau et
coll. pourrait venir d’une mauvaise identification de cette couche.
En conclusion, la co-existence de VGLUT1 et VGLUT2 sur une même vésicule, si elle semble
avoir lieu au cours du développement ou dans des conditions de culture particulière, n’est pas
définitivement démontrée chez l’adulte. Si elle existe, elle représente vraisemblablement une
fraction minoritaire des vésicules.
2) VGLUT1 et VGLUT2 sont-ils exprimés dans des terminaisons qui
diffèrent par leur probabilité de libération ?
Selon l’hypothèse de R. Edwards, VGLUT1 et VGLUT2 sont exprimés par des populations de
vésicules distinctes. Les terminaisons portant l’un ou l’autre des sous-types se distingueraient
par les propriétés électrophysiologiques. En effet, VGLUT1 serait associé à des terminaisons à
125
DISCUSSION GENERALE
faible probabilité de libération et à forte plasticité, alors que VGLUT2 serait exprimé dans des
terminaisons à forte probabilité de libération et peu plastiques (Fremeau et coll., 2004b).
Tableau : comparaison de la transmission quantique pour différentes synapses
glutamatergiques
Synapse
Probabilité de libération Transporteur
Terminaisons axonales intracorticales
Faible1,2
VGLUT1
(couches I-III et V)
Termaisons axonales thalamocorticales (couche IV)
Elevée1
VGLUT2
Neurone pyramidal de l’hippocampe dans CA1
Faible3
VGLUT1
Cellule granulaire du gyrus dentelé
Faible4
VGLUT1
Fibre grimpante du cervelet
Elevée5
VGLUT2
tiré de (Liu, 2003)
Références : 1 :(Gil et coll., 1999) ; 2 :(Markram et coll., 1997) ; 3 :(Murthy et coll., 1997) ; 4 :(Bekkers
et Clements, 1999) ; 5 :(Dittman et Regehr, 1998; Silver et coll., 1998).
De même, au cours du développement, les synapses à haute probabilité de libération (nécessaire
au développement normal du cerveau) laissent place à de synapses plus plastiques et capables de
LTP. Il est tentant de faire le parallèle avec la transition développementale entre VGLUT2 et
VGLUT1 observée dans certaines régions, même si aucune démonstration du lien causal entre la
présence d’un sous-type de transporteur vésiculaire de glutamate et la probabilité de libération
n’a été apportée.
L’interaction de VGLUT1 avec l’endophiline, une molécule impliquée dans l’endocytose des
vésicules synaptiques par la voie de la clathrine, pourrait expliquer des différences de recyclage
entre les vésicules VGLUT1-positives et celles portant VGLUT2. En effet, chez des mutants
nuls de l’endophiline chez le nématode ou la drosophile, la transmission synaptique est
fortement réduite, mais il subsiste une transmission résiduelle qui peut être attribuée à du kissand-run (Guichet et coll., 2002; Verstreken et coll., 2002). D’autre part, il a été montré dans des
synapses centrales (neurones hippocampiques en culture) que ce mode de recyclage des
vésicules était prédominant pour des synapses de faible probabilité de libération (Gandhi et
Stevens, 2003). Ainsi, dans les synapses à faible probabilité de libération VGLUT1-positives,
l’interaction de VGLUT1 et de l’endophiline pourrait titrer l’endophiline, la rendant
indisponible pour recruter la synaptojanine et favorisant ainsi recyclage de type kiss-and-run.
Ceci suggèrerait que le kiss-and-run serait le mode de recyclage des vésicules par défaut et que
la voie de la clathrine ne serait mise en jeu que pour des stimulations plus importantes ou pour
des transmissions à plus haute fidélité.
Au premier abord, il peut paraître surprenant qu’une synapse peu sollicitée utilise une voie de
recyclage plus rapide et moins consommatrice d’énergie, le kiss-and-run, qu’une synapse très
active. Une explication pourrait être que le kiss-and-run serait moins fiable, alors que
126
DISCUSSION GENERALE
l’endocytose par la voie de la clathrine permettrait en quelque sorte un « contrôle-qualité » des
vésicules nouvellement formées. Certaines des vésicules formées par cette voie peuvent ensuite
fusionner avec les endosomes (comme l’indique la présence de Rab5, marqueur des endosomes,
dans les vésicules synaptiques) pour que s’effectue un tri des composants membranaires
(Fischer von Mollard et coll., 1994).
