roneo 7 genome 06 11 13
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L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 Sommaire III. Les siRNA ou small interfering RNA c. Le mécanisme d’action d. L’ARN interférence au laboratoire e. Quelles fonctions physiologiques du siRNA ? f. L’ARN interférence…le début d’une histoire fascinante IV. Les micros RNAs a. Les microARNs (miRNAs) : petits ARN mais rôle majeur dans la régulation génique b. Localisation génomique des gènes codant pour les miRNAs c. Transcription et maturation des transcrits primaires de miRNA en pré-miRNA. d. Régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes par les miNRA e. Complexité des miRNA : une miRyade de mécanismes f. Importance des miRNA dans de nombreuses pathologies g. Causes possible de l’expression ou de la fonction anormales des miRNA h. Vers une utilisation clinique des miRNA ? i. Découverte de miRNA circulants 1 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 Rappel : Mécanisme d'interférence à l'ARN. Sert à dégrader de manière très efficace les ARNm de manière spécifique : un siRNA ciblera un ARNm donné dans la cellule. c. Le mécanisme d'action : Les longs ARN double brin (ARNdb) seront pris en charge par DICER (RNase de type III), qui va les couper en petits ARN et former des siRNA (taille de 20 nucléotides environ). Ces siRNA vont être pris en charge par un second complexe multiprotéique : RISC Il faut retenir qu'un ARN non codant ne fonctionnera jamais seul, il sera toujours accompagné d'une protéine. Le complexe RISC dégrade le brin passager du siRNA. Le brin restant (guide) sera donc complémentaire sur 19 nucléotides d'un ARNm (une séquence de 19 nucléotides suffit pour qu'une séquence soit spécifique d'un gène donné). Le complexe RISC va chercher une séquence complémentaire du brin guide, se fixer à lui puis le couper aux 2 extrémités grâce à Argonaute 2 pour qu'il soit ensuite dégradé par les RNases. Le même complexe RISC va ensuite chercher un autre brin d'ARNm à couper pour être dégradé. C'est un mécanisme extrêmement efficace et non stœchiométrique. i) Le complexe multiprotéique DICER Les ARNdb sont reconnus par leurs extrémités 3' grâce au domaine PAZ et maintenus en place par le domaine dsRNA. Les siRNA : longueur de 19 nucléotides, possèdent des extrémités protubérantes de chaque côté (c'est à dire libre) qui est le fruit de DICER. DICER est une enzyme très importante au cours du développement embryonnaire. En effet, si on réalise le KO (Knock-out) de cette enzyme chez la souris, on a la formation d'organes non viable et donc c’est létal. ii) Le complexe RISC (RNA - induced silencing complexe) : Il a plus de 15 protéines différentes qui le compose. Chez l’homme il y a 8 membres de la famille Argonaute (composantes clés du RISC) classés en 2 sous -familles : - Ago (1 à 4) : expression ubiquitaire (présent n’ importe où dans l'organisme) Piwi (Hiwi 1 à 3 et HILI) : expression restreinte aux cellules germinales (gonadiques et souches) car elles ont un rôle de lutte contre les transposons : elle lutte donc contre 2 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 les intégrations d'ADN à cette endroit qui auraient des conséquences extrêmement délétères pour le génome et aussi pour la future descendance. Les protéines Argonaute 1 à 4 sont composées de deux domaines essentiels pour permettre l’interaction entre les siRNA et ARNm pour entrainer le clivage : - Le domaine PAZ → reconnaissance des ARNdb essentiellement au niveau « 3’ overhand» (extrémité 3' libre) - Le domaine PIWI → activité de coupure des ARNm (Ago 2), on parle d’activité « Slicer » (clivage endonucléolytique) L’orientation du siRNA dans la protéine Argo détermine le choix du brin sens et anti-sens. d. L’ARN interférence au laboratoire Depuis 2001, les