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5)µ4& &OWVFEFMPCUFOUJPOEV %0$503"5%&-6/*7&34*5²%&506-064& %ÏMJWSÏQBS Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier) 1SÏTFOUÏFFUTPVUFOVFQBS Camille Lehuédé le vendredi 29 mai 2015 5JUSF Rôle paracrine des adipocytes dans la progression tumorale mammaire et la chimiorésistance : sécrétions impliquées et régulation par l'obésité ²DPMF EPDUPSBMF et discipline ou spécialité ED BSB : Biotechnologies, Cancérologie 6OJUÏEFSFDIFSDIF IPBS, CNRS, UMR 5089 %JSFDUFVSUSJDFT EFʾÒTF Pr Catherine MULLER Pr Philippe VALET Jury : Pr Bettina COUDERC Pr Charles DUMONTET Pr Bruno FEVE Pr Catherine MULLER Pr Philippe VALET Examinateur Rapporteur Rapporteur Directeur de thèse Directeur de thèse Remerciements Je remercie tout d’abord le Pr Charles Dumontet, le Pr Bruno Feve ainsi que le Pr Bettina Couderc de m’avoir fait l’honneur de participer à mon jury de thèse. Merci d’avoir accepté de juger mon travail et d’avoir permis d’élargir le sujet sur des discussions très intéressantes lors de la soutenance. Merci également d’avoir aidé à rendre cette journée parfaite. Je souhaite vraiment remercier mes deux directeurs de thèse, le Pr Catherine Muller et le Pr Philippe Valet. Cathie, je vous remercie sincèrement de m’avoir fait grandir tout au long de cette thèse. J’ai bien conscience de ne plus être tout à fait la même personne. Merci de m’avoir fait confiance dès le début pour mener cette thèse à bien et merci pour votre créativité scientifique qui est une excellente base pour la suite de mon projet professionnel. Merci également pour votre disponibilité. Philippe, merci pour votre gentillesse, merci de veiller sur nous du haut de la colline. Merci également d’avoir été là dans les moments importants de ma thèse. Je remercie tous les membres de l’équipe MICA, qu’ils soient « anciens » ou « nouveaux » ont tous partagé ce moment important de ma vie. Merci à Lud, mon « ange gardien ». C’est toi qui m’as tout appris, de la culture des adipo aux petits conseils bien distribués tout au long de ma thèse. Merci de m’avoir fait confiance pour reprendre ton projet. Merci aussi pour le super film !!!! Merci à Fred d’avoir largement contribué au projet chimiorésistance. Merci également de le reprendre. Je te confie mon « bébé » avec sérénité. Thank you to Xia, for your participation to the chemoresistance project. It was a very good experience for me to supervise you. Thank you for understanding my English ;)! Good luck for your thesis! Je remercie particulièrement la princesse Ikrame, qui au fur et à mesure de ces années, est devenue une vraie amie. Merci pour ton énorme soutien autant professionnel que personnel. J’ai bien conscience que ma thèse n’aurait pas été la même sans toi ! Je n’ai aucun doute qu’on continuera à garder contact sans trop de problème ! « Ah oui hein ! ». Un grand merci à Laurence. Merci de m’avoir supervisée quelques temps. Merci pour ton expertise scientifique et technique et surtout pour tous les petits conseils que tu m’as donnés tout au long de ma thèse. Merci aussi pour toutes les discussions professionnelles ou non qu’on a pu avoir autour d’un café. Merci à ma petite poule (ça y’est c’est adopté !) Emily. Merci pour ces derniers mois, où ta présence est devenue très importante pour moi. Merci à toi pour ton soutien et ton aide scientifique. Tu es toute jeune et déjà très douée. Merci à Victor d’avoir partagé ces 4 ans avec moi. Merci de m’avoir toujours aidée et épaulée pendant ma thèse, aussi bien expérimentalement que scientifiquement, avec toujours une humeur égale et jamais de jugement. C’était vraiment chouette de partager ma thèse avec toi ! Merci à Steph pour ton énorme contribution sur le projet. Merci pour ton expertise en microscopie et pour ta formation « béton » (quasi double aveugle !). Merci également pour tes conseils au quotidien et les découvertes musicales. Merci à Delphine, surtout pour ces derniers mois. J’ai beaucoup apprécié te connaître de plus en plus. Merci pour ta bonne humeur, ta gentillesse et tes conseils (professionnels ou non). Thanks to YuanYuan for your kindness. It was very nice to share some good moments with you in our office and to discover the Chinese culture. Merci à Adrien, d’avoir partagé le bureau quelques temps. Merci pour ta générosité et ta disponibilité pour les souris. Merci aux « Charlottes », pour votre dynamisme et votre investissement sur les différents projets. Merci à Matthieu et Aurélie d’avoir partagés la vie de labo avec moi pendant quelques temps. Merci à mes stagiaires, Camille, Marion et Marie, qui ont participé aux différents projets et qui m’ont bien faite progresser dans l’organisation, la rédaction, la pédagogie et aussi la confiance en moi. Merci à Yvane pour ton aide pour la « paperasse », ta gentillesse et ta disponibilité. Merci à Sébastien pour ton aide précieuse en informatique. Merci de ne jamais me prendre pour un « boulet » (ou en tout cas de ne jamais le montrer ;)) Merci à Sophie de prendre bien soin de nos petites souris ! Un grand merci à Oriane pour ta sensibilité, ton humour, ton amitié, tes « pauses-café », ta relecture de ma thèse, tes conseils et ton soutien sans faille pendant toutes ces années. Je me retrouve beaucoup en toi et tu as un été un « modèle » pour moi. Ne change surtout pas, tu es parfaite comme ça ! Merci à Emilie, pour ta disponibilité sans limite, ton sourire, ta gentillesse, tes bons repas et ta pédagogie sur les glandes mammaires ! Tu as également été d’un grand soutien pour moi tout au long de ma thèse. Merci à Cécile d’avoir partagée les bons moments et les galères pendant ma thèse, surtout au début et à la fin. On peut dire qu’on a traversé notre thèse côte à côte et c’était super chouette de t’avoir à mes côtés ! Merci à Relo pour ton soutien, ton honnêteté. Merci pour cette complicité qui s’est progressivement tissée. Merci au maître pour ta générosité et de te rendre toujours disponible pour tout et n’importe quoi. Merci à Baérasse et Pauline pour les bons moments passés ensemble. Merci à toutes les personnes de l’IPBS avec qui j’ai pu interagir, en particulier Nathalie, Isa, Leyre, Serge, Pascal, Bertrand, Anaïs et Fatima. Je tiens particulièrement à remercier sincèrement tous mes amis. Merci à Aline, Aurel, Orély, Etienne, Max, Nico, Sam, Marielle, les Chouchoux, Antoine, Carline … Merci à vous pour tous les moments « extra-thèse », passés à Toulouse ou ailleurs qui ont été tellement importants et qui ont permis d’équilibrer de manière cruciale ma vie pendant la thèse. Merci pour votre soutien, votre affection et tout simplement votre amitié. Je ne suis pas sûre que j’aurais réussi à traverser cette épreuve sans vous. Merci à Neige et les filles qui m’ont permis de me détendre et de me défouler, ainsi que de passer des moments supers et des fou-rires. Enfin, je remercie chaleureusement ma famille sans qui rien n’aurait été possible. Merci à mes parents pour votre amour et votre disponibilité sans limite. J’ai conscience de l’énergie que vous déployez pour m’aider au mieux dans mes projets. Merci de m’aider à assumer mes choix, malgré les doutes qui ont pu exister. Vous représentez un vrai pilier pour moi. Merci à mes frères, mes belles-sœurs et les petits loups pour vos sourires et tous ces moments ressourçants… Rôle paracrine des adipocytes dans la progression tumorale mammaire et la chimiorésistance : sécrétions impliquées et régulation par l’obésité 1 2 Résumé de la thèse De nombreux arguments ont mis en évidence que la progression tumorale est non seulement dépendante des cellules tumorales mais aussi des cellules « saines » du microenvironnement (encore appelées stroma) qui entourent la tumeur. Parmi les cellules stromales présentes dans le microenvironnement du cancer du sein, les adipocytes représentent des acteurs émergents dans la progression tumorale. Mon équipe est l’une des premières à avoir montré l’importance des adipocytes péritumoraux dans l’agressivité des cancers du sein. Le dialogue bidirectionnel entre les adipocytes et les cellules tumorales donne lieu à des modifications des deux types cellulaires : les cellules tumorales « éduquées » par les adipocytes présentent une augmentation de leurs capacités invasives et une résistance plus importante à la radiothérapie et les adipocytes co-cultivés avec les cellules tumorales acquièrent un phénotype activé, que nous avons appelé CAAs pour « Cancer-Associated Adipocytes ». Etudier le dialogue croisé entre adipocytes et cellules tumorales est d’importance en médecine, car l’obésité est un facteur reconnu de mauvais pronostic dans de nombreux cancers, notamment le cancer du sein. Chez ce type de patientes, on retrouve des cancers plus agressifs et une résistance plus importante à la chimiothérapie. Le premier objectif de ma thèse a été de poursuivre la caractérisation de l’interaction entre adipocytes et cellules cancéreuses afin de mieux comprendre le rôle des adipocytes dans la progression tumorale mammaire ainsi que les mécanismes impliqués. Ainsi, nous avons montré que lorsque les CAAs sont maintenus en présence des cellules tumorales pendant un temps prolongé, ils sont profondément remaniés aussi bien sur le plan morphologique que fonctionnel. En effet, les CAAs s’allongent progressivement jusqu’à l’apparition d’une morphologie fibroblastique. L’ensemble de leurs caractéristiques, notamment l’expression de FSP-1 (Fibroblast specific protein-1), suggère fortement que ces cellules modifiées représentent une sous-population de fibroblastes associés au cancer (CAFs). Nous avons nommé ces cellules, ADFs pour « Adipocytes-Derived Fibroblasts » et montré que ces derniers, présents dans des tumeurs mammaires humaines, favorisent de manière importante l’invasion des cellules tumorales. Le deuxième objectif de ma thèse a été d’évaluer le rôle des adipocytes dans la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires. En effet, la résistance est une limite majeure à l’efficacité des traitements et contribue à l’apparition de rechutes. Ainsi, nos résultats montrent que les adipocytes sont capables de promouvoir une résistance pléiotropique (doxorubicine, paclitaxel et 5-fluorouracile) dans diverses lignées tumorales mammaires, en favorisant l’expulsion de la drogue en dehors de son site d’action nucléaire. Ce mécanisme d’efflux est réalisé par un processus original, qui implique la protéine LRP/MVP (Lung resistance protein / Major vault protein) et l’encapsulation de drogue dans des vésicules exocytotiques afin de permettre son efflux hors de la cellule. Enfin, cette chimiorésistance médiée par les adipocytes est amplifiée en conditions d’obésité. En conclusion, nos résultats montrent que les adipocytes péritumoraux sont capables d’influencer considérablement la progression tumorale, d’une part en participant à la réaction desmoplasique avec les fibroblastes activés localement présents et d’autre part en favorisant la chimiorésistance. Ces travaux pourraient expliquer, en moins en partie, le mauvais pronostic des cancers du sein chez les patientes obèses et ouvrent donc, à plus long terme, des perspectives thérapeutiques intéressantes, destinées à interrompre le dialogue délétère entre adipocytes et cellules tumorales, en particulier chez les patients obèses. 3 4 Thesis abstract Compelling evidence has demonstrated that tumor progression is the product of an evolving crosstalk between tumors and their surrounding stroma, constituting the tumor microenvironment. Among stromal cells present in breast cancer, adipocytes represent emerging players in tumor progression. My team was among the first to decipher the importance of peritumoral adipocytes in breast cancer aggressiveness. The bidirectionnal crosstalk between adipocytes and tumor cells gives rise to changes in both cell types: tumor cells "educated” by adipocytes exhibit an increase in their invasive abilities and a greater resistance to radiotherapy, and adipocytes cocultivated with tumor cells acquire an activated state. We called these cells CAAs for "Cancer-Associated adipocytes". Studying the role of adipocytes in cancer is a major interest since epidemiological studies have convincingly established that obesity is associated with a poor outcome for several cancers, especially breast cancer, where patients present with more aggressive cancers and increased chemotherapy resistance. The first topic of my PhD was to further characterize the interaction between adipocytes and breast cancer cells to better understand the role of adipocytes in breast tumor progression. Thus, we demonstrated that some CAFs (Cancer-Associated Fibroblasts) present in the breast tumor stroma arise from the “dedifferenciation” of adipocytes upon prolonged stimulation by tumor cells. Adipocytes cocultivated with breast cancer cells exhibit a marked decrease in lipid content and progressively acquire features of activated-fibroblasts including overexpression of FSP-1 (Fibroblast Specific Protein-1). This population was named ADFs (Adipocytes-Derived Fibroblasts) and was found in clinical samples of breast cancer. We further demonstrated that ADFs stimulate the invasive capacities of tumor cells. The second aim of my thesis was to evaluate the role of adipocytes in the chemoresistance of breast tumor cells. Drug resistance represents one of the major obstacles in cancer treatment leading to reduced efficacy of chemotherapy and relapses. Thus, our results suggest that adipocytes promote multidrug resistance (doxorubicin, paclitaxel and 5-fluorouracil) in various breast cancer cell lines. Adipocyte-induced chemoresistance is mediated by an original mechanism driving the drug away from intracellular targets. This efflux process is performed by an emerging concept dependent on LRP / MVP (Lung Resistance Protein / Major Vault Protein) and the release of extracellular vesiclescontaining doxorubicin. Finally, we demonstrated that adipocyte-induced chemoresistance is amplified by obesity. In conclusion, our findings highlight the role of tumor surrounding adipocytes in cancer progression, which participate in the desmoplastic reaction through the dedifferentiation into activated fibroblasts, and which promote chemoresistance. This work may explain, at least in part, the poor prognosis of breast cancer in obese patients and could provide interesting therapeutic targets in order to interrupt this deleterious crosstalk, particularly in obese patients. 5 6 LISTE DES ABREVIATIONS ABC ADF ADSCs AG AI ANP APC ARF6 ATGL ATM ATP-Binding Cassette Adipocyte-Derived Fibroblast Adipose Derived-Stem Cells Acide Gras Anti-Aromatase Atrial Natriuretic Peptide Adenomatous Polyposis Coli ADP-ribosylation factor 6 Adipocyte Triglyceride Lipase Ataxia Telangiectasia Mutated BAT Bcl-2 BCRP BER BMAT BMDCs BNP BRCA BRITE Brown Adipose Tissue B-Cell Lymphoma-2 Breast Cancer Resistance Protein Base Excision Repair Bone Marrow Adipose Tissue Bone Marrow-Derived Cells Brain Natriuretic Peptide Breast Cancer BRown in whITE CAA CAF CAM-DR CBR CCL CD CEPB Chk CLS Cox CREB3L1 CSC CTGF CXCL Cancer-Associated Adipocyte Cancer-Associated Fibroblast Cell Adhesion-Mediated Drug Resistance Carbonylreductase Chemokine Ligand Cluster of differenciation CAAT/Enhancer Binding Protein Checkpoint Kinase Crown-Like Structure Cyclooxygenase Cyclic AMP-responsive Element-Binding protein 3-Like protein 1 Cancer Stem Cell ou Cellule Souche Cancéreuse Connective Tissue Growth Factor Chemokine (C-X-C motif) Ligand DFAT DDR DSB Dvl Dedifferenciated Fat Cells DNA Damage Repair DNA double-Strand Break Dishevelled EGF EMDR EMT EndoMT ER ESCRT ETP BMDCs (Bone FABP FAK FAP FGF Epidermal Growth Factor Environment Mediated Drug Resistance Epithelial-Mesenchymal Transition Endothelial-Mesenchymal Transition Estrogen Receptor Endosomal Sorting Complex Required for Transport Endotrophine Fatty Acid Binding Protein Focal Adhesion Kinase Fibroblast Activated Protein Fibroblast Growth Factor 7 FOXP3 FSP-1 FTC 5-FU FZD Forkhead box P3 Fibroblast Specific Protein-1 Fumitremorgin-C 5-Fluorouracil Frizzled GSC GSK-3β GSH GST Glycosylceramide synthase Glycogen Synthase Kinase -3β Glutathion Glutathion S-Transferase HER HEV HGF HIF HMGB1 HR HSL Human Epithelial growth factor Receptor High Endothelial Venule Hepatocyte Growth Factor Hypoxia-Inducible Factor High Mobility Group Box 1 Homologous Recombination Hormonosensitive Lipase ICL IDC IFN IGF IL ILC IMC InCA Interstrand Crosslink Invasive Ductal Carcinoma Interferon Insulin Growth Factor Interleukin Invasive Lobular Carcinoma Indice de Masse Corporelle Institut National du Cancer JAK Janus Kinase KLF Kruppel-Like zinc Finger transcription factor LEF/TCF LOX LPL LRP LRP5/6 Lymphoid-Enhancer-Binding factor / T-Cell specific transcription factor Lysyl Oxydase Lipoprotein Lipase Lung Resistance Protein Lipoprotein Receptor-related Protein-5 or 6 MAGL MAT MBC MCP M-CSF MDR MEC MET MHO MMP MMR MMT MMTV MRP MSC MV MVB MVP Monoacylglycerol Lipase Mammary Adipose Tissue Metastatic Breast Cancer Monocyte Chemoattractant Protein Macrophage Colony Stimulating Factor Multidrug Resistance Matrice Extra-Cellulaire Mesenchymal-Epithelial Transition Metabolic Healthy Obese Matrix Metalloproteinase Mismatch Repair Mesenchymal-Mesenchymal Transition Mouse Mammary Tumor Virus Multidrug Resistance-associated Protein Mesenchymal Stem Cell Microvesicle Microvesicular Body Major Vault Protein 8 NADH NBD NER NF-κB NG2 NHEJ NK NOS NPC Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Nucleotide Binding Domain Nucleotide Excision Repair Nuclear Factor kappa B Neural Glial antigen 2 Non-Homologous End-Joining Natural Killer Nitric Oxyde Synthase Nuclear Pore Complex OSM Oncostatine PAI-1 PCP PDGF PDGFR PDPN P-gp Pim PKA PKG PPAR Pref-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1 Planar Cell Polarity Platelet-Derived Growth Factor Platelet-Derived Growth Factor Receptor Podoplanine P-glycoprotein Proviral integrations of moloney virus Protéine Kinase dépendante de l’AMPc Protéine Kinase dépendante du GMPc Peroxysome Proliferator Activated Receptor Preadipocyte secreted factor-1 RE RH RP ROS RR Récepteur aux Estrogènes Récepteurs Hormonaux Récepteur à la Progestérone Reactive Oxygen Species Risque Relatif SAT SDF-1 SERM SFRP SLC α-SMA SNARE SOD SREBP STAT SVF Subcutaneous Adipose Tissue Stromal Derived Factor-1 Selective Estrogen Receptor Modulator Secreted Frizzled-Related Protein Solute Carrier α-Smooth Muscle Actin Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptors Superoxyde Dismutase Sterol Regulatory Element Binding Protein Signal Transducer and Activator of Transcription Stromal Vascular Fraction TA TAF TAM TAN TEP-1 TG TGF-β TGFBR2 Th TIL TIMP TLR TMD TNBC Tissu Adipeux Tumor-Associated Fibroblast Tumor-Associated Macrophage Tumor-Associated Neutrophil Telomerase-Associated Protein-1 Triglycéride Transforming Growth Factor-β Type-2 TGF-β Receptor T-helper Tumor-Infiltrating Lymphocyte Tissue Inhibitor Metalloproteinase Toll-Like Receptor Transmembrane Domain Triple Negative Breast Cancer 9 TNF-α Topo2 TNM Treg Tumor Necrosis Factor-α Topoisomérase II Tumor – Nodes - Metastasis T-regulator UCP-1 uPA Uncoupling Protein-1 Urokinase type Plasminogen Activator VAT VE VEGF VLDL VPARP Visceral Adipose Tissue Vésicule Extra-cellulaire Vascular Endothelial Growth Factor Very Low Density Lipoprotein Vault Poly (Adenosine diphosphate Ribose) Polymerase WAT WNT White Adipose Tissue Wingless-type MMTV integration site 10 SOMMAIRE INTRODUCTION .............................................................................................................. 15 INTRODUCTION GENERALE........................................................................................... 17 PARTIE I : LE MICROENVIRONNEMENT TUMORAL................................................... 19 1) 2) 3) Composition du microenvironnement tumoral ....................................................................... 19 1-1) Généralités .................................................................................................................... 19 1-2) Les cellules immunitaires ............................................................................................... 20 a) Les TAMs (Tumor-Associated Macrophages) ................................................................ 21 b) Autres populations leucocytaires .................................................................................... 22 1-3) L’angiogenèse ............................................................................................................... 23 1-4) La matrice extra-cellulaire (MEC).................................................................................. 25 Les CAFs (Cancer-Associated Fibroblasts) ............................................................................ 26 2-1) Généralités .................................................................................................................... 26 2-2) Caractérisation des CAFs ............................................................................................... 28 2-3) Origines des CAFs ......................................................................................................... 30 a) Les fibroblastes résidents ............................................................................................... 30 b) Les MSCs (Mesenchymal Stem Cells) ........................................................................... 31 c) Cellules tumorales ......................................................................................................... 32 d) Cellules endothéliales .................................................................................................... 32 e) ADSCs (Adipose-Derived Stem Cells) ........................................................................... 32 f) Autres sources de CAFs ................................................................................................. 33 2-4) Rôle de CAFs dans la progression tumorale (pour revue (Ohlund et al 2014)) ................ 34 Les adipocytes ....................................................................................................................... 38 3-1) Le tissu adipeux (TA) .................................................................................................... 38 a) Composition du TA ....................................................................................................... 38 b) Localisation des différents tissus adipeux blancs ............................................................ 39 3-2) Les adipocytes ............................................................................................................... 41 a) Origine et différenciation ............................................................................................... 41 b) La plasticité des adipocytes ............................................................................................ 47 c) Rôle physiologique des adipocytes ................................................................................. 47 3-3) Adipocytes et cancer ...................................................................................................... 50 a) Le tissu adipeux dans le stroma tumoral ......................................................................... 50 b) Rôle paracrine des adipocytes dans la progression tumorale : les CAAs.......................... 51 c) Rôle endocrine des adipocytes dans la progression tumorale .......................................... 53 d) Rôle des ADSCs dans la progression tumorale ............................................................... 55 PARTIE II : L’OBESITE ET LE CANCER DU SEIN .................................................... 59 1) Le cancer du sein................................................................................................................... 59 11 2) 3) 1-1) Epidémiologie et facteurs de risque ................................................................................ 59 a) Epidémiologie ............................................................................................................... 59 b) Facteurs de risque .......................................................................................................... 59 1-2) Origine du cancer du sein ............................................................................................... 61 a) La glande mammaire ..................................................................................................... 61 b) Origine du cancer du sein ............................................................................................... 62 1-3) Classification des cancers du sein................................................................................... 63 a) Classification histopathologique actuelle ........................................................................ 63 b) Classification moléculaire .............................................................................................. 64 1-4) Traitements et limites des traitements des cancers du sein .............................................. 66 a) Chirurgie et radiothérapie .............................................................................................. 66 b) Chimiothérapie, hormonothérapie et thérapie ciblée ....................................................... 67 c) Résistance à la chimiothérapie ....................................................................................... 69 L’obésité : un facteur de risque et un facteur affectant le pronostic du cancer du sein ............. 70 2-1) Généralités .................................................................................................................... 70 2-2) Les modifications des tissus adipeux par l’obésité .......................................................... 71 a) Le TA sous-cutané et viscéral ........................................................................................ 71 b) Le TA mammaire........................................................................................................... 74 2-3) Modèles d’études de l’obésité in vitro ............................................................................ 75 Obésité et cancer du sein ....................................................................................................... 76 3-1) Epidémiologie ............................................................................................................... 76 a) Obésité et incidence des cancers .................................................................................... 76 b) Obésité et pronostic des cancers ..................................................................................... 77 3-2) Mécanismes non biologiques affectant le pronostic ........................................................ 78 a) Le dépistage tardif ......................................................................................................... 78 b) Administration insuffisante des doses de chimiothérapie ................................................ 78 3-3) Mécanismes biologiques affectant la progression tumorale (figure 23) ........................... 79 a) Hyperglycémie et hyperinsulinémie ............................................................................... 79 b) Les hormones sexuelles ................................................................................................. 79 c) L’inflammation chronique ............................................................................................. 80 d) Les adipokines ............................................................................................................... 81 e) Hypoxie, angiogenèse et lymphangiogenèse ................................................................... 81 f) Fibrose .......................................................................................................................... 82 g) Autres mécanismes ........................................................................................................ 82 3-4) Cas particulier : Obésité et chimiorésistance................................................................... 84 a) Arguments cliniques ...................................................................................................... 84 b) Arguments pharmacocinétiques ..................................................................................... 84 c) Arguments biologiques .................................................................................................. 85 PARTIE III : LES MECANISMES DE CHIMIORESISTANCE .................................... 89 12 1) 2) 3) 4) Mécanisme d’action de la doxorubicine ................................................................................. 89 1-1) Généralités .................................................................................................................... 89 1-2) Pharmacocinétique de la doxorubicine ........................................................................... 90 1-3) Poison des topoisomérases II (figure 28) ........................................................................ 90 1-4) Rôle des radicaux libres (figure 28) ................................................................................ 91 1-5) Formation d’adduits et de pontages à l’ADN (figure 28) ................................................ 93 1-6) Libération de céramide (figure 28) ................................................................................. 93 Les mécanismes de résistance de la doxorubicine .................................................................. 94 2-1) Généralités .................................................................................................................... 94 2-2) Modification de la disponibilité intra-tumorale du médicament (figure 29) ..................... 95 a) L’influx ......................................................................................................................... 95 b) La métabolisation de la drogue....................................................................................... 96 2-3) Modifications de la topoisomérase II (figure 29) ............................................................ 97 2-4) La réparation des dommages à l’ADN (figure 29). ......................................................... 98 2-5) Echappement à la mort cellulaire (figure 29) .................................................................. 99 2-6) La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT).......................................................... 100 Mécanismes d’efflux de la doxorubicine .............................................................................. 101 3-1) Les transporteurs ABC ................................................................................................. 102 a) Généralités .................................................................................................................. 102 b) Transporteurs ABC et multi-résistance ......................................................................... 103 c) La glycoprotéine P ....................................................................................................... 