Ainsi, l’interaction spécifique entre VGLUT1 et l’endophiline pourrait être responsable de la
faible probabilité de libération observée aux synapses VGLUT1-positives. Cependant, aussi
séduisante qu’elle soit, cette hypothèse repose sur des présomptions et manque de
démonstrations directes. De plus, elle a déjà été remise en cause par certains travaux, dont les
études de probabilité de libération dans les neurones issus de souris VGLUT1 -/-. Dans des
neurones autaptiques en culture, Wojcik et coll. ont observé que la probabilité de libération était
plus faible dans les neurones KO que dans les neurones sauvages. Au contraire, Fremeau et coll.
ont étudié la plasticité à court terme de synapses excitatrices sur des tranches d’hippocampe et
ont montré que les synapses des animaux KO se déprimaient plus rapidement et pour des durées
plus longues que les synapses des souris sauvages, suggérant que la probabilité initiale était plus
élevée.
Cependant, il me semble qu’aucune de ces deux analyses ne permet de conclure quant à la
probabilité de libération de synapses VGLUT1-positives par rapport aux synapses VGLUT2positives. Les deux types de synapses qui sont comparées ici sont les synapses provenant de
neurones n’exprimant que VGLUT2 (KO) et celles exprimant à la fois VGLUT1 et VGLUT2
(WT). Aucune conclusion définitive ne peut donc être tirée de ces expériences. Une réelle
comparaison des propriétés électrophysiologiques des synapses VGLUT1-positives et
VGLUT2-positives devrait être possible à partir d’animaux knock-in, où l’un des sous-types est
exprimé à la place de l’autre, plutôt que chez des souris knock-out.
3) VGLUT1 : un transporteur vésiculaire impliqué dans la biogenèse des
vésicules synaptiques ?
Si le rôle de l’interaction entre VGLUT1 et l’endophiline était bien de favoriser un recyclage
des vésicules par kiss-and-run au lieu d’un recyclage par la voie de la clathrine, on s’attendrait à
observer des synapses morphologiquement normales chez les souris VGLUT1 -/- qui
recycleraient selon la voie longue. Or, de manière surprenante, l’observation de ces synapses par
microscopie électronique a révélé une importante altération de l’ultrastructure des terminaisons
exprimant normalement VGLUT1 (Fremeau et coll., 2004a). Le nombre de terminaisons et la
127
DISCUSSION GENERALE
taille de la densité post-synaptique ne sont pas modifiés, mais le nombre de vésicules
synaptiques est considérablement diminué par rapport aux synapses des souris sauvages (voir
Figure n°13). Une analyse quantitative montre que cette réduction ne concerne que les vésicules
situées à plus de 100 nm de la zone active. De plus, elle est spécifique des synapses exprimant
normalement VGLUT1, puisque les fibres grimpantes du cervelet, exprimant VGLUT2, ne sont
pas affectées. Le diminution du nombre de vésicules en arrière de la zone active est associé à
l’apparition de structures tubulo-vésiculaires, suggérant un défaut dans un processus de trafic
membranaire. Le recyclage global des vésicules synaptiques est normal, d’après des expériences
de marquage de FM1-43 (Wojcik et coll., 2004).
L’ensemble de ces résultats suggère ainsi que les synapses VGLUT1 -/- présentent soit un
défaut subtil de recyclage des vésicules synaptiques non détecté par ce protocole (qui utilise des
stimulations intenses), soit un défaut dans la biogenèse de novo des vésicules synaptiques.
Plusieurs arguments permettent de proposer que VGLUT1 aurait un rôle propre dans la
biogenèse des vésicules synaptiques. En effet, de nombreuses études ont montré que le
recyclage des vésicules synaptiques et leur remplissage en neuromédiateur étaient des processus
indépendants. Le recyclage des vésicules synaptiques est normal dans des neurones cérébelleux
en culture ou des neurones hippocampiques traités à la bafilomycine (Cousin et Nicholls, 1997;
Zhou et coll., 2000) ou dans des motoneurones traités au vésamicol (Parsons et coll., 1999),
malgré l’absence ou la forte réduction de libération de neuromédiateur. De même, chez les
souris invalidées pour le transporteur vésiculaire des monoamines (VMAT2) le recyclage des
vésicules et l’ultrastructure des terminaisons sont comparables aux souris sauvages (Croft et
coll., 2005).