siRNA sont devenus un outil très répandu (et facile d’utilisation) de l’étude de la fonction d’un gène, en permettant son inhibition spécifique. La machinerie qui permet l’ARN interférence via les siRNA est exprimée dans la plupart des types cellulaires. Si l'on travaille en laboratoire, on va directement synthétiser des siRNA avec des extrémités 3' libres et donc on n'aura pas besoin de DICER. Raison pour laquelle on ne synthétise pas des ARNdb : ils sont reconnus par des récepteurs à la surface qui déclenche des réponses interférentes inhibition de la traduction globale et donc non intéressante. i) L’utilisation des siRNA au laboratoire Comment faire pour insérer un siRNA (hydrophile et chargé négativement) dans la cellule ? On va les englober dans des liposomes cationiques (hydrophobe et chargés positivement) qui pourra traverser la membrane cellulaire. Si on voulait éliminer une séquence nommée P53, il faudrait introduire le siARN complémentaire de P53 et, afin de vérifier que toutes les séquences P53 aient disparues de la cellule, on effectuerait la technique de western blot. Avec certain type cellulaire comme les mélanocytes, le liposome cationique ne pourra pas franchir la barrière. Il faudra utiliser la nature : utiliser un virus et un plasmide. Le plasmide, après avoir franchi la membrane nucléaire grâce au virus, va synthétisér du shRNA, qui grâce à la transcription au sein du noyau se transforme en ARNm, qui va dans le cytoplasme puis DICER ect ... 3 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 e. Quelles fonctions physiologiques du siRNA ? Fonction exogène : mécanisme naturel de défense antivirale extrêmement efficace chez les plantes et les invertébrés. Si un virus pénètre dans la cellule on a, grâce à un système de reconnaissance par DICER et RISC, la possibilité de détruire c’est ADN ou ARN viraux. Si un virus arrive à infecter une cellule, c'est que ce virus a développé un système d'inactivation des processus d'ARN interférence (inactivation de DICER). Ce système de défense existerait chez les mammifères (découverte très récente, débat et polémique actuels). Fonction endogène : - Régulation de l’expression génique durant le développement Protection du génome par suppression des mouvements des transposons i) Les siRNA exogènes, mais aussi les siRNA endogènes Découverte des siRNA endogène très récente ! Comment sont-ils synthétisés : - - La plus fréquente chez les mammifères : Les gènes sont synthétisés, et on a un pseudogène localisé pas très loin qui correspond à la séquence inverse du gène. Ils vont donc s'apparier pour former cette endo-siRNA puis exporter dans le cytoplasme puis DICER ... Transcription d'un brin sens et celle de l'anti-sens au niveau de l'ADN puis ils s'apparient et forme un endo-siRNA Au niveau de l'ADN d’une séquence (un peu comme un shRNA) c'est à dire sens et anti sens (peu après), du fait de la proximité spatiale, le siRNA peut se replier et aboutir à l'endo-siRNA. Les endo-siRNA ont le même effet que PIWI c'est à dire ils luttent contre les transposons afin de maintenir l'intégrité de l'espèce et assurer sa descendance. f. L’ARN interférence…le début d’une histoire fascinante Il existe 3 familles d'ARN interférent : les endo-siRNA, les miRNA et les piRNA De nombreuses recherches sont en cours à l'heure actuelle pour découvrir les processus de ces ARN interférents. 