104 d) La sous-famille des MRPs ........................................................................................... 107 e) La BCRP ..................................................................................................................... 108 3-2) La protéine MVP / LRP ............................................................................................... 109 a) Découverte .................................................................................................................. 109 b) Structure et composition .............................................................................................. 110 c) Localisation et fonctions biologiques ........................................................................... 111 d) MVP et chimiorésistance ............................................................................................. 111 e) Hypothèses du rôle de MVP dans la chimiorésistance .................................................. 112 3-3) L’efflux vésiculaire...................................................................................................... 114 a) Les vésicules intra-cytoplasmiques .............................................................................. 114 b) Les vésicules extra-cellulaires ...................................................................................... 115 Rôle du microenvironnement dans la chimiorésistance ........................................................ 117 4-1) Généralités .................................................................................................................. 117 4-2) Rôle des adipocytes dans la résistance aux drogues ...................................................... 118 OBJECTIFS DE THESE ................................................................................................. 121 RESULTATS .................................................................................................................... 125 Article 1. Un nouveau phénotype d’origine adipocytaire : Les fibroblastes dérivés des adipocytes ou ADFs (Adipocytes-Derived Fibroblasts) ....................................................... 127 13 Article 2. Les adipocytes péritumoraux participent à la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires à la doxorubicine, potentiellement via un mécanisme dépendant de LRP/MVP et des vésicules.................................................................................................. 129 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................. 131 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................ 145 ANNEXE ........................................................................................................................... 175 14 INTRODUCTION 15 16 INTRODUCTION GENERALE Au cours de ces dix dernières années, de très nombreuses observations ont mis en exergue que la progression tumorale est issue non seulement des modifications des cellules tumorales elles-mêmes, mais également des cellules du microenvironnement ou stroma tumoral. Parmi les cellules qui constituent le microenvironnement tumoral, les adipocytes représentent le composant majoritaire du stroma de certains cancers, notamment le cancer du sein, qui est le modèle d’étude que j’ai utilisé pour ce travail de thèse. De plus, hormis leur fonction de stockage des graisses, les adipocytes sont des cellules plastiques, capables de sécréter diverses molécules (appelées adipokines), susceptibles de moduler le comportement de la tumeur. Par conséquent, la caractérisation du rôle joué par les adipocytes dans le cancer représente un objectif crucial, d’autant plus que l’obésité est un facteur de mauvais pronostic global notamment pour le cancer du sein. En effet, les femmes obèses atteintes d’un cancer du sein présentent une diminution de la survie globale, de la survie sans maladie et une augmentation des métastases, des rechutes et de la résistance à la chimiothérapie. La chimiothérapie représente actuellement le traitement de référence pour traiter un cancer du sein localement agressif (traitement adjuvant ou néoadjuvant) ou métastatique. Malheureusement, une résistance à la chimiothérapie est souvent observée et est à l’origine de la progression de la tumeur et de l’augmentation des rechutes. De nombreux arguments suggèrent que cette résistance peut être médiée par les cellules du stroma tumoral. L’objectif de ma thèse a donc été de caractériser le rôle des adipocytes dans la progression tumorale mammaire, en étudiant, d’une part, le dialogue qui s’établit entre les adipocytes et les cellules cancéreuses et d’autre part en évaluant l’effet des adipocytes sur un aspect précis de la progression tumorale : la chimiorésistance. Au cours de ces travaux, un objectif important de ma thèse a été de déterminer si le dialogue délétère qui s’établit entre les cellules tumorales et les adipocytes est amplifié dans des conditions d’obésité. Avant de présenter mes résultats, je ferai le point sur l’état des connaissances actuelles concernant le microenvironnement tumoral, en me focalisant plus particulièrement sur les adipocytes. Dans un deuxième temps, le cancer du sein, l’obésité et le lien qui les réunit seront étudiés. Pour finir, je terminerai cette introduction, en décrivant des mécanismes d’action et des mécanismes de résistance de la doxorubicine, molécule thérapeutique majeure dans le traitement des cancers du sein. Les résultats obtenus au cours de ma thèse se découpent en deux parties distinctes. Dans la première partie, nous montrerons que les cellules tumorales mammaires influencent considérablement le phénotype des adipocytes. En effet, sous l’influence prolongée des sécrétions tumorales, les adipocytes se réorientent progressivement en cellules fibroblastiques, présentant des caractéristiques de fibroblastes associés au cancer. Nous avons appelé ces cellules ADFs pour Adipocyte-Derived Fibroblasts et montré qu’elles participent à la progression tumorale (Article 1). Dans la seconde partie, 17 nous avons mis en évidence que les adipocytes contribuent à la résistance des cellules tumorales mammaires à la doxorubicine, lesquelles présentent un phénotype de résistance croisée à diverses chimiothérapies. De manière intéressante, cette chimiorésistance est amplifiée dans un contexte d’obésité (Article 2). 18 PARTIE I : LE MICROENVIRONNEMENT TUMORAL 1) Composition du microenvironnement tumoral 1-1) Généralités Bien que longtemps considéré comme une masse unique de cellules malignes, il est maintenant clairement établi que le cancer représente un véritable organe complexe et multicellulaire (Mueller and Fusenig 2004). Les cellules tumorales évoluent et coexistent dans un microenvironnement ou stroma tumoral, composé de nombreux types cellulaires non tumoraux. Ces cellules dites « saines » sont recrutées et/ou activées localement par les cellules tumorales. L’interaction dynamique entre les cellules tumorales et les cellules stromales permet la progression de la tumeur (Balkwill et al 2012). En effet, au cours de la progression du cancer, les cellules tumorales modifient profondément les cellules du microenvironnement, qui vont en retour favoriser la croissance, la dissémination et la résistance de la tumeur aux traitements (Mueller and Fusenig 2004). C’est en 1986 qu’Harold Dvorak remarque que la formation du stroma tumoral et le processus de cicatrisation présentent des similitudes. En effet, ces deux événements mettent en jeu des processus, tels que la prolifération, la survie, la migration, contrôlés par des facteurs de croissance, des cytokines, des signaux inflammatoires et angiogéniques. Cependant, une différence majeure existe entre ces deux processus : alors que la cicatrisation est auto-limitée dans le temps et dans l’espace, les tumeurs activent leur stroma de façon constitutive et permanente. H. Dvorak définit ainsi une tumeur comme « une plaie qui ne cicatrise jamais » (Dvorak 1986). Le microenvironnement tumoral est classiquement composé de cellules immunitaires, de cellules endothéliales, de péricytes, de fibroblastes, d’adipocytes et de précurseurs cellulaires, comme des BMDCs (Bone Marrow-Derived Cells), des ADSCs (Adipose Derived-Stem Cells) et des MSCs (Mesenchymal Stem Cells) ; ces cellules sont comprises dans une matrice extra-cellulaire (MEC) caractéristique. La tumeur est ainsi vascularisée par un réseau de vaisseaux sanguins et lymphatiques (figure 1). La communication inter-cellulaire est régie par différents facteurs solubles, tels que des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance et des enzymes impliquées dans le remodelage de la MEC, mais également par des vésicules extra-cellulaires. La perturbation des propriétés physiques et chimiques des tissus joue également un rôle dans la progression tumorale (Balkwill and Mantovani 2001) (Balkwill et al 2012). Les caractéristiques communes de la plupart des cellules du microenvironnement tumoral ainsi que leur faible taux d’instabilité génétique, suggèrent que le ciblage du microenvironnement tumoral, ou des médiateurs de leur communication inter-cellulaire pourrait avoir des applications thérapeutiques 19 intéressantes en complément ou non d’autres options thérapeutiques (Balkwill and Mantovani 2001) (Balkwill et al 2012). Figure 1. Composition du microenvironnement tumoral. Les cellules tumorales (« tumour cell ») sont entourées de cellules immunitaires (« immune infiltrate »), de fibroblastes activés (« cancerassociated fibroblast »), irrigués par des vaisseaux sanguins (« blood vessel ») et lymphatiques (« lymphatic vessel ») compris dans une matrice extra-cellulaire (MEC) (d’après (Junttila and de Sauvage 2013)). 1-2) Les cellules immunitair es Le système immunitaire a classiquement pour fonction de reconnaitre et protéger les tissus de l’organisme d’infections et de dommages extérieurs (Junttila and de Sauvage 2013). Cependant, le processus d’inflammation chronique a également un rôle dans le développement de pathologies, telles que des pathologies articulaires et neurodégénératives (Balkwill and Coussens 2004). Un lien entre inflammation et cancer est depuis longtemps suspecté. En effet, l’abondance des cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral a été observée précocement par les pathologistes, mais le rôle de ces cellules dans la progression tumorale a été fortement discuté. D’une part, les cellules immunitaires expriment des antigènes à l’origine du déclenchement d’une réponse immunitaire, favorisant ainsi l’éradication des cellules tumorales par l’hôte. D’autre part, l’inflammation chronique est favorable au développement de la tumeur. C’est en 1850 que R. Virchow a souligné l’effet protumoral de l’inflammation (Mueller and Fusenig 2004). Depuis, de nombreux arguments sont venus renforcer cette théorie. Le premier est qu’il existe un lien entre des situations pathologiques chroniques (Papillomavirus, Helicobacter pylori, hépatite chronique, maladie de Crohn) et le développement de cancers (respectivement : cancers du col de l’utérus, de l’estomac, du foie et du côlon) (Balkwill and 20 Mantovani 2001). Le second argument concerne l’importance de la composante inflammatoire dans les tumeurs, ainsi que la sécrétion de chimiokines, cytokines pro-inflammatoires par les cellules tumorales, destinées à attirer les cellules immunitaires, chacune participant à la progression tumorale. a) Les TAMs (Tumor-Associated Macrophages) Les macrophages représentent un type cellulaire important dans la plupart des tumeurs (jusqu’à 50% de la masse tumorale) et sont des acteurs fondamentaux de l’inflammation associée au cancer. De manière physiologique, ils exercent un vaste rôle dans la défense anti-infectieuse de l’organisme ainsi que dans le maintien de l’homéostasie tissulaire (Chanmee et al 2014). Population hétérogène, les macrophages proviennent classiquement des précurseurs monocytaires de la moelle osseuse (Bone Marrow-Derived Monocytic Precursors). Les monocytes sanguins se différencient ensuite en macrophages après extravasation dans les tissus cibles et se polarisent en différentes sous-populations en fonction des signaux environnementaux sécrétés (Chanmee et al 2014). De façon générale, on distingue les macrophages de type M1 (activés de façon classique) et les macrophages de type M2 (activés de façon alternative), qui présentent des profils phénotypiques, sécrétoires et métaboliques différents (Solinas et al 2009). Les macrophages M1 ont essentiellement un rôle pro-inflammatoire (sécrétion des interleukines IL-6, IL-12, IL-23, du Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α)) et un rôle antitumoral, alors que les macrophages de type M2 exercent un rôle plutôt anti-inflammatoire et protumoral. Ces derniers sont subdivisés en macrophages de type M2a, M2b, M2c et M2d en fonction des cytokines sécrétées (figure 2). Il est classiquement admis que les macrophages associés aux tumeurs (TAMs pour Tumor-Associated Macrophages) présentent essentiellement un phénotype de type M2 et plus particulièrement M2d (Chanmee et al 2014). Figure 2. Polarisation des macrophages. Les monocytes circulants, provenant des précurseurs monocytiques de la moelle osseuse se différentient en macrophages de type M1 et de type M2 (M2a, M2b, M2c et M2d) en fonction de l’environnement sécrétoire (d’après (Chanmee et al 2014)). 21 Les TAMs sont retrouvés de manière abondante dans le microenvironnement tumoral de la plupart des cancers, où ils exercent un rôle pro-tumoral, en jouant sur la prolifération tumorale, la survie, l’angiogenèse et la dissémination métastatique. Ces processus sont liés à la sécrétion de divers facteurs comme les chimiokines (CXCL8, CXCL1, CCL2), le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) et le TNFα. La chimiokine CCL2 (Chemokine Ligand 2) a un rôle majeur dans le recrutement des monocytes dans le stroma tumoral (Solinas et al 2009). Récemment, les TAMs ont également été décrits in vitro et in vivo, comme étant capables d’induire une chimiorésistance à la gemcitabine dans un modèle d’adénocarcinome pancréatique en agissant sur l’apoptose (Weizman et al 2014). De nombreuses données pré-cliniques et cliniques soulignent le lien entre la présence abondante de TAMs dans le microenvironnement tumoral des cancers et le mauvais pronostic associé (Balkwill et al 2012). b) Autres populations leucocytaires Les TAMs représentent la population leucocytaire majoritaire du microenvironnement tumoral, cependant d’autres populations de cellules immunitaires peuvent exercer un rôle dans la progression de la tumeur. Comme les TAMs, les TANs (Tumor-Associated Neutrophils) peuvent être recrutés au sein de la tumeur, par des chimiokines d’origine tumorale ou macrophagique (comme CXCL8) afin d’exercer un rôle pro-tumoral (Vitale et al 2014). Cependant, d’autres études semblent au contraire suggérer un rôle suppresseur de tumeurs des TANs, en éliminant directement les cellules tumorales ou indirectement en inhibant le TGF-β (Transforming Growth Factor-β) (Balkwill et al 2012). Les cellules de l’immunité adaptative, quant à elles, ont un rôle pro ou anti-tumoral en fonction de leur type. Initialement, de nombreuses études ont montré que des taux élevés de TILs (pour TumorInfiltrating Lymphocytes) dans la tumeur sont associés à un bon pronostic, notamment pour les cancers ovariens, colorectaux, du sein, et le mélanome (Solinas et al 2009) (Yu and Fu 2006) (Mao et al 2014). En fait, il semblerait que le type de lymphocytes recrutés au site tumoral serait plus déterminant sur le pronostic que leur nombre. En effet, les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques sont capables de reconnaître et de tuer les cellules tumorales et leur présence dans les cancers est associée à un bon pronostic. Les lymphocytes T CD4+ sont subdivisés en lymphocytes T CD4+ th1 (T helper type 1), en lymphocytes T CD4+ th2 et en lymphocytes Treg (T regulators) (Joyce and Pollard 2009). Les lymphocytes T CD4+ th1 peuvent aider les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques dans la lutte antitumorale, alors que les lymphocytes T CD4+ th2 favorisent plutôt la progression tumorale, en générant notamment un environnement inflammatoire par la sécrétion d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13. Initialement décrits par Gershon et Kondo en 1971, les lymphocytes Treg, caractérisés par l’expression de FOXP3 (Forkhead box P3) et CD25 (Cluster of Differenciation 25), sont considérés comme étant protumoraux de par leur capacité à inhiber la reconnaissance et la destruction immunitaire des cellules tumorales (Joyce and Pollard 2009) (Balkwill et al 2012) (Allen and Louise Jones 2011). Les lymphocytes cytotoxiques NK (Natural Killer) sont retrouvés au sein du microenvironnement tumoral mais à distance des cellules tumorales. Ils ont été montrés comme étant un facteur de bon pronostic 22 pour les cancers colorectaux, gastriques, du poumon, du rein et du foie (Balkwill and Mantovani 2001). Enfin, les lymphocytes B, producteurs d’anticorps, sont faiblement retrouvés au sein du microenvironnement tumoral (Balkwill et al 2012). Le rôle général des cellules immunitaires dans la progression tumorale est résumé dans la figure 3. Figure 3. Rôle global des cellules immunitaires dans la progression tumorale. Les cellules immunitaires jouent un rôle pro-tumoral et/ou anti-tumoral. Concernant les cellules myéloïdes : les neutrophiles, les macrophages de type M2, les mastocytes (mast cells), les MDSCs (Myeloid-Derived Stem Cells) ont un rôle plutôt pro-tumoral, alors que les cellules dendritiques, les macrophages de type M1 et certains neutrophiles ont un rôle anti-tumoral. Dans la population lymphocytaire, les lymphocytes T CD4+ Th2, T regulateurs (Treg) et les lymphocytes B favorisent généralement la progression de la tumeur, alors que les lymphocytes NK, T CD4+ Th1, les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (TC) et certains lymphocytes Treg inhibent la progression tumorale (d’après (Goubran et al 2014)). 1-3) L’angiogenèse Dans des conditions physiologiques, le processus d’angiogenèse intervient principalement durant le développement embryonnaire et de manière isolée chez l’adulte dans des contextes particuliers, tels que le processus de cicatrisation et lors du cycle menstruel chez la femme (Weis and Cheresh 2011). Comme un tissu normal, les tumeurs ont besoin d’un réseau vasculaire permettant une oxygénation adéquate, l’approvisionnement en nutriments et en métabolites ainsi que l’évacuation des déchets métaboliques et du dioxyde de carbone (Allen and Louise Jones 2011). Etape clé dans la progression tumorale, l’angiogenèse permet également la dissémination des cellules tumorales à distance et donc la formation de métastases. C’est en 1971 que Judah Folkman pose les bases de l’angiogenèse : il formule le concept que pour grandir au-delà d’une taille critique (2 mm3), la tumeur doit être 23 vascularisée (Folkman 1971). Lorsque la tumeur atteint une taille critique, les cellules tumorales situées à distance des vaisseaux sanguins manquent d’oxygène et de nutriments et meurent par apoptose ou par nécrose. En réponse à ce processus, les cellules tumorales induisent la formation de nouveaux vaisseaux sanguins majoritairement par bourgeonnement de vaisseaux préexistants (néoangiogenèse) ou à partir du recrutement de précurseurs appelés angioblastes (vasculogenèse). La transition d’une tumeur peu vascularisée vers une tumeur croissante très vascularisée est connue sous le terme de « switch angiogénique » (Bergers and Benjamin 2003) (figure 4). Ce switch angiogénique est orchestré par une balance entre les facteurs activateurs (comme les VEGFs, les FGFs (Fibroblast Growth Factors), les PDGFs (Platelet-Derived Growth Factors) et certaines chimiokines) et inhibiteurs de l’angiogenèse (thrombospondine-1, angiostatine, endostatine) sécrétés dans le microenvironnement par les cellules tumorales elles-mêmes mais également par les cellules stromales, telles que les TAMs, les CAFs (pour Cancer-Associated Fibroblasts) et les adipocytes (Allen and Louise Jones 2011). Le VEGF (encore appelé VEGF-A) est le principal acteur pro-angiogénique (Potente et al 2011). Principal stimulus de l’angiogenèse, l’hypoxie (caractérisée par une diminution du taux d’oxygène, liée à la croissance tumorale) permet la stimulation des protéines HIF (Hypoxia-Inducible Factor) qui vont non seulement avoir un rôle global dans le développement des cellules tumorales (métabolisme, prolifération, apoptose …), mais également avoir un rôle spécifique dans l’angiogenèse en induisant l’augmentation de facteurs pro-angiogéniques (Potente et al 2011). Suite à une stimulation proangiogénique, les cellules endothéliales (constituants principaux des vaisseaux sanguins) « s’activent », c’est-à-dire qu’elles prolifèrent, migrent et participent à la formation de la lumière du vaisseau sanguin et de la membrane basale. Un recrutement de péricytes et de cellules musculaires lisses est ensuite observé. Ces cellules entourent les tubules de cellules endothéliales permettant ainsi la stabilité et la perfusion des vaisseaux sanguins (Potente et al 2011). Figure 4. Le switch angiogénique. Au fur et à mesure de la progression de la tumeur, un processus de néoangiogenèse et de lymphangiogenèse se met en place, permettant l’approvisionnement de la tumeur en oxygène, en nutriments mais aussi en offrant une voie de dissémination des cellules tumorales via le réseau sanguin pour former des métastases à distance (www.scienceofcrc.org (Diana Saville)). 24 La vascularisation tumorale est anormale dans la plupart des cas, en termes de structure et de fonction. En effet, les vaisseaux sanguins sont irréguliers, tortueux, dilatés, branchés de manière anarchique et hémorragiques. Par conséquent, la vascularisation des tumeurs est souvent peu efficace et affecte considérablement l’efficacité des chimiothérapies, classiquement administrées par voie sanguine (Balkwill et al 2012) (Weis and Cheresh 2011) (Joyce and Pollard 2009). D’autre part, les premiers signes d’un cancer invasif sont l’envahissement des ganglions lymphoïdes. Ces métastases sont acheminées par une voie annexe appelée lymphangiogenèse via des vaisseaux lymphatiques et agit de manière synergique à l’angiogenèse (Riabov et al 2014) (figure 4). Cependant, la mise en place de vaisseaux sanguins associés à la tumeur peut aussi être en faveur d’un bon pronostic. En effet, des résultats obtenus récemment par l’équipe de Jean-Philippe Girard ont mis en évidence un rôle clé des HEV (High Endothelial Venules) dans le recrutement des lymphocytes B et T qui vont inhiber la progression tumorale, notamment dans le cancer du sein (Moussion and Girard 2011) (Martinet and Girard 2013). 1-4) La matrice extra-cellulair e (MEC) Composant non cellulaire du microenvironnement tumoral, la MEC est définie comme un mélange complexe de protéines (collagènes, ténascine, fibronectine, cadhérines et intégrines) et de protéoglycanes. Le rôle physiologique de la MEC est de former un support matriciel et mécanique aux cellules permettant ainsi le maintien de l’intégrité fonctionnelle et structurale des cellules et tissus (Schultz and Wysocki 2009). L’architecture de la MEC joue un rôle important dans les grandes fonctions cellulaires et tissulaires, comme la prolifération, la migration, l’apoptose et la différenciation cellulaire, mais module également le réseau vasculaire et les fonctions immunitaires (Cirri and Chiarugi 2012). En fait, la structure de la MEC affecte la morphologie cellulaire, via la signalisation des intégrines et le cytosquelette des cellules ; processus agissant sur le contrôle du cycle cellulaire (Cirri and Chiarugi 2012). La composition de la MEC est profondément remaniée qualitativement et quantitativement dans des conditions physiopathologiques comme le processus de cicatrisation et le cancer. Dans le cas du cancer, les CAFs exercent un rôle majeur dans le remodelage de la MEC, car ce sont les cellules majoritaires sécrétrices des composants de la MEC (collagène, fibronectine…) mais également des protéases et autres enzymes responsables de sa dégradation. Ainsi, les CAFs contrôlent la synthèse, la dégradation et la modification de la MEC, nécessaires à la progression de la tumeur (Gaggioli et al 2007) (Zhang and Liu 2013). Dans les tumeurs solides, une augmentation de la synthèse des composants structuraux de la MEC a été observée, tels que le collagène I (principal constituant de la MEC), le collagène III (collagènes interstitiels), la ténascine C et la fibronectine. D’autres composants sont à l’inverse dégradés comme le collagène IV, qui est le principal constituant de la membrane basale. En effet, un événement clé de la progression tumorale est la perte de l’intégrité de la membrane basale permettant ainsi l’invasion des cellules et l’évolution du cancer vers un stade 25 invasif (Monboisse et al 2014) (Egeblad et al 2010). D’autre part, au cours de la progression tumorale, la MEC devient de plus en plus rigide. Ce phénomène est lié à la formation de liaisons covalentes entre les fibres de collagène, réaction catalysée majoritairement par l’enzyme LOX (Lysyl Oxydase). Cette enzyme est exprimée par les fibroblastes dans les stades précoces de cancer et induite par des conditions d’hypoxie dans des stades plus tardifs (Egeblad et al 2010) (Cirri and Chiarugi 2012). L’expression de LOX et la rigidité de la MEC sont associées à un mauvais pronostic et à un risque élevé de développement de métastases. En effet, dans un modèle murin spontané de tumeurs mammaires MMTV-neu, l’inhibition de LOX induit une diminution des liaisons covalentes entre les fibres de collagène entraînant ainsi une diminution de la rigidité de la MEC. Ce phénomène a pour conséquence une réduction de la survenue des cancers (Levental et al 2009). La rigidité de la MEC tumorale a également pour effet de corrompre les réseaux vasculaires et lymphatiques, empêchant ainsi une distribution normale de chimiothérapie (Cirri and Chiarugi 2012). Le remodelage de la MEC requiert également la lyse protéique des composants matriciels. Cet événement est majoritairement réalisé par des métalloprotéases appelées MMPs (Matrix Metalloproteinases), des cystéines protéases (cathépsine B), et des sérines protéases comme l’urokinase (uPA pour urokinase type Plasminogen Activator), FAPα (Fibroblast-Activated Protein α) et PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1) (Zhang and Liu 2013). De nombreuses études ont mis en évidence la surexpression des MMPs dans différents cancers. En effet, en clivant les composants de la MEC, les MMPs favorisent l’invasion des cellules tumorales et le processus de métastases, mais permettent également des modifications dans l’interaction cellule-matrice via les intégrines, ce qui induit des altérations dans les signalisations en aval, telles que l’adhésion cellulaire, le cytosquelette et l’expression de la kinase d’adhésion focale (FAK pour Focal Adhesion Kinase) impliqués dans la migration cellulaire. Les MMPs sont sécrétées de manière majoritaire par les cellules stromales telles que les CAFs et les TAMs et minoritairement par les cellules tumorales. Le clivage des protéines matricielles a une autre conséquence indirecte sur la progression tumorale, qui est la libération de facteurs de croissance (comme le VEGF), chimiokines et cytokines (comme le TGF-β), piégés dans la MEC. Ces molécules sont impliquées dans tous les processus de la progression tumorale, notamment l’angiogenèse et le processus métastastatique (Balkwill et al 2012). 2) Les CAFs (Cancer-Associated Fibroblasts) 2-1) Généralités Encore appelées cellules de soutien, les fibroblastes sont les cellules mésenchymateuses les plus abondantes dans les tissus conjonctifs. Ils permettent de joindre et de maintenir tous les autres tissus et organes ensemble dans l’organisme. Ces tissus conjonctifs sont composés de fibroblastes espacés, compris dans une MEC. Les fibroblastes assurent l’homéostasie et le renouvellement de la MEC en 26 sécrétant les protéines (collagènes I, III, IV, V, fibronectine, élastine) et protéoglycanes qui la composent ainsi que les protéases qui la remodèlent (MMPs) (Kendall and Feghali-Bostwick 2014). Dans des conditions physiopathologiques, comme la cicatrisation, les fibroblastes (ayant un faible index de prolifération et de faibles capacités métaboliques) « s’activent » : ils se mettent à proliférer, à sécréter abondamment des protéines de la MEC et acquièrent des propriétés contractiles, leur permettant de rejoindre le site infectieux. Ces fibroblastes « activés », encore appelés myofibroblastes (en référence à leurs propriétés contractiles) produisent également des chimiokines, aboutissant au recrutement de cellules immunitaires destinées à combattre l’infection. La fibrose désigne le processus physiologique, qui, généralement en réponse à une infection et/ou une destruction tissulaire, permet la transformation d’un tissu sain en tissu composé de fibroblastes et de protéines de la MEC. Une fois, la lésion « réparée », les myofibroblastes retrouvent leur phénotype initial et les fibroblastes excédentaires meurent par apoptose (Xouri and Christian 2010). Comme souligné précédemment, H. Dvorak est le premier à avoir remarqué que le processus de cicatrisation et le processus tumoral présentent des similitudes. Ainsi, les fibroblastes associés aux cancers, encore appelés CAFs (CancerAssociated Fibroblasts), TAFs (Tumor-Associated Fibroblasts) ou fibroblastes activés, présentent un phénotype similaire aux myofibroblastes présents dans le processus de cicatrisation. Ce phénotype est à l’inverse, fonctionnellement et morphologiquement différent des fibroblastes normaux (figure 5). Cependant, les CAFs restent activés de façon constitutive, contrairement aux myofibroblastes de la cicatrisation. Les CAFs arborent une morphologie allongée, fusiforme, un gros noyau, des jonctions communicantes et adhérentes et des myofilaments d’actine cytoplasmiques (Xouri and Christian 2010) (Zhang and Liu 2013) (figure 5). Les CAFs sont présents dans la plupart des tumeurs solides et représentent une population majoritaire dans le microenvironnement de différents cancers, comme le cancer du sein, de la prostate et du pancréas (Cirri and Chiarugi 2012) (Kalluri and Zeisberg 2006) (Pietras and Ostman 2010) (Ohlund et al 2014). Dans le microenvironnement du cancer du sein, environ 80% des fibroblastes présentent un phénotype activé (Kalluri and Zeisberg 2006) (Sappino et al 1988). 27 Figure 5. Les fibroblastes et les fibroblastes activés. (a) Les fibroblastes normaux évoluent au sein d’une matrice extra-cellulaire (MEC) fibrillaire. Les fibroblastes interagissent avec leur environnement grâce à des intégrines, comme les intégrines α1β1. Morphologiquement, ce sont des cellules fusiformes, avec un cytosquelette d’actine et de vimentine. FSP-1 (Fibroblast-Specific Protein 1) est un marqueur spécifique des fibroblastes. (b) Les fibroblastes peuvent acquérir un phénotype « activé », associé à une augmentation de l’index de prolifération et une augmentation de la sécrétion de nombreuses molécules de la MEC, comme le collagène I et la ténascine C, ainsi que la fibronectine. Ces fibroblastes activés sont souvent caractérisés phénotypiquement par l’expression d’α-SMA (αSmooth Actin Muscle) (d’après (Kalluri and Zeisberg 2006)). 