Il est tentant de spéculer que l’interaction avec l’endophiline est responsable de cette proprieté
particulière de VGLUT1. Mais d’autres expériences seront nécéssaires pour montrer le rôle
physiologique de l’interaction entre VGLUT1 et l’endophiline. Par exemple, il serait intéressant
de voir si une souris knock-in possédant une protéine VGLUT1 ne pouvant plus interagir avec
l’endophiline (par exemple, le mutant Pro554Ala utilisé dans mon étude), possède les mêmes
altérations ultrastructurales que les souris knock-out. Cependant, d’autres protéines à domaine
SH3 pouvant interagir avec la partie riche en prolines de VGLUT1 sont aussi à prendre en
considération. Parmi les autres clones positifs du crible double-hybride, nous avons identifié des
protéines de la famille des vinexines, qui sont connues pour interagir avec le cytosquelette
d’actine (voir Kioka et coll., 2002 pour revue).
128
DISCUSSION GENERALE
2) VGLUT3 EST UN TRANSPORTEUR VESICULAIRE DU
GLUTAMATE ATYPIQUE
L’étude de souris invalidées pour le gène VGLUT1 a dévoilé des propriétés inattendues pour le
transporteur VGLUT1 : en plus de sa capacité à utiliser le gradient de protons vésiculaire pour
charger la vésicule en glutamate, VGLUT1 semble aussi avoir un rôle dans la biogenèse des
vésicules et/ou la régulation de la dynamique de ces vésicules au sein de la terminaison
nerveuse.
Dans le cas de VGLUT3, les études anatomiques ont tout de suite amené la communauté
scientifique à rechercher un autre rôle que le simple transport de glutamate pour cette protéine.
D’ailleurs, cette fonction primaire de VGLUT3 a été difficile à mettre en évidence. Si la
transfection de VGLUT1 ou –2 dans des neurones GABAergiques en culture suffit à leur
conférer un phénotype glutamatergique (possibilité de libérer du glutamate qui est détecté par
des cellules HEK exprimant des récepteurs AMPA) (Takamori et coll., 2000; 2001), cette
expérience n’a pas été décrite pour VGLUT3 (Takamori et coll., 2002). La première preuve que
VGLUT3 permet bien d’accumuler du glutamate dans des vésicules synaptiques a été apportée
par Gillepsie et coll. dans le cadre d’une co-libération de glutamate, de GABA et de glycine par
des neurones du système auditif (Gillespie et coll., , voir plus loin).
1) Expression de VGLUT3 avec d’autres transporteurs vésiculaires et
possible co-libération
L’expression de VGLUT3 dans un certain nombre de neurones non considérés comme
glutamatergiques suggère que la co-transmission serait plus répandue qu’on ne le pensait
auparavant (voir Figure n°14). En effet, l’ARN messager de VGLUT3 a été détecté dans le
cerveau adulte dans différentes populations de neurones :
- les interneurones cholinergiques du striatum (Gras et coll., 2002; Schafer et coll., 2002) ;
- les neurones sérotoninergiques du raphé et des neurones non sérotoninergiques du raphé dorsal
(Gras et coll., 2002) ;
- certains interneurones GABAergiques du cortex et de l’hippocampe (Herzog et coll., 2004a;
Hioki et coll., 2004) ;
- des neurones (en majorité non-sérotoninergiques) du raphé médullaire rostral (raphé pallidus
nucleus et raphé magnus nucleus) impliqués dans la thermorégulation (Nakamura et coll.,
2004).
129
hippocampe, cortex
striatum
VGLUT3
VMAT2
VAChT
VIAAT
raphé
aire tegmentale ventrale,
substance noire,
hypothalamus
Figure n°14: Schéma simplifié de l’expression de VGLUT3 dans des neurones non-glutamatergiques
Les corps cellulaires des neurones sont représentés par des cercles et les projections par des flèches colorées.
Les terminaisons VGLUT3-positives sont indiquées en bleu, celles portant VMAT2, VAChT et VIAAT en
rouge, vert et gris respectivement. Les terminaisons mixtes sont représentées par une double flèche. Ainsi,
lorsque VGLUT3 est exprimé par des neurones non-glutamatergiques, il est parfois colocalisé avec d’autres
transporteurs au niveau des terminaisons et parfois adressé de manière différentielle.
