roneo 7 genome 06 11 13

L2 Pharmacie – Génome N°7
06/11/13 – Pr Denoyelle
Groupe 10 – Samy et JP
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Sommaire
III. Les siRNA ou small interfering RNA
c. Le mécanisme d’action
d. L’ARN interférence au laboratoire
e. Quelles fonctions physiologiques du siRNA ?
f. L’ARN interférence…le début d’une histoire fascinante
IV. Les micros RNAs
a. Les microARNs (miRNAs) : petits ARN mais rôle majeur dans
la régulation génique
b. Localisation génomique des gènes codant pour les miRNAs
c. Transcription et maturation des transcrits primaires de
miRNA en pré-miRNA.
d. Régulation post-transcriptionnelle de l’expression des
gènes par les miNRA
e. Complexité des miRNA : une miRyade de mécanismes
f. Importance des miRNA dans de nombreuses pathologies
g. Causes possible de l’expression ou de la fonction anormales
des miRNA
h. Vers une utilisation clinique des miRNA ?
i. Découverte de miRNA circulants

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Rappel : Mécanisme d'interférence à l'ARN.
Sert à dégrader de manière très efficace les ARNm de manière spécifique : un siRNA ciblera
un ARNm donné dans la cellule.
c. Le mécanisme d'action :
Les longs ARN double brin (ARNdb) seront pris en charge par DICER (RNase de type III),
qui va les couper en petits ARN et former des siRNA (taille de 20 nucléotides environ). Ces
siRNA vont être pris en charge par un second complexe multiprotéique : RISC
Il faut retenir qu'un ARN non codant ne fonctionnera jamais seul, il sera toujours
accompagné d'une protéine.
Le complexe RISC dégrade le brin passager du siRNA. Le brin restant (guide) sera donc
complémentaire sur 19 nucléotides d'un ARNm (une séquence de 19 nucléotides suffit pour
qu'une séquence soit spécifique d'un gène donné). Le complexe RISC va chercher une
séquence complémentaire du brin guide, se fixer à lui puis le couper aux 2 extrémités grâce à
Argonaute 2 pour qu'il soit ensuite dégradé par les RNases. Le même complexe RISC va ensuite
chercher un autre brin d'ARNm à couper pour être dégradé.
C'est un mécanisme extrêmement efficace et non stœchiométrique.
i) Le complexe multiprotéique DICER
Les ARNdb sont reconnus par leurs extrémités 3' grâce au domaine PAZ et maintenus
en place par le domaine dsRNA.
Les siRNA : longueur de 19 nucléotides, possèdent des extrémités protubérantes de chaque
côté (c'est à dire libre) qui est le fruit de DICER.
DICER est une enzyme très importante au cours du développement embryonnaire. En effet,
si on réalise le KO (Knock-out) de cette enzyme chez la souris, on a la formation d'organes non
viable et donc c’est létal.
ii) Le complexe RISC (RNA - induced silencing complexe) :
Il a plus de 15 protéines différentes qui le compose.
Chez l’homme il y a 8 membres de la famille Argonaute (composantes clés du RISC) classés en
2 sous -familles :
- Ago (1 à 4) : expression ubiquitaire (présent n’ importe où dans l'organisme)
- Piwi (Hiwi 1 à 3 et HILI) : expression restreinte aux cellules germinales (gonadiques et
souches) car elles ont un rôle de lutte contre les transposons : elle lutte donc contre

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les intégrations d'ADN à cette endroit qui auraient des conséquences extrêmement
délétères pour le génome et aussi pour la future descendance.
Les protéines Argonaute 1 à 4 sont composées de deux domaines essentiels pour
permettre l’interaction entre les siRNA et ARNm pour entrainer le clivage :
- Le domaine PAZ → reconnaissance des ARNdb essentiellement au niveau « 3’
overhand» (extrémité 3' libre)
- Le domaine PIWI → activité de coupure des ARNm (Ago 2), on parle d’activité « Slicer
» (clivage endonucléolytique)
L’orientation du siRNA dans la protéine Argo détermine le choix du brin sens et anti-sens.
d. L’ARN interférence au laboratoire
Depuis 2001, les siRNA sont devenus un outil très répandu (et facile d’utilisation) de
l’étude de la fonction d’un gène, en permettant son inhibition spécifique.
La machinerie qui permet l’ARN interférence via les siRNA est exprimée dans la plupart des
types cellulaires.
Si l'on travaille en laboratoire, on va directement synthétiser des siRNA avec des
extrémités 3' libres et donc on n'aura pas besoin de DICER.
Raison pour laquelle on ne synthétise pas des ARNdb : ils sont reconnus par des récepteurs à
la surface qui déclenche des réponses interférentes  inhibition de la traduction globale et
donc non intéressante.
i) L’utilisation des siRNA au laboratoire
Comment faire pour insérer un siRNA (hydrophile et chargé négativement) dans la
cellule ? On va les englober dans des liposomes cationiques (hydrophobe et chargés
positivement) qui pourra traverser la membrane cellulaire.
Si on voulait éliminer une séquence nommée P53, il faudrait introduire le siARN
complémentaire de P53 et, afin de vérifier que toutes les séquences P53 aient disparues de
la cellule, on effectuerait la technique de western blot.
Avec certain type cellulaire comme les mélanocytes, le liposome cationique ne pourra
pas franchir la barrière. Il faudra utiliser la nature : utiliser un virus et un plasmide. Le plasmide,
après avoir franchi la membrane nucléaire grâce au virus, va synthétisér du shRNA, qui grâce
à la transcription au sein du noyau se transforme en ARNm, qui va dans le cytoplasme puis
DICER ect ...