2-2) Caractérisation des CAFs En dépit du rôle crucial des CAFs dans la progression tumorale, il existe une certaine ambiguïté dans l’identification de ces cellules au sein du tissu tumoral. Divers éléments contribuent à l’hétérogénéité de cette population cellulaire, notamment le type de tissu dans lequel le cancer se développe, le type cellulaire à l’origine des CAFs, l’environnement local et les interactions paracrines sous-jacentes (Augsten 2014) (Xouri and Christian 2010) (Kalluri and Zeisberg 2006). Non seulement il existe des différences dans les CAFs provenant de différents cancers, mais même au sein d’un même cancer la composition des CAFs peut varier. L’équipe d’E. Puré a isolé des CAFs provenant d’échantillons de cancers du sein, classés en différents sous-groupes (ER+ (positif pour les récepteurs aux œstrogènes), TNBC (Triple Negative Breast Cancer) et HER2+ (Human Epithelial growth factor Receptor 2)) et une étude du profil d’expression génique a été réalisée. Les résultats de cette étude suggèrent qu’il existe une hétérogénéité de marqueurs exprimés par les CAFs en fonction des différents sous-types de cancer du sein (Tchou et al 2012). De la même manière, à l’échelle d’une même tumeur, les marqueurs de CAFs sont exprimés à des niveaux variables d’un CAF à l’autre (Kidd et al 2012) (Gaggioli et al 2007). Pendant longtemps, les CAFs ont été identifiés uniquement par leur niveau d’expression d’α-SMA (αSmooth Muscle Actin) ; protéine impliquée dans la contractilité des cellules. Cependant des analyses immuno-histochimiques ont démontré que certains fibroblastes péri-tumoraux n’exprimaient pas ce 28 marqueur (Bochet et al 2013) (Andarawewa et al 2005). De plus, α-SMA est retrouvé dans d’autres types cellulaires, comme les péricytes, les cellules musculaires lisses intestinales, les cellules myoépithéliales de la glande mammaire, les cardiomyocytes et même les fibroblastes normaux dans certains cas, suggérant que ce marqueur n’est ni spécifique, ni sélectif (Hinz et al 2001) (Ohlund et al 2014). A ce jour, l’identification des CAFs repose sur des critères morphologiques, sur l’expression d’un ensemble de marqueurs, sur leur profil sécrétoire et sur leurs propriétés fonctionnelles, notamment leurs capacités pro-tumorigéniques (De Wever et al 2014) (Augsten 2014). Parmi les marqueurs les plus retrouvés, il y a α-SMA, FSP-1 (Fibroblast Specific Protein 1, encore appelé S100A4), FAPα (encore appelé FAP), NG2 (Neuron-glial Antigen-2), PDFGR-β, podoplanine (PDPN), Thy-1, desmine et Ténacine-C (Ohlund et al 2014) (Polanska and Orimo 2013) (Xing et al 2010). D’autres marqueurs mésenchymateux sont classiquement utilisés pour identifier les CAFs, comme la vimentine, la fibronectine, le collagène I et la prolyl-4 hydroxylase (Polanska and Orimo 2013). L’absence de certains marqueurs contribue également à la détermination des CAFs, telle que la perte de la cavéoline-1, des marqueurs épithéliaux (cytokératine) ou endothéliaux (CD31 pour Cluster of Differenciation 31) (Xing et al 2010). D’autre part, même si les CAFs sont relativement stables génétiquement, certaines altérations génétiques ont été rapportées, comme des mutations ponctuelles, des pertes d’hétérozygotie sur des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeurs comme p53 et PTEN (Xing et al 2010). Parmi tous ces marqueurs, FSP-1 semble être un marqueur qui définit une population unique de fibroblastes (Kalluri and Zeisberg 2006). L’équipe de R. Kalluri a mis en évidence dans des modèles murins de cancers pancréatique et mammaire que les CAFs peuvent se répartir en deux sous-groupes majeurs. Le premier est positif pour le marqueur FSP-1 mais n’exprime aucun des autres marqueurs étudiés (NG2, α-SMA et PDGFRβ), alors que le deuxième groupe n’exprime pas FSP-1 mais exprime les trois autres marqueurs NG2, α-SMA et PDGFβ (Sugimoto et al 2006). De manière intéressante, l’expression relative des différents marqueurs a été proposée comme critère pronostic. En effet, une étude immuno-histochimique récente de cancers colorectaux a mis en évidence que les CAFs qui expriment la podoplanine (PDPN(+)) sont plutôt associés à des cancers peu agressifs et de bon pronostic alors que les CAFs qui n’expriment pas la podoplanine mais qui expriment α-SMA ou FSP-1 (PDPN(-)/α-SMA(élevé) ou PDPN(-)/FSP-1(élevé)) sont associés à un pronostic défavorable (Choi et al 2013). Au cours de nos expériences, les marqueurs FSP-1, FAP-α et α-SMA nous ont particulièrement intéressés. La protéine FSP-1 (encore appelée Mts1 pour Metastasis associated protein) est exprimée dans les CAFs, les cellules tumorales agressives et les macrophages (Ohlund et al 2014). C’est une protéine liant le calcium, capable d’interagir avec des partenaires intra et extra-cellulaires. Ainsi, FSP-1 peut se lier à la myosine et à l’actine intra-cellulaires régulant ainsi le cytosquelette et la motilité cellulaire (Egeblad et al 2005). Elle peut également interagir avec p53 et réguler son activité transcriptionnelle (Schmidt-Hansen et al 2004). Facteur crucial dans le processus métastatique, FSP-1 peut stimuler les 29 cellules tumorales pour qu’elles sécrètent des chimiokines ou des cytokines, capables d’activer en retour les cellules stromales (cellules endothéliales et inflammatoires) (Bettum et al 2014). Une expression importante de FSP-1 favorise la croissance de la tumeur et sa capacité à métastaser (Rasanen and Vaheri 2010). En effet, des cellules tumorales injectées à une souris FSP-1-/- forment moins de tumeurs et aucune métastase, contrairement aux souris FSP-1+/+. De plus, la co-injection de fibroblastes FSP-1+/+ avec des cellules tumorales dans des souris FSP-1-/- restaure la croissance tumorale et le potentiel métastatique, observé dans les souris FSP-1+/+. L’expression de FSP-1 est associée à un mauvais pronostic dans les cancers (Grum-Schwensen et al 2005). FAP est une sérine protéase, présente à la surface des cellules qui possède une activité enzymatique peptidase-collagénase. C’est également un marqueur classique des CAFs, notamment dans les tumeurs du sein, du poumon, de l’ovaire et du pancréas (Ohlund et al 2014). FAP n’est pas spécifique des CAFs : son expression a été rapportée dans les cellules tumorales gastriques, du sein, colorectal et dans les mélanocytes et les mélanomes, mais pas dans les fibroblastes normaux (Kelly et al 2012). Elle exerce un rôle physiologique dans l’hématopoïèse et dans le maintien de la masse musculaire (Roberts et al 2013). Dans le cas du cancer, l’induction de FAP a été associée à une croissance tumorale importante et à une augmentation de l’angiogenèse. Du fait de son activité enzymatique, FAP a un rôle important dans le remodelage de la MEC et dans l’invasion des cellules tumorales (Kelly et al 2012). L’ensemble de ces données souligne clairement l’hétérogénéité des CAFs, qui présentent non pas un mais des phénotypes différents. En dépit des efforts réalisés, beaucoup de questions restent en suspens : combien de sous-populations de CAFs existe-t-il au sein d’un type tumoral donné, quelle est la proportion relative de chaque sous-population, les différentes sous-populations de CAFs sont-elles associées à une origine cellulaire précise (Augsten 2014) ? 2-3) Origines des CAFs De la même façon que l’identification des CAFs, leur origine demeure un sujet à débat. Encore une fois, la difficulté provient du fait que les CAFs représentent une population hétérogène, aux origines diverses et variées. En effet, les CAFs peuvent provenir de fibroblastes résidents, de cellules tumorales, de cellules endothéliales, de péricytes, de cellules inflammatoires, de cellules mésenchymateuses, d’ADSCs et d’adipocytes (figure 6). Ces derniers ont fait l’objet d’une publication lors de ma thèse, qui sera développée dans la partie résultats (Bochet et al 2013). a) Les fibroblastes résidents L’activation de fibroblastes localement présents a classiquement été considérée comme la source majeure de CAFs (Allen and Louise Jones 2011). Ce processus est appelé transition mésenchymomésenchymateuse (MMT pour Mesenchymal-Mesenchymal Transition) (Cirri and Chiarugi 2012). 30 Les cellules tumorales sécrètent des facteurs de croissance comme le TGF-β, le PDGF-β et le FGF2 (Fibroblasts Growth Factor 2) qui induisent les changements phénotypiques et fonctionnels observés dans les CAFs. TGF-β se lie à son récepteur TGFBR2 (Type-2 TGF-β Receptor), présent à la surface des fibroblastes, ce qui induit le recrutement et la phosphorylation de TGFBR1 et l’expression de facteurs impliqués dans la production et le remodelage de la MEC. PDGFR a également été décrit pour son rôle pro-prolifératif des CAFs et comme facteur initiateur de la réaction desmoplasique dans les tumeurs, qui sera décrite plus tard dans cette introduction (Ohlund et al 2014). L’équipe d’A. Orimo a mis en évidence dans un modèle murin de xénogreffes que la co-implantation de fibroblastes normaux avec des cellules tumorales mammaires permet la conversion de fibroblastes en myofibroblastes durant la progression tumorale ; processus, médié et amplifié par une boucle de signalisation autocrine CXCL12 (Chemokine (C-X-C motif) Ligand 12)) encore appelé SDF-1 (Stromal-Derived Factor 1) et TGF-β (Kojima et al 2010). L’activation des fibroblastes résidents en CAFs peut également être médiée par les cytokines IL-8 et IL-1β d’origine tumorale (Schauer et al 2011). En plus des facteurs de croissance et des cytokines, d’autres mécanismes d’activation des fibroblastes ont été décrits. L’équipe d’E. Leuguyel a apporté les preuves qu’une reprogrammation de miRNAs permet aussi la conversion de fibroblastes en CAFs dans un modèle de cancer ovarien (Mitra et al 2012). Très récemment, l’équipe de R. Rhokha a mis en évidence que la perte de TIMP-3 (Tissue Inhibitor Metalloproteinase 3) dans des fibroblastes de souris mutées permet l’induction d’un phénotype CAFs-like (Shimoda et al 2014). Des exosomes d’origine tumorale ont été identifiés comme capables de recruter et activer des fibroblastes et des MSCs (Mesenchymal Stem Cells) au sein du microenvironnement tumoral (Kahlert and Kalluri 2013) (Chowdhury et al 2014). Enfin, les espèces réactives de l’oxygène (ROS pour Reactive Oxygen Species) générées lors de la progression tumorale peuvent induire la conversion de fibroblastes en myofibroblastes, via l’accumulation de HIF1α (Toullec et al 2010). Il est à noter, que l’identification du phénotype de CAFs se base classiquement sur l’acquisition progressive d’α-SMA et sur les capacités fonctionnelles de ces cellules à favoriser la progression tumorale. b) Les MSCs (Mesenchymal Stem Cells) Les cellules souches mésenchymateuses ont été décrites comme étant une source de CAFs importante. Ces progéniteurs, recrutés à partir de la moelle osseuse, sont capables de se différencier en cellules de l’os, en tissu adipeux et en cartilage. Ils sont recrutés au sein du microenvironnement tumoral par différentes sécrétions tumorales et stromales et exercent plusieurs rôles dans la progression tumorale, notamment dans le recrutement de progéniteurs endothéliaux et dans leur différenciation en cellules favorisant la formation des vaisseaux sanguins (Madar et al 2013). Une étude réalisée par l’équipe de D. Barnejee a mis en évidence que des MSCs humains traités par du milieu conditionné de cellules tumorales leurs confèrent des propriétés de CAFs, notamment l’expression de α-SMA, de FSP-1 et de vimentine. De plus, ces cellules activées sécrètent SDF-1 et favorisent in vitro et in vivo la progression 31 de la tumeur (Mishra et al 2008). Les MSCs seraient une importante source de CAFs mais la proportion relative de CAFs provenant des MSCs varierait en fonction des cancers : environ 25% dans un modèle d’adénocarcinome pancréatique et 20% dans un modèle de cancer gastrique pour exemples (Zhang and Liu 2013) (Direkze et al 2004) (Augsten 2014) (Quante et al 2011). c) Cellules tumorales Les CAFs peuvent aussi provenir de cellules tumorales ayant fait la transition épithéliomésenchymateuse ou EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition). Première étape vers l’acquisition d’un phénotype invasif, l’EMT permet aux cellules épithéliales polarisées d’adopter une morphologie mésenchymateuse. Ces cellules sont caractérisées par une morphologie allongée, des capacités migratoires et invasives augmentées, la perte des adhérences cellule-cellule et cellule-matrice et une augmentation de la sécrétion de protéines matricielles. Ce phénotype permet aux cellules de migrer et d’envahir à travers la MEC afin de disséminer à distance. De nombreux facteurs comme le PDGF, le TGF-β et l’EGF peuvent favoriser l’EMT en initiant un grand nombre de voies de signalisation, qui mènent, à terme, à l’activation de facteurs de transcription comme Snail, Slug, Twist et FOXC2 (Kalluri and Zeisberg 2006) (Mao et al 2013). Dans un contexte de fibrose rénale, l’équipe de Neilson a démontré que des cellules épithéliales non transformées peuvent également se transdifférencier en myofibroblastes, qui expriment FSP-1 et le collagène I, suite à une EMT (Iwano et al 2002). Cependant, cette source de CAFs semble minoritaire car contrairement aux cellules tumorales, les CAFs ne présentent pas ou peu d’altérations génétiques (Kalluri and Zeisberg 2006) (Orimo et al 2005). d) Cellules endothéliales De la même façon que les cellules épithéliales, les cellules endothéliales peuvent acquérir un phénotype de CAFs, grâce au processus appelé transition endothélio-mésenchymateuse (endoMT). Ces cellules perdent les marqueurs endothéliaux comme CD31, acquièrent des marqueurs mésenchymateux comme FSP-1 et α-SMA et des propriétés migratoires et invasives (Nie et al 2014). Le TGF-β est également un facteur inducteur de l’endoMT (Xouri and Christian 2010). Les cellules endothéliales ayant fait l’endoMT représenteraient une source conséquente de CAFs et exerceraient un rôle important dans l’angiogenèse (Rasanen and Vaheri 2010) (Potenta et al 2008). e) ADSCs (Adipose-Derived Stem Cells) Les ADSCs sont des cellules souches mésenchymateuses comprises dans le tissu adipeux (Wang et al 2012). Des travaux, publiés par C. Jotzu et al. ont montré que les ADSCs peuvent se transdifférencier en CAFs, sous l’influence des sécrétions de lignées tumorales mammaires via la signalisation du TGFβ1. Ce phénotype CAF-like est caractérisé par l’expression d’α-SMA et de la ténascine C et par un rôle pro-invasif sur les cellules tumorales in vitro. De manière intéressante, ce phénotype peut être 32 réversé par l’utilisation d’un anticorps bloquant dirigé contre le TGF-β1 (Jotzu et al 2011). Plus récemment, l’équipe de FC. Marini a confirmé la capacité des ADSCs à se convertir en CAFs et a en plus souligné l’hétérogénéité phénotypique des CAFs en fonction de leur provenance. En effet, dans un modèle syngénique de cancer du sein et de l’ovaire, les auteurs ont montré que les BMSCs (BoneMarrow Stem Cells) se différencient préférentiellement en CAFs, exprimant FSP-1 et FAP et sont majoritairement localisés à la périphérie de la tumeur. A l’inverse, les ADSCs se différencient en CAFs exprimant α-SMA et NG2 et sont retrouvés à proximité des vaisseaux sanguins (Kidd et al 2012). Cho et al. ont également montré que les exosomes de cellules tumorales ovariennes induisent une transdifférenciation des ADSCs en CAFs, exprimant α-SMA, qui peuvent en retour favoriser la progression de la tumeur, via une signalisation SDF-1 et TFG-β (Cho et al 2011). Plus engagés dans le lignage adipocytaire, les pré-adipocytes sont également une source de CAFs. En effet, il a été proposé in vitro et in vivo, que les pré-adipocytes de la lignée 3T3-L1, soumis aux sécrétions de cellules tumorales mammaires favorisent l’accumulation de fibronectine et le remodelage de la MEC, participant ainsi à la réaction desmoplasique (Chandler et al 2012). f) Autres sources de CAFs Les péricytes (cellules présentes autour des vaisseaux sanguins et régulant la perméabilité vasculaire), ainsi que les cellules musculaires lisses ont également été décrits comme capables de se différencier en myofibroblastes (Kendall and Feghali-Bostwick 2014) (Xouri and Christian 2010). Une étude réalisée par Binai et al. a aussi proposé les monocytes circulants comme origine de myofibroblastes. En effet, en condition de fibrose, les monocytes circulants provenant de patients atteints de sclérose systémique expriment α-SMA et le collagène I, contrairement aux monocytes isolés à partir de patients sains (Binai et al 2012). Par conséquent, les CAFs regroupent un ensemble de cellules, qui proviennent de différentes origines. On peut ainsi imaginer que ces cellules, au même titre que leurs différences phénotypiques, ont un rôle spécifique dans la progression tumorale variant selon les types de tumeurs, les sécrétions paracrines du microenvironnement et les marqueurs qu’elles expriment. Bien que les multiples origines des CAFs soient couramment établies par la communauté scientifique, l’importance fonctionnelle relative de ces différentes sous-populations dans la progression tumorale reste très mal connue (figure 6). 33 Figure 6. Les multiples origines des CAFs dans le stroma tumoral. Huit mécanismes possibles ont été décrits pour expliquer l’origine des CAFs : l’activation de fibroblastes localement présents, le recrutement de cellules souches mésenchymateuses, la transition épithélio-mésenchymateuse de cellules épithéliales, la transition endothélio-mésenchymateuse de cellules endothéliales, la transdifférencitation de péricytes, de cellules musculaires lisses, de cellules inflammatoires et des cellules du tissu adipeux (ADSCs, pré-adipocytes et adipocytes) (d’après (Zhang and Liu 2013)). 2-4) Rôle de CAFs dans la progr ession tumorale (pour revue (Ohlund et al 2014)) Les CAFs sont capables d’agir à toutes les étapes clés de la progression tumorale (figure 7). Leurs effets passent principalement par la sécrétion de différentes molécules, comme des facteurs de croissance (TGF-β, HGF, EGF (Epidermal Growth Factor), IGF (Insulin Growth Factor), CTGF (Connective Tissue Growth Factor), VEGF), des cytokines (CCL7, CXCL12, IL-6, IL-1β) et des protéines impliquées dans la constitution (collagènes, fibronectine) et le remodelage de la MEC (MMPs, FAP) (Mao et al 2013). Ainsi ils peuvent exercer un rôle pro-tumoral directement sur les cellules cancéreuses et aussi indirectement via la stimulation des cellules stromales. De nombreuses études ont souligné le rôle des CAFs dans l’initiation tumorale. En utilisant des expériences de co-cultures et de transplantations chez la souris, Olumi et al. ont montré que des CAFs (à la différence des fibroblastes normaux) induisent la prolifération et l’initiation tumorale à partir de cellules humaines prostatiques épithéliales non tumorales immortalisées. En revanche, les CAFs ne stimulent pas le développement tumoral de cellules prostatiques épithéliales non immortalisées, ce qui suggère qu’un évènement génétique initiateur est nécessaire pour exercer cet effet pro-tumoral (Allen and Louise Jones 2011) (Augsten 2014) (Olumi et al 1999). Dans un modèle murin de xénogreffes des composants épithéliaux et stromaux humains récapitulant la glande mammaire, Kuperwasser et al. ont mis en évidence que la surexpression de TGF-β et/ou d’HGF (Hepatocyte Growth Factor) dans des fibroblastes murins, avant l’implantation, induit l’initiation du cancer du sein (Kuperwasser et al 2004). 34 Les CAFs agissent également sur la progression de la tumeur primaire, en favorisant, la prolifération, l’invasion et le processus d’angiogenèse. Dans un modèle de cancer du sein, il a été montré que l’IL-6, sécrétée par les CAFs (en quantité 100 fois supérieure à la sécrétion par les fibroblastes normaux) permet la migration des cellules tumorales mammaires MDA-MB231 et induit l’EMT des cellules ER+ (MCF-7 et T47D) (Hugo et al 2012) (Mao et al 2013). L’équipe de R. Weinberg a apporté les preuves que les CAFs isolés du stroma d’un carcinome invasif mammaire augmentent de manière importante la croissance tumorale, dans un modèle de xénogreffes (co-implantation CAFs/cellules tumorales). Cet effet n’est pas retrouvé avec des fibroblastes normaux du même patient. En fait, les CAFs produisent des taux élevés de CXCL12 qui, d’une part augmente la croissance tumorale via sa liaison sur son récepteur CXCR4, exprimé à la surface des cellules tumorales et d’autre part recrute les progéniteurs endothéliaux EPCs (Endothelial Progenitor Cells) au sein de la tumeur pour favoriser l’angiogenèse. De manière intéressante, ces caractéristiques de CAFs sont maintenues même en l’absence de contact avec les cellules tumorales (Orimo et al 2005). La réaction desmoplasique Comme nous l’avons vu précédemment, une des caractéristiques des CAFs est leur capacité à synthétiser et remodeler la MEC (voir partie MEC). Certaines tumeurs (pancréas, sein, colorectal, poumon …) sont caractérisées par la présence d’une réaction desmoplasique (encore appelée desmoplasie). Elle est définie par le développement anormal d’un tissu fibreux en réponse à une lésion. Dans le cas du cancer, la réaction desmoplasique correspond au recrutement et à la prolifération de fibroblastes activés, capables de sécréter des protéines matricielles et des enzymes protéolytiques, ce qui forme une « MEC permissive à la progression tumorale ». Histologiquement, la réaction desmoplasique est caractérisée par une « coque » rigide qui se forme autour de la tumeur (composée de CAFs et riche en collagène I) et à une prolifération accrue des CAFs au sein de la tumeur. La réaction desmoplasique est associée à une augmentation de la prolifération tumorale, un phénotype invasif et une augmentation de la chimiorésistance. Elle représente ainsi un facteur de mauvais pronostic dans les cancers du poumon, du pancréas, du sein et colorectal (Ohlund et al 2014). En régulant la MEC, les CAFs influencent considérablement la progression tumorale, en agissant sur le recrutement des autres composants stromaux au sein de la tumeur, capables eux aussi d’agir sur la prolifération, la migration des cellules tumorales et le processus métastatique (Ohlund et al 2014). En plus d’agir sur la carcinogenèse et sur la croissance de la tumeur primaire, les CAFs peuvent considérablement influencer le processus métastatique. Ce processus requiert l’enchainement de plusieurs évènements : l’EMT des cellules tumorales, qui adoptent ainsi un phénotype invasif, l’angiogenèse, l’intravasation des cellules tumorales dans le réseau sanguin et leur extravasation dans des tissus à distance, où les cellules font une MET (Mesenchymal-Epithelial Transition) pour former des colonies à des sites distants de la tumeur primaire (Mao et al 2013). En plus d’induire l’EMT des 35 cellules tumorales et de participer à l’angiogenèse, les CAFs favorisent l’intravasation des cellules tumorales en se coopérant aux macrophages via une signalisation CCL2 (Mao et al 2013) (Tsuyada et al 2012). Ils peuvent également influencer l’invasion des cellules par la sécrétion de chimiokines, de cytokines et de MMPs. De plus, les CAFs sont dotés de propriétés migratoires et invasives leur permettant de circuler eux-mêmes dans l’organisme avec les cellules tumorales (Xing et al 2010) (Cirri and Chiarugi 2012). Cornil et al. ont montré que seules les cellules provenant de mélanomes invasifs prolifèrent de manière accrue en présence de CAFs, ce qui suggère le potentiel des CAFs à créer une niche favorable au développement de métastases (Cornil et al 1991). Le transport des CAFs avec les cellules tumorales protège ces dernières de l’apoptose dans le réseau sanguin et leur permet de se développer plus facilement une fois arrivées aux sites métastatiques (Duda et al 2010). L’injection de CAFs dans des souris déficientes pour FSP-1 (qui présentent moins de métastases que les souris FSP-1+/+) restaure partiellement le phénotype et le potentiel métastatique (Grum-Schwensen et al 2005). Il a été rapporté que les CAFs favorisent la capacité des cellules tumorales à acquérir un phénotype de cellules-souches cancéreuses (encore appelées CSCs pour Cancer Stem Cells). Il est bien connu que dans la tumeur, une proportion des cellules adopte ce phénotype, les rendant plus résistantes aux traitements et plus enclines à former de nouveaux foyers tumoraux. Les CAFs sont capables de promouvoir l’auto-renouvèlement des cellules tumorales et d’augmenter leur niveau d’expression en marqueurs de CSCs (CD133- et ratio élevé de CD44/CD24) (Klarmann et al 2009) (Cirri and Chiarugi 2012). Les CAFs peuvent également participer au maintien d’une inflammation chronique, favorable à la progression tumorale (voir partie sur les cellules inflammatoires), en exprimant des facteurs proinflammatoires, capables de recruter des cellules myéloïdes (monocytes et macrophages) (Ohlund et al 2014) (Torres et al 2013). Ils sont aussi dotés d’un rôle immunosuppressif en inhibant notamment l’action des lymphocytes NK (Balsamo et al 2009) (Zhang and Liu 2013). Les CAFs agissent sur le métabolisme des cellules tumorales afin de promouvoir la tumorigenèse. Le métabolisme de la cellule tumorale est un processus complexe et hautement hétérogène. Les cellules tumorales utilisent le glucose principalement via la glycolyse anaérobie, aboutissant à la production de lactate, même en présence d’oxygène (processus appelé « effet Warburg »), alors que les cellules normales catabolisent complétement ce processus via la phosphorylation oxydative aboutissant à la production d’ATP. Un switch vers la glycolyse aérobie a été également rapporté dans les CAFs à proximité des cellules tumorales, ce qui permet la génération de lactate et de pyruvate. Ces métabolites peuvent ainsi être utilisés par la cellule tumorale comme combustible, afin d’alimenter le métabolisme mitochondrial (cycle de Krebs, phosphorylation oxydative), aboutissant à terme, à la formation d’ATP et au développement de la tumeur. Ce processus a été référé comme « reverse Warburg effect » (Pavlides et al 2009) (Ohlund et al 2014). Les CAFs participent, ainsi, à la dynamique du métabolisme tumoral en s’adaptant aux besoins métaboliques de la cellule tumorale (Ohlund et al 2014). 36 Les effets pro-tumorigéniques des CAFs sont aussi liés à la résistance aux traitements. Il a été rapporté que l’HGF, sécrété par les CAFs, induit une résistance au gefitinib (inhibiteur de l’EGFR) dans un modèle de cancer du sein triple négatif. Les CAFs peuvent aussi favoriser une résistance aux chimiothérapies, à l’hormonothérapie et aux thérapies anti-angiogéniques (Dittmer and Leyh 2014). Crawford et al. ont isolé des fibroblastes de tumeurs résistantes ou sensibles aux anti-VEGF. Ils ont mis en évidence le fait que les CAFs provenant de tumeurs résistantes sont capables de rendre des cellules tumorales précédemment sensibles, résistantes aux anti-VEGF, en agissant donc comme un « cheval de Troie » (Crawford et al 2009). Figure 7. Rôles des CAFs dans la progression tumorale. Les CAFs peuvent agir sur toutes les étapes clés de la progression tumorale : ils peuvent 1) recruter d’autres cellules stromales, qui vont s’associer aux CAFs dans la promotion tumorale, 2) favoriser l’activation et la reprogrammation de cellules stromales en CAFs, 3) initier la progression tumorale, 4) réguler le potentiel « cellulessouches » des cellules tumorales, 5) induire un shift métabolique, 6) remodeler la MEC, la rendant « permissive à la progression tumorale », 7) favoriser une inflammation chronique, 8) supporter l’angiogenèse, 9) potentialiser le processus métastatique et aider les cellules tumorales à résister aux traitements (d’après (Ohlund et al 2014)). 37 3) Les adipocytes Longtemps oubliés dans la caractérisation du microenvironnement tumoral, il s’avère que le tissu adipeux (TA) et plus particulièrement les adipocytes exercent un rôle important dans la progression tumorale. En effet, le TA est présent en quantité importante dans l’organisme (environ 20% chez les hommes et 28% chez les femmes) et ses fonctions multiples lui permettent d’influencer considérablement le devenir de la tumeur (Thompson et al 2012). 