ADN circulant, PCR digitale et cancers colorectaux

Cellules tumorales
et ADN libre circulant
dossier
thématique
ADN circulant, PCR digitale
et cancers colorectaux
Circulating DNA, digital PCR and colorectal cancers
» Les avancées récentes dans le domaine de la PCR digitale, dues
en partie à l’apport des systèmes microfluidiques, permettent
aujourd’hui la détection d’altérations moléculaires spécifiques de
tumeurs directement dans les effluents biologiques. En permettant
une analyse non invasive du statut mutationnel des patients atteints
de cancer, ces procédures pourraient devenir un outil indispensable
dans le suivi de ces patients.
Summary
RÉSUMÉ
Valérie Taly*, Philippe Nizard*, Pierre Laurent-Puig*,**
Mots-clés : ADN tumoral circulant – Cancer colorectal – PCR digitale –
Microfluidique – Biomarqueurs du cancer.
L
* Université Paris
Sorbonne Cité ;
Inserm UMR­S775 ;
centre universitaire
des Saints­Pères, Paris.
** Département
de biologie, hôpital euro­
péen Georges­Pompidou,
AP­HP, Paris.
188
a recherche d’altérations génétiques dans les
cellules tumorales fait partie de la prise en
charge des patients atteints de cancer. En effet,
ces marqueurs aident au diagnostic, au pronostic et,
surtout, à orienter le traitement dans le cadre de la
médecine de précision. Les avancées récentes dans
le domaine de la PCR digitale ouvrent la voie à la
détection et à la quantification de ces marqueurs
directement dans les liquides biologiques (ce qu’on
appelle une “biopsie liquide”), dont le plasma.
Avec plus de 600 000 morts par an dans le monde,
le cancer colorectal est une des formes les plus
communes de cancer et la seconde cause de décès
liés au cancer dans les pays occidentaux (plus de
300 000 nouveaux cas aux États-Unis et en Europe
chaque année). Son incidence augmente en France
de 1 % par an depuis 20 ans. La survie à 5 ans de ces
patients est de 40 à 50 %. Le pronostic du cancer
colorectal est étroitement associé au stade de la
maladie au moment du diagnostic. Le taux de survie
à 5 ans est de 94 % lorsque le cancer colorectal est
dépisté et traité à un stade précoce (stade I). Il est
par conséquent très important d’identifier au plus
tôt la présence ou la récidive de ce cancer. Malgré
des progrès thérapeutiques récents, le diagnostic,
le pronostic et la prédiction de la réponse théra-
Recent developements in digital PCR, greatly favorized
by microfluidics systems contribution, are now allowing
the highly sensitive detection of tumor-specific molecular
alterations directly in biological samples including blood. By
allowing the noninvasive analysis of the mutational status
of patients with cancer, these procedures could become a
major tool for patient follow-up.
Keywords: Circulating DNA – Colorectal cancer – Digital
PCR – Microfluidics – Cancer biomarkers.
peutique posent des problèmes de santé publique
encore non résolus.
Des réseaux d’altérations génétiques complexes ont
été décrits pour la plupart des cancers. Celles-ci sont
hautement spécifiques des tumeurs et permettent
donc de distinguer les cellules tumorales des cellules
saines. En permettant la caractérisation des tumeurs
à l’échelle moléculaire, de tels biomarqueurs sont
tout particulièrement intéressants pour la recherche
en cancérologie, le diagnostic et le traitement du
cancer. Les biomarqueurs du cancer peuvent être
de 3 types : pronostique (traiter ou non ?), prédictif
(quel médicament ?) et pharmacodynamique (quelle
dose ?), chacun pouvant aider au développement
de stratégies thérapeutiques efficaces et de médicaments anticancéreux.
