04 10 2016 10h15 11h15 virologie pr goffard b4 b3

2016-2017 Méthodes de diagnostic utilisées en virologie
Méthodes de diagnostic utilisées en virologie
– UE VII : Virologie infectiologie –
Poly du cours distribué en amphi (dispo sur moodle)
Semaine : n°5 (du 01/10/2016 au
05/10/2016)
Date : 04/10/2016
Heure : de 10h15 à
11h15 Professeur : Anne Goffard
Binôme : n°04 Correcteur : n°03
Remarques du professeur (Diapos disponibles, Exercices sur le campus, Conseils, parties importantes
à retenir, etc.)
→ La mise à jour du cours avec le bon schéma arrive sur moodle prochainement
•Les schémas des techniques tombent à l'examen
PLAN DU COURS
I) Introduction
II) Diagnostic indirect
A) Elisa
B) Western Blot
III) Diagnostic direct
A) Isolement viral en culture cellulaire
1) Principe
2) Intérêts et limites de l'isolement viral.
B) Recherche d'Ag viraux par méthodes immunologiques
1) Immunofluorescence
2) ELISA
C) Recherche des génomes viraux
IV) Prélèvements biologiques à visée diagnostique en virologie
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I) Introduction
En virologie, on utilise des méthodes de laboratoires que l'on connait déjà : ELISA, immunofluorescence, PCR.
On décide si on veut faire un diagnostic direct ou indirect.
Diagnostic direct : on met en évidence le virus lui même ou un de ses constituants (Ag viral, protéines virales,
génome viral de type ADN ou ARN).
Diagnostic indirect : on recherche les anticorps contre les constituants d'un virus, on recherche la réaction
immunologique qui s'est produite en réaction à une infection. Ce sont des techniques de sérologie.
→ On recherche alors les Ac synthétisés par le patient en réaction d'une infection virale.
II) Diagnostic indirect
On cherche à mettre en évidence dans un échantillon biologique des anticorps dirigé contre un virus.
Pour cela, on utilise :
–ELISA
–Western Blot.
Au cours d'une infection, on synthétise des Ac. Les plus précoces sont les IgM. Quand les IgM sont présents chez
le patient, c'est que l'infection est en cours. On parle d'infection aiguë.
Plus tard au cours de l'infection, on voit apparaître des IgG.
En virologie, on ne s'intéresse pas aux IgA.
(Cf cours immuno : différence de structure entre IgM et IgG.)
→ Les IgM sont les marqueurs d'une infection récente, précoce, aiguë.
→ Les IgG sont les marqueur d'une infection ancienne, guérie ou non.
Il faut connaître tous les schémas des techniques, elle peut demander ça à l'examen !!!
A) ELISA permettant la recherche d'Anticorps
(Attention !! il y a une erreur de schéma dans le poly : le schéma dans la partie ELISA n'est pas le bon.)
On a des microplaques (vendues par les sociétés commerciales) destinées au diagnostic.
Sur les plaques, sont fixés des Ag viraux. On y dépose le sérum du patient. Les Ac présents dans le sérum du
patient vont se fixer sur les Ag. Après incubation, on lave. On va révéler le complexe Ag-Ac qui s'est formé au
fond de la plaque grâce à une Immunoglobuline marquée avec un marqueur colorimétrique dirigée contre les Ig
humaines. On ajoute le substrat de l'enzyme qui donne une réaction colorée et on mesure la densité optique dans
le puit. Cela nous permettra de savoir s'il y a des Ac.
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Intérêts de l'ELISA :
–Totalement automatisé :
–Moins de risques d'erreur.
–Plus rapide : traite un grand nombre d'échantillons
–Rapide
–Peu couteux
Le coût d'une analyse de sérologie coûte 0,017€ au CHU de Lille, grâce à l'automatisation.
Remarque : On a différents automates capables de réaliser les ELISA : par recherche unitaire, en microplaques, par
séries...
B) Western Blot : recherche d'Anticorps
On a vu la méthode en Biologie cellulaire en 2A pour mettre en évidence des protéines mais ici on ne l'utilise pas
de la même façon. Le Western Blot pour faire le diagnostic du HIV n'est pas une technique de biologie
moléculaire.
On l'utilise pour mettre en évidence des Anticorps.
Cela est fait dans les industries pharmaceutiques. Ils cultivent des souches virales du HIV. Ils homogénéisent,
inactivent et séparent les protéines virales. Ils ont donc une préparation dans laquelle il y a les protéines virales en
suspension.