3-1) Le tissu adipeux (T A) a) Composition du TA Le TA est un tissu conjonctif, plastique, composé d’un grand nombre de cellules. Sa fonction première est de stocker l’énergie excédentaire sous forme de triglycérides (TG) et de mobiliser cette énergie sous forme d’acides gras (AG), en fonction des besoins énergétiques de l’organisme. Il permet également d’assurer un support mécanique pour les tissus alentours et sert d’isolant thermique pour l’organisme. De plus, le TA est maintenant décrit comme un organe endocrine, qui sécrète une grande variété de molécules, regroupées sous le terme d’adipokines, telles que des hormones, des facteurs de croissance, des enzymes et des cytokines, pouvant agir sur un grand nombre de fonctions biologiques comme la régulation de la masse adipeuse, de la différenciation des adipocytes, du flux sanguin, de la fonction immunitaire et des fonctions plus larges, comme la prise alimentaire. L’ensemble des sécrétions du TA exerce, ainsi, un rôle important dans des pathologies, telles que l’obésité ou la lipodystrophie (Poulos et al 2010). Il existe majoritairement deux types de TA : le TA blanc encore appelé WAT (pour White Adipose Tissue), que je vais détailler ci-après et le TA brun (BAT pour Brown Adipose Tissue). A l’inverse du WAT, le BAT contient plusieurs petites vacuoles lipidiques et de nombreuses mitochondries, riches en cytochromes leur conférant leur couleur brune. Ils sont principalement responsables de la thermogenèse en dissipant l’énergie sous forme de chaleur sans production d’ATP (grâce à l’oxydation des AG et au découplage de la chaine respiratoire mitochondriale). Ce processus est majoritairement réalisé par la protéine UCP-1 (Uncoupling Protein-1), localisée au niveau de la membrane mitochondriale (Lee et al 2014) (Sanchez-Gurmaches and Guertin 2014). Chez l’Homme, ce TA est surtout présent chez le nouveau-né et tend à disparaître chez l’adulte. Récemment, un troisième type de TA a été identifié, appelé TA beige ou brite (pour BRown in whITE). Ce TA est caractérisé par un phénotype intermédiaire et serait retrouvé chez l’adulte (contrairement au BAT) sous forme de dépôts au sein du WAT (Hyvonen and Spalding 2014) (Shabalina et al 2013). Le TA blanc est organisé en lobules, délimités par des cloisons (septa) de tissu conjonctif. Les adipocytes sont serrés les uns aux autres, prenant ainsi une forme polygonale. Ce TA est composé de deux populations principales : les adipocytes matures, qui représentent la population cellulaire majoritaire 38 (80-90% du volume du TA et 60-70% du nombre de cellules présentes dans le TA) et un groupe hétérogène de cellules, regroupé sous le terme de SVF (Stromal Vascular Fraction) (Thompson et al 2012). Parmi ces cellules, figurent des précurseurs adipocytaires (pré-adipocytes), des cellules endothéliales (formant un réseau vasculaire conséquent), des fibroblastes, des cellules immunitaires, des fibres nerveuses et des cellules souches mésenchymateuses (ADSCs), comprises dans une MEC (Cousin et al 2006) (figure 8). L’ensemble de ces cellules participent au maintien, au développement ainsi qu’à la viabilité du tissu. Les adipocytes du TA blanc (à l’inverse des adipocytes du TA brun) présentent une large vacuole lipidique uniloculaire, occupant la quasi-totalité du cytoplasme (environ 90% de la cellule). Ce sont de grosses cellules rondes et volumineuses (diamètre moyen : 130µm) avec un noyau périphérique accolé à la membrane plasmique et dont la taille peut varier assez rapidement en fonction de la balance énergétique (figure 8). Figure 8. Composition du tissu adipeux blanc. Les adipocytes matures sont les éléments principaux du TA. Les autres types cellulaires, présents au sein du TA sont les précurseurs adipocytaires (ADSCs et pré-adipocytes), des fibroblastes, des cellules immunitaires (macrophages, T cells), des vaisseaux sanguins et une MEC (d’après (Ouchi et al 2011)). b) Localisation des différents tissus adipeux blancs La morphologie et la physiologie du TA varient considérablement en fonction du type et de la localisation. En effet, chez le mammifère, le TA blanc est disséminé dans des sites anatomiques divers. Les deux sites majoritaires sont le TA viscéral (mésentérique, rétro-péritonéal et périgonadique (péri-ovarien et péri-prostatique)) et le TA sous-cutané, classiquement localisé au niveau de l’hypoderme (fémoro-glutéal et abdominal). Le TA est aussi localisé au niveau de la glande mammaire (TA mammaire) et dans la moelle osseuse (TA médullaire) (figure 9). Cependant, dans des conditions pathologiques comme l’obésité, le TA peut s’accumuler à d’autres endroits dans l’organisme, notamment autour des reins, du cœur, et des poumons (Ouchi et al 2011). Il existe un dimorphisme 39 sexuel, quant à la répartition du TA : les hommes accumulent plus les TG dans le TA viscéral (répartition androïde) et dans le TA sous-cutané abdominal alors que les femmes stockent plus les graisses dans le TA sous-cutané fémoro-glutéal (répartition gynoïde). Figure 9. Répartition des différents TA dans l’organisme chez la femme et chez l’homme. Le TA viscéral et le TA sous-cutané sont les deux TA majoritaires. D’autres localisations sont retrouvées comme le TA médullaire, le TA péri-ovarien chez la femme et le TA péri-prostatique chez l’homme (d’après (Laurent et al 2014)). Le TA viscéral (VAT) et le TA sous-cutané (SAT). Alors que le SAT est plutôt responsable de l’isolation thermique de l’organisme, des études épidémiologiques ont mis en évidence qu’un excès de VAT est associé à un risque d’insulino-résistance et à des complications métaboliques, responsables de pathologies, telles que le diabète de type II, l’hypertension, l’athérosclérose … ; le SAT serait plus un facteur protecteur pour ces pathologies (Sanchez-Gurmaches and Guertin 2014). Les différences entre VAT et SAT peuvent s’expliquer par des capacités de stockage, de mobilisation des AG et par un profil sécrétoire différent. Par exemple, l’insuline, qui est l’hormone majeure impliquée dans le stockage et la mobilisation des AG est plus active dans le VAT (Hayashi et al 2008). De plus, la plupart des études s’accorde pour dire que les adipocytes du VAT sont plus sensibles aux agonistes βadrénergiques (signal inducteur de la lipolyse) que les adipocytes du SAT, ce qui a pour conséquence que le VAT possède une plus forte activité lipolytique que le SAT. Les différences fonctionnelles de ces deux TA s’expliquent également par des profils sécrétoires différents. En effet, le VAT sécrète davantage de cytokines pro-inflammatoires que le SAT, notamment l’IL-6, IL-8, PAI1 (Plasminogen activation inhibitor I), ainsi que les molécules impliquées dans l’immunité innée, alors que le SAT sécrète plus de leptine, qui est une hormone importante dans le contrôle de la prise alimentaire et de la régulation du stockage énergétique (voir le chapitre adipokines). Comme le SAT est moins actif métaboliquement que le VAT, il assurerait un meilleur stockage des TG à court et à long terme. De 40 plus, les adipocytes du VAT sont plus petits que les adipocytes du SAT. Ainsi, en cas d’excès énergétique, le SAT est plus mobilisé pour accumuler les TG (Bjorndal et al 2011). Les différences entre le VAT et le SAT impliquent également la SVF. En effet, Tchkonia et al. ont montré que les préadipocytes provenant du SAT ont de plus grandes capacités adipogéniques que les pré-adipocytes viscéraux isolés à partir du même individu (Tchkonia et al 2002). Le TA mammaire (MAT). Le MAT est un TA particulier car il fait partie intégrante de la glande mammaire et a un rôle primordial pour son développement. En effet, la glande mammaire est une glande exocrine, composée de cellules épithéliales (formant les canaux galactophores et les lobules) et de cellules myoépithéliales, comprises dans un stroma complexe, composé majoritairement d’adipocytes et de fibroblastes inclus dans une MEC. Son architecture et son développement seront développés dans la partie II. De nombreuses études ont montré que le MAT est essentiel au développement de l’épithélium mammaire, à toutes les étapes. Un dialogue intime se crée entre les cellules épithéliales et les adipocytes du MAT (Hovey et al 1999). Outre le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun, un troisième type d’adipocytes a été décrit chez la souris, appelé adipocytes roses. Les auteurs à l’origine de ce concept ont mis en évidence que pendant la lactation, les cellules épithéliales alvéolaires mammaires produisant le lait, proviennent de la transdifférenciation d’adipocytes sous-cutanés, soulignant la grande plasticité des adipocytes (Giordano et al 2014). Le TA médullaire (BMAT pour Bone marrow adipose tissue). Encore très peu décrits, les adipocytes médullaires représentent un composant important du microenvironnement de la moelle osseuse. Ce type de TA aurait un profil unique, intermédiaire entre le BAT et le WAT, caractérisé par des adipocytes de petite taille (Lecka-Czernik 2012). 3-2) Les adipocytes a) Origine et différenciation Le nombre d’adipocytes chez l’adulte est relativement constant. Le turnover des adipocytes serait d’environ 0.2-0.3% par jour correspondant à une demi-vie de 300 à 400 jours pour ces cellules (Spalding et al 2008) (Thompson et al 2012). En cas de perte de poids, seule la taille adipocytaire, et non le nombre, diminue (Hyvonen and Spalding 2014). Les adipocytes, au même titre que les myocytes, les chondrocytes, les ostéocytes et les fibroblastes dérivent d’un même précurseur : les MSCs. Ce processus, appelé adipogenèse se traduit par une première phase de détermination, qui implique l’engagement d’une cellule souche mésenchymateuse vers un adipoblaste, qui deviendra pré-adipocyte. Les pré-adipocytes sont des cellules allongées, de morphologie fibroblastique. Ils ne peuvent pas être différenciés morphologiquement, de leur précurseur, mais ils ont perdu la capacité à se différencier en une cellule d’un autre lignage. Jusqu’à ce 41 stade, les cellules ont encore la capacité de proliférer. Cette phase a été peu caractérisée (Christodoulides et al 2009) (figure 10). La seconde phase, appelée phase de différenciation adipocytaire correspond à la transition du préadipocyte en adipocyte, qui deviendra mature. A ce stade, l’adipocyte possède ses capacités fonctionnelles et la machinerie enzymatique nécessaire à ses fonctions, telles que la synthèse et le transport de lipides, la réponse à l’insuline et la sécrétion de nombreuses protéines (Feve 2005) (figure 10). C’est au cours de cette étape que d’importants changements morphologiques s’opèrent, tels qu’une augmentation importante de la taille de la cellule, un « arrondissement » de la cellule et une accumulation de vacuoles lipidiques. Au début de cette phase, un profond remaniement du cytosquelette et de la MEC est observé, jouant un rôle important dans l’acquisition du phénotype de l’adipocyte mature et dans le bon déroulement de cette phase. Cette étape est suivie d’une expansion clonale, qui consiste à quelques mitoses, puis s’ensuit une perte irréversible des capacités prolifératives. Enfin, lors de la différenciation terminale, l’adipocyte acquiert ses propriétés lipogéniques, lipolytiques et sécrétoires. Une fois les capacités métaboliques de l’adipocyte acquises, ces derniers commencent à accumuler des lipides. Les lignées cellulaires murines pré-adipocytaires 3T3-F442A et 3T3-L1, couramment utilisées, sont déjà déterminées vers le lignage adipocytaire, mais permettent de récapituler in vitro la phase de différenciation adipocytaire. Ces lignées sont établies à partir d’une sélection clonale de fibroblastes, dérivés d’un embryon d’une souris swiss 3T3, âgée de 17 à 19 semaines (Feve 2005) (Lafontan 2012). 42 Figure 10. Etapes clés de l’adipogenèse : la détermination et la différenciation adipocytaires. La détermination adipocytaire consiste à l’engagement d’une MSC dans le lignage adipocytaire. La différenciation adipocytaire est l’étape permettant la transition d’un pré-adipocyte vers un adipocyte mature. Ces deux phases sont sous le contrôle étroit de facteurs de transcription et de régulateurs extracellulaires (d’après Gregoire et al. 1998, Physiology Reviews and Feve et al. 2005). Le contrôle transcriptionnel de l’adipogenèse : Comme cette étape est associée à de profonds changements phénotypiques et métaboliques de la cellule, elle est sous le contrôle de facteurs transcriptionnels, comme les PPARs (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) et les protéines de la famille des CEBPs (CAAT/Enhancer Binding Proteins) ou encore les SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Proteins) et les KLFs (KruppelLike zinc Finger transcription factor). Le modèle classique de l’adipogenèse suggère une induction initiale et transitoire des facteurs C/EBPβ et C/EBPδ. L’expression précoce de ces facteurs permet l’expression de PPARγ. Par la suite, l’action conjointe de C/EBPβ, C/EBPδ et de PPARγ induit C/EBPα. Une fois activés, ces deux facteurs (PPARγ et C/EBPα) agissent en synergie et s’autorégulent afin de maintenir leur expression et activent de nombreux gènes codant pour des protéines impliquées dans le métabolisme et l’acquisition du phénotype adipocytaire (Du et al 2010) (figure 10). PPARγ représente le facteur clé de l’adipogenèse. 43 Membre de la superfamille des récepteurs nucléaires, son expression est suffisante pour induire la différenciation adipocytaire. Jusqu’à présent, aucun autre facteur n’a été montré capable d’induire l’adipogenèse en absence de PPARγ (Lee and Ge 2014). Le rôle de PPARγ n’est pas seulement important pour induire l’adipogenèse, il est également crucial pour maintenir les adipocytes dans un état différencié et dans la régulation de la sensibilité à l’insuline (Tamori et al 2002). Des mutations de PPARγ ont ainsi été associées à des pathologies comme la lipodystrophie (caractérisée par une diminution voire une absence de TA) et des maladies métaboliques, comme l’hypertension et une insulino-résistance (Lee and Ge 2014). Il existe deux isoformes de PPARγ : PPARγ1 et PPARγ2, générés par épissage alternatif. PPARγ2 est exclusivement exprimé par les adipocytes et fortement induit lorsque les cellules rentrent dans la phase de différenciation adipocytaire (Feve 2005). Les membres de la famille C/EBP (C/EBPα, C/EBPβ et C/EBPδ) sont exprimés par les adipocytes et ont donc un rôle important dans l’adipogenèse. C/EBPα est impliqué dans la régulation directe de nombreux gènes adipocytaires et exerce aussi un rôle dans le maintien des adipocytes différenciés et dans leur sensibilité à l’insuline (Rosen and MacDougald 2006). Régulation extra-cellulaire de l’adipogenèse : L’adipogenèse est donc le résultat d’une activation séquentielle de facteurs de transcription, dont les plus importants sont les PPARs et les C/EBPs mais une multitude d’autres facteurs de transcription sont régulés dans les adipocytes. D’autres signaux intra et extra-cellulaires peuvent également réguler ce processus, afin d’adapter la croissance et la différenciation des nouveaux adipocytes en fonction des besoins énergétiques. La signalisation insuline / récepteur IGFR-1et les gluco-corticoïdes figurent parmi les facteurs pro-adipogéniques, alors que le TGF-β, les cytokines pro-inflammatoires, Pref-1 (Preadipocyte secreted factor 1), la voie de signalisation Notch et les membres de la famille WNT (Wingless-type MMTV integration site) inhibent l’adipogenèse (Rosen and MacDougald 2006). Cette dernière est apparue comme un régulateur clé de l’adipogenèse et nous a particulièrement intéressé (Bochet et al 2013) (figure 11). Les membres de la famille Wnt sont des glycoprotéines secrétées, pouvant agir de manière autocrine ou paracrine afin d’influencer le destin cellulaire et le développement (Feve 2005). Les ligands Wnt exercent leurs effets via des signalisations « canoniques » et « non-canoniques » (Christodoulides et al 2009). La voie de signalisation canonique Wnt/β-caténine converge vers l’activation du facteur de transcription β-caténine. En l’absence de ligands Wnts, la β-caténine est recrutée par le complexe de dégradation, composé entre autres par l’Axine et APC (Adenomatous Polyposis Coli), ce qui facilite sa phosphorylation par la caséine kinase 1 et par GSK3β (Glycogen Synthase Kinase-3β). Ceci conduit la β-caténine à l’ubiquitinylation et à sa dégradation protéasomale. Ainsi, la β-caténine est maintenue à un niveau d’expression faible dans la cellule. Elle est surtout localisée au niveau des membranes et au cytosquelette, liée à l’E-cadhérine et à l’α-caténine, afin de réguler les processus d’adhésion cellulaire 44 (Collu et al 2014). Lorsque les Wnts se lient aux récepteurs frizzled (FZD) et aux co-récepteurs LRP5/6 (Lipoprotein Receptor-related Protein-5 or 6), une inactivation du complexe de dégradation est observée. Puis, Dishevelled (Dvl) et l’Axine sont recrutés au niveau de la membrane, loin du complexe de dégradation. La β-caténine hypophosphorylée s’accumule alors dans le cytoplasme, transloque alors au noyau et se lie aux facteurs de transcription de la famille LEF/TCF (LymphoidEnhancer-Binding factor/T-Cell specific transcription Factor) pour activer des gènes cibles, tels que PPARδ, Axin2, c-Myc, cycline D1, matrilysine et CD44 (Collu et al 2014) (Christodoulides et al 2009) (Mulholland et al 2005) (figure 11). Les voies de signalisation non canoniques induites par les Wnts, indépendantes de la β-caténine sont moins bien caractérisées. On distingue la voie Wnt/PCP (Planar Cell Polarity) et la voie Wnt/calcium impliquées dans des fonctions cellulaires diverses, telles que la migration cellulaire (Christodoulides et al 2009) (Collu et al 2014). Figure 11. La voie de signalisation Wnt/β-caténine. (A) En absence de ligands Wnt, la β-caténine est prise en charge par le complexe de dégradation Axine / APC, qui va contribuer à la phosphorylation de la β-caténine par la caséine kinase-1 et par GSK3β. Ceci conduit la β-caténine à l’ubiquitinylation et sa dégradation protéasomale. (B) Les ligands Wnt se lient aux récepteurs membranaires Frizzled et co-récepteurs LRP5/6, ce qui recrute la protéine Dishevelled et l’Axine, empêchant la formation du complexe de dégradation. La β-caténine cytosolique s’accumule alors, transloque au noyau et se lie aux facteurs de transcription TCF/LEF, afin d’activer ses gènes cibles (d’après (Collu et al 2014)). La voie de signalisation Wnt/β-caténine exerce un rôle crucial de frein dans l’adipogenèse (figure 12). Au contraire, une inactivation de cette voie en intra ou extra-cellulaire, par des protéines recombinantes SFRPs (Secreted Frizzled-Related Proteins) ou par l’expression constitutive de l’Axine, induit une adipogenèse spontanée à partir de pré-adipocytes et de précurseurs mésenchymateux (Wright et al 2007) (Ross et al 2000). La voie Wnt/β-caténine inhibe la phase de différenciation adipocytaire en bloquant l’expression de PPARγ et C/EPBα. Les cibles de la β-caténine : c-myc et la 45 cycline D1 facilitent cet effet en se liant à ces deux facteurs de transcription. La régulation négative de la voie Wnt/β-caténine sur PPARγ et C/EPBα est réciproque car en présence de stimuli adipogéniques, l’induction de ces deux facteurs de transcription mène à une diminution de l’expression des Wnts (figure 12). Les ligands Wnt les plus étudiés dans l’adipogenèse sont Wnt10b, Wnt10a, Wnt6, Wnt3a et Wnt1 (Mulholland et al 2005). L’expression de Wnt10b est élevée dans les pré-adipocytes et diminue rapidement après l’induction de la différenciation (Christodoulides et al 2009). In vivo, des souris transgéniques exprimant Wnt10b sous le contrôle du promoteur FABP4 (Fatty Acid Binding Protein 4), fortement fonctionnel dans les adipocytes présentent une diminution de 50% de leur masse graisseuse et sont résistantes à l’obésité induite par un régime hyperlipidique (Longo et al 2004). Une étude a souligné, chez l’homme, l’impact de Wnt10b dans l’obésité. En effet, une mutation portant sur le gène de Wnt10b a été retrouvée chez plus de 200 sujets obèses, présentant une obésité sévère précoce (Laudes 2011). De plus, des études récentes ont mis en évidence que la voie Wnt serait également impliquée dans l’interaction des adipocytes avec les cellules inflammatoires, afin d’impacter l’inflammation chronique observée chez les patients obèses atteints de diabète de type 2 (Laudes 2011). Cependant, certains ligands Wnt, tels que Wnt5b sont décrits pro-adipogéniques, en activant probablement des voies Wnt non canoniques (Christodoulides et al 2009). La voie canonique Wnt/β-caténine contrôle également la balance entre l’adipogenèse et la myogenèse. Dans des précurseurs mésenchymateux, une activation de cette voie stimule l’ostéoblastogenèse au dépens de l’adipogenèse (Bennett et al 2005) (Rosen and MacDougald 2006). Via l’activation de la voie Wnt/β-caténine, Wnt3a, présent dans les cellules souches mésenchymateuses induit l’expression de plusieurs facteurs pro-myogéniques, tels que PAX7, MYOD et la myogénine et la diminution de C/EBPα et PPARγ (Laudes 2011) (Shang et al 2007). Figure 12. Rôle de la voie Wnt/β-caténine dans l’adipogenèse. Cette voie inhibe l’adipogenèse au niveau de la détermination et de la différenciation adipocytaires (d’après (Christodoulides et al 2009)). 46 b) La plasticité des adipocytes Les adipocytes se sont révélés être des cellules hautement plastiques, capables de se convertir en d’autres types cellulaires, représentant ainsi un nouvel outil dans la médecine régénérative. Un switch entre les adipocytes bruns et blancs peut être observé en fonction des conditions physiologiques et des signaux sous-jacents (Casteilla et al 2008). La conversion d’adipocytes blancs en adipocytes brunslike a été appelée « browning » et peut être induite par une exposition au froid et une stimulation βadrénergique (Himms-Hagen et al 1994) (Lee et al 2014). D’autres études ont mis en évidence la capacité des adipocytes à se dédifférencier. Par une technique appelée « ceiling culture », les adipocytes matures, obtenus à partir de tissus humains ou murins, se dédifférencient en cellules fibroblastiques capables de proliférer et de se différencier en d’autres lignages. Nommés DFAT (Dedifferenciated Fat Cells), ces adipocytes dédifférenciés perdent l’expression de marqueurs adipocytaires et acquièrent des marqueurs de cellules souches mésenchymateuses, tels que RUNX2 et SOX9 ; phénotype proche des ADSCs. In vitro, les DFAT sont capables de se différencier en adipocytes, en chondrocytes, en ostéoblastes, en cardiomyocytes et en péricytes et représentent ainsi une source cruciale de progéniteurs multipotents (Matsumoto et al 2008). Une étude publiée par Gustafson et al. a mis en évidence que le traitement des adipocytes différenciés à partir de la lignée 3T3-L1 par le ligand Wnt3a et le TNFα induit une dédifférenciation des adipocytes. Ces cellules dédiffenciées adoptent un phénotype fibroblastique, caractérisé par une diminution des marqueurs adipocytaires et des propriétés prolifératives et migratoires (Gustafson and Smith 2010). L’équipe de MC. Rio a également mis en évidence que les cellules tumorales et les adipocytes établissent un dialogue réciproque, induisant la sécrétion de la MMP-11 dans les adipocytes péritumoraux, qui permet leur dédifférenciation en cellules de type fibroblastique. Cette MMP régule aussi négativement l’adipogenèse (Motrescu et al 2008) (Andarawewa et al 2005). c) Rôle physiologique des adipocytes Du fait du manque de connaissances, le TA et les adipocytes ont longtemps été considérés comme des acteurs passifs du métabolisme énergétique. Depuis une vingtaine d’années, de nouvelles fonctions des adipocytes ont été identifiées, telles que la production de composants biologiquement actifs, qui font des adipocytes de véritables cellules endocrines, ayant également un rôle actif sur le métabolisme énergétique. Fonctions métaboliques de l’adipocyte Les adipocytes ont un rôle primordial dans le maintien de l’homéostasie énergétique. En effet, ils permettent d’une part de stocker les lipides sous forme de TG (lipogenèse + synthèse des TG) et d’autre part de les libérer dans l’organisme sous forme d’AG (lipolyse), qui peuvent aller dans le sang 47 vers le foie et les muscles, où ils seront utilisés afin de fournir de l’énergie, grâce à la β-oxydation en fonction des besoins (Wilfling et al 2014). La synthèse des TG. Il existe deux mécanismes différents permettant de synthétiser les TG. La première et principale source est le captage des TG provenant de la circulation sanguine. Les TG sont contenus dans des lipoprotéines (chylomicrons et VLDL (Very Low Density Lipoprotein)) et seront hydrolysés par l’enzyme LPL (Lipoprotein Lipase) en AG, enzyme sécrétée par les adipocytes et présente à la surface des cellules endothéliales. La deuxième source d’AG est la lipogenèse de novo, permettant la formation d’AG à partir des précurseurs glucidiques. Dans les deux cas, il s’ensuit une réaction d’estérification par greffe de trois molécules d’AG sur un squelette glycérol aboutissant à la formation de TG. Le glycérol est obtenu à partir du glycérol-3-phosphate, formé par la glycolyse (Proenca et al 2014). Chez les mammifères, le stockage des TG est assuré dans la vacuole lipidique de l’adipocyte. Cette vacuole est composée plus précisément d’un corps de lipides neutres (triacylglycérol ou des esters de cholestérol), entouré par une monocouche de phospholipides et séparé du cytosol par une couche de protéines structurales, comme les protéines de la famille périlipine (Wilfling et al 2014). A la surface de cette vacuole lipidique, il y a également des enzymes (impliquées dans la synthèse de phospholipides et de TG, les lipases et les régulateurs lipolytiques) et des co-activateurs. Le stockage des TG est primordial, car en cas de diminution, une lipotoxicité peut avoir lieu par libération de TG circulants. Ce processus est à l’origine de pathologies, telles que la résistance à l’insuline. La synthèse des TG et la lipogenèse sont soumises à des régulations hormonales et nutritionnelles importantes. Facteurs très importants, les catécholamines (via l’AMPc et la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA)) inhibent la lipogenèse ainsi que la synthèse et l’activité de la LPL. A l’inverse, l’insuline est un facteur pro-lipogénique important et inducteur de la synthèse des TG. La lipolyse. Ce processus consiste en l’hydrolyse des TG présents dans la gouttelette lipidique, en AG et glycérol. Les AG pourront ainsi être utilisés comme substrats énergétiques par la cellule, comme médiateurs de la signalisation et pour la synthèse des membranes. Les AG sont pris en charge par des transporteurs appelés FABPs cytosoliques, leur permettant de circuler dans la cellule et d’être adressés à différents compartiments cellulaires (Storch and Thumser 2010). La lipolyse est réalisée majoritairement par trois lipases : ATGL (Adipocyte Triglyceride Lipase), HSL (Hormonosensitive Lipase ou LHS pour Lipase Hormonosensible) et MAGL (Monoacylglycerol Lipase). La LHS représente l’étape limitante de la lipolyse. En effet, l’activité de la LHS est contrôlée de façon étroite par phosphorylation réversible, réalisée par une PKA et PKG (protéine kinase dépendante de l’AMPc ou du GMPc). Les périlipines interviennent probablement dans le maintien de la LHS. La lipolyse est régulée de façon précise par de multiples signaux d’origine nerveuse, paracrine ou endocrine. Les cathécholamines, en agissant par l’intermédiaire des récepteurs β-adrénergiques (β1, β2 et β3) (prolipolytiques) ou bien sur les récepteurs α-adrénergiques (anti-lipolytiques) sont des effecteurs 48 puissants de la lipolyse. L’insuline est considérée comme le plus puissant inhibiteur physiologique de la lipolyse, puisqu’elle stimule la phosphodiestérase, qui entraîne la diminution des taux intracellulaires d’AMPc, et donc une diminution de l’activation de la PKA et de la LHS (Kitamura et al 1999). Les peptides natriurétiques (ANP (Atrial natriuretic peptide) et BNP (Brain natriuretic peptide)) exercent un effet lipolytique, via l’activation de récepteurs membranaires spécifiques et par un processus indépendant à l’AMPc. De manière intéressante, Sangenes et al. ont démontré que les peptides natriurétiques pouvaient également favoriser la lipolyse via une voie dépendante du GMPc mais indépendamment de l’AMPc (Sengenes et al 2000). Fonctions sécrétoires des adipocytes Au cours de ces dernières années, des études ont mis en évidence les différents facteurs produits et libérés par les adipocytes, permettant de définitivement asseoir leur nature multi-sécrétrice. En effet, la découverte de la leptine en 1994 par le groupe de Friedman a profondément changé la vision générale du rôle des adipocytes dans l’organisme. Cette hormone agit, via la circulation sanguine, sur la régulation de la prise alimentaire, la dépense énergétique et le métabolisme énergétique (Zhang et al 1994). Depuis, de nombreux facteurs sécrétés par l’adipocyte, regroupés sous le terme d’adipokines, ont été identifiés. L’intérêt croissant porté au rôle sécrétoire des adipocytes repose sur le nombre et la variété des rôles biologiques des facteurs secrétés. Certaines adipokines sont libérées dans la circulation sanguine et agissent à distance sur les grandes fonctions de l’organisme, comme la leptine et l’adiponectine, qui sont considérées comme des hormones adipocytaires. D’autres ont un rôle plutôt local, paracrine ou autocrine. Les fonctions générales des adipokines sont très vastes et comprennent : la régulation du métabolisme énergétique (adiponectine, leptine, apeline ou résistine), du système cardio-vasculaire (angiotensinogène, angiotensine, PAI1), du système immunitaire (protéines du complément, cytokines pro-inflammatoires et chimiokines) et des fonctions plus générales (facteurs de croissance). La plupart de ces molécules sont d’origine peptidique mais les adipocytes synthétisent également des médiateurs lipidiques (prostaglandines, acide lysophosphatidique, stéroïdes …) (Poulos et al 2010). Dans les années à venir, il est évident que d’autres adipokines seront découvertes. L’expression des adipokines peut être altérée dans de nombreuses situations pathologiques, comme l’obésité et le diabète (voir partie II) (Ouchi et al 2011). De par leur fonction très particulière, leur omniprésence dans l’organisme et leur capacité sécrétrice, les adipocytes représentent un constituant stromal abondant, qui peut influencer considérablement les cellules tumorales aussi bien de manière endocrine que paracrine (Ouchi et al 2011) (Vona-Davis and Rose 2007). 