4 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP i) N°7 Les petits ARN non codants…un univers en pleine expansion. De nombreux ARN non codant sont découvert régulièrement, pour certains leur fonctions sont inconnues, on connait uniquement leur existence. Fonctions extrêmement vaste : modifications épigénétiques, maintien de l'intégrité du génome, régulation de la transcription, défense virale. Cela a entrainé une révolution de la biologie sur les phénomènes de régulation de la cellule. Il y a de plus en plus de publication sur ces ARN depuis une dizaine d'années. IV. Les micro-ARN : Ce sont des ARN interférents. Ces miRNAs agissent également grâce à des protéines assez semblables (DICER, Argonaute) mais qui fonctionnent de façon un peu différente. Cette fois-ci cela se passe au niveau post transductionnel, en bloquant l'action des ARNm et non plus en le dégradant. Les miRNAs possèdent toutefois des spécificités telles que DROSHA. Les micro-ARN sont identifiés en 1993 de façon hasardeuse par deux chercheurs (décrite comme sans intérêt à l'époque) car la découverte des ARN interférents date de 1998. Comment s'est fait cette découverte des micro-ARN ? Le ver nématode (mutan lin-4) a la particularité de réitérer le stade L1, par le fait que lin-4 inhibe la synthèse de protéine lin-14 (facteur de la transition L1L2). Lin-4 ne code pas pour une protéine mais pour un ARN non codant. Un second chercheur observe que lin-14 dans sa partie 3' UTR possède de nombreux sites de fixation de lin-4 (7 sites de fixation). Ces sites sont tous sous forme de boucles : la complémentarité est imparfaite entre lin-4 et lin-14. Les deux chercheurs concluront leurs expériences en disant "il y a des interactions ARN sens-anti sens. C'est une bizarrerie spécifique au développement des nématodes" (car lin-4 n'est retrouvé nul part ailleurs). En 2000 : Publication d'un travail sur le nématode d'un autre ARN non codant : let-7, qui gouverne le passage de L4Adulte, en inhibant la protéine Lin-41. Rapprochement entre lin-4 et let-7, qu'ils décident d'appeler : des small temporal RNA (stRNA), ce n'est donc plus une bizarrerie mais un mécanisme global chez le nématode. Cette fois-ci, Let-7 est retrouvé chez des êtres supérieurs (métazoaires), ils concluront donc que les stRNA ont un rôle fondamental dans le domaine du vivant. 2001 : Renomination des stRNA en miRNA. 5 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 a. Les microARNs (miRNAs) : petits ARN mais rôle majeur dans la régulation génique Ce sont des petits ARN non-codants endogènes de 17 à 25 nucléotides régulants négativement l’expression génique au niveau post-transcriptionnel. Les miRNAs sont d’origine naturelle et proviennent exclusivement de sources endogènes, codés par notre génome. Ils sont retrouvés chez les plantes, animaux et virus, extrêmement bien conservés au cours de l’évolution. Chez l’homme 2578 miRNA matures humain décrits et codés par 1872 précurseurs (Juin 2013). Les miRNA ont des profils d’expressions spécifiques tissulaires, on va donc pouvoir avoir des signatures de miARN qui constituent le tissu donné, et spatio-temporels. Ils ont un rôle clé de régulation dans de nombreux processus physiologiques essentiels : développement, différenciation, immunité, apoptose et prolifération. b. Localisation génomique des gènes codant pour les miRNAs Ils sont globalement organisés en polycistrons, c'est-à-dire que les gènes codant pour les miRNA vont être localisés les uns à la suite des autres, sous la dépendance d’un même promoteur. - Gènes codant pour les miRNAs : isolés ou en cluster (fréquent, environ 50% chez l’homme) Transcrit sous forme de précurseurs à partir d’exons ou d’introns provenant de transcrits codants ou non-codants. Majoritairement, les miRNA se retrouvent au niveau des introns des unités transcriptionnelles. Ils régulent le gène, transcrit à partir de cette unité. c. Transcription et maturation des transcrits primaires de miRNA en pré-miRNA. 