Dans les tumeurs solides comme celles du côlon
ou du sein, au moins une quinzaine de mutations
somatiques sont présentes dans pratiquement toutes
les cellules tumorales, mais qui sont absentes des
cellules normales. Ces mutations peuvent servir de
biomarqueurs hautement spécifiques (1). De plus, une
meilleure connaissance des cibles moléculaires des
chimiothérapies a permis l’identification de facteurs
génétiques prédictifs de la réponse aux médicaments
utilisés pour le traitement des cancers digestifs et de
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ADN circulant, PCR digitale et cancers colorectaux
leur toxicité, rendant ainsi possible dans le futur de
proposer, pour chaque patient, un traitement personnalisé. Par exemple, il a été montré que la présence
de mutations de KRAS est associée à l’absence de
réponse aux traitements ciblés du cancer colorectal
employant des anticorps anti-EGFR (2).
Il a été démontré que de l’ADN libre circulant présentant des altérations génétiques spécifiques de
tumeurs pouvait être détecté dans le plasma et le
sérum de personnes atteintes de cancer (3). Ainsi, il a
été décrit que les niveaux d’ADN tumoraux circulants
chutent après résection complète de la tumeur et
augmentent à nouveau si de nouvelles lésions apparaissent. Des études préliminaires ont établi la valeur
pronostique de telles altérations et ont montré que la
présence d’ADN libre circulant associé aux tumeurs
dans le plasma peut être utilisée pour identifier des
patients avec un fort risque de récidive (3).
Les avancées des connaissances moléculaires sur
les tumeurs solides ainsi que le développement de
techniques permettant une grande sensibilité de
détection des mutations (dont les procédures de PCR
digitale que nous développerons plus loin dans cet
article) autorisent aujourd’hui la détection de l’ADN
tumoral dans des effluents biologiques. En effet, la
détection de l’ADN tumoral circulant de manière
non invasive dans le plasma, les selles ou les urines
requiert des méthodes très sensibles et, idéalement,
quantitatives. La transposition de ces techniques à
grande échelle avec un nombre important de mutations différentes est une limitation encore non résolue. En effet, la détection de tels ADN demeure un
défi, puisqu’ils représentent une très petite fraction
de l’ADN total circulant, souvent moins de 0,01 % (1).
ADN circulant libre dans le sang
La présence d’acide nucléique dans le sérum ou le
plasma a été décrite dès 1948 par Mandel et Metais (4).
La présence d’ADN circulant chez des patients atteints
de maladies systématiques a été mise en évidence une
vingtaine d’années plus tard (5). C’est en 1977 que
Leon et al. mettent en évidence de l’ADN circulant dans
le sérum de patients atteints de cancers (6) en quantité
plus importante que chez des sujets non cancéreux.
Ces résultats ont ensuite été confirmés dans une série
de cancers colorectaux (7). La concentration moyenne
de l’ADN libre circulant dans le sérum était de 118 ng/ml
chez les patients atteints de pathologie intestinale
bénigne et de 412 ng/ml chez les patients atteints
de cancers digestifs. Dans une étude plus récente,
la concentration moyenne de l’ADN circulant libre
mesurée dans le plasma était de 194 ng/ml (extrêmes :
25-980 ng/ml) chez les patients atteints de cancer
colorectal et de 3,7 ng/ml chez les sujets sains (8).
Depuis ces publications, de nombreux travaux ont été
publiés (pour une revue, voir Lecomte et al. [9]) ; ils ne
montrent pas de corrélation claire entre la quantité
d’ADN circulant et le stade tumoral.
Comme nous l’avons vu plus haut, des niveaux élevés d’ADN circulant dans le plasma ou le sérum ne
sont pas spécifiques d’une maladie maligne, mais ont
également été trouvés dans des maladies non tumorales (infarctus du myocarde, traumatisme ou maladie
inflammatoire telle que la polyarthrite rhumatoïde).