49 3-3) Adipocytes et cancer a) Le tissu adipeux dans le stroma tumoral Le microenvironnement tumoral est classiquement composé de cellules inflammatoires, de CAFs, de progéniteurs, de cellules endothéliales et d’adipocytes compris dans une MEC. Parmi toutes ces cellules (décrites dans les deux premières sous-parties), le rôle des adipocytes a été révélé depuis peu, alors qu’ils représentent un composant cellulaire majeur, notamment dans le cancer du sein, de la prostate, du côlon, du pancréas, de l’ovaire, de l’utérus, les leucémies et le mélanome (figure 13) (Sheng and Mittelman 2014) (Laurent et al 2014) (Wang et al 2012). Dans le cas du cancer du sein, le TA fait partie intégrante de la glande mammaire, ainsi une proximité s’établit d’emblée entre les cellules tumorales et les adipocytes. C’est d’ailleurs dans ce modèle que l’interaction adipocytes et cancer a été le mieux caractérisée. Dans le cas des autres cancers, la tumeur doit disséminer et donc devenir invasive localement pour entrer en contact avec les adipocytes. Figure 13. Marquages hématoxyline/éosine du front invasif de mélanome, de cancer colorectal, de la prostate et du sein. Lorsque les cancers deviennent invasifs, les cellules tumorales (rose-mauve) rencontrent le TA, majoritairement composé d’adipocytes (ronds blancs) (d’après Laurent et al., 2014, Obésité). Le rôle du TA dans la progression tumorale a été abordé dans les années 1990 par l’équipe de ZQ Cheng. Cette étude a mis en évidence que la co-injection intra-dermique de cellules tumorales murines avec des fragments de TA mammaire ou ovarien dans la souris, induit une croissance tumorale et une capacité métastatique plus importantes qu’en absence de TA (Elliott et al 1992). Dans les années 2000, quelques études ont ensuite mis en évidence le rôle des adipocytes dans la prolifération des cellules tumorales mammaires ; processus médié par les sécrétions adipocytaires (Amemori et al 2007) 50 (Manabe et al 2003) (Tokuda et al 2003). Depuis, un intérêt croissant portant sur le rôle des adipocytes dans la progression tumorale a été observé. Ainsi, les adipocytes ont été incriminés pour leur rôle promoteur de la croissance ou des métastases des tumeurs du sein, de la prostate, du côlon, de l’estomac, du rein, de l’ovaire et des leucémies (Park et al 2014) (Nieman et al 2013). Outre les adipocytes, le TA est composé d’ADSCs, qui ont également un rôle dans la progression tumorale. Les molécules impliquées dans le dialogue paracrine entre adipocytes et cancer commencent à être bien identifiées : cytokines pro-inflammatoires, protéines de la MEC ou de son remodelage et acides gras libres (Nieman et al 2013) (Hefetz-Sela and Scherer 2013), ainsi que le rôle des adipokines endocrines telles que la leptine et l’adiponectine. Une étude réalisée en 2005 a étudié les adipokines produites par le TA mammaire dans un contexte tumoral, par une approche protéomique. Au total, 359 protéines ont été répertoriées comme lui étant spécifiques, soulignant ainsi le rôle du TA dans la progression tumorale (Celis et al 2005). b) Rôle paracrine des adipocytes dans la progression tumorale : les CAAs De par la proximité physique qui s’établit entre les cellules tumorales et les adipocytes, un rôle local des adipocytes sur la progression tumorale a été spéculé via une interaction paracrine. Notre équipe a été l’une des premières à valider l’hypothèse d’un dialogue bidirectionnel entre les adipocytes et les cellules tumorales (Dirat et al 2011) (Dirat et al 2010) (Andarawewa et al 2005). Pour cela un système de co-culture en 2D a été mis en place, dans lequel les cellules tumorales et les adipocytes sont séparés par un insert poreux, permettant uniquement la diffusion des sécrétions des deux types de cellules, sans établir de contact direct entre elles. Dans le modèle du cancer du sein, les cellules tumorales préalablement co-cultivées avec des adipocytes présentent une augmentation de leurs capacités invasives in vitro et in vivo. En effet, lorsque les cellules tumorales mammaires, préalablement cocultivées avec des adipocytes sont injectées dans la queue d’une souris syngénique, le nombre et la quantité de métastases pulmonaires sont augmentés (Dirat et al 2011). D’autre part, les adipocytes cocultivés avec les cellules tumorales subissent d’importantes modifications morphologiques et fonctionnelles et présentent un phénotype spécifique, caractérisé par trois grands types de modifications qui font d’eux des cellules « activées » : une délipidation, une diminution des marqueurs adipocytaires, la surexpression de protéines pro-inflammatoires (IL-6, IL-1β, PAI1) et la surexpression de protéines de la MEC ou impliquées dans son remodelage. Ainsi, par analogie aux CAFs ou aux TAMs, nous avons nommé ces cellules : CAAs pour Cancer-Associated Adipocytes (figure 14). Ces CAAs, dont le phénotype a été défini in vitro, sont présents au niveau du front invasif des tumeurs humaines et présentent les caractéristiques similaires à ce qui a été décrit in vitro. Nous avons mis en évidence que l’IL-6 joue un rôle majeur dans l’augmentation de l’invasion induite par les adipocytes (Dirat et al 2011). De façon intéressante, nous avons montré que l’expression (ARNm) de l’IL-6 est corrélée avec la taille des tumeurs et à l’envahissement ganglionnaire mais non à l’expression des récepteurs aux œstrogènes, du type ou du grade des tumeurs mammaires (Dirat et al 2011). Outre 51 l’inflammation, la deuxième caractéristique des CAAs est qu’ils expriment des protéines de la MEC et de son remodelage. L’équipe de Philipp Scherer a mis en évidence qu’une expression importante de collagène VI est retrouvée dans les adipocytes péritumoraux et cela favorise la croissance des tumeurs mammaires in vivo (Iyengar et al 2005). Plus récemment, cette même équipe a montré qu’un fragment de clivage du collagène VI, l’endotrophine, agit comme molécule de signalisation afin de promouvoir la fibrose, l’angiogenèse et l’inflammation dans le microenvironnement des tumeurs mammaires, favorisant ainsi l’agressivité tumorale et en particulier l’apparition de métastases (Park and Scherer 2012). Le groupe de Marie-Christine Rio a montré que les CAAs expriment également la MMP11 (ou stromelysine 3), métalloprotéase qui favorise la progression tumorale, via sa capacité à cliver la MEC et certains de ses substrats, comme le collagène VI (Andarawewa et al 2005) (Motrescu et al 2008). La dernière caractéristique des CAAs est la perte des TG contenus dans les gouttelettes lipidiques. Dans l’équipe, nous avons montré que les AGs libérés par les adipocytes sont transférés dans les cellules tumorales mammaires et prostatiques (Laurent et Wang, en préparation). En dépit du fait que le phénotype CAA a été principalement identifié dans le cancer du sein, un phénotype similaire a été décrit dans le cancer de la prostate invasif, de l’ovaire, du côlon et le mélanome (Finley et al 2009) (Nieman et al 2013) (Kushiro et al 2012). De plus, le transfert de lipides a été identifié dans le cancer de l’ovaire et de la prostate (Nieman et al 2011). Dans le cancer de l’ovaire, les cellules tumorales disséminent fréquemment dans l’omentum, région riche en adipocytes présente dans la cavité péritonéale. Sous l’effet d’un processus de lipolyse, les adipocytes se délipident et les cellules tumorales ovariennes accumulent des lipides, sous forme de gouttelettes. Ce transfert de lipides (sous forme d’AG) est important pour la croissance de la tumeur dans l’omentum. Ces AG peuvent être utilisés par les cellules tumorales comme constituants des membranes, comme facteurs de signalisation mais aussi comme source d’énergie pour la tumeur à travers la β-oxydation au niveau des mitochondries (Wang en préparation), (Nieman et al 2011). Ainsi, au même titre que le « reverse warburg effect » dans les CAFs, une véritable symbiose métabolique se crée entre les adipocytes et les cellules tumorales, fournissant à ces dernières l’énergie nécessaire à leur invasion vers des sites métastatiques (Nieman et al 2013). La figure 14 résume le rôle des CAAs sur la progression tumorale et leurs caractéristiques. Dans l’équipe, nous avons également montré que les CAAs favorisent la radiorésistance des cellules tumorales mammaires. Ces dernières, co-cultivées avec des adipocytes présentent une résistance plus importante aux radiations ionisantes, associée à une diminution de la mort post-mitotique (Bochet et al 2011). Un rôle des adipocytes dans la chimiorésistance a également été suggéré mais les mécanismes décrits seront détaillés dans la partie III de cette introduction. Outre le rôle des adipocytes dans l’effet prolifératif et invasif des cellules tumorales, un rôle dans l’angiogenèse a également été soulevé. En effet, les adipocytes sécrètent de manière importante des facteurs pro-angiogéniques, tels que le VEGF. Dans un modèle de cancer du côlon, une étude récente a montré que le milieu conditionné 52 d’adipocytes favorise l’angiogenèse in vitro (modèle de la membrane chorioallantoïde d’un embryon de poulet) (Xiao et al 2014). Dans ce cas, le dialogue bidirectionnel entre les cellules tumorales et les adipocytes n’a pas été pris en compte. L’effet pro-tumoral observé est uniquement lié aux sécrétions basales des adipocytes. Figure 14. Rôle des CAAs dans la progression tumorale. Sous l’effet des sécrétions tumorales, les adipocytes se réorientent en CAAs, caractérisés par (i) une délipidation et une diminution des marqueurs adipocytaires, (ii) une surexpression de molécules pro-inflammatoires, (iii) une surexpression de protéines de la MEC ou de son remodelage. Les CAAs en retour favorisent la progression tumorale, en augmentant la croissance, l’invasion et la radiorésistance des cellules tumorales. Ces processus peuvent être médiés, par l’IL-6, le collagène VI (COLVI), les MMP11 et 9 et les acides gras (AG) provenant des adipocytes (d’après (Wang et al 2012)). c) Rôle endocrine des adipocytes dans la progression tumorale En plus d’avoir un rôle paracrine, certaines adipokines peuvent agir de façon endocrine, via le réseau sanguin. En effet, les adipokines TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1 (CCL2) ont été impliquées dans la progression tumorale (Inouye et al 2007) (Sartipy and Loskutoff 2003) (Nieman et al 2013). Dans cette partie, seules les adipokines les plus connues dans le cancer seront détaillées, comme la leptine et l’adiponectine. La leptine. Produit du gène ob, la leptine est une hormone sécrétée majoritairement par les adipocytes, certaines cellules épithéliales et récemment elle a aussi été identifiée dans les CAFs (Barone et al 2012). La leptine a initialement été décrite pour son rôle dans l’homéostasie énergétique et dans la 53 régulation de la prise alimentaire, comme facteur de satiété, au niveau du système nerveux central. Ainsi, les souris mutées pour le gène de la leptine ob/ob ou son récepteur db/db présentent une obésité très importante, associée à une insulino-résistance (Park et al 2011) (Ouchi et al 2011). Outre son rôle dans le métabolisme énergétique, la leptine exerce un rôle important dans l’immunité, l’inflammation, l’angiogenèse, l’hématopoïèse et la reproduction (Ouchi et al 2011) (Muoio and Lynis Dohm 2002). Son activité est médiée, via son récepteur LEP-R transmembranaire, codé par le gène db. La liaison de la leptine à son récepteur induit une cascade de signalisation en aval, notamment les voies de signalisation JAK2-STAT3 (Janus Kinase 2 - Signal Transducer and Activator of Transcription 3), MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), PI3K-AKT (Phosphatidylinositol 3 Kinase – Protein kinase B), impliquées dans différents processus cellulaires, comme la prolifération, la migration, la survie des cellules ; voies identifiées comme pro-tumorales (Ando et al 2014). En effet, la leptine et son récepteur sont surexprimés dans certains cancers, notamment le cancer du sein, où elle est associée à des tumeurs de haut grade et métastatiques (Ishikawa et al 2004). Son rôle pro-tumoral est multiple : il a été montré in vitro et in vivo que la leptine favorise la prolifération et la transformation des cellules, l’angiogenèse, les voies anti-apoptotiques des cellules tumorales, diminue l’efficacité des traitements et favorise l’EMT des cellules (Ando et al 2014). L’insuline, l’hypoxie, l’IGF-1, le TNF-α, les C/EBPs et les œstrogènes stimulent la production de leptine dans les adipocytes et dans les cellules cancéreuses (Schaffler et al 2007). De façon intéressante, la leptine est également capable d’activer le récepteur aux œstrogènes. Ainsi, une corrélation a été trouvée dans le cancer du sein entre le niveau d’expression du récepteur à la leptine et les tumeurs positives pour le récepteur aux œstrogènes (Ando et al 2014). Elle est également surexprimée dans de nombreuses cellules tumorales : mammaires, pancréatiques, gastro-intestinales, du poumon et leucémiques (Park et al 2014) (Hefetz-Sela and Scherer 2013). La leptine a un rôle important dans l’obésité, comme le démontre le phénotype des souris mutées pour son gène. De plus, sa synthèse et sa concentration plasmatique sont augmentées proportionnellement à la masse de tissu adipeux, ce qui a pour conséquence une augmentation de la leptine chez les patients obèses (Ando et al 2014). Toutefois, un lien direct entre l’augmentation de la leptine et la survenue de tumeur dans un contexte d’obésité reste à être démontré (Park et al 2014) (Hefetz-Sela and Scherer 2013). L’adiponectine. L’adiponectine est quasi exclusivement synthétisée par les adipocytes et est présente à des concentrations élevées dans le sang. Son expression est plus importante dans le TA sous-cutané que dans le TA viscéral (Ouchi et al 2011). Son action est médiée via les récepteurs AdipoR1, AdipoR2 et T-cadhérine (CDH13), localisés spécifiquement dans différents tissus. En effet, AdipoR1 est plutôt présent dans les muscles et AdipoR2 dans le foie. La liaison de l’adiponectine à ses récepteurs active en aval les voies de signalisation dépendantes de l’AMPc, les MAPK et c-Jun (Park et al 2011) (Vona-Davis and Rose 2007). Les rôles physiologiques de l’adiponectine sont multiples : rôle protecteur contre l’obésité et les maladies cardiovasculaires (action anti-athérogène), diminution 54 de la résistance à l’insuline, sécrétion de cytokines anti-inflammatoires, augmentation de l’oxydation des AG. La production d’adiponectine par les adipocytes est inhibée par des facteurs proinflammatoires (TNF-α, l’IL-6), l’hypoxie et le stress oxydatif (Ouchi et al 2011). Il est maintenant bien connu que les taux plasmatiques d’adiponectine sont inversement proportionnels à la masse de TA. Ainsi, les patients obèses présentent des faibles taux d’adiponectine dans l’organisme. Le rôle de l’adiponectine dans la progression tumorale est à l’heure actuelle encore controversé. Elle a tout d’abord été négativement corrélée avec des cancers du sein post-ménopausiques, de l’endomètre, du rein, du côlon, gastrique, pancréatique et les leucémies (Hefetz-Sela and Scherer 2013). Autrement dit, les patients atteints de cancers présentent des taux plasmatiques très faibles d’adiponectine, suggérant un rôle anti-tumoral (Park et al 2011). Cette action serait médiée par un effet inhibiteur sur la croissance tumorale et anti-angiogénique via l’apoptose des cellules tumorales et des cellules endothéliales (Brakenhielm et al 2004). Il a également été montré que l’adiponectine peut exercer une action anti-proliférative sur les cellules tumorales en séquestrant des facteurs de croissance (Wang et al 2005). Cependant, les cellules tumorales expriment les récepteurs AdipoR1 et AdipoR2 et les cellules endothéliales associées aux tumeurs expriment le récepteur T-cadhérine à un niveau important, soulignant la possibilité que l’adiponectine et ses récepteurs puissent favoriser la progression tumorale (Hefetz-Sela and Scherer 2013). En effet, dans un modèle murin, qui développe spontanément des tumeurs murines (MMTV-PyMT), l’absence de l’adiponectine est en faveur d’une diminution de la croissance tumorale, associée à une diminution de l’angiogenèse. Alors qu’à des stades tardifs, la perte de l’adiponectine est associée à des tumeurs plus agressives. Le mécanisme moléculaire de l’adiponectine a été expliqué par une action angio-mimétique dans la vascularisation tumorale (Landskroner-Eiger et al 2009). Un autre mécanisme d’action de l’adiponectine a été identifié : ses récepteurs ont une action céramidase, qui convertit le céramide en sphingosine. La sphingosine peut rapidement se convertir en sphingosine 1 phosphate qui a une action pro-tumorale et pro-angiogénique avérée (Reynolds et al 2004). d) Rôle des ADSCs dans la progression tumorale Comme il a été souligné auparavant, le TA n’est pas seulement composé d’adipocytes. Il contient d’autres composants comme les ADSCs, capables d’influencer la progression de la tumeur (Wang et al 2012). Dans le TA, les ADSCs (encore appelées ASCs) sont localisés entre les adipocytes et la MEC, autour des petits vaisseaux sanguins (Tran et al 2012) (Bielli et al 2014). Le rôle physiologique des ADSCs est de contribuer au turnover des adipocytes et d’assurer l’homéostasie vasculaire du TA (Bielli et al 2014). Avant la découverte de la grande plasticité des ADSCs, les MSCs provenant de la moelle osseuse étaient considérées comme la source majoritaire de cellules souches. Les ADSCs et les MSCs présentent des grandes similitudes : le potentiel « cellules-souches », la capacité à se différencier en cellules de différents lignages et des propriétés vasculogéniques (expression de marqueurs péricytaires). Cependant, ces deux types de progéniteurs présentent des différences. La 55 capacité proliférative en culture des ADSCs est supérieure à celle des MSCs. Certains antigènes de surface sont différents : La présence de CD34 à la surface des ADSCs n’a pas été rapportée sur les MSCs, ce qui permet leur identification différentielle (Bielli et al 2014). Comme les adipocytes, les ADSCs se retrouvent à proximité étroite des cellules tumorales, leur conférant un rôle actif dans la progression tumorale. De plus, les signaux d’origine tumorale (cytokines pro-inflammatoires, facteurs de croissance, chimiokines) permettent le recrutement de différents composants stromaux à distance, comme les MSCs, alimentant la progression de la tumeur. Une étude réalisée par Kidd et al. a montré, in vivo, que les ADSCs sont recrutés au niveau de la tumeur et favorisent la progression tumorale, pour former le stroma vasculaire et fibrovasculaire (Kidd et al 2012). Ainsi, les ADSCs peuvent se différencier en CAFs et participer à la réaction desmoplasique sous l’action des sécrétions tumorales (voir partie sur les CAFs), cellules qui ont été appelées APDFs pour Adipose-Progenitors Derived Fibroblasts dans la figure 15. Cette hypothèse a également été validée par une étude démontrant que des ADSCs « activés » participent à la sécrétion de composants de la MEC et à sa contraction, favorisant la rigidité observée dans certaines tumeurs (voir partie sur la MEC) et la progression de la tumeur (Chandler et al 2011). Il a été rapporté que les ADSCs favorisent in vitro et in vivo la croissance, la survie et les capacités migratoires et invasives des cellules tumorales (Pinilla et al 2009) (Muehlberg et al 2009) (Welte et al 2012) (Walter et al 2009) (Wang et al 2012). Certaines molécules ont été identifiées dans l’effet pro-invasif observé, comme l’IL-8, IL-6, CCL5, CXCL12 (Pinilla et al 2009) (Muehlberg et al 2009) (Welte et al 2012) (Walter et al 2009) (Wang et al 2012). Plus récemment, il a été démontré que les ADSCs favorisent l’expansion des cellules souches cancéreuses (CSCs) et induisent l’EMT des cellules cancéreuses, via une signalisation dépendante de PDGF (expression de α-SMA, fibronectine et vimentine) (Devarajan et al 2012). Dans le cancer du sein, les ADSCs provenant de TA viscéral humain favorisent la capacité métastatique de cellules tumorales et l’angiogenèse in vivo, dans un modèle de xénogreffes (Rowan et al 2014). Les ADSCs favorisent également la chimiorésistance des cellules tumorales, ce processus sera décrit ultérieurement dans la partie III (Chen et al 2014). L’effet pro-tumoral des ADSCs a été observé dans les cancers du sein, de la prostate, du poumon non à petites cellules, de l’ovaire, du pancréas et le glioblastome (Ji et al 2013). Cependant, quelques études ont démontré un rôle plutôt anti-tumoral des ADSCs. Takahara et al. ont montré que les ADSCs inhibent la prolifération et favorisent l’apoptose de lignées tumorales prostatiques in vitro et in vivo (Takahara et al 2014). Des résultats similaires ont été observés par Cousin et al., dans le cancer du pancréas (Cousin et al 2009). Le rôle des ADSCs dans la progression tumorale doit être pris en considération, car la grande plasticité de ces cellules et leur capacité à augmenter la vascularisation a été mis à profit par les chirurgiens plastiques dans la technique du lipofilling (injection de TA +/- ADSCs dans le cas d’une reconstruction mammaire, suite à une résection tumorale) (Wang et al 2013b). 56 Plus engagés dans le lignage adipocytaire, les pré-adipocytes peuvent également interagir avec les cellules tumorales. Il a été rapporté que la différenciation adipocytaire est inhibée lors de la co-culture de pré-adipocytes avec des cellules tumorales, processus dépendant du TNF-α et de l’IL-11 sécrétés par les cellules tumorales (Meng et al 2001). Une étude publiée l’année dernière par l’équipe d’Olivier de Wever, à laquelle j’ai eu l’occasion de participer, suggère que l’Oncostatine (OSM) sécrétée par les leucocytes CD45+ de la fraction SVF du TA, isolé à partir de tumeur, favorise l’invasion, le remodelage du cytosquelette d’actine des cellules tumorales mammaires et l’angiogenèse, via une signalisation dépendante de STAT3 (Lapeire et al 2014) (voir Annexe). Cette étude suggère très clairement que le TA dans sa globalité favorise la progression tumorale. Figure 15. Rôle des ADSCs et des APDFs dans la progression tumorale. Sous l’effet des sécrétions tumorales, les ADSCs s’activent en APDFs (Adipose-progenitors derived fibroblasts), qui présentent un phénotype de CAFs et participent à la réaction desmoplasique. Les APDFs stimulent en retour la progression tumorale (d’après (Wang et al 2012)). En conclusion, le rôle du microenvironnement tumoral est capital dans la progression du cancer. La tumeur est capable de recruter et de modifier les cellules du microenvironnement à son profit. Parmi les composants de ce microenvironnement, les CAFs ont un rôle majeur sur tous les aspects de la progression tumorale. De nombreuses études ont clairement établi que sous l’effet des sécrétions tumorales, d’autres cellules stromales peuvent se transdifférencier en CAFs et participer ainsi à la réaction desmoplasique. Souvent oubliés, les adipocytes se sont révélés être des cellules originales, douées de capacités métaboliques uniques et de capacités sécrétoires importantes. De plus, ce sont des cellules plastiques, capables de s’adapter à leur environnement et se transdifférencier. Ainsi un dialogue bidirectionnel s’établit entre les cellules tumorales et les adipocytes, à l’origine d’un 57 véritable cercle vicieux modifiant les cellules tumorales et les adipocytes. Etant donné les caractéristiques particulières des adipocytes précédemment décrites, l’étude d’une transdifférenciation des adipocytes en CAFs sous l’influence prolongée des sécrétions tumorales a été le premier objectif de ma thèse. De plus, dans des conditions pathologiques comme l’obésité, un profond remaniement du TA et des adipocytes est observé, pouvant potentialiser le dialogue néfaste qui s’instaure entre les cellules tumorales et les adipocytes. Par conséquent, l’obésité et son lien avec le cancer seront l’objet de la 2ème partie de cette introduction. 58 PARTIE II : L’OBESITE ET LE CANCER DU SEIN 1) Le cancer du sein 1-1) Epidémiologie et fact eurs de risque a) Epidémiologie Le cancer du sein est le cancer féminin le plus répandu, en termes d’incidence sur l’ensemble des pays du monde (25% des cancers) (InCA, www.e-cancer.fr). Il représente la cinquième cause de mort par cancer (tous cancers confondus). A l’heure actuelle, il reste la première cause de mortalité chez la femme par cancer dans les pays en voie de développement (14.3% au total soit 883 000 cas). Pendant longtemps considéré comme la première cause de mortalité par cancer chez la femme dans le monde entier, il est depuis peu passé à la deuxième place dans les pays développés (198 000 cas soit 15.4%), après le cancer du poumon (globocan 2012 : globan.iarc.fr). En 2012, on estimait à 48 763 le nombre de nouveaux cas en France. Actuellement, le cancer du sein touche 1 femme sur 8, dont la majorité est âgée de 50 ans et plus. De manière isolée, ce cancer peut aussi apparaître chez l’homme (moins de 1% des cancers du sein) (Vaysse et al 2013). Malgré une augmentation du nombre de nouveaux cas, on constate depuis quelques années une baisse de la mortalité. Actuellement, le cancer du sein bénéficie d’un pronostic relativement favorable à long terme, d’autant plus que son diagnostic et sa prise en charge se font précocement. En effet, on estime à environ 89% le taux global de survie relative à 5 ans après le diagnostic. Cette évolution inverse s’explique notamment par un dépistage organisé, qui conduit à des diagnostics plus précoces et par l’amélioration des prises en charge (InCA, www.ecancer.fr). b) Facteurs de risque Le cancer du sein, comme la plupart des cancers, est une maladie multifactorielle, imputable à de nombreux facteurs, comme le patrimoine génétique, l’âge, le statut hormonal, l’alimentation et l’exposition à des cancérigènes environnementaux (Bernstein 2002). Cependant, les études épidémiologiques suggèrent que la connaissance des facteurs de risques pourrait expliquer seulement 40% des cancers du sein (Kruk 2014). - L’âge. L’âge demeure le principal facteur de risque de survenue de cancer du sein. En effet, 75% des cancers du sein se déclarent après l’âge de 50 ans. Leur survenue est rare avant l’âge de 35 ans et reste exceptionnelle avant 20 ans. L’âge moyen de diagnostic est de 61 ans (InCA, www.e-cancer.fr). - Les antécédents familiaux. Il n’y a pas de définition unique de « cancers du sein familiaux », mais on considère généralement que les critères suivants représentent un facteur de risque, nécessitant de proposer une consultation génétique : s’il existe au moins trois cas de cancers du sein et/ou de l’ovaire 59 dans une famille, deux cas de cancers du sein dans une famille proche, avec au moins un diagnostiqué avant l’âge de 50 ans, deux cas de cancers avant 40 ans, ou encore un cancer du sein et/ou de l’ovaire chez un même patient. Les mutations les plus connues pour les cancers du sein sont les gènes BRCA1 et BRCA2 (Breast Cancer 1 and 2). Ces gènes sont à haute pénétrance, c’est-à-dire qu’une mutation / délétion / réarrangement sur ces gènes confèrent un risque élevé de développer des cancers. En effet, une mutation sur BRCA1 induit un risque de 52% en moyenne (26-69%) de développer un cancer du sein avant l’âge de 70 ans et 47% en moyenne (29-60%) pour une mutation sur BRCA2 (Milne et al 2008). D’autres gènes à pénétrance modérée, voire faible ont été identifiés, comme CHK2 (Checkpoint Kinase 2) ou ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) pour exemples (Shiovitz and Korde 2015). - L’histoire hormonale et reproductive de la femme. La durée d’exposition prolongée des hormones endogènes sur la glande mammaire augmente le risque de développement d’un cancer du sein. En effet, des menstruations précoces (avant 12 ans) et une ménopause tardive (après 50 ans) sont associées à un risque plus élevé (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer (2012)). En plus des hormones endogènes, la femme est très souvent exposée aux hormones exogènes, via les contraceptifs oraux et les traitements substitutifs hormonaux, prescrits lors de la ménopause pour pallier à la chute hormonale observée. Des études ont mis en évidence une corrélation entre la prise de ces hormones exogènes et le risque de développer un cancer du sein. Concernant les contraceptions orales, le risque est faible mais significatif (RR=1.08) (RR pour risque relatif) (Gierisch et al 2013). D’autres facteurs en lien avec la vie reproductive de la femme ont été corrélés à un risque plus accru de développer un cancer du sein. En effet, la nulliparité et l’âge tardif de la première grossesse sont des facteurs de risque, surtout pour les cancers positifs pour les récepteurs hormonaux. A l’inverse, l’allaitement est un facteur protecteur pour tous les types de cancers du sein surtout les cancers triples négatifs (Anderson et al 2014). - Le mode de vie et l’environnement. Un mode de vie sédentaire, caractérisé par une faible activité physique et une alimentation riche en graisses animales et en sucres est considéré comme facteur de risque du cancer du sein. Dans la continuité, l’obésité est également associée à une augmentation du nombre de cancers chez la femme ménopausée et sera étudiée dans la partie obésité et cancer. La consommation d’alcool (surtout chez la femme ménopausée) et de tabac est aussi corrélée à la survenue de cancers du sein (Kruk 2014). - Autres facteurs. Une hyperplasie bénigne atypique du sein, une densité élevée des seins à la mammographie et l’exposition aux radiations ionisantes ont été également associées au développement de cancers du sein (Kruk 2014). 60 1-2) Origine du cancer du sein a) La glande mammaire La glande mammaire est une glande exocrine, dont le rôle physiologique est la production de lait lors de l’allaitement. L’épithélium mammaire est composé de cellules épithéliales luminales (à l’intérieur) et de cellules myoépithéliales basales (à l’extérieur). Une MEC sépare l’épithélium du stroma, qui est constitué majoritairement d’adipocytes. Parmi les cellules épithéliales, on distingue les cellules canalaires et les cellules lobulaires. Les lobes de la glande mammaire sont divisés en lobules, euxmêmes constitués d’alvéoles formant les unités sécrétrices de la glande. Chaque alvéole s’ouvre sur un canalicule, dans lequel est éjecté le lait. Les canalicules s’abouchent sur un canal intermédiaire, qui rejoint un canal galactophore, permettant de drainer le lait jusqu’à l’extérieur du sein, via l’aréole (Brisken 2002) (figure 16). Les cellules myoépithéliales possèdent des propriétés contractiles (expression d’α-SMA) et présentent des marqueurs épithéliaux comme des cytokératines spécifiques. De par leurs propriétés contractiles, ces cellules permettent l’acheminement du lait à travers les canaux. Les cellules myoépithéliales sont aussi impliquées dans la morphogenèse de la glande mammaire, en modulant la prolifération et la différenciation des cellules luminales et dans la stabilisation structurale de la glande (Moumen et al 2011). Figure 16. Structure de la glande mammaire. La glande mammaire est composée de cellules épithéliales (canalaires et lobulaires) et de cellules myoépithéliales, comprises dans un stroma, composé d’adipocytes, de fibroblastes, de vaisseaux sanguins et d’une MEC (adapté de (Radisky et al 2003)). La glande mammaire est l’unique organe qui se développe majoritairement après la naissance (Fata et al 2004). Elle est en perpétuel remaniement et passe par différents stades au cours des différentes 61 étapes de la vie : naissance, puberté, grossesse et lactation, involution et enfin ménopause. A la naissance, le développement de la glande est inachevé ; elle est réduite à un réseau de canaux ramifiés. A la puberté, la glande mammaire subit de profonds changements morphologiques, sous l’influence des hormones sécrétées. Ainsi, les œstrogènes permettent la prolifération de la glande et la formation de ramifications. Une augmentation du tissu conjonctif et de la vascularisation du TA mammaire est aussi observée à ce stade, liée en partie à la sécrétion d’œstrogènes et de progestérone. Lors de la grossesse et de l’allaitement, la glande mammaire termine son développement, par la mise en place de nombreuses alvéoles. Cette étape se fait en deux temps : tout d’abord, les cellules lobulaires prolifèrent, puis une augmentation de leur activité sécrétoire est observée afin de préparer la glande mammaire à l’allaitement. De plus, les adipocytes subissent un processus de dédifférenciation en préadipocytes et de transdifférenciation en cellules épithéliales sécrétrices (voir partie I) (Giordano et al 2014) (Wiseman and Werb 2002). Lors du sevrage, les alvéoles régressent et la glande mammaire revient à son état initial ; ce processus est appelé involution. A la ménopause, il y a un déclin des structures de la glande, qui sont remplacées par du TA (figure 16) (Wiseman and Werb 2002) (McGee et al 2006). b) Origine du cancer du sein Les cancers les plus fréquents sont des adénocarcinomes : ils peuvent se développer à partir des cellules épithéliales lobulaires ou canalaires, mais dans la majorité des cas, l’origine est l’épithélium canalaire. On considère actuellement, que la majorité des cancers provient de cellules épithéliales luminales. En effet, les cellules myoépithéliales seraient plutôt limitantes dans la progression de la tumeur. Elles sont à l’origine de tumeurs bénignes et de cancers rares nommés myoépithélias (Sopel 2010). Cependant, des études récentes ont souligné des similitudes dans les marqueurs entre le cancer du sein triple négatif basal-like et les cellules myoépithéliales, suggérant une origine commune. D’autre part, ces cellules sont en interaction continue avec le stroma, propice à la progression de la tumeur, comme nous l’avons vu dans la première partie. Ainsi, la contribution directe ou indirecte des cellules myoépithéliales dans le développement de cancer du sein doit être davantage évaluée (Moumen et al 2011). Durant son cycle de développement, la glande mammaire subit des modifications morphologiques et fonctionnelles, comparables au développement d’un cancer du sein. D’une part, la croissance et le développement de la glande mammaire sont régulés au niveau systémique par des hormones ovariennes ou hypophysaires et au niveau local par des interactions paracrines entre les cellules épithéliales et les cellules stromales. Les cellules stromales, qui composent la glande mammaire sont des adipocytes, des fibroblastes, des cellules inflammatoires et une MEC (figure 16). Les cellules stromales sécrètent des facteurs de croissance, des composants de la MEC et de son remodelage afin d’interagir avec le compartiment épithélial. Réciproquement, les cellules épithéliales influencent le 62 stroma, afin de l’adapter au développement de la glande et à leurs besoins. D’autre part, le développement de la glande mammaire nécessite des étapes observées lors de la progression tumorale, telles que l’invasion dans le stroma environnant, la prolifération cellulaire, la résistance à l’apoptose, l’angiogenèse et le remodelage de la MEC (Wiseman and Werb 2002). 