Amplification et séquençage

8. Amplification et séquençage des
acides nucléiques
ADN chromosomique, plasmides
(ADN bactérien), ARN messager
Rupture cellulaire
Isolation et purification
des acides nucléiques
Concentration et amplification et
séquençage de l’ADN ou de
l’ARN isolé
301
8.1 Extraction et isolation de l’ADN
(D’après genetics.nbii.gov/ basic2.html)
302
Extraction et isolation de l’ADN
Échantillon de cellules ou de tissus
Traitement avec une solution hypotonique
ou avec des détergents (Triton X-100 et SDS)
Rupture cellulaire et
dissociation des
complexes ADN-protéine
Incubation séquentiel avec un enzyme
protéolytique (protéinase K) et la ribonucléase
Élimination de protéines
et d’ARN
Extraction de l’ADN dans de l’éthanol
Seules les longues chaînes
d’ADN précipitent dans l’EtOH;
les nucléotides simples et les
produits de la digestion de l’ARN
restent dans la phase aqueuse.
303
Centrifugation par gradient de densité:
™ Une méthode alternative pour l’isolation de
l’ADN est la séparation de protéines, ARN
et ADN selon des différences dans leurs
densités flottantes ou poussées.
™ Une telle séparation est effectuée en
centrifugeant à haute vitesse l’échantillon
brut dans une éprouvette contenant un
gradient de densité formé (ex. 1.6 à 1.8
g/mL) par une solution de CsCl.
™ Lors de la centrifugation, les
macromolécules (protéines, ADN, ARN)
présentent dans la solution de CsCl forment
des bandes distinctes selon leurs densités
flottantes.
(D’après D. Holme et H. Peck,
Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
304
™ L’ADN chromosomique peut être séparé des plasmides par centrifugation par
gradient de densité en présence du bromure d’éthidium (EtBr).
(D’après D. Holme et H. Peck,
Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
™ L’EtBr est un fluorophore qui se lie entre deux brins d’ADN. En se liant à
l’ADN, l’EtBr diminue la densité flottante de celle-ci, dû à un déroulement
partiel de la double hélice.
™ Il y a plus d’EtBr qui se lie à l’ADN chromosomique (ADN linéaire) qu’aux
plasmides (ADN circulaire).
™ La densité de l’ADN chromosomique est diminuée par 0.125 g/mL, tandis que
que celle des plasmides est diminuée par 0.085 g/mL.
305
8.2 Isolation de l’ARN
™
™
L’isolation de l’ARN n’est pas aussi simple que celle de l’ADN:
™
Les échantillons sont facilement contaminés par de la
ribonucléase (omniprésente) qui cause la fragmentation de l’ARN.
Des d’inhibiteurs sont ajoutés pour empêcher l’activité endogène
de la ribonucléase et l’activité exogène est minimisée par
l’utilisation de verrerie stérile et de produits chimiques de haute
pureté.
™
L’ARN est fortement associé à des protéines (polysomes). Des
traitements agressifs sont nécessaires pour libérer l’ARN.
Deux méthodes communément employées pour l’isolation de
l’ARN sont la méthode de la protéinase K (enzyme
protéolytique qui cause la dissociation des complexes ARNprotéine et la digestion des protéines) et le traitement au
thiocyanate de guanidine.
306
Méthode de la protéinase K
Échantillon de cellules
Rupture cellulaire; le noyau
demeure intacte
Traitement avec une solution hypotonique
Centrifugation
Élimination du débris et noyau
cellulaire; l’ARN cytoplasmique
demeure dans le surnageant
Traitement du surnageant
avec la protéinase K
Extraction avec du phénol/chloroforme
Extraction avec de l’éthanol
Dissociation des complexes ARNprotéine et la digestion des protéines
Élimination des produits de
la digestion enzymatique
Précipitation de l’ARN dans
307
la phase aqueuse avec de l’EtOH
Traitement au thiocyanate de guanidine
Échantillon de cellules
Traitement avec du thiocyanate de guanidine
et du 2-mercaptoéthanol
Centrifugation du surnageant sur du CsCl
(5.7 mol/L) à 100 000 g pendant 18 h
Rupture cellulaire et
dénaturation de la
ribonucléase
Isolation de l’ARN au
fond du tube
La pelote d’ARN est dissout dans du tampon
L’ARN est concentré par précipitation dans de l’éthanol froid
Séparation et purification de l’ARNm par chromatographie par affinité
(oligo-dT-cellulose ou poly(U)-sépharose)
308
8.3 L’amplification des acides nucléiques par
réaction de polymérisation en chaîne
™ La quantité d’ADN dans un échantillon est souvent insuffisante pour
le séquençage et l’analyse.