Les comparaisons entre les niveaux d’ADN circulant
et les marqueurs tumoraux couramment utilisés dans
le cancer du côlon (antigène carcinoembryonnaire
[ACE]), le cancer de la prostate (antigène prostatique
spécifique [PSA]) et le cancer du sein (CA 15-3) ont
démontré qu’ils sont corrélés de manière significative. La valeur diagnostique des niveaux sériques de
l’ADN libre circulant semble être supérieure à celle
de l’ACE pour le cancer colorectal (10). Dans le cadre
d’une étude portant sur une série de 26 patients ayant
subi une résection potentiellement R0 des métastases
hépatiques du cancer colorectal, un niveau élevé de
l’ADN circulant libre préopératoire était prédictif d’une
récidive (11). Une étude récente suggère que l’augmentation des niveaux d’ADN circulant au cours du
suivi des patients ayant subi une chirurgie R0 pour
un cancer colorectal est associée à la survenue d’une
récidive (12). En outre, dans cette étude, qui portait
sur 70 patients, la baisse des niveaux d’ADN circulant
librement, mesurée sur des échantillons de plasma
prélevés 4 et 10 mois après la chirurgie, était associée
à l’absence de récidive de la maladie.
La nature tumorale de l’ADN circulant a été montrée
en 1994 par Sorenson et al. (13), par la détection des
mutations de l’oncogène KRAS dans le plasma des
patients atteints de cancer du pancréas. Les mutations de l’oncogène KRAS détectées dans l’ADN du
plasma circulant librement étaient identiques à celles
détectées dans la tumeur primaire pancréatique de
ces mêmes patients (14-17).
Depuis ces premiers travaux, des altérations somatiques spécifiques de l’ADN tumoral ont pu être
détectées dans le plasma ou le sérum de la majorité
des tumeurs solides (18). De même, la plupart des
altérations génétiques somatiques décrites dans les
tumeurs solides ont pu être détectées dans l’ADN
circulant plasmatique ou sérique chez des patients
atteints de cancer (18).
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Cellules tumorales
et ADN libre circulant
dossier
thématique
L’origine précise de l’ADN circulant n’est pas connue.
Plusieurs hypothèses ont été proposées. L’ADN tumoral
proviendrait des cellules tumorales apoptotiques ou
nécrotiques de la tumeur primitive. Il pourrait aussi être
activement transporté à travers la membrane des cellules tumorales. Enfin, il pourrait provenir de la lyse des
cellules tumorales circulantes ou de micrométastases.
Altérations moléculaires de l’ADN circulant
libre dans le cancer colorectal
Parmi les altérations génétiques fréquemment observées dans le cancer colorectal, les mutations de l’oncogène KRAS et des gènes suppresseurs de tumeur TP53
et APC ont été détectés dans le sérum ou le plasma
des patients atteints de cancer colorectal (pour une
revue, voir Lecomte et al. [9] et les références associées). Les mutations de l’oncogène KRAS ont été les
premières altérations génétiques identifiées dans
l’ADN circulant libre chez les patients atteints d’un
cancer colorectal. Elles peuvent être détectés dans le
plasma ou le sérum de 25 à 30 % des patients atteints
de cancer colorectal. Ce faible taux de détection est
lié au fait que seuls 40 % des cancers colorectaux sont
porteurs d’une mutation de KRAS. Si l’on ne considère
que les tumeurs mutées pour l’oncogène KRAS, le taux
de détection de la même modification dans l’ADN circulant est d’environ 50 %. Cette fréquence augmente
avec le stade de la maladie, et les patients ayant une
maladie métastatique sont plus fréquemment détectés positifs dans leur plasma ou leur sérum que les
malades ayant une maladie localisée. Cependant, la
comparaison des différentes séries de la littérature
est rendue difficile, car diverses techniques ayant des
sensibilités différentes sont utilisées.
Ces différents travaux, bien qu’ils aient montré la faisabilité de la détection d’ADN tumoral circulant au
sein d’échantillons biologiques, ont également mis
en évidence la nécessité d’augmenter la sensibilité
des tests.