DISCUSSION GENERALE
Au niveau protéique, VGLUT3 colocalise avec de nombreux marqueurs de systèmes de
transmission non glutamatergiques. On trouve en effet la protéine VGLUT3 dans :
- les terminaisons cholinergiques du striatum (Fremeau et coll., 2002; Gras et coll., 2002;
Schafer et coll., 2002) ;
- les terminaisons sérotoninergiques du cortex (Schafer et coll., 2002; Hioki et coll., 2004)
certaines terminaisons (sérotoninergiques et non-sérotoninergiques) de neurones du raphé en
culture (Fremeau et coll., 2002; Schafer et coll., 2002) ;
- certains corps cellulaires d’interneurones GABAergiques de l’hippocampe (stratum radiatum)
(Fremeau et coll., 2002) et du neocortex (Hioki et coll., 2004) ;
- certaines terminaisons GABAergiques de l’hippocampe (couche pyramidale) (Fremeau et
coll., 2002; Boulland et coll., 2004; Herzog et coll., 2004a) et du neocortex (Hioki et coll.,
2004). Celles-ci contiennent généralement la cholécystokinine et la pré-protachikinine B
(Boulland et coll., 2004; Hioki et coll., 2004) ;
- certaines terminaisons monoaminergiques de l’hippocampe (Boulland et coll., 2004).
La Figure n°14 récapitule de manière schématique les données sur la présence de VGLUT3
dans des neurones non-glutamatergiques. Dans certains cas, VGLUT3 et l’autre transporteur
vésiculaire semblent adressés de manière différentielle à des terminaisons distinctes, alors que
dans d’autres cas, une colocalisation des deux marqueurs est observée au sein des mêmes
terminaisons. Ainsi, le raphé semble envoyer des projections mixtes glutamatergiques et
sérotoninergiques vers le cortex (Hioki et coll., 2004) alors que VGLUT3 et VMAT2 semblent
ségrégés au niveau des terminaisons de la substance noire ou de l’aire tegmentale ventrale
(résultats non montrés).
Il reste cependant à déterminer si, au sein des terminaisons qui co-expiment VGLUT3 et un
autre transporteur vésiculaire, les deux transporteurs sont portés par les mêmes vésicules. Il
faudra
également
apporter la
preuve
physiologique
d’une
co-libération
des
deux
neuromédiateurs par une seule vésicule.
2) Spécificité des outils utilisés pour les techniques d’anatomie
En ce qui concerne le profil d’expression de VGLUT3 au niveau de l’ARN messager et la
répartition de la protéine VGLUT3 un certain nombre de données ont été rapportées qui restent
conflictuelles.
En hybridation in situ, l’étude de Fremeau et coll. montre une expression abondante de l’ARN
messager codant VGLUT3 dans l’amygdale, l’hypothalamus et la substance noire (Fremeau et
coll., 2002) qui n’a pas été confirmée par les autres études (Gras et coll., 2002; Schafer et coll.,
131
DISCUSSION GENERALE
2002). Il faut noter que la sonde ribonucléique utilisée couvre la totalité de la séquence codante
VGLUT3 et présente donc une importante homologie avec VGLUT1 et –2, qui sont d’ailleurs
exprimés beacoup plus fortement dans le cerveau. Au contraire, les sondes utilisées pour nos
études (Gras et coll., 2002; Herzog et coll., 2004a; Gras et coll., 2005) et celle de Schafer et
coll. (Schafer et coll., 2002) correspondent aux séquences en 3’ de l’ADN complémentaire de
VGLUT3 qui sont assez divergentes entre les sous-types et donc plus spécifiques. De plus, nous
avons obtenus des résultats similaires par hybridation in situ froide avec cette ribosonde et par
hybridation in situ radioactive utilisant différents oligonucléotides (Gras et coll., 2002).