™ L’amplification en chaîne par polymérase (ACP) est un procédé
d'amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN
(Kary Mullis, Prix Nobel 1993).
™ Une seule molécule d’ADN suffit pour l’ACP. Avec l’ACP, plusieurs
tâches qui avant étaient impossible sont maintenant devenues de
routine (ex. identification d’un coupable avec un seul cheveu ou
spermatozoïde et l’identification rapide de maladies infectieuses).
™ Principes de l’ACP
™ ACP en temps réel (mesure semi-quantitative des produits de l’ACP
durant la réaction)
™ Transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire
309
8.3.1 Principes de l’ACP
™ La réaction d’amplification est effectuée dans un seule éprouvette
qui est placée dans un thermocycleur.
™ L’éprouvette contient:
(1) l’échantillon d’ADN à amplifier
(2) un excès de 2 amorces, i.e. des oligonucléotides, constitués de
10 à 30 bases, ayant des séquences complémentaires aux bouts
de l’ADN cible
(3) un excès des 4 acides désoxyribonucléiques (dATP, dCTP,
dGTP et dTTP)
(4) l’ADN polymérase, une enzyme qui synthétise, à partir des
amorces, le brin complémentaire de celui qui sert de matrice
(5) un tampon qui maintient le pH à une valeur constante et fournit
les ions Mg2+ qui sont nécessaires à la réaction
310
La réaction d’amplification est constituée de 3 étapes principales:
Étape 1- dénaturation de l'ADN
(séparation des deux brins de la
double hélice) à température
élevée (94-95°C).
Étape 2- positionnement des amorces
en face de leurs séquences
complémentaires, sur les brins
d'ADN, et fixation sur ces cibles
(hybridation).
5’
Étape 3- phase d'extension dans
laquelle l'ADN polymérase
synthétise, à partir des amorces,
le brin complémentaire de celui
qui sert de matrice.
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
311
312
™ Les 3 étapes, dénaturation de l’ADN, hybridation des amorces et extension
des amorces, constituent un cycle. L’ACP comporte généralement 20 à 35
cycles successifs d'amplification.
™ Le chauffage et refroidissement répétitif du mélange réactionnel est
communément appelé cycle thermique.
™ Chaque étape dure 30 à 120 s. Seule la 1ère étape de dénaturation dure
5 min. Une ACP de 30 cycles peut être donc complétée dans 1 à 2 hres.
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
313
™ En théorie, le nombre de copies d’ADN est doublé dans chaque cycle.
Le nombre théorique de molécules d’ADN (double brins), Nm, à la fin de la
réaction dépend du nombre initial de molécules d’ADN (double brins), No,
dans le mélange réactionnel et du nombre de cycles, n:
N m = No ⋅ 2n
™ Ce nombre théorique n’est jamais atteint dus à des facteurs limitants, tels
que l’épuisement des réactifs et l’amplification de chaînes plus longues
durant les premiers cycles.
™ En pratique, le nombre de molécules d’ADN peut être estimé selon
l’équation:
Nm = No ⋅ (1 + x )n
où x est l’efficacité de la réaction (valeur de 0 à 1).
314
™ Par exemple, pour une réaction d’amplification de 20 cycles (n=20)
avec une seule molécule d’ADN à double brins (No=1), le nombre
théorique de copies à la fin de la réaction est > 106 (=220).
™ Si on suppose une efficacité de la réaction de 0.7 (x), la réaction est
estimée à produire une amplification d’environ 40 000 (=1.720).
™ L’efficacité et le rendement ne sont pas les seuls indicateurs de la
réaction d’amplification. La spécificité (génération de la séquence
cible uniquement) et fidélité (un nombre négligeable d’erreurs dans
la séquence des chaînes synthétisées) de la réaction sont aussi des
caractéristiques importantes.
315
8.3.2 Vitesse d’amplification
séquence cible
(à amplifier)
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
316
™ La réaction d’amplification atteint éventuellement un plateau, le nombre
de copies n’augmente plus. Ceci est dû à l’épuisement de réactifs (amorces
et nucléotides), à l’inhibition enzymatique par des phosphates libérés
durant la réaction, à la détérioration thermique de l’ADN polymérase et à
l’hybridation des brins plus long d’ADN à des températures élevées au
dépit de l’hybridation de l’ADN à simple brin avec des amorces.
