TP symbiose-poly 2016

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Adaptation des plantes à l'environnement :
UE 30MU19GV
TP SYMBIOSE
INTRODUCTION
Les légumineuses (Fabaceae) sont une famille de plantes Eudicotylédones comprenant
environ 18000 espèces, représentant 15% des surfaces agricoles dans le monde. La majeure
partie de ces plantes présente un grand intérêt agronomique que ce soit pour l’alimentation
humaine de par la qualité de leurs graines (soja, pois-chiche, lentilles, fèves..) ou en tant que
plantes fourragères (trèfle, luzerne…).
L’un des grands avantages des légumineuses réside dans le fait qu’elles soient capables de
fixer l’azote atmosphérique via une interaction symbiotique avec des bactéries du sol de type
rhizobia. Cette symbiose à bénéfice réciproque va permettre aux bactéries de profiter d’un
micro-habitat exceptionnellement favorable ; les légumineuses leur procurant un apport en
substrats carbonés issus de la photosynthèse. En échange, les bactéries vont fixer et réduire
l’azote atmosphérique en ammonium, directement assimilable par les plantes hôtes. Ainsi les
légumineuses en interaction avec leur symbionte n’ont pas besoin d’apport de fertilisants
azotés.
La mise en place de la symbiose rhizobienne peut se diviser en trois grandes étapes :
(1) L’étape pré-symbiotique durant laquelle les deux
organismes se reconnaissent par dialogue moléculaire
via l’émission de molécules chimiques. En effet, lors
d’une carence en azote, les racines de la légumineuse
émettent des substances chimiques de reconnaissance
(flavonoïdes). Ces exsudats attirent la bactérie, qui, en
retour, synthétise et sécrète des facteurs de nodulation
(NFs). Ces facteurs sont différents suivant l'espèce
rhizobienne et ont une structure antigénique spécifique,
reconnue par la plante.
(2) L’infection rhizobienne qui se traduit par la
pénétration des bactéries via des cordons d’infection dans
les tissus hôtes, associée à une initiation des divisions de
cellules corticales de la racine.
(3) L’organogénèse nodulaire conduisant à la
formation d’un nouvel organe (nodosité) dédié à la
fixation d’azote.
Source d’après POPP and OTT, 2011

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L’infection et l’organogénèse nodulaire sont deux événements coordonnés dans l’espace et
dans le temps. En effet l’infection est initiée dans l’épiderme et l’organogénèse dans les tissus
du cortex interne mais les 2 événements doivent être synchronisés pour permettre la libération
des bactéries au bon moment dans la future nodosité.
Les mécanismes moléculaires contrôlant l’interaction symbiotique sont connus et mettent en
jeu différents gènes symbiotiques.
Lors du processus d’infection, les NFs sont perçus au niveau de la membrane plasmique par
les récepteurs LYK3 et NFP, de la
famille des LysM-RLK. Cette
perception déclenche une cascade
de signalisation faisant intervenir
DMI2 et DMI1, conduisant à la
génération d’oscillations calciques
nucléaires. Ces oscillations sont
perçues et décodées par la protéine
kinase calcium et calmoduline
dépendante DMI3. L’activation de
DMI3 entraîne la transcription de
gènes nécessaire à la mise en place
de la symbiose, notamment ERN1
et ENOD11, via l’interaction
d’une série de régulateurs
transcriptionnels (Figures 1 et 3).
FIG1 D’après Singh and Parniske 2012
Deux voies de signalisation menant à l’induction de l’expression des gènes ERN1 et ENOD11
ont été à ce jour identifiées (Figure 2):
- La protéine IPD3 est activée par le domaine kinase de DMI3 par phosphorylation.
IPD3 induit alors la transcription de NIN qui est lui-
même capable de se fixer au promoteur des gènes NF-Y
pour induire leur transcription. Les protéines NF-Y
régulent positivement l’expression des gènes ERN1 et
ENOD11.
- Le complexe IPD3/DMI3 va se lier au facteur de
transcription NSP2. NSP2 va interagir avec NSP1 pour
activer la transcription des gènes ERN1 et ENOD11.
FIG2 : d’après Laloum et al., 2014

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Lors de l’organogénèse, la perception des cytokinines par le récepteur CRE1 permet
l’induction de gènes de type RR induisant l’activation du réseau transcriptionnel entraînant la
dédifférenciation et la division des cellules corticales qui donneront naissance à la nodosité
(Figure 3).
FIG3 D’après Oldroyd et al., 2011; Kondorosi et al., 2005
La formation d’un organe capable de fixer l’azote est intéressant pour la plante mais c’est
aussi un procédé très couteux en énergie. Ainsi, les légumineuses contrôlent le nombre et la
taille des nodosités par un processus d’autorégulation (AON : Autoregulation Of Nodulation).
L’AON est une régulation systémique de la nodulation qui implique à la fois un signal foliaire
et racinaire dont le gène SUNN est un acteur principal (Figure 4).
(1) Les NFs induisent le processus de nodulation mais aussi l’expression des peptides CLE.
(2) Ces peptides transportés vers les parties aériennes
via le xylème sont perçus par SUNN / HAR1. (3)
Cette perception induit la production d’un signal dans
les feuilles qui a une action longue distance et
négative sur la formation de nodosités dans les
racines (4).
FIG4 D’après Oka-Kira and Kawaguchi, 2006
DMI3

