Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans l`adaptation

Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans l’adaptation métabolique des
lymphocytes T.
Bérengère de Toeuf, Cyril Gueydan, Véronique Kruys, Guillaume Oldenhove:Laboratoire de
Biologie moléculaire du gène et Laboratoire d’Immunobiologie
La régulation d’une réponse immune repose essentiellement sur l’activité de sous-populations de
lymphocytes T fonctionnellement distinctes. Suite à une stimulation antigénique, ces cellules acquièrent
des fonctions effectrices, qui se caractérisent par la production de cytokines capables d’activer les
effecteurs de la réponse immune. De plus, l’activité de ces cellules effectrices est contrôlée par les
lymphocytes T régulateurs qui limitent le développement de réponses inflammatoires excessives. De
nombreux facteurs de l’environnement modulent l’activité des lymphocytes T effecteurs et T
régulateurs. Un nombre croissant d’observations suggère en effet que l’environnement métabolique
(hypoxie, telle qu’observée dans les tumeurs ou les zones d’inflammation, composition du milieu en
acide aminés, glucose,..) affecte l’activité des lymphocytes T de manière différentielle. Ainsi, une
diminution de la pression partielle en oxygène semble inhiber les réponses de type Th1, tout en
favorisant le développement de réponses de type Th17. Un des objectifs des laboratoires impliqués dans
ce projet est de mieux comprendre les mécanismes qui permettent aux lymphocytes T de s’adapter aux
changements métaboliques imposés par l’environnement.
Plusieurs enzymes jouent un rôle fondamental dans l’adaptation métabolique des lymphocytes T. En
particulier, la Lactate déshydrogénase (LDH), qui convertit le pyruvate en lactate, voit son expression
fortement augmentée lors de la stimulation antigénique. L’expression élevée de LDH permettrait aux
lymphocytes T de passer d’un métabolisme aérobique à un métabolisme glycolytique, plus compatible
avec un état de prolifération. Des observations effectuées par le laboratoire et d’autres groupes,
suggèrent que l’expression de la LDH est contrôlée au niveau de la traduction et de la dégradation de
l’ARN messager qui code pour cette enzyme. En particulier, la protéine Tristetraproline (TTP), connue
pour réguler la stabilité et efficacité de traduction de nombreux ARNm impliqués dans la régulation
d’une réponse inflammatoire, pourrait être responsable de la variation des taux de LDH observée lors
d’une stimulation lymphocytaire.
Le travail de mémoire consistera à évaluer l’effet d’une invalidation du gène codant pour la TTP sur la
réponse des lymphocytes T in vitro et in vivo. Nous comparerons la capacité d’adaptation métabolique
des lymphocytes T dans les différentes conditions de perturbation (normoxie et hypoxie) et nous
mesurerons les conséquences de ces perturbations sur la mise en place d’une réponse immune.
L’ensemble du travail devrait permettre de mieux comprendre le processus d’adaptation métabolique
des lymphocytes T et apporter des informations importantes sur la manière dont ce processus peut être
altéré dans des pathologies immunes et cancéreuses.

Effet de l’hypoxie sur la réponse immunitaire
Laboratoire d’Immunobiologie
Charlotte Bisilliat-Donnet, Guillaume Oldenhove et Muriel Moser
La réponse immunitaire est activée principalement dans les organes lymphoïdes, mais la fonction des
lymphocytes effecteurs, c’est-à-dire leur capacité à éliminer l’antigène, est régulée par l’environnement
tissulaire de l’infection ou de l’inflammation.
Nous nous intéressons en particulier à l’effet de la privation d’oxygène, ou hypoxie, situation observée
entre autres dans les tumeurs, l’intestin et les tissus enflammés. L’étude de l’effet de l’hypoxie sur les
lymphocytes T a donné des résultats controversés à ce jour. Nos propres résultats montrent que des
conditions hypoxiques de culture inhibent le développement des lymphocytes T CD4
+
de type
inflammatoire (Th1, producteurs d’IFN-γ).
La réponse cellulaire à l’hypoxie dépend en particulier du facteur de transcription HIF-1, dont la
sousunité HIF-1a est dégradée en normoxie : elle est hydroxylée par des proline hydroxylases (PHD),
ubiquitinée par la protéine von Hippel-Lindau et dégradée par le protéasome. En hypoxie, HIF-1α est
stabilisée suite à une diminution d’activité des PHD et induit la transcription d’un ensemble de gènes
qui favorisent la survie et la fonction des cellules à des pressions d’O2 faibles. Le facteur HIF-1 est un
senseur majeur de l’hypoxie, mais d’autres facteurs sont également impliqués (HIF-2, HIF-3, NF-κB).
De plus, d’autres facteurs peuvent stabiliser HIF-1α, tels que les chélateurs de fer, le chlorure de cobalt
et des métabolites cellulaires tels que le lactate.
Nous disposons au laboratoire de souris HIF-1α floxées et PHD2 floxées et des souris Cre spécifiques
d’un type cellulaire donné. En croisant ces souches, nous obtenons des souris sur-exprimant ou
sousexprimant le facteur HIF-1a dans des populations cellulaires d’intérêt (lymphocytes T
conventionnels, T régulateurs, cellules dendritiques, etc). Nous caractériserons la réponse immunitaire
(après immunisation) et la réponse inflammatoire (colite, arthrite rhumatoïde) de ces souris in vivo.
Ce projet devrait permettre d’identifier des cibles de régulation des réponses inflammatoires.
Bibliographie :
- Dang, E. V. et al. Control of TH17/Treg Balance by Hypoxia-Inducible Factor 1. Cell 146,772–
784 (2011).
- Clambey, E. T. et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha-dependent induction of FoxP3 drives
regulatory T-cell abundance and function during inflammatory hypoxia of the mucosa. Proc.Natl. Acad.
Sci. 109, E2784–E2793 (2012).
- Shehade, H., Oldenhove, G., & Moser, M. (2014). Hypoxia in the intestine or solid tumors: A
beneficial or deleterious alarm signal? European Journal of Immunology, 44(9), 2550-2557.
doi:10.1002/eji.201444719