6 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 Une ARN polymérase de type 2 vient transcrire l’ARN, synthèse d’un ARNm appelé primiRNA, coiffé et polyadénylé. Apparition de structure typique notamment en tige boucle ou épingle à cheveux, au sein des micros ARN primaires. Selon les mi-RNA on a une complémentarité parfaite ou des mésappariements. Ces pri-miRNA subissent une première étape de maturation prise en charge par Drosha, elle clive les structures en tige–boucle. Elle permet d’aboutir à la synthèse des précurseurs, les pré–miRNAs (taille réduite : 70pb). L’extrémité protubérante permettra la reconnaissance par DICER, étape suivante de maturation. - Reconnaissance par DGCR8 des séquences flanquantes du pri-miRNA Clivage par Drosha de la tige boucle approximativement à 11pb (entre régions flanquantes et tige boucle) Clivage asymétrique (nucléotides non appariés dans la partie 3’OH) 7 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP i) N°7 La voie canonique de maturation des miRNA (voie majoritaire) Importante pour la maturation des pri-miARN en pré-miRNA, cette étape a lieu au niveau nucléaire, puis il y a export vers le cytoplasme. ii) Nomenclature des miRNA Exemple Préfixe : ajout de 3 lettres caractérise l’espèce, organisme - hsa : Homo Sapiens - mmu : Mus musculus Gènes ou pré-miRNAs : mir-X miRNA mature : mirR-X X : suffixe numérique, correspond à l’ordre de découverte hsa-miR-181 Particularité : miRNA matures (différences par quelques bases) : ajout d’une lettre. miR-181a et miR-181b. Si les deux bras du pré-miRNA miRNA matures indication sur l’origine du bras de la structure en tige-boucle du pré-RNA miR-X-5p et miR-X-3p 8 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 miRNA mature peut résulter de la transcription ou de la maturation de transcrits à partir de loci différents (ajout d’un suffixe numérique) miR-181a-1 et miR-181a-2 miR-181a-1 : locus sur chromosome 1 miR-181a-2 : locus sur chromosome 9 iii) - Système d’export des pré-miRNA du noyau vers le cytoplasme Liaison du complexe Exportine-5/RAN-GTP/pré-miRNA aux nucléoporines dans le noyau migration à travers les pores nucléaires. Relargage des pré-miRNA dans le cytoplasme lié à l’hydrolyse des RAN-GTP par la RANGTPase activating protein. Transport retour de Exp-5 du cytoplasme vers le noyau Régénération du RAN-GTP par RCC1 (Ran guanine nucleotide exchange factor) iv) Clivage du pré-miRNA par DICER 9 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 - Reconnaissance des 2 nucléotides protubérants du pré-miRNA par le domaine PAZ de DICER - domaine de liaison à l’ARNdb (dsRBD) permet de positionner les domaines RNAse de type III clivage du pré-miRNA. v) Biosynthèse des miRNA Le miRNA double brin est ensuite pris en charge par le complexe RISC (miRISC). Globalement chez les mammifères ont retrouve au sein de ce complexe une protéine argonaute de type 1 majoritairement. Les miARNs induisent un blocage (inhibition) de la traduction. 10 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 Chez les plantes et les invertébrés les miARNs vont pouvoir cliver les ARNm grâce à la protéine Ago2 dans le complexe miRISC. d. Régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes par les miNRA Un miRNA se fixe dans la partie 3’UTR de l’ARNm, cette région est appelée «seed» région ou région reine. Cette région correspond aux nucléotides 2 à 8 du miRNA (5’3’) et vient s’apparier par complémentarité parfaite avec l’ARNm. Différence avec siRNA : mésappariement possible, boucle entre les nucléotides 8 à 13. Complémentarité sur la partie 3’ du miRNA. A retenir +++ : les siRNAs ont 19 nucléotides qui font qu’ils sont spécifiques d’une cible (ARNm) donnée alors que les miRNA vont pouvoir cibler dans la cellule de multiples cibles. Un miRNA peut réguler simultanément la transcription d’une centaine de gènes. Un gène peut être régulé simultanément par plusieurs miRNA. i) Action sur des réseaux de cibles très partiellement caractérisés. Ex a : miR-1 : peut réguler ARNm a,b et c. Il peut bloquer la traduction de ces 3 ARNm. Ex b : Un ARNm peut être régulé par plusieurs miRNA Complexité qui peut se mettre en place en terme de réseaux !!! Réseau extrêmement complexe dans les cellules. 