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 317
8.3.3 Réactifs
1. ADN polymérase:
™
La polymérase catalyse la synthèse de brins complémentaires
d’ADN.
™
Des polymérases qui sont résistantes à la chaleur sont utilisées,
telles que la Taq polymérase (Thermus aquaticus),
la Tth polymérase, la Pwo polymérase et la Pfu polymérase.
™
L’enzyme doit être capable de synthétiser des longues séquences
d’ADN (i.e. bonne activité de polymérisation).
™
De plus, les polymérases de type Pwo et Pfu exhibent une activité
exonucléase 5’-3’; des mauvais nucléotides sont reconnus, enlevés
et remplacés par les bons nucléotides. L’activité exonucléase 5’-3’
augmente la fidélité de réplication de l’ADN.
318
2. Amorces:
™ Des amorces sont des courts oligonucléotides, dont les séquences de
nucléotides sont complémentaires aux bouts des régions ciblés de
l’ADN à amplifier.
™ Deux amorces distincts sont utilisés pour l’ACP: un amorce qui
synthétise de gauche à droite et un autre qui synthétise de droite à
gauche.
™ Chaque amorce se lie à un brin de l’ADN original.
amorces
319
™ La synthèse d’ADN procède toujours dans la direction 5’ à 3’. Le 1er
nucléotide à être incorporé réagit avec l’OH-3’ libre de l’amorce.
Le bout 5’ de l’amorce est bloqué.
™ La paire d’amorces doit être
choisie spécifiquement pour
Ol’échantillon d’ADN.
5'
A
O P O CH2 O
™ La longueur des amorces est
H 3' H
Ogénéralement entre 10 et 30
H
H
nucléotides et leur séquence doit
O
H
être complémentaire pour une
5'
T
O P O CH2 O
section unique de l’ADN matrice.
H 3' H
O™Idéalement, chaque amorce
H
H
contient un nombre équivalent de
O
H
nucléotides.
5'
G
O P O CH2
™ Pour éviter la formation de
O
H3' H
O
dimères entre les amorces, il ne
H
H
doit pas y’avoir de complémentarité
O
H
intra- ou intermoléculaire entre les
5'
O P O CH2 O C
amorces.
H 3' H
™ La température de dénaturation
OH
H
des amorces doit être similaire,
OH
H
ainsi qu’être située entre 55°C et
320
80°C.
3. Désoxynucléotides triphosphates:
™ Le mélange réactionnel doit contenir un excès des 4 désoxynucléotides
triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) puisqu’ils sont consommés
durant l’ACP.
O
O
O
Base
-
O P O P O P O
O-
O-
O
OH
H
H
OH
H
H
dNTP
NH2
NH2
N
N
N
Cytosine
O
N
N
N
Adénine
O
O
H3C
NH
N
Thymine
O
N
N
NH
N
NH2
Guanine
™ La concentration de chaque désoxynucléotide doit être égale.
321
4. Tampon:
™ Le pH et la force ionique du tampon est choisi selon la polymérase
utilisée.
™ La force ionique a une influence importante sur la spécificité de l’ACP.
™ Une solution tampon typique possède une force ionique d’environ 50
mM, un pH de 8.3 et contient du Tris-HCl et du KCl ou du NaCl.
™ La solution tampon contient aussi du MgCl2 à une concentration entre
0.5 et 5 mM. Les ions Mg2+ forment un complexe soluble avec l’ADN et
la polymérase.
™ Le rôle des ions Mg2+ est d’amener la polymérase à proximité de l’ADN
et de balancer les charges négatives sur les molécules d’ADN. De plus,
les ions Mg2+ stimule l’activité de la polymérase. La [Mg2+] est liée à la
spécificité et au rendement de la réaction d’amplification. À des
concentrations faibles de Mg2+, l’activité enzymatique de la polymérase
est diminuée. Un excès de Mg2+ résulte en une dénaturation incomplète
de l’ADN puisque la forme double brins de l’ADN est stabilisée par ces
ions. De plus, une [Mg2+] élevée augmente la liaison des amorces aux
mauvais sites, résultant en une perte de spécificité.
322
8.4. L’ACP en temps réel
™ On peut suivre le progrès de la réaction d’amplification en chaîne
par polymérase en utilisant un marqueur fluorescent pour quantifier
les produits formés durant chaque cycle.
™ L’augmentation des produits de la réaction peut être quantifier en
mesurant l’augmentation de l’intensité de fluorescence.