Au niveau protéique également, plusieurs arguments laissent supposer un manque de spécificité
de l’anticorps utilisé dans le travaux de Fremeau et coll. (Fremeau et coll., 2002; Boulland et
coll., 2004; Harkany et coll., 2004). En effet ces auteurs ne montrent aucune donnée sur la
spécificité de leur anticorps pour VGLUT3 par rapport aux autres sous-types (sur des cellules
transfectées par exemple), ni aucune image globale de la répartition de VGLUT3 dans le
cerveau. Dans un article récent, ils ont développé un nouvel antisérum pour justifier de la
spécificité du marquage observé, mais en utilisant le même antigène que précédemment
(Boulland et coll., 2004). Au contraire, nous avons développé des antisérums contre des
peptides situés dans la partie N-terminale ou dans la partie C-terminale de la protéine, ainsi que
des antisérums dirigés contre des protéines de fusion C-terminales, avec des résultats
comparables. Il sera intéressant de voir si le marquage observé par Fremeau et coll. dans le
cervelet, dans les cellules gliales ou dans les dendrites de cellules pyramidales du cortex persiste
chez des souris invalidées pour VGLUT3. En attendant une telle confirmation de la spécificité
des anticorps utilisés, certains des résultats sont donc à prendre avec précaution.
3) Expression ectopique de VGLUT3
Alors que les protéines VGLUT1 et VGLUT2 ne sont présentes que dans les terminaisons
nerveuses, VGLUT3 a été décrite par différentes équipes dans les corps cellulaires et les
dendrites proximaux de certains neurones (Fremeau et coll., 2002; Herzog et coll., 2004a).
Il existe trois possibilités, non-exclusives, pour expliquer cette importante immunoréactivité. La
première possibilité est que ce transporteur ait une vitesse de renouvellement très lente et que,
après synthèse de la protéine dans les corps cellulaires, celle-ci soit acheminée vers les
terminaisons nerveuses beaucoup plus lentement que les deux autres sous-types. Selon la
deuxième explication, formulée par T. Harkany, cette localisation atypique de VGLUT3 lui
permettrait de jouer un rôle dans le libération rétrograde de glutamate par ces cellules (Harkany
et coll., 2004). VGLUT3 serait localisé sur les dendrites de cellules pyramidales de la couche
II/III du cortex et permettrait la libération de glutamate par exocytose au niveau de ces
132
DISCUSSION GENERALE
dendrites, assurant ainsi une signalisation rétrograde sur des interneurones inhibiteurs.
Cependant, ces résultats sont à prendre avec précaution car seuls les travaux réalisés avec
l’anticorps de R. Edwards permettent de détecter la protéine VGLUT3 au niveau des corps
cellulaires et dendrites de cellules pyramidales du cortex. Ce marquage est moins intense que le
marquage observé dans certains interneurones inhibiteurs qui, lui, a été confirmé par d’autres
études. D’autre part, si les données présentées dans cette étude montrent l’implication de
transport vésiculaire de glutamate (le phénomène observé est inhibé par de fortes concentrations
en ions chlorure et par le bleu Evans, deux conditions connues pour inhiber les VGLUTs),
l’implication de VGLUT1 ou de VGLUT2 ne peut pas être exclue.
Une troisième explication de la localisation de VGLUT3 au niveau des corps cellulaires et
dendrites est que VGLUT3 ait un rôle propre indépendant de la libération de glutamate. Il
pourrait s’agir d’un rôle métabolique (stockage de glutamate à des fins métaboliques) ou d’un
rôle protecteur, en retirant le glutamate du cytoplasme. Ce type de fonction a déjà été proposé
pour le transporteur vésiculaire des monoamines VMAT2, qui appartient à une superfamille de
transporteurs appelée TEXAN (pour Toxin EXtruding Antiporter). En effet, une trop forte
concentration de monoamines dans le cytoplasme peut entraîner des effets délétères pour la
cellule par oxydation des monoamines et production de radicaux libres. Le transporteur
VMAT2, en concentrant les monoamines environ 104 à 105 fois à l’intérieur des vésicules
permet de les accumuler dans un compartiment où cette oxydation n’a plus lieu. Le gène
VMAT1, un homologue de VMAT2 exprimé préférentiellement dans les tissus périphériques, a
d’ailleurs été isolé comme gène de résistance au MPP+, une neurotoxine qui agit en provoquant
un stress oxydatif. Cependant, l’analogie avec VMAT2 a ses limites, car le glutamate est
toxique lorsqu’il est dans le milieu extracellulaire alors que des concentrations cytoplasmiques
de l’ordre de 1 à 10 mM sont tolérées par la cellule. De plus, les VGLUTs ne permettent
d’établir un gradient que d’environ 10 fois entre l’intérieur de la vésicule et le cytoplasme.