Ils vont déposer la préparation dans des puits en haut du gel de polyacrylamide et on fait migrer avec un gradient
électrique. Les protéines virales se séparent en fonction de leur taille : les plus grandes seront en haut et les plus
petites en bas. Ils transfèrent le tout sur une membrane de nitrocellulose et ils refont passer un courant électrique.
On a donc les plus grosses protéines en haut, les plus petites en bas.
→ On obtient des bandelettes de nitrocellulose avec sur chaque colonne des protéines fixées, séparées en fonction
de leur taille.
Le laboratoire de virologie achète les bandelettes faites. On dépose le sérum du patient suspect d'une infection au
HIV sur la bandelette, on incube, on lave. On révèle en utilisant un Ac monoclonal anti Ig humaine marquée avec
une enzyme. On voit apparaître des bandes colorées.
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Exemple d'un patient suspect d'une infection par le HIV.
Sérum 1 :
Il y a une bande de contrôle pour affirmer qu'on a mis du sérum sur la bandelette. On a une seule bande qui
apparaît : dans le sérum du patient il y a des Ac dirigés contre la protéine p24 (marqueur d'une primo infection par
le HIV)
Sérum 2 : (3 semaines après)
Bande de contrôle toujours présente. On remarque que la bande correspondant à la réaction contre la protéine p24
est plus forte en intensité. On voit apparaître des Ac dirigés contre une autres protéine : la gp160.
Cela montre que pendant les 3 semaines entre cette bandelette et la précédente, le patient était bien infecté par le
HIV : il a synthétisé des Ac dirigés contre les protéines virales.
Sérum 3 : (3 mois après)
Marque de contrôle positive. Le patient présente des Ac dirigés contre toutes les protéines virales.
On utilise peu le Western Blot en virologie. La seule application est la confirmation du dépistage de HIV.
Intérêts et applications :
–technique de confirmation
–moins sensible que l'ELISA
–permet de caractériser les Ac
–en partie automatisée
–peu couteuse
Ce qu'on doit savoir faire :
•Décrire le principe de l'ELISA pour la recherche d'Ac
•Expliquer les applications de l'ELISA pour la recherche d'Ac
•Décrire le principe du Western Blot et présenter une application
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III) Diagnostic direct
On cherche à mettre en évidence soit le virus lui-même dans un échantillon biologique soit un de ses constituants
(protéines virales ou antigènes, génomes viraux)
Il n'y a jamais de microscopie électronique en virologie : on utilise l'isolement viral en culture cellulaire, la
détection d'Ag par des méthodes immunologiques (ELISA et immunofluorescence), l'étude du génome viral par
biologie moléculaire.
A) Isolement viral en culture cellulaire
On tente à partir d'un échantillon in vitro de reproduire la réplication virale. Si on multiplie un virus in vitro, ça
veut dire qu'il était entier dans l'échantillon.
Le but est de savoir si dans un échantillon donné, il y a un virus infectieux. J'ai à ma disposition l'isolement viral
en culture cellulaire : j'ai des cellules sur lequel je peux déposer le virus et voir si il se réplique.
C'est une technique longue et couteuse, qui disparaît peu à peu mais ça reste pour l'instant la technique de
référence.
1) Principe
Est ce que le patient présentant les signes cliniques est infecté par un virus ?
On essaye de démontrer que dans l'échantillon biologique, on a un virus infectieux qui se réplique. Or, tous les
virus ne se multiplient pas dans n'importe quelle cellule. Il n'existe pas un type cellulaire sur lequel tous les virus
se répliquent. On a donc pleins de systèmes cellulaires différents.
On utilise principalement des cellules adhérentes (= cellules adhérant à un support)
On a des milieux de culture dans lequel on ajoute des AA, du sérum de veau, des antibiotiques et des
antifongiques.
On a des étuves à 37°C sous 5% de CO2, pour que le virus reste en vie et puisse se multiplier.
Le plus souvent, on utilise des cellules humaines d'origine tumorale.
Par exemple : Hep2 (cellules de carcinome de larynx) et HeLa (cellules de
carcinome de col utérin). Les cellules adhérentes forment un tapis
cellulaire.
On a des échantillons de patient dans lequel on recherche un virus
infectieux. On dépose sur le tapis cellulaire quelques gouttes du
prélèvement biologique que l'on a reçu. Ca peut être n'importe quoi :
salive, liquide amniotique, sang, sérum, plasma, LCR, crachat, sécrétion
oeso-pharyngée...
Cela se fait dans des laboratoires spécifiques avec un niveau de sécurité
L2. Les techniciens de laboratoires sont qualifiés : ils mettent l'échantillon
sur les cellules et on incube.
Certains virus donnent un effet cytopathogène.
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