™ Un graphique de l’intensité de fluorescence en fonction du nombre
de cycles d’amplification donne une idée plus précise de la cinétique
qu’une mesure de l’accumulation des produits après un nombre fixe
de cycles.
™ Deux différents types d’essaies peuvent être utilisés pour l’ACP en
temps réel: essaie par liaison d’un colorant et essaie basé sur des
sondes.
323
8.4.1 Essaie par liaison d’un colorant
™ Dans un tel essaie, on utilise un colorant qui fluoresce après liaison à
l’ADN à double brins.
™ Puisque de plus en plus de molécules d’ADN à double brins sont produites
après chaque cycle d’ACP, l’intensité de fluorescence augmente.
™ Les colorants se lient soit entre les bases appariées ou au sillon mineur de
la double hélice d’ADN.
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
324
8.4.2 Essaie basé sur des sondes
™ Cette méthode est basée sur la
dégradation d’une sonde cible par
l’activité exonucléase 5’-3’ de la
polymérase.
™ La sonde est un court oligonucléotide
dont la séquence est complémentaire à
une région de l’ADN cible se trouvant
entre les deux amorces.
™ Un fluorophore est attaché au bout 5’ de
la sonde et l’extincteur est lié au bout 3’.
™ La proximité de l’extincteur réduit la
fluorescence du fluorophore.
™ La sonde est ajoutée au mélange
réactionnel et se lie à l’ADN dénaturé.
Sa fluorescence est éteinte.
™ Durant l’élongation des amorces, le
fluorophore est enlevé de la sonde due
à l’activité exonucléase de la
polymérase. Le fluorophore libéré
fluoresce dans le mélange réactionnel.
™ L’intensité de fluorescence est
directement proportionnel au nombre de
cycles d’amplification (i.e. nombre de
molécules amplifiées).
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
325
8.5 Transcription inverse de l’ARN
5'
3'
ARNm
72°C
5'
3'
amorce
42°C
5'
transcriptase
inverse
3'
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
ARNm
ADN
94°C
ACP de l'ADN
326
8.6 Séquençage des acides nucléiques
™ Puisque la séquence des nucléotides dans une molécule d’ADN ou
d’ARNm détermine sa fonction, le séquençage des acides
nucléiques est une tâche bioanalytique importante.
™ Le développement de méthodes rapides et automatisées pour le
séquençage des acides nucléiques a attiré beaucoup d’intérêt dans
les dix dernières années, surtout dans le contexte du projet du
génome humain.
™ Méthodes de séquençage:
9 microréseaux d’ADN (pour des oligonucléotides courts)
- méthode de Maxam-Gilbert
- méthode de Sanger
327
8.6.1 L’usage d’enzymes de restriction
™ L’ADN extrait des cellules ou des
tissus est souvent trop long pour être
directement séquencé.
™ L’ADN doit avant être coupé en plus
petits fragments de jusqu’à 800 paires
de bases.
™ Les endonucléases de restriction sont
employées.
™ Ces enzymes reconnaissent une
séquence spécifique de 4 à 8 bases
dans une molécule d’ADN à double
brins et coupent les deux brins à un
point spécifique prêt du site de
reconnaissance.
™ Une digestion (ou plusieurs digestions
séquentielles) avec des enzymes de
restriction produit une série de
fragments qui peuvent être dénaturés
et séparés par électrophorèse sur gel.
™ Après séparation, les fragments
d’ADN à simple brin peuvent être
séquencés.
328
Exemple d’enzymes de restriction
(D’après http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RestrictionEnzymes.html)
329
8.6.2 Méthode de Maxam-Gilbert
™ Le séquençage des fragments d’ADN à
simple brin débute avec le marquage
radioactif du bout 5’ avec du phosphore32 (voir figure de droite).
5’
3’
™ Les fragments d’ADN sont ensuite traités
avec un réactif chimique qui coupe l’ADN
à un site spécifique.
™ La réaction chimique est effectuée dans
des conditions de rendement faible pour
que chaque molécule d’ADN est coupé
seulement une fois à un site donné.
™ Les fragments obtenus sont séparés
selon leur taille par SDS-PAGE. La
position des fragments sur le gel est
détecté par autoradiographie.
™ Pour un séquençage complet, un
échantillon d’ADN est généralement
séparé en quatre parties et chaque partie
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,330
est traitée avec un réactif différent.
Bioanalytical Chemistry, 2004)
1. Coupure de la guanine (G):
™ Traitement avec le diméthyl
sulfate (DMS) et la pipéridine.