1-3) Classification des cancers du sein Les cancers du sein représentent un groupe de maladies hétérogènes, qui diffèrent par leur morphologie, leur comportement biologique ou leur évolution clinique (Chacon and Costanzo 2010). Le diagnostic du cancer du sein repose sur un bilan initial, composé d’un examen clinique, d’une imagerie par mammographie, souvent associée à une échographie et d’un examen anatomopathologique sur prélèvement (par micro ou macro-biopsie). Ce bilan initial permet d’affirmer le diagnostic et d’orienter la thérapeutique. Un bilan d’extension loco-régional et à distance est ensuite recommandé afin d’évaluer la dissémination de la maladie. a) Classification histopathologique actuelle - Facteurs pronostiques. L’examen histopathologique permet de déterminer le stade de la tumeur, en évaluant d’une part l’infiltration de la tumeur primaire et d’autre part son étendue dans l’organisme. Pour la tumeur primaire, on distingue classiquement les carcinomes intra-canalaires ou in situ, les carcinomes canalaires infiltrants (IDC pour Invasive Ductal Carcinoma) et les carcinomes lobulaires in situ ou infiltrants (ILC). Les carcinomes in situ restent localisés dans l’épithélium mammaire. Autrement dit, la tumeur est localisée dans les canaux ou les lobules et n’a pas franchi la membrane basale. Les IDC correspondent à la majorité des cancers (70-80% des cas) et représentent des tumeurs dures, à contour étoilé non régulier, présentant une distorsion architecturale et des microcalcifications. D’autres formes plus rares sont retrouvées comme les carcinomes canalaires inflammatoires, médullaires ou mucineux… Des critères d’agressivité peuvent être établis permettant de déterminer le grade de la tumeur, comme l’architecture tumorale (tissu plus ou moins différencié), la forme et la taille des noyaux ainsi que les mitoses. Les cancers sont classés de I à III (du moins au plus agressif) (Boisserie-Lacroix et al 2013). La classification TNM permet de déterminer la taille et l’agressivité de la tumeur. « T » correspond à la tumeur primaire, « N » à l’envahissement ganglionnaire, qui représente le premier site métastatique de la tumeur et « M » pour les métastases dans des organes périphériques. Les sites classiques de métastases pour le cancer du sein sont les poumons, l’os et le foie. - Facteurs prédictifs. Une détection immunohistochimique des récepteurs hormonaux (RH) est réalisée en routine (RE pour récepteurs aux œstrogènes et RP pour récepteurs à la progestérone), ainsi que la recherche de l’amplification de l’oncogène HER2 (pour Human Epidermal growth factor 63 Receptor 2). L’amplification HER2 est présente dans environ 18% des cancers du sein et est associée à des cancers généralement négatifs pour les RH, particulièrement agressifs, mais de bon pronostic depuis l’arrivée de la thérapie ciblée : trastuzumab (Boisserie-Lacroix et al 2013). Ces trois marqueurs donnent des informations prédictives très importantes, car les patients RH+ peuvent bénéficier d’une hormonothérapie et les patients HER2 d’une thérapie ciblée au trastuzumab (Herceptin®, anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre HER2). Les cancers négatifs pour les RH et pour la surexpression de HER2 sont appelés triple négatif ou TNBC (Triple Negatif Breast Cancer). Les patientes atteintes de ce type de tumeurs ne bénéficient donc pas d’une hormonothérapie ou d’une thérapie ciblée. Les tumeurs TNBC sont souvent associées à un mauvais pronostic avec des taux de récidives importants et précoces augmentant le taux de mortalité (figure 17) (Vuong et al 2014) (Yersal and Barutca 2014) b) Classification moléculaire Décrite par Perou, la classification moléculaire est basée sur le type morphologique des cancers et sur l’expression différentielle de certains gènes (Perou et al 2000) (figure 17). - Luminal A. Ces cancers représentent environ 50-60% des cancers du sein. Nommé « luminal A » par similitude avec l’expression de protéines présentes dans les cellules épithéliales luminales, ce type de cancer est caractérisé par une expression très importante des récepteurs aux œstrogènes (RE+), un faible index de prolifération, un tissu assez différencié et une absence de surexpression de l’oncogène HER2 (HER2-). Ils correspondent à des cancers canalaires ou lobulaires in situ, ou invasifs de grade I ou II et sont plutôt de bon pronostic. Le taux de rechute de ces cancers est relativement faible. Les cancers de type luminal A peuvent métastaser dans les os, mais rarement dans le foie, les poumons et le cerveau (Boisserie-Lacroix et al 2013) (Yersal and Barutca 2014). - Luminal B. Ce type de cancer concerne environ 20% des cancers du sein. L’expression du RE est plus faible que pour les cancers de type luminal A. Ils sont caractérisés par des cellules, présentant un index de prolifération élevé et une distorsion architecturale. L’oncogène HER2 est surexprimé dans environ 30% des cas (Loi et al 2009). Cliniquement, ils correspondent à des cancers infiltrants de grade II ou III et sont de pronostic moins favorable que le type luminal A (Boisserie-Lacroix et al 2013) (Yersal and Barutca 2014). - HER2+. L’oncogène HER2 est un membre de la famille des tyrosine-kinases membranaires. Le récepteur HER2 est codé par le gène HER2, localisé sur le chromosome 17q21 (Yersal and Barutca 2014). L’activation de ce récepteur peut se faire sans ligand, par homodimérisation ou hétérodimérisation du récepteur avec d’autres récepteurs de la même famille (Yersal and Barutca 2014). Cela induit une cascade de signalisation en aval, telles que les voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et ras/MAPK, impliquées dans la cancérogenèse (Fumoleau et al 2007). Ces tumeurs 64 représentent environ 10-15% des cancers du sein. Elles sont caractérisées par l’absence d’expression des récepteurs hormonaux, une forte expression de l’amplicon HER2 et un index de prolifération élevé. D’un point de vue clinique, les cancers HER2+ sont généralement des carcinomes invasifs de grade II ou III agressifs. Environ la moitié des tumeurs HER2+ exprime le récepteur aux œstrogènes mais généralement à des niveaux très bas (Yersal and Barutca 2014). Ce sous-type de cancer du sein a un potentiel métastatique important vers le cerveau et le foie (Yersal and Barutca 2014). Présentant un mauvais pronostic de base, ces tumeurs peuvent être traitées par la thérapie ciblée trastuzumab, ce qui a considérablement amélioré le pronostic de ces patientes (Slamon et al 2001). - Basal-like. La majorité des cancers basal-like sont des cancers triple négatifs, c’est-à-dire qu’ils n’expriment ni les récepteurs hormonaux, ni l’oncogène HER2. Ils représentent environ 10 à 25% des tumeurs mammaires et 56 à 85% des cancers triples négatifs. La caractéristique de ces cellules est l’expression de cytokératines (5 - 6 et 17) et de la laminine. Ils sont nommés « basal-like » par analogie d’expression avec les cytokératines des cellules basales myoépithéliales. Ces tumeurs sont des carcinomes invasifs, de grade III, faiblement différenciés, très prolifératifs, présentant des zones de nécrose tumorale et une forte réaction fibrotique intra-tumorale (Boisserie-Lacroix et al 2013). La grande majorité de ces tumeurs est mutée pour p53. Les tumeurs basal-like sont de mauvais pronostic et traitées classiquement par chimiothérapie conventionnelle (Perou 2010). - Claudin-low. Ce type de cancer triple négatif a été récemment identifié. Leur nom « claudin-low » est lié à la faible expression de gènes claudines, notamment la claudine 3, 4 et 7. Les claudines sont des protéines impliquées dans les jonctions cellule-cellule, comme l’E-cadhérine. Ces tumeurs sont proches des tumeurs basal-like mais possèdent toujours un infiltrat très important de cellules immunitaires. De plus, les cellules tumorales possèdent des caractéristiques de cellules-souches et de transition épithélio-mésenchymateuse. Ce sont des tumeurs de haut grade, très peu différenciées. Le pronostic de ces tumeurs est aussi, voire plus, défavorable que les tumeurs basal-like (Perou 2010). - Normal like. Ces tumeurs représentent environ 5-10% des carcinomes du sein. Elles ont été peu caractérisées et certains chercheurs pensent qu’elles représentent un artefact technique, lié à une contamination avec du tissu sain, durant l’analyse par puces à ARN. Elles expriment des gènes, retrouvés dans le stroma mammaire (notamment du TA). Comme elles n’expriment ni ER, PR et HER2, elles seraient classées dans les TNBC, mais ne sont pas considérées comme des basal-like, car elles n’expriment pas les cytokératines et l’EGFR (Yersal and Barutca 2014). 65 Figure 17. Classification simplifiée des cancers du sein. En fonction de leur expression des récepteurs hormonaux (RH), de la surexpression de l’oncogène HER2, de leur morphologie, de l’expression de certaines protéines et de leur index de prolifération, les cancers du sein peuvent être classés en 5 sous-types : luminal A, luminal B, HER2+, Basal-like et Claudin-low. Cette classification moléculaire des cancers du sein permet d’orienter la thérapeutique. TNBC : cancers triple-négatifs, CK : cytokératines (d’après (Boisserie-Lacroix et al 2013) (Perou 2010) (Yersal and Barutca 2014)). 1-4) Traitements et limites des traitements des cancers du sein a) Chirurgie et radiothérapie A l’heure actuelle, la prise en charge thérapeutique du cancer du sein repose sur plusieurs méthodes, telles que la chirurgie, la chimiothérapie, l’hormonothérapie, les thérapies ciblées et la radiothérapie, qui seront pratiquées en fonction de l’étendue et l’agressivité de la maladie au diagnostic, ainsi que de l’expression des récepteurs hormonaux et de HER2. - La chirurgie. La chirurgie est très souvent le traitement de première intention. Dans le cas des cancers in situ, la chirurgie seule (par tumorectomie ou mastectomie) peut suffire ou bien en association avec la radiothérapie. Pour les carcinomes infiltrants, selon l’étendue de la maladie, la chirurgie est soit conservatrice (tumorectomie) ou non, par ablation du sein (mastectomie totale). Une expertise ganglion est réalisée soit par la technique du ganglion sentinelle si les tumeurs sont de petites tailles soit par curage axillaire. 66 - La radiothérapie. Cette thérapie est plus souvent réalisée en adjuvant de la chirurgie. Elle consiste à irradier le sein et / ou la paroi thoracique, associée plus ou moins aux chaînes ganglionnaires en fonction de l’extension de la maladie. Cette technique a pour but d’entraver la division cellulaire et d’induire la mort des cellules tumorales. Généralement, la dose totale est de 50 gy, délivrée en 25 fractions de 2 gy. Dans le cas de cancers in situ, la radiothérapie est indiquée uniquement après chirurgie conservatrice. Concernant les cancers infiltrants, la radiothérapie est préconisée systématiquement après chirurgie conservatrice et dans certains cas après mastectomie totale. b) Chimiothérapie, hormonothérapie et thérapie ciblée Dans la majorité des cas, le traitement débute par la chirurgie et selon l’agressivité des cancers infiltrants, elle est suivie d’une chimiothérapie dite adjuvante, associée ou non au trastuzumab. Dans certains cas, la chirurgie est précédée d’un traitement néoadjuvant, composé d’une chimiothérapie ou d’une hormonothérapie. Tandis que l’hormonothérapie néoadjuvante est recommandée dans la plupart des cas, la chimiothérapie néoadjuvante est de plus en plus utilisée pour tous les types de cancers du sein. Le traitement néoadjuvant est utilisé pour diminuer la taille de la tumeur avant la chirurgie afin d’augmenter le taux de chirurgies conservatrices et de permettre ainsi aux femmes de conserver leur sein malgré un cancer invasif (Untch et al 2014) (van Nes et al 2009). Il est également utilisé en cas de cancers agressifs, dont la priorité du traitement consiste à réduire le risque de diffusion micrométastatique de la maladie par voie systémique. Pour les cancers du sein RH+ (luminal A et luminal B), l’hormonothérapie peut être utilisée seule ou associée à la chimiothérapie (Miller et al 2014). - L’hormonothérapie. Il existe deux catégories majeures de thérapie endocrine : les modulateurs sélectifs du récepteur aux œstrogènes ou SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators) et les inhibiteurs de l’aromatase. Les SERMs se lient aux récepteurs aux œstrogènes de manière compétitive afin d’inhiber leur action. Le chef de fil de cette classe de médicaments est le tamoxifène. Les antiaromatases (AI) inhibent l’action de l’aromatase, qui convertit les androgènes circulants en œstrogènes ; source majoritaire d’œstrogènes (Milani et al 2014). Les AI sont utilisés uniquement chez la femme ménopausée et représentent dans ce cas le traitement de choix (Miller et al 2014). - La chimiothérapie. La chimiothérapie ou thérapie anti-cancéreuse est le traitement du cancer, destiné à induire la mort des cellules cancéreuses. Elle consiste à l’administration de molécules thérapeutiques, encore appelées cytotoxiques, qui vont cibler les cellules à prolifération rapide, en stoppant leur division cellulaire aboutissant à leur mort. Les cellules cancéreuses ne sont malheureusement pas les seules cellules touchées. Certaines cellules saines peuvent être atteintes, comme les entérocytes ou les cellules hématologiques, ce qui aboutit aux effets indésirables, observés lors du traitement. Dans le cas des cancers HER2+, une association avec un inhibiteur de HER2 (trastuzumab) est indiquée. Pour plus d’efficacité, une association de plusieurs molécules 67 (polychimiothérapie) ayant des mécanismes d’action différents, est très souvent utilisée, selon le type de tumeur, sa localisation, son stade et l’état du patient (Joensuu and Gligorov 2012) (Connolly and Stearns 2013) (Miller et al 2014). La figure 18 résume les différentes associations classiquement utilisées pour traiter un cancer du sein, ainsi que les molécules qui les composent et leur classe thérapeutique. Les anthracyclines (doxorubicine, daunorubicine) et les taxanes (paclitaxel et docetaxel) représentent les deux classes de cytotoxiques les plus utilisés dans le cancer du sein précoce et agressif. Ils sont communément indiqués en traitement adjuvant ou néoadjuvant et / ou dans le cas de cancers d’emblée métastatiques. Bien que les cancers du sein métastatiques ou MBC (Metastatic Breast Cancer) soient incurables, l’utilisation de chimiothérapie systémique a montré un véritable bénéfice, sur la prolongation de la survie des patientes, le retard de la progression de la maladie et l’amélioration des symptômes (Andreopoulou and Sparano 2013) (Greenberg et al 1996). Parmi l’arsenal thérapeutique dont on dispose, la doxorubicine, le paclitaxel et le 5-fluorouracile nous ont particulièrement intéressés au cours de mes travaux de thèse et seront développés dans la partie III. Chimiothérapie classique HER2- HER2+ Composants docetaxel TAC doxorubicine cyclophosphamide doxorubicine AC + paclitaxel cyclophosphamide paclitaxel doxorubicine AC + docetaxel cyclophosphamide docetaxel docetaxel TC cyclophosphamide 5-fluorouracile FAC doxorubicine cyclophosphamide 5-fluorouracile FEC épirubicine cyclophosphamide cyclophosphamide CMF méthotrexate 5-fluorouracile doxorubicine cyclophosphamide AC + paclitaxel et trastuzumab paclitaxel trastuzumab docetaxel TCH carboplatine trastuzumab Classe thérapeutique Taxanes Anthracyclines Agent alkylant / Moutarde azotée Anthracyclines Agent alkylant - Moutarde azotée Taxanes Anthracyclines Agent alkylant / Moutarde azotée Taxanes Taxanes Agent alkylant / Moutarde azotée Anti-métabolite / Analogue pyrimidine Anthracyclines Agent alkylant / Moutarde azotée Anti-métabolite / Analogue pyrimidine Anthracyclines Agent alkylant / Moutarde azotée Agent alkylant / Moutarde azotée Anti-métabolites / Analogue folate Anti-métabolite / Analogue pyrimidine Anthracyclines Agent alkylant / Moutarde azotée Taxanes Inhibiteur de HER2 Taxanes Platines Inhibiteur de HER2 Figure 18. Résumé des différentes combinaisons thérapeutiques utilisées pour traiter un cancer du sein. 68 - Les thérapies ciblées. Comme leur nom l’indique, les thérapies ciblées sont dirigées contre une ou plusieurs protéines précises, surexprimées dans certains types de cancers. L’avantage des thérapies ciblées par rapport aux thérapies conventionnelles est le fait qu’elles vont viser spécifiquement les cellules tumorales et présentent ainsi une toxicité moindre que les thérapies conventionnelles. En pratique, elles sont classiquement utilisées en association à un traitement systémique par chimiothérapie conventionnelle (figure 18). Le trastuzumab est un anticorps monoclonal humanisé qui se lie au domaine extra-cellulaire du récepteur HER2. Ce traitement est utilisé en routine dans le traitement des cancers du sein HER2+. Autre traitement ciblant HER2, le lapatinib est un inhibiteur tyrosine kinase mixte de HER et de l’EGFR (Wang et al 2011). c) Résistance à la chimiothérapie La réponse à la chimiothérapie est très variable en fonction du type de cancers, de l’évolution de la maladie et de l’état des patientes. Dans certains cas, des phénomènes de résistance aux traitements apparaissent, accélérant la progression tumorale, le taux de rechutes et diminuant la survie des patientes. En clinique, la résistance correspond à une progression de la maladie pendant le traitement pour un cancer du sein métastatique ou à une rechute du cancer après une période de 6 à 12 mois suite à un traitement adjuvant (Andreopoulou and Sparano 2013). Autrement dit, la chimiothérapie n’est pas efficace sur la tumeur, car cette dernière survit voire progresse pendant le traitement, ou juste après le traitement. La limite de 12 mois a été fixée, car des études ont montré que la rechute du cancer après 12 mois n’est pas liée à une résistance de la tumeur au traitement, car l’utilisation de la chimiothérapie se montrera à nouveau efficace. (Castiglione-Gertsch et al 1997) (Guo et al 2011). Les taux de réponse d’un cancer du sein métastatique suite à un traitement en première ligne, composé d’anthracyclines et de taxanes est de 30 à 70 % (Coley 2008). Certains sous-types de cancers sont connus pour être plus résistants que d’autres à la thérapie. En effet, les cancers du type luminal B présentent une résistance plus importante à l’hormonothérapie que les cancers du type luminal A. Ils seraient également plus résistants à la chimiothérapie néoadjuvante (doxorubicine / paclitaxel) que les cancers HER2+ et basal-like. Cependant, ils répondraient mieux à la chimiothérapie (5-fluorouracile / doxorubicine / cycloposphamide) que les cancers luminal A (Rouzier et al 2005) (Yersal and Barutca 2014). De par leur statut HER2-, RH-, les cancers du sein triple-négatifs ne peuvent bénéficier que de la chimiothérapie. Cependant, des études ont mis en évidence le fait que les cancers TNBC présentaient une meilleure réponse à la chimiothérapie que les autres types de cancers du sein (au moins pour les patientes ne présentant pas d’atteinte ganglionnaire) (Colleoni et al 2010). Certaines études ont montré que la chimiothérapie néoadjuvante utilisée dans des cas de TNBC présente deux types de réponses. Une minorité de patientes présente une réponse complète et un pronostic très favorable. A l’inverse, une majorité de patientes a une maladie résiduelle après traitement ainsi qu’un mauvais pronostic. Ces données suggèrent qu’un sous-groupe de TNBC 69 est extrêmement sensible à la chimiothérapie mais la grande majorité présente une résistance et un pronostic incertain (Liedtke et al 2008). Les mécanismes de résistance à la chimiothérapie conventionnelle, notamment la doxorubicine seront décrits dans la partie III. Les tumeurs HER2+ peuvent aussi développer une résistance aux thérapies ciblées, mais les mécanismes expliquant cette résistance ne seront pas étudiés ici, au même titre que les mécanismes de résistance à l’hormonothérapie. 2) L’obésité : un facteur de risque et un facteur affectant le pronostic du cancer du sein L’obésité est une maladie chronique, qui existe dans les pays développés et dans les pays en voie de développement et qui touche aussi bien les enfants que les adultes (van Kruijsdijk et al 2009). Elle est maintenant considérée comme un problème de santé publique majeur. L’obésité est souvent associée à un syndrome métabolique, à l’origine d’un grand nombre de maladies, telles que le diabète de type II et les maladies cardiovasculaires. De plus, l’obésité est à l’origine de l’augmentation de l’incidence de nombreux cancers et représente aussi un facteur de mauvais pronostic pour certains cancers. 2-1) Généralités L’obésité est définie comme une accumulation anormale ou excessive de graisse. La cause fondamentale de surpoids et d’obésité est une balance énergétique positive, dans laquelle les apports excèdent les dépenses énergétiques pendant une durée prolongée, conduisant à l’accumulation de graisse dans l’organisme et la prise de poids. Cependant, l’obésité est une maladie complexe, qui est la conséquence de nombreux facteurs, tels qu’une prédisposition génétique, des facteurs environnementaux, l’alimentation et le mode de vie. En pratique, elle est classiquement définie sur la base de l’indice de masse corporelle (IMC), calculé par le rapport du poids sur la taille au carré (en kg/m2). Il existe cinq classes d’IMC, regroupées dans la figure 19. Figure 19. Classification du statut pondéral en fonction des valeurs de l’IMC. 70 Selon l’OMS, le nombre de cas d’obésité a plus que doublé depuis 1980. En 2014, dans le monde, plus d’1.9 milliard d’adultes étaient en surpoids et 600 millions étaient obèses. Globalement, environ 13% (11% des hommes et 15% des femmes) de la population adulte mondiale étaient en surpoids ou obèses en 2014. Aux Etats-Unis, la prévalence des sujets obèses est de 30% et 65% des sujets sont en surpoids (Sundaram et al 2013). Le surpoids et l’obésité concernent également près de 42 millions d’enfants de moins de 5 ans. De plus, le surpoids et l’obésité sont les premiers facteurs de risque de décès au niveau mondial. Environ 3.4 millions d’adultes en meurent chaque année : 44% liés au diabète, 23% liés aux cardiopathies ischémiques et de 7 à 41% liés à certains cancers (OMS : www.who.int). L’obésité associée à une répartition androïde (liée à l’accumulation de TG au niveau du ventre) est plutôt à l’origine de maladies cardio-vasculaires (hypertension artérielle et insuffisance coronarienne) et métaboliques (diabète de type II et dyslipidémies). A l’inverse, l’obésité associée au type gynoïde (excès de graisse au niveau des cuisses) est plutôt liée à des complications mécaniques (arthrose) ou veineuses (thrombose, varice). 2-2) Les modifications des tissus adipeux par l’obésité Comme mentionné dans la partie I, il n’existe pas un TA mais plusieurs, dont les caractéristiques morphologiques et sécrétoires peuvent varier. De nombreuses études ont été réalisées sur les modifications du TA viscéral, induites par l’obésité mais peu sur le TA mammaire. a) Le TA sous-cutané et viscéral Au cours de la prise de poids et de l’obésité, les adipocytes subissent des changements morphologiques et fonctionnels importants. L’excès de stockage des lipides provoque une augmentation de la taille des adipocytes (hypertrophie) et de leur nombre (hyperplasie). Deux cas de figures sont alors observés. Dans la majorité des cas, l’expansion du TA est associée à des complications métaboliques. Cependant, dans certaines situations, aucune comorbidité n’est associée à la prise de poids. Ici, l’excès de stockage des lipides entraîne une expansion du TA, via une légère hypertrophie des adipocytes pré-existants mais surtout via une augmentation du recrutement des progéniteurs adipocytaires. Ainsi l’oxygénation, l’angiogenèse et le remodelage de la MEC du TA (qui semble être plus plastique), sont relatifs à l’expansion du TA (figure 20). Ce type de patients, appelés « metabolic healthy obeses » (MHO) présentent peu de complications métaboliques liées à leur obésité (Seo and Rhee 2014). A l’inverse, l’expansion pathologique du TA est liée majoritairement à une hypertrophie massive des adipocytes pré-existants, à une angiogenèse limitée suivie d’une hypoxie, à une inflammation importante ainsi qu’une fibrose. Tous ces processus mènent à un stress oxydatif et un stress du réticulum endoplasmique (RE), à l’origine d’un TA dysfonctionnel (Hefetz-Sela and Scherer 2013) (Sun et al 2011) (figure 20). Les adipocytes dysfonctionnels présentent des capacités métaboliques moins efficaces et un profil sécrétoire modifié. De nombreuses 71 études ont mis en relation un TA dysfonctionnel avec l’apparition de complications métaboliques, comme la résistance à l’insuline, le diabète de type II et les maladies cardiovasculaires. Ce TA pathologique serait également impliqué dans la progression tumorale, notamment de par des sécrétions inappropriées (voir partie obésité et cancer) et va exclusivement nous intéressés par la suite (HefetzSela and Scherer 2013). Sécrétée par les cellules β du pancréas, l’insuline est la principale hormone impliquée dans l’homéostasie glucidique. Elle possède un rôle majeur dans l’utilisation des substrats énergétiques glucidiques et lipidiques. Son action est médiée via sa liaison à son récepteur à activité tyrosine kinase, qui active en aval, des voies de signalisation, comme la voie PI3K et la voie des MAPK. Globalement, lors d’un apport calorique trop important, une insulino-résistance est observée, liée à des phosphorylations multiples inhibitrices, aboutissant à la perte de l’activité du récepteur à l’insuline (IR). L’insuline s’accumule dans le sang, ainsi que le glucose (les cellules sont incapables de capter le glucose), à l’origine d’un diabète de type II. Les AG libres, le glucose, les cytokines proinflammatoires (IL-6, TNF-α) ainsi que la leptine peuvent être à l’origine de ces phosphorylations et donc de l’insulino-résistance observée. Figure 20. Expansion du TA « saine » et pathologique lors de l’obésité. (A) L’expansion saine du TA est liée à un recrutement important des progéniteurs adipocytaires, une réponse angiogénique et un remodelage de la MEC appropriés à l’expansion du TA. (B) L’expansion pathologique du TA est associée à une hypertrophie massive des adipocytes pré-existants, une angiogenèse limitée, une hypoxie, une fibrose et une inflammation importante (d’après (Sun et al 2011)). L’inflammation du TA générée par l’obésité est un paramètre important. On considère que le TA des sujets obèses est dans un état inflammatoire chronique, dit de « bas-bruit » (Laurent et al 2014). Au fur et à mesure de l’expansion du TA, une production de molécules chimio-attractrices, notamment CCL2, est observée. La sécrétion de chimiokines permet le recrutement de cellules inflammatoires au sein 72 du TA (surtout des macrophages de type M1), elles-mêmes responsables de la sécrétion de chimiokines et de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-6 et le TNF-α, maintenant le TA dans un état d’inflammation chronique. L’infiltration de macrophages est plus présente dans le TA viscéral que dans le TA sous-cutané, ce qui explique pourquoi le TA viscéral est plus impliqué dans l’insulinorésistance (Ouchi et al 2011). Une infiltration des lymphocytes T, notamment les lymphocytes T CD8+, est également retrouvée dans le TA obèse (Dalmas et al 2011). Les adipocytes peuvent grossir jusqu’à une taille critique, au-delà de laquelle ils meurent par nécrose et libèrent les AG libres (Ford et al 2013). Ces adipocytes nécrotiques sont pris en charge et donc entourés par les macrophages, formant une structure en couronne, appelée CLS (Crown-Like Structures) (Ouchi et al 2011) (Cinti et al 2005). La présence de CLS est admise comme étant une caractéristique de l’inflammation associée à l’obésité. Les CLS seraient 30 fois plus nombreux dans le TA de sujets obèses que dans le TA de patients normopondéraux. De plus, la densité en CLS est positivement corrélée à la taille adipocytaire dans le TA viscéral et dans le TA sous-cutané (Cinti et al 2005). Les adipocytes inflammatoires, dont l’activité lipolytique est élevée, libèrent localement des AG qui stimulent la voie TLR4/NF-κB (TollLike Receptor 4 / Nuclear Factor kappa B) dans les macrophages, contribuant ainsi à une boucle paracrine délétère entre les adipocytes et les macrophages. L’inflammation présente dans le TA est également le résultat de l’hypoxie, qui aboutit aussi au recrutement des macrophages au sein du TA (Dalmas et al 2011). L’hypertrophie des adipocytes entraîne rapidement un appauvrissement du TA en oxygène. Cette hypoxie induit des cascades de régulation en aval, qui modifient notamment la MEC et le processus d’angiogenèse (Sun et al 2013). Bien que les adipocytes soient capables d’élaborer un réseau sanguin, par la sécrétion de molécules pro-angiogéniques, l’angiogenèse du TA obèse est très souvent insuffisante, le maintenant dans un état hypoxique (Hosogai et al 2007). Lors de l’expansion du TA, un remodelage de la MEC est nécessaire. En effet, les adipocytes sont entourés par un réseau de protéines matricielles relativement flexible, afin de s’adapter à une expansion rapide au cours d’un apport énergétique excessif ou à une réduction drastique lors d’une restriction calorique (Park et al 2014). Lors d’une expansion importante du TA, une augmentation de la fibrose intersticielle est observée, aboutissant à la perte de la flexibilité de la MEC, ainsi qu’au dysfonctionnement des adipocytes. Cette fibrose est liée d’une part à l’inflammation et l’hypoxie et d’autre part à la modification du profil sécrétoire des adipocytes obèses. Ainsi, elle est le résultat d’un déséquilibre entre la synthèse des composants de la MEC, tels que les collagènes I, III et VI et une dégradation insuffisante de ces protéines (Sun et al 2013). La fibrose générée dans le TA dysfonctionnel a également des conséquences sur l’angiogenèse du TA. En plus d’induire une rigidité des vaisseaux sanguins, la MEC peut directement promouvoir ou inhiber le processus d’angiogenèse, via des cascades de signalisation en aval. C’est le cas du collagène VI qui est capable d’inhiber le bourgeonnement des nouveaux vaisseaux sanguins, empêchant à terme la bonne vascularisation du TA. 73 Comme nous l’avons vu dans la partie I, les adipocytes sécrètent de nombreuses molécules, appelées adipokines, telles que des protéines impliquées dans la synthèse de la MEC et son remodelage, des cytokines pro-inflammatoires, des chimiokines, des facteurs de croissance, des hormones ainsi que des métabolites lipidiques, capables d’influencer de nombreux processus dans l’organisme. De nombreuses études ont démontré que les adipocytes dysfonctionnels présentent des profils sécrétoires différents, variant en fonction des TA (figure 21) (Laurent et al 2014) (Ouchi et al 2011) (van Kruijsdijk et al 2009) (Park et al 2014). Ainsi, dans le TA viscéral de sujets obèses, la leptine, PAI-1, les cytokines pro-inflammatoires, l’HGF et le VEGF sont augmentés. A l’inverse, l’adiponectine est plutôt diminuée aussi bien dans le TA viscéral que dans le TA sous-cutané. Dans le TA sous-cutané obèse, la leptine, PAI-1, l’HGF et le VEGF sont augmentés et les cytokines pro-inflammatoires varient peu (Laurent et al 2014). De plus, il a été rapporté que les cellules endothéliales isolées de TA viscéral de patients obèses présentent une plus forte expression des gènes relatifs à l’inflammation et l’angiogenèse que les cellules endothéliales isolées du TA sous-cutané (Villaret et al 2010). Ces résultats suggèrent, là encore, que le TA viscéral est plus inflammatoire et associé aux complications métaboliques inhérentes à l’obésité (Hefetz-Sela and Scherer 2013). Figure 21. Adipokines sécrétées par le TA viscéral et le TA sous-cutané dans un contexte normopondéral et d’obésité. La taille des flèches, ainsi que l’intensité de coloration indiquent des variations positives des concentrations en adipokines (d’après (Laurent et al 2014)). b) Le TA mammaire A l’inverse du TA viscéral, le TA mammaire (MAT) obèse est très peu décrit. Cependant, une étude réalisée par Subbaramaiah et al. a montré que les souris obèses présentent des adipocytes nécrotiques entourés de macrophages, formant les CLS dans le TA viscéral et dans le TA mammaire, démontrant des similitudes entre ces deux TA, quant à l’inflammation induite par l’obésité. De plus, la présence de 74 CLS, dans le TA mammaire des souris obèses, est associée à l’activation de la voie NF-κB et à une augmentation de l’expression de médiateurs inflammatoires (Subbaramaiah et al 2011). Cette même équipe a montré peu après, que les résultats obtenus chez la souris pouvaient être transposés chez la femme. En effet, la présence de CLS a été retrouvée dans le TA mammaire des femmes pré et postménopausées (dans un contexte tumoral, après mastectomie). De manière intéressante, la sévérité de l’inflammation (définie par un index CLS) est corrélée positivement à l’IMC et à la taille adipocytaire des patientes (Morris et al 2011). En parallèle, Sun et al. ont montré, dans des conditions non tumorales, que le TA mammaire obèse est inflammatoire, caractérisé par la présence de macrophages, cytokines et chimiokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-6, IL-8 et CCR5 (Sun et al 2012). Récemment, une étude publiée par Arendt et al. a confirmé que la glande mammaire de souris obèses est enrichie, d’une part en macrophages (notamment de macrophages de type M1 et de façon moindre de macrophages de type M2) et d’autre part en cellules endothéliales et en péricytes. Ces travaux suggèrent, que le MAT de souris obèses présente aussi une augmentation de l’angiogenèse (Arendt et al 2013). L’équipe de Philipp Scherer a également mis en évidence que l’endotrophine (ETP), qui est un fragment de clivage de collagène VI, est augmentée dans la glande mammaire des souris obèses, suggérant la présence d’une fibrose importante (Park and Scherer 2012). L’ensemble de ces études suggère que le TA mammaire, au même titre que le TA viscéral, est modifié dans un contexte d’obésité, mais d’autres études sont nécessaires afin de caractériser la glande mammaire chez la souris et chez la femme obèses. 