4) Expression transitoire de VGLUT3 dans les cellules de Purkinje et le
système auditif
En plus de son profil d’expression atypique chez l’adulte, VGLUT3 présente un profil
développemental surprenant puisque l’ARN et la protéine sont détectés transitoirement dans des
territoires dont ils sont absents à l’âge adulte.
Nos résultats sur l’expression transitoire de VGLUT3 dans le cervelet et dans le système auditif
sont en accord avec d’autres données de la littérature. En effet, Schafer et coll. observent par
Northern blot une expression plus importante de l’ARN messager codant VGLUT3 à P7
133
DISCUSSION GENERALE
(Schafer et coll., 2002). Boulland et coll. observent également un pic de la protéine VGLUT3
vers P7 sur des extraits protéiques du cervelet analysés par Western blot.
Blaesse et coll. montrent que VGLUT3 est exprimé transitoirement dans plusieurs noyaux du
complexe
supra-olivaire.
La
présence
de
VGLUT3
dans
la
projection
GABAergique/glycinergique allant du noyau médian du corps trapézoïde (MNTB) au noyau de
l’olive latérale supérieure (LSO) a également été décrite par Gillespie et coll., qui apportent la
preuve de la fonctionnalité de VGLUT3 dans ces terminaisons puisqu’ils mesurent des réponses
mixtes GABA/glycine/glutamate dans les cellules cibles (Gillespie et coll., 2005). Comme je
vais le détailler ci-dessous, cette étude fournit la première preuve électrophysiologique que la
présence de VGLUT3 permet effectivement la libération de glutamate.
Quel peut être le rôle de cette expression transitoire d’un transporteur vésiculaire du glutamate
dans
des
synapses
GABAergiques
ou
GABAergiques/glycinergiques
au
cours
du
développement post-natal ? Une caractéristique commune aux deux systèmes mis en jeu est
qu’ils sont soumis à des maturations synaptiques au cours du développement postnatal.
Le complexe olivaire supérieur est constitué d’un ensemble de noyaux du tronc cérébral
impliqué dans le traitement de l’information auditive (voir Figure n°15-A). L’organisation
tonotopique des connections permet la localisation des sons grâce au décalage entre les
afférences provenant des deux oreilles par l’intermédiaire des noyaux cochléaires. Ces
connections entre les différents noyaux subissent des maturations synaptiques
pendant le
développement postnatal. Ainsi, les corps cellulaires des neurones du MNTB envoient des
projections sur le LSO qui sont d’abord mixtes GABAergiques/glycinergiques puis
glycinergiques à partir de P14-P21. Gillespie et coll. ont montré qu’en plus de la composante
GABAergique, ces synapses avaient une composante glutamatergique entre P1 et P12.
L’analyse par immunofluorescence de ces neurones a révélé que VGLUT3 était exprimé dans
les corps cellulaires des neurones du MNTB ainsi que dans leurs terminaisons au niveau du
LSO. La présence de VGLUT3 à cette synapse correspond à la période de maturation où les
connections entre le MNTB et le LSO sont soit éliminées, soit renforcées, permettant ainsi un
raffinement du cricuit auditif (Kandler, 2004).
L’autre expression transitoire que nous avons détecté est celle de VGLUT3 dans les cellules de
Purkinje. Les cellules de Purkinje sont des cellules GABAergiques qui représentent la seule
voie de sortie du cortex cérébelleux. Elles intègrent les informations provenant des cellules
granulaires (fibres parallèles VGLUT1-positives) et des cellules de l’olive inférieure (fibres
grimpantes VGLUT2-positives, voir Figure N°15-B). Nos travaux montrent que la protéine
VGLUT3 est présente à la fois au niveau des corps cellulaires, des terminaisons des collatérales
134
A
Ipsilateral side
Contralateral side
(Glycine/GABA/glutamate
during development)
B
(during development)
VGluT3
Figure n°15: Représentation schématique des voies dans lesquelles VGLUT3 est exprimé transitoirement au
cours du développement post-natal.