O
7
8
N 5 6 NH
1
9N
2
4
N
3
NH2
Guanine
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
331
2. Coupure de la guanine (G) et de l’adénine (A):
NH2
7
™ L’adénine est aussi méthylée par le DMS à la position N3.
N
5
1N
3
2
8
9
™ Le traitement avec la pipéridine donne aussi lieu
à la coupure de la base d’adénine.
6
N
4
N
Adénine
™ La vitesse de coupure de l’adénine est un cinquième de celle de la guanine.
™ Par contre, si de l’acide (i.e. acide formique) est ajouté au mélange
réactionnel au lieu du DMS, la guanine et l’adénine sont hydrolysées à des
vitesses comparables.
™ Les positions des adénines dans une chaîne sont établies
en comparant les positions des guanines et des guanines + adénines.
332
3. Coupure de la cytosine (C)
et de la thymine (T):
™ Le traitement des fragments d’ADN
avec de l’hydrazine et de la
pipéridine libère des cytosines et
des thymines.
NH2
O
H3C
N
N
Cytosine
O
NH
N
O
Thymine
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
333
4. Coupure de la cytosine (C):
™ Si la réaction avec l’hydrazine est effectué dans une solution de 1.5
M NaCl, l’ADN est coupé seulement avant une cytosine.
™ Une comparaison des positions des cytosines + thymines et des
cytosines permet de situer les thymines.
™ Les conditions des quatre réactions sont ajustées pour que les
bases sont relâchés en moyenne à une position aléatoire par
molécule d’ADN.
™ La base située à l’extrémité 5’ ne peut pas être identifié puisque le
nucléotide est détruit durant la réaction. De plus, la 2è base est
souvent impossible à résoudre par électrophorèse sur gel.
Les 1ère et 2è bases doivent être identifiées par séquençage du brin
complémentaire.
334
Exemple de séquençage d’un fragment d’ADN par la méthode de Maxam-Gilbert
5’
Électrophorèse
sur gel
3’
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
335
Électrophorèse
sur gel
Radiographie ADN
D’après http://www.chromosome.com/radiograph.html
336
8.6.3 Méthode de Sanger
(méthode didéoxy ou méthode de terminaison de chaîne)
™ La méthode de Sanger est basée sur la synthèse d’un brin complémentaire
de l’ADN en utilisant les oligonucléotides à séquencer comme matrices (tel
que pour l’ACP).
™ Contrairement à l’ACP, la synthèse du brin complémentaire est effectuée
en présence d’un nucléotide de terminaison de chaîne.
™ L’échantillon d’ADN à simple brin est divisé en 4 portions. Chaque portion
est incubée avec de l’ADN polymérase, les quatre désoxyribonucléotides
triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) et une amorce appropriée.
™ Le brin complémentaire synthétisé est marqué en incorporant du 32P, soit
dans l’amorce ou dans un des désoxyribonucléotides triphosphates, ou
marqué avec les fluorophores pour détection par la fluorescence.
™ Dans chacun des 4 mélanges réactionnels,
est ajouté un 2’,3’-didéoxynucléotide
triphosphate (ddNTP) en petite quantité.
O
-
O
O
O P O P O P O
O-
O-
O-
Base
O
H
H
H 3'
H
H
H
ddNTP
337
™ Dès que un ddNTP est incorporé dans la chaîne croissante, la réaction se
termine puisqu’il n’y aura pas de 3’-OH libre pour l’incorporation d’un autre
nucléotide.
™ L’incorporation d’un ddNTP résulte dans une série de chaînes tronquées,
chacune terminée par un analogue didéoxy dans la position de la base
correspondante.
™ Les produits de chacune des 4 réactions sont séparés selon leur taille par
électrophorèse sur gel dans des voies parallèles.
™ La séquence du brin complémentaire d’ADN est déterminée par
autoradiographie. Cette séquence est ensuite utilisée pour identifier la
séquence de l’ADN original.
338
Exemple de séquençage d’un fragment d’ADN par la méthode de Sanger
Électrophorèse
sur gel
(D’après D.J. Holme, H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
339
Exemple de séquençage d’ADN par la méthode de Sanger
marqueurs fluorescents
340
(D’après http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/bcintro/list_of_figures.htm)
Marquage avec 32P versus marquage avec 4 fluorophores
(D’après http://www.steve.gb.com/science/index.html#biochemical_methods)
341
342
(D’après http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAsequencing.html)
343
(D’après http://www.sars.no/facilities/sequencing.php)
344