Méthodes d’identification d’altérations
moléculaires au sein de l’ADN circulant
libre
Comme nous l’avons vu plus haut, les altérations génétiques spécifiques de la tumeur peuvent être détectées
à partir de l’ADN tumoral présent dans le plasma et
le sérum de patients atteints de cancer colorectal.
Cependant, les techniques classiques de détection de
190
mutations ne sont pas suffisamment sensibles : leur
seuil de sensibilité est de l’ordre de 0,1 à 1 %, alors que
l’ADN tumoral circulant représente souvent moins de
0,01 % de l’ADN total circulant (19).
Le développement des procédures de PCR digitales
pourrait permettre de franchir le saut technologique
nécessaire à l’analyse systématique de l’ADN tumoral circulant (pour des revues, voir Taly et al. [20] et Baker [21]).
Dans le but d’utiliser au mieux les différentes altérations génétiques mises en évidence en tant que
biomarqueurs en oncologie clinique, il est nécessaire
de distinguer des altérations spécifiques de tumeurs
au sein de grandes quantités d’ADN provenant des
cellules normales (19). Les méthodes utilisées communément, dont la discrimination allélique par sondes
TaqMan®, l’ARMS (Amplification Refractory Mutation
System) ou le SNaPshot®, revendiquent un seuil de
détection minimal d’ADN muté de l’ordre de 0,1 à 1 %
(copies mutées au sein d’un excès de copies sauvages).
De plus, ces méthodes sont généralement qualitatives
ou ne donnent qu’une estimation vague de l’abondance des molécules d’ADN mutantes (22).
La majorité des méthodes utilisées pour caractériser
les altérations génétiques incorporent une étape de
PCR. Cette technique présente de nombreuses limitations (amplification préférentielle de petits fragments,
production de séquences chimériques, difficulté de
détecter des ADN peu représentés), en particulier pour
l’amplification de mélanges complexes d’ADN (comme
l’ADN extrait de tumeurs, du plasma ou des selles). En
effet, l’ADN issu de ces échantillons biologiques est
en fait un mélange d’ADN issu de cellules normales et
cancéreuses. Le signal obtenu lors d’un test représentera
en réalité un signal moyen qui englobera l’ensemble
des signaux correspondant aux différents ADN présents.
Dans ces conditions, la présence d’un ADN d’intérêt
peut échapper à une analyse s’il ne représente qu’une
infime fraction de la population totale, comme lors
des études diagnostiques (recherche de cellules cancéreuses circulantes, mise en évidence de génotypes
minoritaires, etc.). De plus, les tumeurs sont des tissus
génétiquement hétérogènes, ce qui limite l’utilité de
ce type d’analyse globale. En compartimentant les
molécules cibles, il devient possible de les analyser
indépendamment. Il est ainsi possible d’atteindre une
très haute sensibilité, puisque celle-ci ne dépend que
du nombre d’événements analysés. Ce concept est le
fondement de la PCR digitale, où chaque molécule
d’ADN est tout d’abord isolée dans un puits de plaque
de microtitration, avant que la présence des molécules
d’intérêt soit révélée par PCR (23). En utilisant les technologies actuelles (microplaques à 1 536 puits avec des
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ADN circulant, PCR digitale et cancers colorectaux
capacités de 1 à 2 μl), davantage de miniaturisation
est problématique : pour des volumes inférieurs au
microlitre, le comportement des liquides est dominé
par l’évaporation et les forces capillaires qui vont, par
exemple, conduire à la formation de ponts entre les
puits. L’utilisation de systèmes microfluidiques en flux
continu (non digitaux) a permis d’augmenter encore les
capacités de miniaturisation. La société Fluidigm utilise
des réseaux de valves pneumatiques pour confiner
des réactions en microréacteurs de quelques nanolitres, réduisant de ce fait les quantités de réactifs et
augmentant significativement les débits d’analyse (24,
25). Néanmoins, le débit de ces méthodes n’excède pas
quelques dizaines de milliers de réactions en parallèle,
et la réalisation d’expériences à très haut débit (plusieurs
millions de réactions parallèles) nécessite une réduction
de volume supplémentaire.