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OBJECTIFS DU TP
Le TP a pour objectif de visualiser de façon microscopique et moléculaire la mise en place du
processus de nodulation symbiotique entre la bactérie Sinorhizobium meliloti et la
légumineuse Medicago truncatula. Pour cela le TP sera divisé en 3 parties :
Partie numéro 1 : Observation macroscopique du processus de nodulation symbiotique
entre la légumineuse Medicago truncatula et la bactérie Sinorhizobium meliloti.
Cette partie permettra de mettre en évidence différentes étapes de la nodulation :
a) Dans un premier temps, l’étape précoce d’infection sera observée au niveau
microscopique grâce à l’utilisation d’une souche de S. meliloti exprimant
constitutivement la construction ProHemA : LacZ. Cette souche permet, après coloration
avec une solution d’X-Gal, de suivre la formation des cordons d’infection qui se
développent dans le poil absorbant ainsi que la formation d’un primordium de
nodosité.
b) Dans un deuxième temps l’étape tardive d’organogénèse sera étudiée avec
l’observation et la quantification des nodosités de plantes sauvages ou de mutants
présentant des altérations dans le processus symbiotique.
Partie numéro 2 : Observation macroscopique de l’induction de l’expression du gène
ENOD11 en réponse à la bactérie S. meliloti.
Comme vu précédemment , l’expression du gène ENOD11 est induite dans la racine de la
plante hôte en réponse aux rhizobia durant l’étape de pré-infection et d’infection. Cette
induction sera visualisée grâce à l’utilisation de plantes transgéniques exprimant de façon
stable le promoteur du gène ENOD11 fusionné transcriptionnellement au gène uidA codant
pour la protéine rapportrice GUS. La coloration sera effectuée en condition contrôle ainsi
qu’en condition symbiotique afin de vérifier que l’induction de l’expression du gène dépend
de l’infection.
Partie numéro 3 : Observation moléculaire de l’induction de l’expression du gène
ENOD11 et d’autres gènes symbiotiques en réponse à la bactérie S. meliloti
L’induction du gène ENOD11 ainsi que du gène NIN sera également visualisée de façon
moléculaire grâce à une analyse par RT- PCR.
JOUR1 : 26 janvier 2016
a) P2 : Inoculation des plantes transgéniques ProENOD11 ::uidA.
b) P3 : Inoculation des plantes sauvages écotype A17 pour l’observation
moléculaire de l’induction du gène ENOD11.
Vous disposez de boîtes de Petri sur lesquelles ont été mises à pousser pendant une
semaine des plantes sauvage A17 de M. truncatula et des plantes transgéniques
ProENOD11 ::uidA sur un milieu nutritif carencé en azote. Afin d’observer le processus de

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nodulation, les racines de ces plantes sont inoculées avec une suspension de Sinorhizobium
meliloti ayant été mises en culture 2 jours plus tôt, sous agitation et à 30°C, dans un milieu
liquide YEB (Annexe 1) supplémenté avec 500 µg/mL de streptomycine.
 N’oubliez pas de garder des boîtes de plantes non inoculées qui constitueront les
contrôles négatifs.
PROTOCOLE:
- Sous la hotte stérile, transvaser la culture liquide bactérienne dans un falcon 50 mL.
- Centrifuger 10 minutes à 4000 rpm puis éliminer le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 5 mL d’eau stérile sous la hotte sans vortexer.
- Transvaser la solution bactérienne dans un erlenmeyer de 500 mL
- Rajouter de l’eau stérile à la solution jusqu’à obtenir une DO600nm de 0,05
- Une fois la DO obtenue, ouvrir les boîtes avec les plantules et immerger uniquement les
racines avec la solution bactérienne.
- Refermer les boîtes et attendre 1 heure.
- Après 1 heure d’incubation, retirer la solution bactérienne des boîtes.
- Refermer les boîtes sur 3 côtés avec du parafilm.
Les boîtes sont replacées à 24°C en condition de jours longs jusqu’au lendemain.
c) P1 : Observation de nodosité sur différents génotypes :
Vous disposez de boîtes contenant différents génotypes de Medicago truncatula :
plantes sauvages A17, mutant cre1 et mutant sunn, préalablement inoculées. Observer la
structure externe d’une nodosité et dénombrer leur nombre sur les différents génotypes.
Renouveler l’observation aux séances suivantes.
JOUR2 : 27 janvier 2016
P1 : Inoculation de plantes sauvages pour la détection des cordons d’infection par
coloration à la -Galactosidase.
PROTOCOLE: identique au jour 1 sauf que la bactérie utilisée exprime constitutivement
le gène LacZ.
P2 : Coloration GUS des plantes ProENOD11 ::uidA inoculées avec S. meliloti.
PROTOCOLE:  Mettre des gants.
- Prélever 3 ou 4 racines avec un scapel et des pinces et déposer les dans le puits d’une
plaque.
- Rajouter le tampon X-Gluc (Annexe1) de façon à ce que les racines soient immergées.
- Infiltrer sous vide pendant 5 minutes.
- Incuber à l’obscurité (papier aluminium) à 37°C.
- Lorsque la coloration est apparue, enlever la solution X-Gluc et rincer une fois avec de
l’eau.