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e. Quelles fonctions physiologiques du siRNA ?
Fonction exogène : mécanisme naturel de défense antivirale extrêmement efficace chez
les plantes et les invertébrés. Si un virus pénètre dans la cellule on a, grâce à un système de
reconnaissance par DICER et RISC, la possibilité de détruire c’est ADN ou ARN viraux.
Si un virus arrive à infecter une cellule, c'est que ce virus a développé un système d'inactivation
des processus d'ARN interférence (inactivation de DICER).
Ce système de défense existerait chez les mammifères (découverte très récente, débat et
polémique actuels).
Fonction endogène :
- Régulation de l’expression génique durant le développement
- Protection du génome par suppression des mouvements des transposons
i) Les siRNA exogènes, mais aussi les siRNA endogènes
Découverte des siRNA endogène très récente !
Comment sont-ils synthétisés :
- La plus fréquente chez les mammifères : Les gènes sont synthétisés, et on a un pseudo-
gène localisé pas très loin qui correspond à la séquence inverse du gène. Ils vont donc
s'apparier pour former cette endo-siRNA puis exporter dans le cytoplasme puis DICER
...
- Transcription d'un brin sens et celle de l'anti-sens au niveau de l'ADN puis ils
s'apparient et forme un endo-siRNA
- Au niveau de l'ADN d’une séquence (un peu comme un shRNA) c'est à dire sens et anti
sens (peu après), du fait de la proximité spatiale, le siRNA peut se replier et aboutir à
l'endo-siRNA.
Les endo-siRNA ont le même effet que PIWI c'est à dire ils luttent contre les transposons afin
de maintenir l'intégrité de l'espèce et assurer sa descendance.
f. L’ARN interférence…le début d’une histoire fascinante
Il existe 3 familles d'ARN interférent : les endo-siRNA, les miRNA et les piRNA
De nombreuses recherches sont en cours à l'heure actuelle pour découvrir les processus de
ces ARN interférents.

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i) Les petits ARN non codants…un univers en pleine expansion.
De nombreux ARN non codant sont découvert régulièrement, pour certains leur
fonctions sont inconnues, on connait uniquement leur existence.
Fonctions extrêmement vaste : modifications épigénétiques, maintien de l'intégrité du
génome, régulation de la transcription, défense virale.
Cela a entrainé une révolution de la biologie sur les phénomènes de régulation de la cellule.
Il y a de plus en plus de publication sur ces ARN depuis une dizaine d'années.
IV. Les micro-ARN :
Ce sont des ARN interférents.
Ces miRNAs agissent également grâce à des protéines assez semblables (DICER, Argonaute) mais
qui fonctionnent de façon un peu différente.
Cette fois-ci cela se passe au niveau post transductionnel, en bloquant l'action des ARNm et non plus
en le dégradant. Les miRNAs possèdent toutefois des spécificités telles que DROSHA.
Les micro-ARN sont identifiés en 1993 de façon hasardeuse par deux chercheurs (décrite comme
sans intérêt à l'époque) car la découverte des ARN interférents date de 1998.
Comment s'est fait cette découverte des micro-ARN ?
Le ver nématode (mutan lin-4) a la particularité de réitérer le stade L1, par le fait que lin-4 inhibe
la synthèse de protéine lin-14 (facteur de la transition L1L2).
Lin-4 ne code pas pour une protéine mais pour un ARN non codant.
Un second chercheur observe que lin-14 dans sa partie 3' UTR possède de nombreux sites de fixation
de lin-4 (7 sites de fixation).
Ces sites sont tous sous forme de boucles : la complémentarité est imparfaite entre lin-4 et lin-14.
Les deux chercheurs concluront leurs expériences en disant "il y a des interactions ARN sens-anti sens.
C'est une bizarrerie spécifique au développement des nématodes" (car lin-4 n'est retrouvé nul part
ailleurs).
En 2000 : Publication d'un travail sur le nématode d'un autre ARN non codant : let-7, qui
gouverne le passage de L4Adulte, en inhibant la protéine Lin-41.
Rapprochement entre lin-4 et let-7, qu'ils décident d'appeler : des small temporal RNA (stRNA), ce n'est
donc plus une bizarrerie mais un mécanisme global chez le nématode.
Cette fois-ci, Let-7 est retrouvé chez des êtres supérieurs (métazoaires), ils concluront donc que les
stRNA ont un rôle fondamental dans le domaine du vivant.
2001 : Renomination des stRNA en miRNA.