La compartimentation in vitro (IVC) est une approche
digitale où les réactions sont confinées dans les
gouttes d’une émulsion d’eau dans l’huile (26). Des
millions de compartiments d’un volume allant du
picolitre au femtolitre sont produits en parallèle par
émulsification, et chacun se comporte comme un
microréacteur indépendant contenant l’ensemble
des éléments nécessaires à une réaction. La PCR en
1. PCR
émulsion (ePCR) est une des nombreuses applications
de cette technologie qui permet de surpasser les limitations liées à l’amplification de mélanges complexes
d’ADN. Dans cette procédure, chaque réaction sur
molécule individuelle est confinée dans une gouttelette aqueuse microscopique. L’ePCR a été utilisée
pour la transcription inverse de molécules uniques,
la détection et la quantification de mutations génétiques rares, l’haplotypage et le criblage à haut débit
de cibles pour des facteurs de transcription, et permet
l’amplification de l’ADN dans 2 séquenceurs de nouvelle génération (Genome Sequencer FLX de Roche
et SOLiD® de Life Technologies) [pour une revue, voir
Taly et al. (27)]. L’utilisation de l’ePCR permet une très
forte diminution des volumes d’échantillons et de réactifs utilisés et une très forte augmentation des débits
d’analyse. Ces particularités sont autant d’avantages
quand il s’agit d’échantillons cliniques.
La pertinence de l’utilisation de l’ePCR pour les applications diagnostiques et pronostiques a déjà été
démontrée grâce à l’utilisation d’une méthode appelée BEAMing (nommée selon ces composantes : Beads,
Emulsion, Amplification et Magnetics) [28, 29] (figure 1).
L’approche BEAMing a été appliquée à la détection
d’ADN circulant du plasma et des selles (1, 30), et les
2. Émulsification
3. PCR
4. Désémulsification
A
B
Séquence
normale
Séquence
mutante
ADN circulant libre
Amplicons
extrait de plasma
avec une séquence
étiquette
C
G
Émulsion
d’eau-dans-l’huile
de milieu réactionnel
de PCR
Émulsion de billes
portant
de nombreux
amplicons
Suspension aqueuse
de billes portant
de nombreux
amplicons
C
ddG
C
PE
Séquence normale
PE
CyS
Hybridation des amorces
T
A
Extension des amorces
T
PE
Séquence mutante
T
ddA
PE
FITC
Figure 1. Principe de la procédure BEAMing : exemple d’une des stratégies utilisées pour détecter des séquences mutantes. A. Des
billes possédant de multiples variantes d’une séquence cible sont produites par une version modifiée de la procédure originale décrite
par Dressman et al. (29). B. Une procédure d’extension d’amorce est réalisée sur les séquences immobilisées sur les billes. Figure
d’après Diehl et al. (1) [Copyright (2005) National Academy of Sciences, USA. PNAS is not responsible for the accuracy of this translation].