A, le complexe olivaire supérieur et plus particulièrement la projection du noyau médian du corps trapézoïde (MNTB)
vers le noyau de l’olive latérale supérieure (LSO), est responsable de la localisation des sons. Cette projection est
glycinergique chez l’adulte mais comporte également des composantes GABAergiques et glutamatergiques au cours de
la maturation du réseau. B, Les cellules de Purkinje du cervelet reçoivent une innervation glutamatergique provenant
des cellules granulaires (VGLUT1-positive) et de l’olive inférieure (VGLUT2-positive). Au cours du développement
post-natal, elles expriment VGLUT3 en plus de VIAAT.
Sources: Zigmond et coll., 1999 (A) et Hioki et coll., 2003 (B).
DISCUSSION GENERALE
récurrentes qui entourent les corps cellulaires et des terminaisons dans les noyaux profonds du
cervelet. Ces résultats suggèrent que les cellules de Purkinje pourraient libérer du glutamate en
plus du GABA au cours du développement post-natal. Une telle libération de glutamate au
niveau des corps cellulaires ou des dendrites est possible puisque des études sur la synapse entre
les fibres parallèles et les cellules de Purkinje suggèrent une libération rétrograde de glutamate
qui provoquerait une dépression de ces synapses (Levenes et coll., 2001). Il est intéressant de
noter que les connections entre fibres parallèles et cellules de Purkinje font l’objet d’un
important remodelage post-natal (Sotelo, 2004).
Ainsi, l’expression transitoire de VGLUT3 dans ces circuits pourrait avoir un rôle dans
l’élimination de synapses et la maturation des réseaux. Il serait intéressant d’examiner la
connectivité et la fonctionnalité de ces circuits chez des souris adultes invalidées pour le gène
VGLUT3, afin de mesurer les conséquences de l’absence de cette expression passagère.
136
PERSPECTIVES
PERSPECTIVES
Au cours de mon doctorat, j’ai contribué à démontrer que les transporteurs vésiculaires du
glutamate étaient soumis à de nombreuses régulations, aussi bien transcriptionnelles que
fonctionnelles.
Dans la partie I, nous avons vu que le profil d’expression de VGLUT3 dans le cerveau de rat
adulte est très différent de celui de VGLUT1 et –2. En effet, ce transporteur est présent dans des
neurones non-glutamatergiques tels que les neurones sérotoninergiques du raphé, les neurones
cholinergiques du striatum et certains interneurones GABAergiques du cortex et de
l’hippocampe. De plus, la protéine VGLUT3 est présente non seulement dans les terminaisons
nerveuses, comme VGLUT1 et –2, mais aussi dans certains corps cellulaires et dendrites.
Dans la partie II, nous avons mis en évidence une régulation de l’expression des VGLUTs au
cours du développement post-natal, avec une expression transitoire de VGLUT2 dans des
territoires qui exprimeront VGLUT1 à l’âge adulte, et une expression transitoire de VGLUT3
dans les cellules de Purkinje du cervelet.
Dans la partie III, nous découvrons que VGLUT1, mais pas VGLUT2, est capable d’interagir
avec l’endophiline et ainsi pourrait être impliqué dans la biogenèse des vésicules synaptiques ou
leur recyclage dans les terminaisons VGLUT1-positives. Cette hypothèse est renforcée par les
altérations morphologiques observées dans les terminaisons nerveuses de souris invalidées pour
VGLUT1. Cependant le rôle de l’interaction entre VGLUT1 et l’endophiline n’est pas encore
totalement élucidé.
Malgré le grand nombre de données accumulées sur les VGLUTs depuis leur identification
moléculaire en 2000, de nombreuses questions restent sans réponse définitive. Ainsi, la possible
différence physiologique entre VGLUT1 et VGLUT2, sous-types majoritaires, n’est pas encore
clairement établie. De même, le rôle exact de VGLUT3 dans des neurones nonglutamatergiques n’est pas encore démontré. D’autres questions encore n’ont pas été abordées
ici et je ne ferai que les évoquer très brièvement en guise de perspectives pour les études à venir.
VGLUT1, -2 ET –3 : DES TRANSPORTEURS DE PHOSPHATE
INORGANIQUE ?