Edition et modification du génome des lymphocytes T par une approche CRISPR/Cas9
Cyril Gueydan, Véronique Kruys , Oberdan Leo
Laboratoire de Biologie moléculaire du gène et Laboratoire d’Immunobiologie
Les lymphocytes T exprimant le co-recepteur CD4 sont des acteurs majeurs de la réponse immunitaire
chez les mammifères. Ces cellules sont divisées en deux sous-groupes principaux : les lymphocytes T
effecteurs responsables de la mise en place d’une réponse immune, et les lymphocytes T régulateurs), à
fonction anti-inflammatoire. La compréhension des mécanismes qui permettent de contrôler la
différenciation des T effecteurs et régulateurs est centrale pour comprendre comment l’organisme
parvient à mettre en place et contrôler une réponse immune.
La capacité de modifier génétiquement de manière rapide et précise le génome des cellules de
mammifères est un défi majeur de la recherche en Biologie moléculaire. La découverte récente du
système CRISPR/Cas9 a fourni aux chercheurs un outil de choix pour modifier de manière précise des
séquences d’ADN dans le génome des cellules. Ce système est constitué d’un ARN guide
complémentaire d’une séquence du génome (sgRNA) et d’une nucléase (Cas9). L’interaction entre Cas9
et le sgRNA permet de positionner la nucléase sur le génome et ainsi induire des modifications ciblées
de l’ADN. Ces modifications permettent d’inactiver ou de modifier l’expression de gènes cibles. La
capacité d’adapter cette approche à l’étude des cellules du système immunitaire représenterait non
seulement un réel progrès technologique, mais permettrait aussi d’imaginer de nouvelles pistes
thérapeutiques dans le domaine de l’immunothérapie.
Dans le cadre de ce mémoire, nous proposons d’adapter la technologie CRISPR/Cas9 aux lymphocytes
T CD4. Nous testerons différentes approches pour introduire un ARN guide de type sgRNA et la protéine
Cas9 dans des LT CD4. Nous évaluerons ensuite la capacité du système CRISPR/Cas 9 à modifier de
manière efficace le génome des LT CD4. Le but final du projet consistera à inactiver des gènes impliqués
dans la différenciation des LT CD4 et à caractériser les conséquences de ces inactivations sur la fonction
des LT CD4 et la mise en place de la réponse immune chez la souris.

Purification et caractérisation structurale des protéines régulatrices de la réponse
immune de la famille Tis11/TTP
Cyril Gueydan, Véronique Kruys,Vincent Raussens
Laboratoire de Biologie moléculaire du gène et Laboratoire de structure et fonctions des membranes
biologiques
Les protéines de la famille Tis11/TTP sont des protéines de liaison à l’ARN qui jouent un rôle central
dans le contrôle de nombreux processus biologiques et en particulier le contrôle de la réponse immune.
Chez la souris, l’inactivation de plusieurs gènes de cette famille conduit à des pathologies
inflammatoires sévères et souvent létales.
Les protéines Tis11/TTP peuvent se lier à des éléments conservés, présents dans la partie 3’ non traduite
de plusieurs ARN messagers. Ces séquences, riches en adénine et uridine sont baptisées ARE (AU-rich
Element) et permettent de contrôler la dégradation ou la stabilisation des ARN messagers. La fixation
des protéines Tis11/TTP sur une séquence ARE induit la dégradation rapide de l’ARNm alors qu’en
absence de Tis11/TTP, l’ARNm reste stable. Cette famille de protéines contient dans la région centrale
un motif à doigts à zinc en tandem permettant le contact avec les molécules d’ARN. Différents signaux
cellulaires induisent la phosphorylation des protéines Tis11/TTP ce qui influence la stabilité de ces
protéines et leur fixation aux ARN cibles. Toutefois, les mécanismes moléculaires qui contrôlent ces
processus restent mal compris à ce jour.
Récemment, notre laboratoire a montré que les protéines Tis11/TTP appartiennent à la famille des
protéines intrinsèquement déstructurées (IDP). Les IDPs constituent un groupe de protéines dont le
structure tridimensionnelle est variable et peut évoluer entre des états totalement déstructurés ou
(partiellement) structurés. Dans certains cas, il a été montré que les IDPs adoptent une conformation tri-
dimensionnelle suite à la fixation d’un ligand.
Les caractéristiques particulières de ces protéines ne permettent pas d’étudier leur structure par
l’approche classique de cristallisation et diffraction de rayon X et nécessitent l’utilisation d’autres
techniques spectroscopiques.
Dans le cadre de ce travail de mémoire, nous proposons de purifier différentes protéines de la famille
Tis11/TTP et d’étudier leur structure par spectroscopie IR, dichroïsme circulaire et échange de
deutérium. Nous évaluerons comment la liaison à l’ARN influence la structure des protéines Tis11/TTP.
L’objectif à plus long terme du projet est de comprendre comment les signaux cellulaires qui induisent
la phosphorylation des protéines Tis11/TTP permettent de moduler la structure et la fonction de ces
protéines. Nous pourrons ainsi mieux comprendre comment ces facteurs sont impliqués dans différentes
pathologies inflammatoires.