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et ADN libre circulant
dossier
B
Création de gouttes
ADN extrait de plasma de patient
Gouttelettes contenant
de l’ADN normal
Gouttelettes contenant
de l’ADN mutant
Gouttelettes
sans ADN cible
(“vides”)
Thermocyclage des réactions (PCR)
Solution de PCR
Sonde TaqMan® VIC
spécifique de la séquence 1
(concentration haute)
Sonde TaqMan® VIC
Sonde TaqMan® FAM spécifique de la séquence 2
spécifique de la séquence 4 (concentration basse)
(concentration haute)
Sonde TaqMan®FAM
spécifique de la séquence 3
(concentration basse)
Lecture de la fluorescence
des gouttelettes individuelles
Thermocyclage des réactions (PCR)
Gouttelettes contenant
de l’ADN cible 1
Création de gouttes
Gouttelettes contenant
de l’ADN cible 2
Gouttelettes contenant
de l’ADN cible 3
Gouttelettes contenant
de l’ADN cible 4
Gouttelettes
sans ADN cible
Fluorescence rouge (VIC)
Solution de PCR
Sonde TaqMan® conjuguée
au fluorophore VIC
(spécifique de la séquence normale)
Sonde TaqMan® conjuguée
au fluorophore FAM (spécifique
de la séquence mutante)
ADN extrait de plasma
de patient
Séquences
normales
Gouttelettes
“vides”
Séquences
mutantes
Fluorescence verte (FAM)
Lecture de la fluorescence
des gouttelettes individuelles
Fluorescence rouge (VIC)
A
thématique
Séq. 1
Séq. 2
Séq. 3 Séq. 4
Fluorescence verte (FAM)
Figure 2. Représentations schématiques de stratégies de PCR digitale dites en duplex (A) ou en multiplex (B). La première stratégie permettra, par exemple,
de quantifier une séquence mutante en se basant sur la quantité mesurée de la séquence normale. La seconde stratégie permettra de détecter quantitativement
de multiples séquences cibles (modifié, d’après Taly et al. [35]).
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auteurs ont exploré la possibilité d’utiliser de l’ADN libre
circulant dérivé de tumeurs pour la prise en charge du
cancer colorectal (pour un commentaire dans Nature
Medecine, voir Fleischhacker et Schmidt [31]).
Ces limitations peuvent être résolues en utilisant des
systèmes microfluidiques pour la production des gouttelettes (polydispersité < 1,5 %) et leur manipulation. Ainsi,
des systèmes microfluidiques peuvent être employés
pour produire, manipuler et analyser des gouttelettes
d’un volume allant du picolitre au nanolitre (22, 32).
Ces systèmes ont permis le développement de stratégies de PCR digitale simples permettant la détection très
sensible de mutations rares au sein de mélanges d’ADN
complexes (33, 34) [voir figure 2 pour des exemples de
stratégies]. Ces procédures ont également été étendues
à la détection en multiplex de différentes mutations de
l’oncogène KRAS au sein d’échantillons d’ADN circulant
issus de patients atteints de cancer colorectal avancé (35).
L’ensemble des travaux visant à l’utilisation de la PCR
digitale pour l’évaluation des échantillons sanguins de
patients ouvre une voie prometteuse pouvant mener à
l’utilisation clinique systématique de biopsies liquides
dans le cadre du cancer colorectal. De nombreuses
procédures ont été décrites, et différents appareils commerciaux utilisant la PCR digitale ont été développés
ces dernières années, offrant la possibilité de réaliser
des expériences de validation de l’utilisation de la PCR
digitale pour l’analyse de ce type d’échantillons à grande
échelle impliquant des collections rétrospectives et
prospectives de patients. Ainsi, l’ADN circulant pourra
être utilisé pour évaluer la réponse au traitement et
pour identifier les événements de récurrences de cancer.
Son analyse pourra fournir une image en temps réel du
statut mutationnel du patient sans avoir à se reposer sur
des échantillons archivés de la tumeur primitive ou à
effectuer des biopsies invasives de sites métastatiques.
Finalement, la possibilité de détecter l’ADN tumoral circulant ouvre également la possibilité d’un dépistage et
d’un diagnostic précoces avant qu’un cancer devienne
cliniquement détectable (36).
■
5
M
e
N
V. Taly déclare avoir des liens d’intérêts avec Raindance Technologies.
P. Nizard déclare ne pas avoir de liens d’intérêts.
P. Laurent­Puig déclare avoir des liens d’intérêts avec Raindance Technologies, Merck et Amgen.
192
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14213_
ADN circulant, PCR digitale et cancers colorectaux
ADN circulant, PCR digitale
et cancers colorectaux
Circulating DNA, digital PCR and colorectal cancers
Valerie Taly*, Pierre Laurent-Puig*,**
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