Il ne faut pas oublier que les transporteurs vésiculaires du glutamate appartiennent à la famille
des transporteurs de phosphate inorganique de type I (Werner et coll., 1998). A ce titre, ils
pourraient catalyser l’entrée de phosphate inorganique dans la cellule en échange d’ions Na+.
137
PERSPECTIVES
Pourtant ce type de fonction exigerait que les VGLUTs soient présents à la membrane
plasmique, ce qui est en opposition avec ce qui a été montré jusqu’ici. En effet, toutes les études
de microscopie électronique, comme les études de fractionnement cellulaire, montrent que
VGLUT1, -2 et -3 sont des protéines associées aux vésicules synaptiques. Pourtant, rien ne
permet d’exclure qu’un certain pourcentage des protéines VGLUTs d’une cellule, non
détectable par rapport à la fraction majoritaire vésiculaire ou recruté seulement dans des
conditions physiologiques particulières, soit présent à la membrane plasmique à un moment
donné et assure un rôle propre. Ce type d’observation a déjà été faite en ce qui concerne le
transporteur à haute affinité de la choline, CHT1, qui est majoritairement présent sous forme de
réserve sur un compartiment vésiculaire, mais dont la fonction de recapture de choline est
assurée à la membrane plasmique (Ferguson et coll., 2003). Il est donc possible que les
VGLUTs fassent également l’objet de régulations quant à leur localisation subcellulaire au sein
d’un neurone. Il serait intéressant de comprendre quels sont les signaux permettant l’adressage
préférentiel des VGLUTs vers les vésicules, en comparaison avec d’autres membres de la
famille NaPi qui sont principalement exprimés à la membrane plasmique.
EXPLORATION DE VGLUT1, 2 ET 3 DANS DIFFERENTES
PATHOLOGIES
Une meilleure compréhension des implications fonctionnelles et des régulations des différents
transporteurs vésiculaires du glutamate devrait permettre, à terme, de développer de nouveaux
outils pour l’étude du glutamate et de ses dysfonctionnements dans le SNC.
Les VGLUTs pourraient représenter des cibles pharmacologiques intéressantes permettant de
moduler certains systèmes glutamatergiques de manière spécifique. En effet, nous avons évoqué
le fait que le glutamate était une molécule excitotoxique, impliquée dans des phénomènes de
dégénérescence cellulaire dans différentes pathologies neurologiques comme la sclérose latérale
amyotrophique, les ischémies et les épilepsies. Il est également impliqué dans des pathologies
psychiatriques telles que les schizophrénies, la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.
Il serait intéressant de chercher à comprendre l’implication de chacun des sous-types dans ces
différentes pathologies pour ensuite développer de nouveaux agents pharmacologiques
spécifiques.
De manière intéressante, l’expression de VGLUT1, mais pas celle de VGLUT2, est augmentée
par des traitements par différentes classes d’antidépresseurs (Moutsimilli et coll., 2005; Tordera
et coll., 2005). Au contraire, aucune modification de l’ARN messager ou de la protéine
VGLUT1 n’a été observée après un traitement par d’autres classes de psychotropes tels que les
138
PERSPECTIVES
neuroleptiques. La spécificité de l’effet observé suggère que les VGLUTs sont impliqués dans
des voies différentes et qu’il existe des régulations propres à chacun des sous-types. Cela ouvre
la possibilité de mieux disséquer les dysfonctionnment de la transmission glutamatergique dans
certaines pathologies, avec pour espoir de cibler certaines voies glutamatergiques de manière
spécifique pour le traitement de maladies neurologiques ou psychiatriques.
L’implication des VGLUTs est également à chercher dans les glioses. En effet, les VGLUTs ont
été décrits comme responsables de la libération de glutamate par des astrocytes en culture. Or,
ceux-ci présentent des caractéristiques similaires aux astrocytes réactifs et pourraient représenter
de bonc indicateurs de ce qui se passe in vivo après des lésions cérébrales.
A plus court terme, il me semble qu’il serait primordial d’étudier plus en détail le rôle
physiologique de chaque VGLUT à l’aide d’approches intégrées, telles que le développement de
souris knock-out ou knock-in, où l’un des sous-types serait exprimé à la place d’un autre. Ainsi,
nous pourrions savoir dans quelle mesure les différents sous-types peuvent se substituer les uns
les autres, et quelles sont les spécificités de VGLUT1, -2 et –3.
139
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