Université de Sherbrooke Par Isabelle Marois Département de médecine, Service de pneumologie

Université de Sherbrooke
Étude du comportement de la réponse immune lymphocytaire T CD8+ suite à un
traitement anti-influenza
Par
Isabelle Marois
Département de médecine, Service de pneumologie
Programme d'immunologie
Mémoire présenté à la Faculté de médecine et sciences de la santé en vue de l'obtention du
grade de maître ès sciences (M. Se.) en immunologie
Sherbrooke, Québec, Canada
Mai, 2011
Membres du jury d'évaluation
Dr Martin Richter (Directeur), Programme d'immunologie
Dr Abdelaziz Amrani, Programme d'immunologie
Dr Fernand-Pierre Gendron, Programme d'anatomie et biologie cellulaire
© Isabelle Marois, 2011

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Étude du comportement de la réponse immune lymphocytaire T CD8+ suite à un
traitement anti-influenza
Par Isabelle Marois
Département de médecine et sciences de la santé
Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l'obtention
du diplôme de maître ès sciences (M.Sc.) en Immunologie, Faculté de médecine et des
sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
La grippe est une infection respiratoire causée par le virus influenza, ayant d'importants
impacts socio-économiques. La grande capacité mutagénique de ce virus nous oblige à
développer notre arsenal pharmacologique vu l'augmentation du nombre de résistances aux
antiviraux. Ce projet propose d'utiliser des médicaments accessibles et disponibles pour le
traitement de diverses maladies qui sont susceptibles de limiter la propagation virale en
ciblant des voies cellulaires essentielles pour la réplication virale (acidification
endosomales et niveaux de calcium cellulaire). Les résultats obtenus ont démontré que
l'utilisation d'agents lysosomotropes alcalinisants et de modulateurs du calcium inhibait de
façon significative la réplication virale. La sensibilité des souches à ces traitements était les
suivantes : H1N1 et H3N2 adaptées à la souris, H1N1 humaine, H1N1 porcine et H5N1 et
N5N2 aviaire. Des concentrations plus élevées étaient nécessaires pour un traitement post-
infection. La combinaison de traitements entre eux ou avec l'oseltamivir (inhibiteur de la
neuraminidase) ont démontré un effet inhibiteur additif significatif. L'inhibition de
l'induction de la polymérase acide virale tôt dans l'infection a indiqué que les traitements
empêchent le relâchement du génome viral dans la cellule. In vivo, seule la
chloroquine (50 mg/kg/jr) inhibait significativement la réplication virale pulmonaire.
Néanmoins cette section du projet soutient l'idée d'exploiter des mécanismes cellulaires
cruciaux pour le virus afin de développer de nouveaux traitements antiviraux.
L'oseltamivir réduit la réplication du virus influenza et l'inflammation excessive dans les
poumons durant l'infection. Cependant, les effets du traitement antiviral et d'une réduction
de la dose infectieuse, suite aux traitements ou lors d'une infection avec une faible dose
infectieuse, sur la réponse immune sont mal connus. La seconde partie du projet soutient
que malgré les réductions de la sévérité de l'infection et de la réplication virale pulmonaire
observées, la réponse immune adaptative T CD8+ permettrait la génération de cellules
mémoires conférant une immunité secondaire hétérotypique. Les résultats obtenus ont
démontré qu'une réduction de la charge virale pulmonaire diminuait le recrutement de
cellules de l'immunité innée et de lymphocytes T CD8+ spécifiques au virus au site
d'infection, comparativement à forte charge virale pulmonaire. La génération des
lymphocytes T CD8+ dans les organes lymphoïdes secondaires n'était pas affectée. Ces
deux situations ont diminué la persistance de la population mémoire dans les poumons ce
qui diminue la protection des souris lors de l'infection secondaire. Notre étude aurait donc
démontré qu'une diminution de la charge virale pulmonaire pourrait avoir d'importantes
conséquences négatives sur la génération de la réponse immune adaptative et mémoire.
Mots clés : Influenza, pH, calcium, oseltamivir, dose infectieuse initiale, réponse immune
lymphocytaire T CD8+, mémoire immunologique