2-3) Modèles d’études de l’obésité in vitro Un certain nombre de modèles ont été mis au point in vitro afin d’étudier les mécanismes moléculaires de l’adipogenèse. Pour des raisons de faisabilité, les lignées murines de pré-adipocytes 3T3-L1 et 3T3F442A sont très souvent utilisées. Ces lignées présentent une morphologie fibroblastique et sont déjà engagées dans le lignage adipocytaire. Leur différenciation en adipocytes matures se fait in vitro par ajout de divers stimuli adipogéniques pour la lignée 3T3-L1 et seulement de l’insuline pour la lignée 3T3-F442A, qui est plus engagée dans la différenciation adipocytaire (Wang et al 2012). Les adipocytes matures peuvent également être obtenus par différenciation ex vivo des ADSCs provenant de la SVF du TA (Dirat et al 2011). Récemment, la lignée humaine d’ADSCs : hMAD a été établie et caractérisée (Lafontan 2012). Bien que ces modèles partagent beaucoup de similitudes avec les adipocytes primaires (stockage des TG, expression des marqueurs spécifiques des adipocytes, réponse aux facteurs lipogéniques et lipolytiques), ils ne peuvent en aucun cas mimer l’hypertrophie et les modifications sécrétoires induites par l’obésité. Afin de garder le phénotype obèse, les explants de TA obèses peuvent être utilisés. L’inconvénient de travailler sur le TA total est le fait qu’on ne peut pas distinguer les effets des adipocytes, des effets de la SVF, qui contient un grand nombre de cellules actives (voir partie I). De plus, ces explants vont rapidement présenter des altérations, dues à une 75 mauvaise oxygénation et un manque de nutriments (Gesta et al 2003). On considère que la culture d’un explant ne doit pas dépasser 48h (Wang et al 2012). Pour étudier le rôle spécifique des adipocytes dans un contexte d’obésité, les adipocytes peuvent être isolés par digestion du TA sous l’action de collagénases. Ces adipocytes primaires ne peuvent pas survivre plus de 24h (Lafontan 2012). Pour cultiver les adipocytes sur des temps plus longs, ils devront être intégrés dans des matrices en 3D, à base de collagène I ou d’hydrogel, développé par le groupe de Karine Clément (brevet numéro CA2800667A1). Ces modèles de matrice en 3D représentent, à ce jour, les modèles les plus prometteurs pour l’étude des adipocytes dans un contexte d’obésité. 3) Obésité et cancer du sein 3-1) Epidémiologie a) Obésité et incidence des cancers De nombreuses études épidémiologiques ont établi un lien entre obésité et cancer. En effet, l’obésité est à l’origine de l’augmentation de l’incidence de certains cancers, autrement dit de l’initiation du développement d’un cancer. Une méta-analyse incluant 282 137 patients, a établi un lien entre surpoids / obésité et une augmentation du risque de développer un cancer. Ces données sont regroupées dans la figure 22. Ainsi, l’obésité représente un facteur de risque pour les cancers de l’œsophage, rénal, de l’endomètre, du côlon, de la thyroïde, du sein chez la femme post-ménopausée, du pancréas (femme), les leucémies et le mélanome (homme) (Renehan et al 2008) (Bhaskaran et al 2014). Type de cancers Sein post-ménopause pré-ménopause Colon Endomètre Oesophage Rein Leucémie Mélanome Myélome multiple Lymphome non hogkinien Pancréas Prostate Rectum Thyroïde Foie Hommes ND 1,24 (***) 1,52 (***) 1,24 (***) 1,08 (**) 1,17 (**) 1,11 (***) 1,06 (***) 1,07 1,03 1,09 (***) 1,33 (*) 1,24 Femmes 1,12 (***) 0,92 (**) 1,09 (***) 1,59 (***) 1,51 (***) 1,34 (***) 1,17 (*) 0,96 (*) 1,11 (***) 1,07 (*) 1,12 (*) Figure 22. IMC et risques relatifs de développer des cancers. Ces données proviennent de la méta-analyse de Renehan et al. (Renehan et al 2008). ND = Non déterminé. * p≤0.05, ** p<0.01 et *** p<0.0001 (d’après (Hefetz-Sela and Scherer 2013)). 1,02 1,14 (**) 1,07 76 Concernant le cancer du sein, l’obésité favorise le développement du cancer chez la femme ménopausée mais pas chez la femme pré-ménopausée. L’obésité serait même un facteur protecteur vis-à-vis du cancer du sein chez la femme pré-ménopausée. Ceci s’expliquerait par la présence de nombreux cycles menstruels anovulatoires chez la femme obèse et donc une moindre exposition aux œstrogènes endogènes (Xia et al 2014). Une méta-analyse très récente a confirmé ces données et a suggéré que le risque de développer un cancer du sein chez la femme ménopausée est proportionnel à l’IMC mais de manière non linéaire (IMC 25 kg/m2: RR=1.02, IMC 30: RR=1.12 et IMC 35: RR=1.26) (Xia et al 2014). L’obésité a également été associée à certains des sous-types du cancer du sein. Une étude réalisée par Suzuki et al. suggère fortement que l’obésité chez la femme ménopausée est associée à un risque de 82% de développer un cancer ER+PR+. Ce risque existe aussi chez la femme pré-ménopausée mais à moindre niveau (20% de risque) (Suzuki et al 2009). Cependant, certaines études s’accordent pour dire que l’obésité est un facteur de risque pour les TNBC mais seulement chez les femmes pré-ménopausées (Pierobon and Frankenfeld 2013) (Vona-Davis et al 2008). Pour conclure, l’ensemble de ces études suggère qu’il y a bien un lien entre obésité et incidence du cancer du sein chez la femme ménopausée, surtout pour le sous-type ER+PR+ (sous-type majoritairement présent chez les femmes ménopausées). Cependant, il existe une certaine controverse quant au lien entre obésité et incidence du cancer du sein chez la femme pré-ménopausée. b) Obésité et pronostic des cancers Outre l’augmentation du nombre de cancers, l’obésité est également associée à un mauvais pronostic de nombreux cancers, tels que les cancers de l’œsophage, du côlon, du foie, du pancréas, du rein, de la prostate, de l’estomac, de l’ovaire, de l’utérus, du col de l’utérus, du sein et le mélanome (Park et al 2014). Une large cohorte sur 900 000 patients, publiée par the New England Journal of Medicine a établi pour la première fois, qu’aux Etats-Unis, environ 14% des décès par cancer chez l’homme et 20% chez la femme seraient dus à l’obésité (Calle et al 2003). Une étude réalisée par l’institut Curie en 1999 sur une large cohorte de 14 702 patientes a mis en évidence le fait que l’obésité est associée à un mauvais pronostic pour tous les cancers du sein : mauvais pronostic caractérisé par un cancer avancé au diagnostic, une diminution de la survie sans maladie et de la survie globale, une augmentation de l’apparition de métastases et une augmentation des rechutes (Majed et al 2008). Ces résultats ont été confirmés par d’autres études, notamment dans une, publiée par Ewertz et al. Cette étude suggère que les patientes obèses présentent un cancer plus avancé au diagnostic, un risque de développer des métastases après 10 ans augmenté de 46% et un risque de mourir d’un cancer du sein augmenté de 38%. De plus, cette étude suggère que la chimiothérapie (cyclophosphamide, méthotrexate, 5fluorouracile, epirubicine) et l’hormonothérapie (tamoxifène) sont moins efficaces après 10 ans chez les patientes présentant un IMC > 30 kg/m2 (Stark et al 2010) (Ewertz et al 2011). De manière intéressante, tous les sous-types de cancers du sein s’avèrent être affectés par l’obésité. Les patientes atteintes de cancers HER2+ semblent être encore plus touchées, en termes de mortalité et de 77 développement de métastases à distance (Ewertz et al 2011). L’impact de l’obésité sur le pronostic du cancer a particulièrement retenu notre attention, car, contrairement à l’incidence, l’obésité est un facteur de mauvais pronostic global pour les cancers du sein, indépendamment du sous-type et du statut ménopausique. De plus, l’obésité influence, de manière importante, la réponse à la chimiothérapie (voir partie obésité et chimiorésistance). 3-2) Mécanismes non biologiques affectant le pr onostic Les mécanismes physiopathologiques permettant d’expliquer le mauvais pronostic des cancers du sein chez la femme obèse ne sont pas encore bien connus, mais certains facteurs biologiques ont été étudiés. Il s’agit d’une part, de facteurs systémiques, tels que les hormones (insuline, œstrogènes, leptine) et d’autre part, de facteurs locaux, comme les altérations du TA liées à l’obésité (figure 23). Cependant, l’obésité est une maladie complexe, qui peut faire intervenir d’autres facteurs dits non biologiques, tels qu’un dépistage tardif et une administration insuffisante des doses de chimiothérapie. a) Le dépistage tardif Le mauvais pronostic associé au cancer du sein des patientes obèses peut être associé à un retard au diagnostic, et donc une maladie plus évoluée au moment de la découverte du cancer, ce qui est très fréquent chez ce type de patientes (Ewertz et al 2011). Le retard au diagnostic peut provenir d’une difficulté à identifier la tumeur, liée notamment à l’augmentation de la taille du sein chez les patientes obèses (Boyd et al 2006) (Crispo et al 2015). Cependant, plusieurs études ont démontré que la sensibilité des méthodes de détections médicales, telles que la mammographie n’est pas altérée par l’obésité (Crispo et al 2015) (Elmore et al 2004). Le retard de diagnostic concernerait uniquement les cas détectés par auto-palpation (Majed et al 2008). b) Administration insuffisante des doses de chimiothérapie Les doses de chimiothérapie sont classiquement calculées sur la base de la surface corporelle (en m2), qui est déterminée en fonction du poids et de la taille du patient. Les patientes obèses ont très souvent une surface corporelle supérieure à 2 m2. Empiriquement, les médecins ont tendance à diminuer les doses chez les patientes obèses de peur qu’une dose proportionnelle à leur surface corporelle (donc élevée) entraîne des effets indésirables trop importants, d’autant plus que ce type de patientes présente bien souvent des co-morbidités associées. Cependant, les recommandations préconisent la prescription de la dose exacte ajustée à la surface corporelle et non une sous-dose, susceptible de diminuer leur pronostic (Lyman and Sparreboom 2013). En effet, plusieurs études suggèrent que les femmes obèses recevant des doses de chimiothérapie prévues dans le protocole ne subissent pas plus d’effets indésirables (Carroll et al 2014) (Colleoni et al 2005). 78 3-3) Mécanismes biologiques affectant la progr ession tumorale (figur e 23) a) Hyperglycémie et hyperinsulinémie L’obésité est très souvent associée à un phénomène d’insulino-résistance, accompagnée d’un diabète de type II. - Hyperglycémie. Les résultats des études cliniques et des méta-analyses suggèrent qu’il y a un lien entre le diabète sucré et le développement de cancers, tels que les cancers du foie, du pancréas, de l’endomètre, colorectal, du sein et rénal. Mais les mécanismes physiopathologiques ne sont pas encore bien connus (Gallagher and LeRoith 2013). Les cellules tumorales utilisent le glucose, comme source d’énergie majoritaire, afin de produire de l’énergie par l’effet Warburg. L’équipe de Philipp Scherer a démontré que des souris hyperglycémiques (hyperglycémie induite par apoptose des cellules β pancréatiques), présentaient des tumeurs plus agressives. Le mécanisme impliqué serait que l’hyperglycémie induit des modifications épigénétiques de certaines voies de signalisation protumorales, telles que les voies EGFR, HER2 et HER3 (Park et al 2012) (Park et al 2014). - Hyperinsulinémie. L’hyperinsulinémie est directement corrélée à des effets pro-tumorigènes. D’une part, l’insuline peut se fixer sur ses récepteurs IR, exprimés par les cellules tumorales. D’autre part, l’insuline induit la synthèse de l’IGF-1 (Insulin-Growth Factor-1), qui est un facteur de croissance peptidique produit par le foie. Les concentrations d’insuline et d’IGF-1 circulants sont augmentés chez les sujets obèses (Ford et al 2013). De plus, l’insuline partage environ 50% d’homologie de séquence avec l’IGF-1 et peut ainsi se fixer sur son récepteur IGFR-1 (Insulin Growth Factor Receptor-1). L’IGF-1 et l’insuline peuvent donc promouvoir la carcinogenèse en activant des voies de signalisation pro-tumorales, telles que les voies MAPK et PI3K/Akt et en inhibant l’apoptose. Ainsi, des études épidémiologiques prospectives ont montré une forte association entre la concentration en IGF-1 circulant et le risque de développer des cancers de la prostate, colorectal et du sein chez la femme préménopausée (Park et al 2014) (Pollak et al 2004). Enfin, l’insuline augmente la synthèse et la biodisponibilité des hormones stéroïdes sexuelles, incluant les androgènes, la progestérone et les œstrogènes, connus pour être pro-tumorigènes. L’insuline peut également stimuler la voie de signalisation de la leptine (Rose and Vona-Davis 2014). b) Les hormones sexuelles Le rôle des hormones sexuelles dans la progression tumorale, notamment des œstrogènes, permet d’expliquer uniquement l’incidence et le pronostic des cancers du sein dépendants des hormones (ER+PR+). Après la ménopause, les œstrogènes (libérés par les ovaires avant la ménopause) sont produits presque exclusivement par les cellules stromales (surtout les pré-adipocytes) du TA (Rose and Vona-Davis 2014). Cette synthèse se fait par l’enzyme aromatase qui permet la conversion des androgènes en œstrogènes. L’activité aromatase, ainsi que le taux d’œstrogènes sont proportionnels à 79 l’IMC. Les femmes obèses ménopausées présentent, en effet, des quantités importantes d’œstrogènes, et ceci est associé à une augmentation du risque de développer un cancer du sein (Key et al 2002). D’autre part les cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF-α) peuvent induire l’expression de l’aromatase dans les ADSCs (Zhao et al 1996). De plus, dans leur étude sur le TA mammaire obèse, Subbaramaiah et al. ont montré que l’inflammation du TA induite par l’obésité est associée à une augmentation de l’expression de l’aromatase par les cellules stromales (Subbaramaiah et al 2011). Les œstrogènes se lient au récepteur Er-α (Estrogen receptor-α) qui active des voies de signalisation en aval, permettant d’induire la prolifération cellulaire, de diminuer l’apoptose et de favoriser l’angiogenèse via l’induction du VEGF (Ford et al 2013). c) L’inflammation chronique L’inflammation chronique représente une altération importante du TA induite par l’obésité. Cette inflammation est liée au recrutement de cellules inflammatoires, telles que des macrophages et également à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines, telles que CCL2, IL-6 et TNF-α, augmentées dans un contexte d’obésité. L’infiltration des macrophages dans le TA de souris et de personnes obèses peut représenter jusqu’à 40% du TA (Hefetz-Sela and Scherer 2013). Comme nous l’avons vu dans la partie I, l’inflammation et les macrophages présents dans le microenvironnement tumoral sont associés à la progression de la tumeur à toutes les étapes (prolifération tumorale, survie, angiogenèse, chimiorésistance et dissémination métastatique). Dans l’étude de Morris et al., portant sur la comparaison du TA mammaire des patientes obèses préménopausées ou ménopausées présentant un cancer du sein, les résultats montrent la présence d’une inflammation dans le TA mammaire indifféremment du statut ménopausique des femmes. Ainsi, l’inflammation dans le TA mammaire représente un facteur de risque et de mauvais pronostic pour le cancer du sein, indépendamment du statut ménopausique (Morris et al 2011). Dans un modèle murin de carcinome hépatocellulaire induit par diethylnitrosamine, les souris obèses présentent une masse tumorale plus importante que les souris normopondérales. De manière intéressante, les souris obèses KO pour l’IL-6 ou pour le TNF-α présentent un hépatocarcinome moins important que les souris obèses sauvages, suggérant le rôle important de l’inflammation liée à l’obésité, dans le développement du carcinome hépatocellulaire (Park et al 2010). Très récemment, Arendt et al. ont montré que l’obésité favorise la progression tumorale, via une augmentation du recrutement de macrophages et via l’angiogenèse. Les auteurs proposent comme modèle de leurs résultats que les adipocytes obèses du TA mammaire sécrètent CCL2, qui permet le recrutement de macrophages qui vont former des CLS. En réponse à CCL2 et IL-1β, les macrophages sécrètent CXCL12, qui favorise l’angiogenèse et la progression tumorale (Arendt et al 2013). L’équipe de Stephen Hursting a également montré que les tumeurs mammaires murines dans les souris obèses sont enrichies en marqueurs inflammatoires et pro-angiogéniques (De Angel et al 2013) (figure 24). 80 d) Les adipokines Lors de l’obésité, le profil sécrétoire des adipocytes est profondément remanié (figure 21). Parmi toutes les adipokines, l’adiponectine et la leptine ont largement été étudiées, notamment pour leur rôle dans le cancer (voir partie I). - Leptine. La leptine est considérablement augmentée dans le TA et la circulation sanguine de patientes obèses, faisant d’elle une hormone clé dans le lien entre obésité et cancer. En effet, des patientes atteintes de cancer du sein, ayant des concentrations élevées d’ARNm du récepteur à la leptine, au sein de la tumeur, présentent un cancer de mauvais pronostic (Miyoshi et al 2006). - Adiponectine. A l’inverse, la concentration en adiponectine est inversement corrélée à l’obésité. Ainsi, un niveau faible d’adiponectine est associé à une augmentation de l’incidence de certains cancers, comme le cancer de l’endomètre, du sein chez la femme ménopausée, du côlon, de l’estomac, du rein et les leucémies (Tworoger et al 2007) (Kelesidis et al 2006). e) Hypoxie, angiogenèse et lymphangiogenèse L’angiogenèse exerce un rôle pivot dans la progression tumorale : elle permet le passage d’une tumeur peu vascularisée de faible taille à une tumeur croissante très vascularisée et favorise le processus métastatique (voir partie I). Comme dans une tumeur, le TA obèse requiert une étroite coopération entre les adipocytes, les macrophages et les cellules endothéliales, afin de se développer pour répondre aux demandes énergétiques accrues. Dans un contexte d’obésité, les adipocytes sécrètent davantage de facteurs pro-angiogéniques, tels que du VEGF, du FGF, la leptine, la résistine, l’adiponectine, PAI-1 et l’IL-6, susceptibles de promouvoir l’angiogenèse tumorale et la progression de la tumeur (HefetzSela and Scherer 2013). Chez l’Homme, il existe une corrélation entre l’IMC et la masse adipeuse totale avec la concentration en VEGF sanguine (Rose and Vona-Davis 2014). Gu et al. ont étudié l’effet de l’obésité sur la progression tumorale mammaire dans un modèle murin de souris ovariectomisées. Ils ont injecté en orthotopique la lignée tumorale murine ER+ E0771 à des souris obèses ou non et suivi la progression de la tumeur. Les résultats montrent que la croissance tumorale est plus élevée dans les souris obèses et ceci est associé à une angiogenèse plus importante, caractérisée par une augmentation de la densité intra-tumorale des vaisseaux, une augmentation du VEGF dans le sang, au sein de la tumeur et dans le TA. De manière intéressante, le TA sous-cutané exprime plus de VEGF que le TA viscéral dans les souris obèses. Ainsi, cette étude suggère que lors de l’obésité, certaines adipokines sont augmentées dans le TA, qui peut localement favoriser l’angiogenèse et le développement de la tumeur (Gu et al 2011). Dans un modèle murin de mélanome, Jung et al. ont montré que les souris obèses présentent des mélanomes, des métastases ganglionnaires ainsi qu’une lymphangiogenèse plus importants. Les auteurs suggèrent que dans un contexte d’obésité, un dialogue entre les adipocytes, les macrophages et les cellules tumorales se met en place, permettant 81 d’augmenter la lymphangiogenèse et l’envahissement des cellules tumorales dans les ganglions lymphatiques ; dialogue médié par CCL2, M-CSF (Macrophages Colony Stimulating Factor), VEGFA, C et D, CCL19, CCL7 et CCR7 (Jung et al 2015). Lié au manque d’angiogenèse et à l’expansion du TA, le TA obèse devient hypoxique. L’hypoxie a été rapportée comme capable d’activer des voies pro-inflammatoires dans le TA, d’induire une fibrose et le processus d’angiogenèse. Ces trois processus ainsi que l’hypoxie, en tant que telle, ont un rôle évident dans la progression de la tumeur (partie I) (Hefetz-Sela and Scherer 2013) (figure 24). f) Fibrose Au cours de l’expansion du TA, un important remodelage de la MEC est requis, aboutissant généralement à une fibrose. La fibrose est un processus important dans la progression tumorale (voir partie I). Ainsi, l’expression des composants de la MEC est modulée par l’obésité et peut influencer la progression de la tumeur. L’équipe de Philipp Scherer a montré que l’endotrophine, exerce un rôle important dans la progression tumorale mammaire, notamment dans les phénomènes de fibrose et d’inflammation, via le recrutement des macrophages et des cellules endothéliales. L’endotrophine confère à la tumeur un phénotype plus agressif et un potentiel métastatique plus important (voir partie I) (Hefetz-Sela and Scherer 2013). L’effet pro-tumoral de l’endotrophine est médié par la signalisation du TGF-β, contribuant à la fibrose et à l’EMT : processus favorisant l’invasion et la survie des cellules tumorales (Hefetz-Sela and Scherer 2013). De manière intéressante, l’endotrophine est augmentée dans le TA obèse et a un rôle crucial dans les complications métaboliques associées à l’obésité. L’endotrophine exerce ainsi un rôle clé dans la progression tumorale, le processus métastatique et les complications métaboliques associées à l’obésité (Park and Scherer 2012). Par conséquent, les protéines impliquées dans la synthèse et le remodelage de la MEC semblent jouer une fonction importante dans la progression tumorale, associée à l’obésité. g) Autres mécanismes - Les métabolites lipidiques. L’insulino-résistance liée à l’obésité induit une lipolyse des adipocytes. Ainsi, des AG sont libérés dans la circulation générale. D’autres métabolites, comme le diacylglycérol et les céramides, sont relargués par les adipocytes et peuvent servir de seconds messagers pour activer des voies de signalisation (voies de signalisation de la PI3K, du NF-κB), impliquées dans l’apoptose, la prolifération et la croissance cellulaire. De plus, les AG et d’autres métabolites libérés dans la circulation générale participent à la progression tumorale en augmentant la β-oxydation et la génération d’espèces réactives de l’oxygène et contribuent à la biosynthèse de nouvelles membranes lipidiques (Park et al 2011). Bien que l’énergie des cellules cancéreuses semble être fournie majoritairement par la glycolyse, l’oxydation des AG offre une voie alternative intéressante, notamment lors de l’augmentation des AG libres, retrouvée dans l’obésité (Schafer et al 2009). 82 - L’EMT. L’équipe de Stephen Hursting a isolé deux lignées tumorales mammaires murines, à partir de tumeurs mammaires spontanées chez la souris MMTV-Wnt1, qui correspondent aux sous-types de cancer du sein basal-like et claudin-low. Les auteurs ont injecté ces cellules en orthotopique dans la glande mammaire de souris obèses, normopondérales ou soumises à une restriction calorique. Les résultats montrent qu’il existe une relation entre la balance énergétique, l’EMT, la présence de cellules initiatrices de cancer et la progression tumorale. Autrement dit, les souris obèses développent des tumeurs plus importantes, caractérisées par la présence de marqueurs mésenchymateux, d’une infiltration adipocytaire et de CSCs. A l’inverse, les souris mises en restriction calorique, présentent des tumeurs plus petites, enrichies en marqueurs épithéliaux (Dunlap et al 2012). - ADSCs. A l’inverse des patients normopondéraux, les patients obèses présentent des quantités importantes d’ADSCs circulants, en lien probablement avec un recrutement et une prolifération plus importants de ces cellules lors de l’expansion du TA. De manière importante, la présence d’ADSCs circulants est exacerbée chez les patients obèses atteints de cancers, notamment de cancer du sein. Etant donné le rôle important de ces cellules dans la progression tumorale (partie I), il est logique d’imaginer que les ADSCs pourraient avoir un rôle crucial dans la progression tumorale des patients obèses (Ghosh et al 2014). L’équipe de Bunell a isolé des ADSCs du TA sous-cutané abdominal de patients obèses ou non et une étude de l’impact de ces progéniteurs sur la progression tumorale in vitro et in vivo a été réalisée. Les résultats suggèrent que les ADSCs, provenant de patients obèses augmentent la prolifération tumorale in vitro et la tumorigénicité in vivo des cellules tumorales mammaires, via un mécanisme qui implique l’augmentation de la leptine, induite par l’obésité et les œstrogènes (Strong et al 2013). Parmi toutes les hypothèses évoquées ci-dessus pouvant faire le lien entre obésité et cancer, les plus convaincantes impliquent les perturbations du TA, notamment l’inflammation, l’angiogenèse et la fibrose. En effet, les modifications du TA induites par l’obésité concernant ces trois paramètres permettent la formation d’un environnement permissif à la progression de la tumeur. D’un point de vue biologique, de fortes similitudes ont été observées entre les modifications du TA viscéral et du TA mammaire obèses chez la souris, dans un contexte normal et tumoral. D’un point de vue clinique, le TA mammaire des femmes obèses n’est pas encore complétement caractérisé mais des études préliminaires ont mis en évidence que ce TA, au même titre que le TA viscéral est plus inflammatoire, renforçant l’hypothèse d’un rôle paracrine important du TA sur la progression de la tumeur (figure 24). 