11 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 Identifications des cibles de miRNA : algorithme - Échec très important (>75%) Limites des approches in silico ii) Mécanismes moléculaires de la régulation de la traduction et/ou de dégradation des ARNm. Inhibition de l’initiation ou de l’élongation de la traduction. Plusieurs modèles proposés : - Au moment de l’initiation de la traduction, blocage de la reconnaissance de la coiffe Pendant l’élongation, déstabiliser les polyribosomes Activation par le complexe miRISC d’une protéase qui dégrade le peptide naissant Mécanisme montrant que le miRISC pourrait activer une protéine particulière (GW182) qui activerait une exonucléase, qui dégradera l’ARNm. e. Complexité des miRNA : une miRyade de mécanismes Les miRNA peuvent jouer d’autres rôles dans la cellule en dehors de la régulation négative de l’expression génique : - fixation dans les régions codantes et 5’-UTR des ARNm stimuler la traduction (conditions de stress) miRNA nucléaire (signal de localisation nucléaire) : jouer un rôle au niveau de la transcription (directe ou indirecte) Activité DECOY : indépendant du complexe RISC f. Importance des miRNA dans de nombreuses pathologies Rôle majeur dans la plupart des maladies : - développement/maladies du système nerveux central maladies cardiovasculaires maladies virales immunité inflammation cancer : lien direct entre miRNA et cancer : localisation des gènes codant pour les miRNAs dans des sites fragiles/génétiquement instables et des régions du 12 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 génome fréquemment associées au cancer (amplification, délétion ou réarrangement…) Altération de l’expression des miRNA dans de nombreux cancers : OncomiRs « OncomiRs » : miRNAs oncogénique. Ils sont surexprimés dans les tumeurs, régulent négativement les gènes suppresseurs de tumeurs. Les miRNAs suppresseurs de tumeur ont une expression faible dans le cancer donc expression d’oncogènes dans les cellules. g. Causes possibles de l’expression ou de la fonction anormale des miRNA Peut se passer à différent niveaux : - - sites chromosomiques fragiles (amplifications, délétions ou mutations des gènes codants pour les miRNA) facteurs de transcription changements épigénétiques (méthylation des ilots CpG, modification des histones) altérations de la machinerie traitant les miRNA (niveau Drosha et Dicer, interactions protéines) : conduisant à une moindre ou surexpression des miRNAs. mutations/SNP en 3’-UTR du messager (perte ou création de sites fonctionnels pour les miRNA) h. Vers une utilisation clinique des miRNA ? Ils vont pouvoir jouer le rôle de marqueur, bien plus discriminants que les ARNm - outils pronostiques : prédisposition au cancer outils diagnostiques : cibles thérapeutiques et médicaments On est très loin d’une utilisation clinique des miRNAs : confrontation à de nombreux problèmes. Actuellement les Anti-mirs : bloque l’expression des miRNAs. Exemple actuel : anti-mir bloquant expression mir-122 jouant un rôle dans cancer du foie et hépatite C. i. Découverte de miRNA circulants - présents dans de nombreux fluides biologiques (sang, urine, lait, salive...) Particulièrement stables : 13 L2 Pharmacie – Génome 06/11/13 – Pr Denoyelle Groupe 10 – Samy et JP N°7 - - « libres » : présence au sein de complexe ribonucléprotéiques (Ago2, nucléophosmine…) - « Vésicules » : microparticules, microvésicules, exosomes, HDL… Rôle dans la communication cellulaire ? Délivrance des miRNAs à distance où ils assurent leur fonction dans des cellules cibles Renforcement de l’intérêt des miRNA comme biomarqueurs en cancérologie ? 14