III
Table des matières.
Table des matières III
Liste des figures VII
Liste des tableaux X
Liste des abréviations XI
1. Introduction 1
1.1 Le virus influenza. 1
1.1.1 La grippe 1
1.1.2 Description des virus influenza 2
1.2 Les caractéristiques générales du système respiratoire 3
1.2.1 Anatomie du système respiratoire 4
1.2.2 Mécanismes de protection contre les dangers de l'environnement 5
1.2.3 Affinité particulière des souches d'influenza pour le système respiratoire 6
1.2.4 Cycle de vie du virus dans la cellule de Pépithélium pulmonaire 7
1.3 Capacité de mutagenèse et recombinaison rapide du virus 10
1.3.1 Dérive antigénique 10
1.3.2 Saut antigénique 11
1.4 Traitements, moyens de prévention et de protection 11
1.4.1 Immunité naturelle 12
1.4.2 Vaccins 13
1.4.3 Antiviraux 14
1.4.4 Antiviraux alternatifs visant des mécanismes cellulaires 15
1.5 Réponse de l'hôte lors d'une infection au virus influenza. 17
1.5.1 Système de reconnaissance et génération du milieu inflammatoire et
antiviral 17
1.5.2 Implication des cellules du système immunitaire inné et adaptatif lors de
l'infection primaire 19
1.5.3 Génération et fonctions protectrices de la population de lymphocytes T
CD8+ spécifiques mémoires 25
1.5.4 Implications des cellules de l'immunité adaptative lors de l'infection
secondaire 26
1.5.5 Effets des antiviraux efficaces sur la réponse immunitaire 29
1.5.6 Effets de la dose infectieuse initiale sur la réponse immunitaire 31
1.6 Modèles d'infection virale pour l'étude de la réponse immunitaire 32

IV
1.6.1 Différence de la réponse immune chez l'humain et la souris lors d'une
infection par le virus influenza 33
2. Hypothèses et objectifs de recherche 35
2.1 Objectifs de l'étude 36
3. Matériel et méthodes 37
3.1 Anticorps et réactifs 37
3.2 Culture cellulaire 38
3.3 Amplification virale 38
3.4 Formation des plages de lyse virales et essai d'inhibition des plaques virales....... 38
3.5 Titre viraux pulmonaires 40
3.6 Cinétique d'infection cellulaire pour quantifier l'induction du gène viral PA 40
3.7 Extraction d'ARN et qRT-PCR 40
3.8 Essai de lactate déshydrogénase (LDH) 42
3.9 Modèle de souris infectées avec l'influenza 42
3.9.1 Description du modèle murin pour caractériser l'effet antiviral des
traitements alternatifs in vivo 43
3.9.2 Description du modèle murin pour la caractérisation de la réponse immune
suite à un traitement antiviral efficace 43
3.9.3 Description du modèle murin pour la caractérisation de la réponse immune
suite à une infection avec différentes doses infectieuses initiales 44
3.10 Dissection des souris, traitement des organes et isolement des cellules 44
3.10.1 Sérum 44
3.10.2 Rate 44
3.10.3 Lavages bronchoalvéolaires (LBA) 44
3.10.4 Poumons 45
3.10.5 Ganglion du médiastin (MLN) 45
3.10.6 Dénombrement cellulaire 46
3.11 Marquage cellulaire et analyse par cytométrie en flux 46
3.12 Analyses statistiques 47
4. Résultats 48
4.1 Objectif 1 : Déterminer les effets antiviraux des agents lysosomotropes
alcalinisants et des modulateurs du calcium sur les modèles d'infection par le
virus influenza in vitro et in vivo 48
4.1.1 Effets des agents lysosomotropes alcalinisants sur la réplication du virus
influenza in vitro 48