83 3-4) Cas particulier : Obésité et chimior ésistance a) Arguments cliniques Comme nous l’avons vu auparavant, l’obésité est un facteur de mauvais pronostic global pour les cancers du sein, en favorisant notamment les rechutes. Le lien entre obésité et mauvais pronostic du cancer est probablement multifactoriel mais des arguments suggèrent que l’obésité influence la réponse à la chimiothérapie. Récemment, une analyse rétrospective a été réalisée sur 5 683 patientes atteintes de cancers du sein opérables et traitées par chimiothérapie adjuvante composée d’anthracyclines et de taxanes. Les résultats suggèrent que seules les patientes présentant une obésité sévère (IMC > 35) ont un cancer du sein de très mauvais pronostic, en termes de rechutes et de mortalité, indépendamment du sous-type de cancers (Pajares et al 2013). Des résultats similaires ont été rapportés par De Azambuja et al., qui ont étudié l’effet de l’obésité sur le pronostic du cancer de sein, traité par chimiothérapie adjuvante (doxorubicine et docetaxel). Les auteurs ont démontré que l’obésité est associée à une diminution de la survie sans maladie et de la survie globale (de Azambuja et al 2010). Des résultats semblables ont été observés avec la chimiothérapie néoadjuvante. Litton et al. ont réalisé une étude sur 1 169 patientes, atteintes de cancers du sein et traitées par chimiothérapie néoadjuvante. Concernant les chimiothérapies administrées, 91% des patientes ont reçu un traitement à base d’anthracyclines, et parmi ces patientes, 72% ont reçu en plus une chimiothérapie composée de taxanes ou de trastuzumab. Les données obtenues montrent que les patientes obèses ou en surpoids présentent un cancer du sein plus avancé, caractérisé par une réponse complète plus faible à la chimiothérapie néoadjuvante que les patientes de poids normal (Litton et al 2008). Ces résultats ont été confirmés dans d’autres études (Del Fabbro et al 2012) (Kacem et al 2010). Ainsi, l’ensemble de ces données suggère que l’obésité est globalement associée à une moindre réponse aux chimiothérapies adjuvante et néoadjuvante, expliquant en partie le mauvais pronostic des patientes obèses atteintes de cancer du sein. b) Arguments pharmacocinétiques L’obésité peut avoir un rôle systémique sur la chimiorésistance, en altérant la pharmacocinétique des chimiothérapies. En effet, les drogues lipophiles peuvent partiellement se stocker dans le TA excédentaire (Cheymol 2000). L’obésité est également associée à une augmentation de l’α-1 glycoprotéine acide, qui pourrait augmenter la liaison plasmatique des drogues basiques, empêchant leur bonne distribution (Blouin et al 1987). La clairance hépatique et rénale peut être altérée dans l’obésité, liée à une augmentation de l’activité du cytochrome P450 2E1 et à une augmentation de la filtration glomérulaire et la sécrétion tubulaire. Ceci peut au final altérer la pharmacocinétique des drogues hydrophiles (Sheng and Mittelman 2014). Comme l’exposition aux drogues dépend du volume de distribution et de la clairance, l’obésité pourrait être associée à une toxicité plus importante, 84 mais comme vu précédemment, les études ont montré que ce n’était pas le cas (Lyman and Sparreboom 2013). c) Arguments biologiques De manière intéressante, les différentes modifications du TA liées à l’obésité, telles que la fibrose, l’inflammation, l’angiogenèse et certaines adipokines ont été associées séparemment à une diminution de la sensibilité des cellules tumorales à la chimiothérapie (voir partie I et partie III). De plus, certaines études se sont intéressées au rôle des adipocytes ou du TA dysfonctionnel sur la résistance aux traitements, dans un contexte d’obésité. La première étude qui a étudié ce processus est l’étude de Behan et al. en 2009. Après injection d’une lignée tumorale syngénique de leucémie aigüe lymphoïde à des souris obèses ou non, un traitement à la vincristine (à dose proportionnelle au poids du corps) a été réalisé. Les résultats montrent que l’obésité augmente les rechutes de la tumeur après traitement. Afin d’identifier le mécanisme, les auteurs ont co-cultivé les adipocytes de la lignée 3T3-L1 avec des cellules tumorales leucémiques. De manière intéressante, les adipocytes diminuent l’efficacité de la vincristine en protégeant les cellules de l’apoptose induite par le traitement. L’effet des adipocytes n’est pas restreint à la vincristine, les cellules co-cultivées avec les adipocytes sont également plus résistantes au nilotinib, la daunorubicine et au dexamethasone. Ce processus est associé à une augmentation des facteurs anti-apoptotiques Bcl-2 et Pim-2 (Proviral integrations of moloney virus 2). Cette étude souligne l’impact direct des adipocytes dans l’induction d’une chimiorésistance mais le mécanisme reliant l’obésité et la chimiorésistance n’a pas été étudié (Behan et al 2009). Dans le modèle du cancer du sein, l’équipe de Philipp Scherer a montré que la quantité d’endotrophine est augmentée, suite à un traitement au cisplatine. A l’inverse, l’endotrophine cause une chimiorésistance et un processus d’EMT, en faveur de la progression tumorale. De manière intéressante, les souris KO pour le collagène VI sont plus sensibles au cisplatine, via une inhibition de l’EMT (Park et al 2013). Comme l’endotrophine est augmentée dans le TA obèse, l’étude de l’implication de cette protéine dans la chimiorésistance dans un contexte d’obésité pourrait être intéressante (Park et al 2014). L’équipe de Stephen Husting a également montré, que les souris obèses sont plus résistantes à la gemcitabine, dans un modèle de tumeur mammaire. Ils ont démontré que l’inclusion de la gemcitabine dans des nanoparticules lipidiques contrebalance cette chimiorésistance (De Angel et al 2013). De manière intéressante, des études ont corrélé l’hyperglycémie (fréquemment retrouvée dans un contexte d’obésité) avec le phénomène de chimiorésistance. La composition et la dépendance de la tumeur en glucose dépendent du stade tumoral. Virchvakarma et al. ont étudié in vivo le rôle du glucose dans la progression tumorale du lymphome à des stades précoces ou tardifs du cancer et ont évalué l’impact de l’hyperglycémie sur la chimiorésistance. Les résultats suggèrent que l’exposition au glucose des cellules tumorales à des stades tardifs de la progression tumorale, entraîne une diminution de la sensibilité des cellules au cisplatine et au méthotrexate. Ce phénomène est associé à une surexpression de la protéine d’efflux P-gp (voie partie III) (Vishvakarma et al 2013). De manière intéressante, une 85 étude réalisée par Zeng suggère que l’exposition des cellules tumorales mammaires au glucose induit une résistance au 5-fluorouracile, à la doxorubicine et au paclitaxel. Le mécanisme est lié à une augmentation de FAS (Fatty Acid Synthase) (enzyme impliquée dans la lipogenèse) ainsi que du céramide (Zeng et al 2010). Tous les mécanismes, induits par un TA dysfonctionnel et qui peuvent potentiellement favoriser l’initiation et la progression tumorale, ainsi que les rechutes et la chimiorésistance sont résumés dans la figure 23. La figure 24 résume les mécanismes connus, faisant le lien entre les modifications du TA mammaire de souris et de patientes obèses et la progression tumorale. Figure 23. Conséquences potentielles des altérations du TA par l’obésité sur l’initiation tumorale, la progression tumorale, les rechutes et la chimiorésistance. L’obésité entraîne des modifications du TA et des adipocytes, qui produisent des niveaux élevés de cytokines proinflammatoires, de chimiokines, de facteurs de croissance, d’hormones sexuelles, de métabolites lipidiques. Ce TA dysfonctionnel est une source de protéines matricielles, de CSCs (Cancer Stem Cells) et d’ADSCs. Tous ces facteurs sont susceptibles d’agir à toutes les étapes de la progression tumorale (de l’initiation, à la progression tumorale et aux rechutes). L’obésité induit aussi des changements métaboliques systémiques, tels qu’une hyperglycémie et une hyperinsulinémie, qui contribuent également à créer un environnement permissif pour la tumeur (d’après (Park et al 2014)). 86 Figure 24. TA mammaire et cancer du sein : comparatif des mécanismes connus entre la souris et l’Homme. Sous l’influence de l’obésité, le TA mammaire est modifié. Chez la souris, une hypertrophie des adipocytes est observée, ainsi qu’une fibrose, une angiogenèse et une inflammation. Ce TA dysfonctionnel influence la progression tumorale, en favorisant une chimiorésistance, une fibrose, une inflammation, une angiogenèse et un processus EMT. A l’inverse, une diminution de la survie est observée. Ces processus sont médiés par CCL2, l’endotrophine (ETP) et le VEGF. Le TA des femmes obèses est également modifié. Il est ainsi caractérisé par une hypertrophie adipocytaire et une inflammation. Peu de données sont fournies concernant le rôle du TA mammaire dans la progression tumorale. Les études épidémiologiques suggèrent que les femmes obèses présentent un cancer du sein de plus mauvais pronostic, caractérisé par une augmentation des métastases, des rechutes et de la chimiorésistance et une diminution de la survie globale et la survie sans maladie. En conclusion, il existe une association évidente entre l’obésité et la progression tumorale mammaire, et ce, indépendamment du statut ménopausique. En effet, l’obésité est un facteur de mauvais pronostic global pour les cancers du sein caractérisé, entre autres, par une augmentation des rechutes, de la mortalité et par une chimiorésistance, suite à un traitement par chimiothérapie adjuvante ou néoadjuvante. La chimiothérapie demeure un des traitements de référence du cancer du sein, soit dans des cancers souvent agressifs, soit dans les cancers métastatiques d’emblée. De nombreuses hypothèses peuvent expliquer l’augmentation de la résistance à la chimiothérapie chez les patientes obèses, mais les plus convaincantes impliquent les perturbations du tissu adipeux, qui contribuent à créer un microenvironnement permissif à la tumeur. Au sein du TA, le rôle des adipocytes dans la résistance aux traitements a été suggéré ; cependant les mécanismes précis qui relient les adipocytes obèses et la chimiorésistance des cancers du sein ne 87 sont pas bien connus. La partie III consistera à étudier les différents mécanismes moléculaires et cellulaires connus, impliqués dans la résistance à la chimiothérapie, qui pourraient potentiellement être influencés par les adipocytes. 88 PARTIE III : LES MECANISMES DE CHIMIORESISTANCE 1) Mécanisme d’action de la doxorubicine 1-1) Généralités Découverte dans les années 1960, la famille des anthracyclines se situe parmi les molécules anticancéreuses les plus efficaces, malgré une forte toxicité cardiaque et myéloïde. Cette famille d’agents anti-cancéreux s’est révélée très active sur un large panel de tumeurs (Jamieson and Boddy 2011). Une méta-analyse, réalisée par l’EBTCG (Early Breast Cancer Trialist’s Collaborative Group) a prouvé l’efficacité d’un traitement à base d’anthracycline sur la prévention des récurrences (RR = 0.89) et sur la survie (RR de mourir d’un cancer du sein = 0.84). De plus, l’utilisation des anthracyclines présente des avantages en terme de toxicité, par rapport au traitement CMF (Cyclophosphamide, Méthrotrexate, 5-Fluorouracile) (Lal et al 2010). Comme la plupart des antibiotiques, les premières anthracyclines ont été isolées à partir du pigment produit par la bactérie Streptomyces peucetius et ont été nommées doxorubicine (ADRIAMYCINE®) et daunorubicine (DAUNOMYCINE®) (figure 25) (Minotti et al 2004). Alors que la doxorubicine est utilisée principalement dans le traitement des tumeurs solides, telles que le cancer du sein, du poumon, de l’ovaire, de l’estomac, de la thyroïde, les sarcomes et les lymphomes, la daunorubicine est indiquée dans les leucémies lymphoblastiques et myéloblastiques (Cortes-Funes and Coronado 2007). Depuis, d’autres antracyclines ont rejoint l’arsenal thrérapeutique anti-tumoral, comme l’éprubicine, l’idarubicine, la pirarubicine, la zorubicine, l’aclarubicine, la valrubicine et le mitoxantrone. En dépit de l’utilisation accrue des anthracyclines en clinique, leur mécanisme d’action reste un sujet à débat (Minotti et al 2004). Les anthracyclines présentent un effet cytotoxique et antiprolifératif, liés à l’inhibition de la biosynthèse de macromolécules d’ADN et d’ARN, via deux actions : l’intercalation de l’ADN et l’inhibition de la topoisomérase II. Les anthracyclines peuvent aussi générer des radicaux libres qui contribuent à leur effet cytotoxique (Minotti et al 2004). Figure 25. Structures chimiques des principales anthracyclines. DOX : doxorubicine, DNR : daunorubicine, EPI : épirubicine, IDA : idurabucine (d’après (Minotti et al 2004)). 89 1-2) Pharmacocinétique de la doxorubicine Au niveau chimique, toutes les anthracyclines présentent une structure rigide aromatique, contenant un motif quinone, lié par une liaison glycosidique à un sucre aminé : la daunosamine (figure 25) (CortesFunes and Coronado 2007). Concernant la pharmacocinétique de la doxorubicine, elle présente souvent une clairance plasmatique tri-phasique après injection intra-veineuse. La demi-vie de distribution de la doxorubicine est de 3 à 5 minutes. Du fait de sa lipophilie, elle rentre rapidement dans les cellules, majoritairement par voie passive (Tacar et al 2013). Sa concentration intra-cellulaire est environ 10 à 500 fois supérieure à sa concentration extra-cellulaire (Lal et al 2010). Dans la cellule, elle est majoritairement retrouvée dans le noyau (concentration nucléaire environ 50 fois supérieure à sa concentration cytoplasmique). La forme libre intra-cellulaire de la doxorubicine (2% de la quantité totale intra-cellulaire de doxorubicine) peut être séquestrée dans d’autres compartiments cellulaires, tels que les lysosomes, l’appareil de Golgi et les mitochondries (Tacar et al 2013) (Danesi et al 2002). De plus, il existe une faible biotransformation de la doxorubicine en doxorubicinol. Cette biotransformation a lieu dans le foie et est réalisée par les carbonylreductases 1 et 3. La doxorubicine et le doxorubicinol sont métabolisés en doxorubicinone et doxorubicinolone. Ces deux métabolites peuvent être réduits en structures aglycones : 7-deoxydoxorubicinone et 7-déoxydoxorubicinolone qui sont excrétés après conjugaison avec l’acide glucuronique ou sulphonique. Les aglycones de doxorubicine sont très transitoires. En effet, ces métabolites ont été détectés dans les liquides biologiques de seulement quelques patients traités à la doxorubicine et à des concentrations très faibles (en comparaison avec le doxorubicinol et la doxorubine) (Lal et al 2010). La demi-vie terminale de la doxorubicine est de 24 à 36 heures, suggérant qu’elle prend beaucoup plus de temps pour s’éliminer que pour pénétrer dans les tissus (Tacar et al 2013). 1-3) Poison des topoisomérases II (figur e 28) Les topoisomérases II (topo2) sont des enzymes nucléaires qui suppriment les contraintes de torsion de l’ADN, permettant le bon déroulement de la réplication, de la transcription et de la ségrégation chromosomique. Ce rôle essentiel repose sur la capacité de la topoisomérase II à réaliser des cassures double-brin afin de supprimer les super-enroulements de l’ADN, puis à assurer le passage d’une autre molécule d’ADN à travers la coupure et à réaliser la religature des brins (Nitiss 2009a). Il existe deux isoformes de la topoisomérase II chez les mammifères : topo2α (exprimée préférentiellement dans les cellules qui prolifèrent) et topo2β (ubiquitaire) (Lansiaux and Pourquier 2011). Les topoisomérases II sont des enzymes homodimériques, qui réalisent une cassure double-brin dans un brin d’ADN (appelé segment G (pour Gate)) et vont passer le second brin (appelé segment T (pour Transported)) à travers la cassure. Brièvement, en présence de Mg2+, chaque unité de la topo2 se lie à chaque brin de l’ADN du fragment G, par une liaison phosphotyrosine covalente, provoquant une cassure double-brin. En présence d’ATP, l’enzyme change de conformation et adopte une forme de « pince fermée », 90 permettant la capture de l’autre brin d’ADN (le segment T), qui peut ainsi passer à travers la cassure du segment G et sera libéré de la topo2. Le segment G est religaturé et la pince s’ouvre, libérant le segment G intact (figure 26) (Nitiss 2009b). La doxorubicine est un poison des topoisomérases II α et β. Elle peut bloquer la réaction catalytique de la topo2 à deux étapes différentes. A faible concentration, la doxorubicine bloque la religature de l’ADN. En fait, elle stabilise la réaction intermédiaire (normalement transitoire), où les brins d’ADN sont coupés et liés de manière covalente aux résidus tyrosine de la topo2. Un complexe ternaire anthracycline-topo2-ADN est ainsi formé et stabilisé. Le complexe induit l’accumulation de cassures simple et double-brin, formant d’importants dommages à l’ADN et la mort cellulaire (Cortes-Funes and Coronado 2007). A forte concentration, la doxorubicine interfère avec la liaison initiale entre l’ADN et la topo2, empêchant la formation du complexe clivable et générant des cassures et la mort cellulaire (figure 26) (Pommier et al 2010). 1-4) Rôle des radicaux libr es (figur e 28) Un des mécanismes de la doxorubicine, à l’origine de son rôle anti-tumoral et de sa toxicité notamment cardiaque est la génération de ROS (Reactive Oxygen Species). La structure quinone de la doxorubicine lui permet d’agir comme accepteur d’électrons, via des réactions d’oxydoréduction impliquant la cytochrome P450 réductase, la NADH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) déshydrogénase et la xanthine oxydase. L’addition d’électrons à la structure quinone de la doxorubicine la convertit en structure semiquinone. Cette réaction est suivie d’une oxydation spontanée à l’origine de la quinone de base et des anions superoxydes. Ces anions superoxydes donnent naissance à des peroxydes d’hydrogène ; réaction catalysée par la superoxyde dismutase (figure 27) (Jamieson and Boddy 2011). Une des conséquences de la génération intra-cellulaire de ROS est d’induire des dommages à l’ADN et la mort cellulaire. De plus, les ROS peuvent entraîner la peroxydation des lipides des membranes (Gewirtz 1999). En effet, durant le cycle d’oxydoréduction, la semiquinone peut s’oxyder en aglycone, très soluble dans les lipides. Ainsi, l’aglycone peut s’intercaler dans les membranes biologiques et former des ROS, à l’origine de la fragilisation des membranes et de la mort cellulaire. Chimiquement, la structure de la doxorubicine et des autres anthracyclines permet la génération de ROS. Cependant, les études qui ont mis en évidence ce mécanisme d’action se placent souvent à des doses supracliniques. Dans les cas où la doxorubicine est utilisée à des doses cliniques, on observe une longue phase de latence entre l’administration de la drogue et la détection de H 2O2 (Gewirtz 1999). 91 Figure 26. Mécanismes d’inhibition de la toposiomérase II par la doxorubicine. (a) Réactions schématiques catalysées par la topo2 : décaténation et relaxation de l’ADN superenroulé. (b) La topoisomérase II réalise une cassure double-brin dans un brin d’ADN (appelé segment G (pour Gate)), et passe le second brin (appelé segment T (pour Transported)) à travers la cassure. La doxorubicine peut bloquer la réaction catalytique de la topo2 à deux étapes différentes. A faible concentration, la doxorubicine bloque la religature de l’ADN, en stabilisant le complexe clivable composé de la topo2 et de l’ADN coupé. Puis cela entraîne des dommages à l’ADN et la mort cellulaire. A forte concentration, la doxorubicine interfère avec la liaison initiale entre l’ADN et la topo2, empêchant la formation du complexe clivable (d’après (Nitiss 2009a) (Pommier et al 2010)). Figure 27. Formation de ROS par la doxorubicine. En présence de NADH, la structure quinone de la doxorubicine peut être oxydée en structure semiquinone par les enzymes NOS (Nitrite oxyde synthase) et XDH (Xanthine deshydrogénase). Puis une oxydation spontanée par l’oxygène reforme la quinone de base et des anions superoxydes, qui peuvent former H2O2 (d’après (Jamieson and Boddy 2011)). 92 1-5) For mation d’adduits et de pontages à l’ADN (figur e 2 8) De par ses propriétés intercalantes, la doxorubicine est capable de former des liaisons covalentes avec l’ADN, mais elle aurait aussi la capacité à se lier à l’ADN mitochondrial (Tacar et al 2013). Elle forme des pontages très stables entre les molécules d’ADN et également des adduits à l’ADN. La doxorubicine s’intercale préférentiellement entre les bases de l’ADN Guanine et Cytosine adjacentes. La formation d’adduits doxorubicine-ADN peut activer, en aval, les réponses de dommages à l’ADN et l’apoptose (Yang et al 2014). Cependant, ces mécanismes impliquent des doses élevées de doxorubicine (Gewirtz 1999) (Minotti et al 2004). De plus, après réactions radicalaires, médiées par le fer, les anthracyclines produisent des formaldéhydes, à partir de carbone ou de lipides. La doxorubicine réagit avec le formaldéhyde généré pour former un intermédiaire appelé DOX-FORM. De manière intéressante, ce conjugué est capable de s’intercaler dans l’ADN, par liaison covalente très stable (formation d’une base de Schiff) (Minotti et al 2004). La formation de DOX-FORM renforce de manière importante la toxicité induite par la doxorubicine (Taatjes and Koch 2001). Des études ont montré que des niveaux élevés de DOX-FORM étaient détectés dans les cellules tumorales sensibles à la doxorubicine et non dans des cellules tumorales résistantes ou des cellules normales (Kato et al 2001). Cependant, la formation d’adduits à l’ADN ne semble pas être le mécanisme majeur de la doxorubicine. En effet, un traitement à la doxorubicine aux doses cliniques entraîne seulement la formation de 4.4 +/- 1 adduits sur 107 paires de bases de l’ADN (Coldwell et al 2008). 1-6) Libération de céramide (figur e 28) Le céramide est une molécule lipidique, impliquée dans une variété de processus cellulaires, tels que l’apoptose, la senescence et l’inhibition de la prolifération. De manière intéressante, un traitement des cellules tumorales sensibles à la doxorubicine induit une augmentation de céramide. Cette augmentation n’est pas retrouvée dans les cellules tumorales résistantes, suggérant que la quantité de céramide peut jouer un rôle sur la chimiorésistance (Liu et al 2001). Ainsi, la doxorubicine bloque la prolifération cellulaire en stimulant la synthèse du céramide et donc l’apoptose. Des études récentes ont suggéré que la doxorubicine favorise la synthèse du céramide en augmentant la protéolyse de la protéine membranaire CREB3L1 (Cyclic AMP-responsive Element-Binding protein 3-Like protein 1), localisée au niveau des membranes du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi. La protéolyse de CREB3L1 libère son domaine amino-terminal, qui peut transloquer au noyau et inhiber la prolifération cellulaire. De manière intéressante, la production de céramide par la doxorubicine peut induire cette protéolyse. Le niveau d’expression de CREB3L1 est également associé à la sensibilité à la doxorubicine (Denard et al 2012). Pour conclure, le ciblage du céramide par la doxorubicine représente un mécanisme d’action moins connu, mais qui joue un rôle non négligeable dans la cytotoxicité de la doxorubicine. 93 Figure 28. Résumé des mécanismes d’action cytotoxiques de la doxorubicine. La doxorubicine rentre majoritairement par voie passive dans la cellule. Dans le noyau, elle peut s’intercaler dans l’ADN et inhiber la topoisomérase II, ce qui crée des dommages à l’ADN et la mort cellulaire. La doxorubicine peut être oxydée en structure semiquinone dans la mitochondrie et générer des ROS, par retour à la forme quinone initiale. Les ROS induisent des dommages à l’ADN, la péroxydation des lipides et la mort cellulaire. Enfin la doxorubicine favorise la synthèse de céramide, qui va induire la protéolyse de CREB3L1 membranaire. CREB3L1 peut transloquer au noyau et favoriser la transcription de gènes cibles comme p21, aboutissant à l’arrêt du cycle et la mort cellulaire. 2) Les mécanismes de résistance de la doxorubicine 2-1) Généralités En dépit des multiples mécanismes d’action de la doxorubicine convergeant vers la mort des cellules tumorales, l’apparition de résistance est fréquemment observée. A l’échelle cellulaire, la résistance thérapeutique est définie par la capacité des cellules tumorales à survivre et à proliférer après un traitement anti-tumoral. On appelle multi-résistance ou MDR (Multidrug Resistance), le fait que les cellules tumorales développent une résistance à différentes molécules non reliées structurellement et présentant des mécanismes d’action différents. Décrit pour la première fois en 1970, ce phénotype est majoritairement responsable de l’échec thérapeutique anti-tumoral dans la plupart des cancers (Stavrovskaya 2000). La résistance peut provenir des cellules tumorales elles-mêmes ou bien du microenvironnement tumoral. Les cellules tumorales résistent aux traitements par le biais de plusieurs 94 mécanismes. Les mécanismes de résistance sont divisés en deux catégories : la résistance intrinsèque et la résistance acquise. La résistance intrinsèque se développe dès le premier contact avec l’agent anti-cancéreux et suggère la présence initiale de facteurs entravant l’action cytotoxique de la chimiothérapie. La résistance acquise se développe durant le traitement des tumeurs, initialement sensibles à la chimiothérapie. Ce type de résistance est souvent associé au développement de mécanismes adaptatifs durant le traitement, comme une modification de l’expression de la cible thérapeutique ou l’activation de voies de signalisation compensatoires (Holohan et al 2013). En fait, suite à l’induction d’un stress, tel qu’un traitement par un agent anti-cancéreux, la cellule tumorale met en place des mécanismes de défense, afin de limiter la cytotoxicité liée à la drogue, ce qui favorise la résistance. De plus, les tumeurs contiennent un degré d’hétérogénéité moléculaire et cellulaire élevé, suggérant que la chimiorésistance peut favoriser la sélection d’une sous-population minoritaire résistante (Swanton 2012). De manière intéressante, certains mécanismes de résistance de la doxorubicine peuvent être communs à d’autres drogues. Parmi les mécanismes les plus retrouvés, on distingue une modification de la disponibilité intra-tumorale du médicament, une altération de la cible de la drogue, une augmentation des mécanismes de réparation des dommages à l’ADN, une dérégulation des systèmes de mort cellulaire, une activation de facteurs favorisant la survie cellulaire et l’EMT (Holohan et al 2013). 2-2) Modification de la disponibilité intra -tumorale du médicament (figur e 29) L’altération de la disponibilité de la drogue représente la première ligne de défense de la cellule tumorale, en empêchant son entrée dans la cellule (influx), en favorisant sa sortie (efflux) ou en la métabolisant. Ces trois mécanismes peuvent fonctionner indépendamment ou en synergie. Les mécanismes d’efflux ont un rôle très important dans les mécanismes de résistance et plus particulièrement dans la résistance à la doxorubicine. L’efflux nous a particulièrement intéressés lors de mes travaux de thèse et les différents mécanismes d’efflux seront détaillés dans la partie suivante. a) L’influx La famille des protéines SLC (Solute carrier) est constituée de transporteurs membranaires dont leur fonction principale est l’entrée intra-cellulaire de différents substrats, tels que des métaux, des cations organiques, des anions, des phosphates, des sucres, des acides aminés, des acides monocarboxyliques, des oligopeptides, des nucléosides et des vitamines hydrosolubles. Ces transporteurs sont impliqués dans l’influx de drogues hydrosolubles et de petites molécules, telles que les sels de platine et le méthotrexate (Januchowski et al 2013) (Lal et al 2010). Une diminution de l’expression des transporteurs SLC a été associée à une chimiorésistance (Januchowski et al 2013) (Huang and Sadee 2006). De par sa structure plutôt hydrophobe, la doxorubicine a la capacité à traverser les membranes et rentre dans la cellule majoritairement par voie passive (Huang and Sadee 2006). Cependant, le 95 transporteur SLC22A16, responsable de l’influx de cations organiques, a la capacité à prendre en charge la doxorubicine. Quelques études ont mis en évidence que ce transporteur peut influencer la chimiosensibilité et la chimiorésistance des cellules à la doxorubicine. En effet, une transfection stable de SLC22A16 dans des cellules leucémiques Jurkat confère une sensibilité plus importante des cellules à la doxorubicine (Bray et al 2010). De manière intéressante, une étude clinique a révélé qu’un polymorphisme génétique sur le transporteur SLC22A16 est associé à la réponse au traitement AC (doxorubicine-cyclophosphamide) des cancers du sein (Bray et al 2010). Cependant, de par la lipophilie de la doxorubicine, l’influx n’exerce qu’un rôle minoritaire dans sa résistance. b) La métabolisation de la drogue La métabolisation d’une drogue est un processus physiologique qui permet l’inactivation et l’élimination de cette drogue. Ainsi, une augmentation de la métabolisation d’un agent anti-cancéreux peut entraîner son inefficacité et donc une résistance. Plusieurs enzymes sont impliquées dans ce processus, telles que le cytochrome P450, les carbonylreductases, les aldéhydes déshydrogénases et les enzymes de détoxification des ROS (les glutathion S-transférases (GST), le glutathion (GSH), la superoxyde dismutase (SOD), la catalase et la glutathion péroxydase) (Jamieson and Boddy 2011). - Les carbonylreductases. Ce sont des enzymes ubiquitaires, cytosoliques, qui catalysent la réduction de différents substrats, tels que des aldéhydes, des cétones, des quinones et autres xénobiotiques. Elles ont un rôle dans la détoxification de drogues, dans le métabolisme cellulaire, dans la transduction du signal et dans l’apoptose. Les carbonylreductases 1 et 3 (CBR1 et 3) métabolisent la doxorubicine en doxorubicinol, moins cytotoxique que la doxorubicine (Rosemond and Walsh 2004). Une étude a mis en évidence qu’un traitement de la lignée tumorale mammaire MCF-7 à de faibles doses de doxorubicine, induit une augmentation de CBR1 ; processus accompagné d’une diminution intracellulaire de la doxorubicine. Ces données suggèrent que les cellules tumorales peuvent promouvoir le métabolisme inactivateur de la doxorubicine, dans un but de détoxification (Gavelova et al 2008). D’autre part, il existe des polymorphismes génétiques de ces enzymes, ce qui peut avoir un rôle potentiel dans la résistance à la doxorubicine, mais ces processus n’ont pas été bien caractérisés dans le contexte de la chimiorésistance (Jamieson and Boddy 2011) (Thorn et al 2011). - Métabolisation des ROS. Un des mécanismes d’action de la doxorubicine est de former des ROS. Ce processus est généré par différentes enzymes, telles que la xanthine deshydrogénase, la NAD(P)H oxydase et l’oxyde nitrique synthase (NOS) (Jamieson and Boddy 2011). D’autres enzymes sont impliquées dans la détoxification des ROS, telles que la superoxyde dismutase (SOD), la catalase, la glutathion peroxydase et la glutathion S-transferase (GST). Il existe des polymorphismes génétiques de la NOS et de la SOD, associés à la réponse à la chimiothérapie. Par exemple, un polymorphisme de la SOD2 est associé à un mauvais pronostic de patients atteints d’un cancer du sein traités par doxorubicine. Mais cet effet n’est pas retrouvé pour les patients traités par une autre chimiothérapie 96 (Glynn et al 2009). Une étape clé de l’inactivation cellulaire des xénobiotiques est l’enzyme GST, qui permet la conjugaison de la drogue avec le glutathion (GSH). Ainsi les médicaments, notamment les sels de platine (cisplatine, oxaliplatine) et le cyclophosphamide, se lient de manière covalente au GSH. Certaines pompes d’efflux, telles que le transporteur ABCC1, peuvent reconnaître les drogues associées au GSH et favoriser ainsi leur expulsion de la cellule (Coley 2008). On a ainsi pu observer des surexpressions de GSH et GST dans des lignées tumorales résistantes à la doxorubicine (O'Brien et al 2000). 2-3) Modifications de la topoisomérase II (figur e 29) La sensibilité des drogues peut être affectée par des altérations de leur cible, comme des mutations, des modifications post-traductionnelles ou des changements de leur niveau d’expression. Le mécanisme d’action primaire de la doxorubicine est de bloquer l’action de la topoisomérase II. Il existe une corrélation entre le niveau d’expression de la topo2 et la sensibilité aux anthracyclines. Les études in vitro et in vivo ont montré une plus forte sensibilité des cellules qui surexpriment l’enzyme et une résistance des cellules dans lesquelles elle est réprimée, mais ce processus n’a pas été bien caractérisé dans les études cliniques (Beck et al 1993) (Burgess et al 2008). De manière intéressante, une association est apparue entre l’amplification de l’oncogène HER2 et le pronostic des patientes atteintes de cancers du sein, traitées par une chimiothérapie à base d’anthracyclines. En effet, le gène codant pour la topo2α est associé au gène HER2 par sa localisation sur le chromosome 17. Ainsi, une co-amplification de ces deux gènes est fréquemment retrouvée en clinique. Ce type de tumeurs serait plus sensible aux régimes de chimiothérapie à base d’anthracyclines, que les tumeurs HER2+ uniquement (Park et al 2003). Une corrélation clinique entre l’expression de TIMP-1 (Tissue inhibitor metalloproteinase – 1) et HER2 ou topo2 a également été suggérée. Un profil HT (HER2 amplifié et/ou TIMP-1 négatif) ou 2T (topo2α aberrant et/ou TIMP-1 négatif) sur des tumeurs mammaires serait associé à un bon pronostic en terme de mortalité (mais pas en terme de survie sans maladie) pour des patientes traitées par chimiothérapie à base d’anthracyclines (Ganapathi and Ganapathi 2013) (Ejlertsen et al 2010) (Hertel et al 2012). Généralement, les cellules présentant des mutations de la topo2 et donc une moindre réponse à la doxorubicine, sont également moins sensibles aux autres chimiothérapies ciblant la topo2, tels que l’étoposide (VP-16) et les épipodophyllotoxines (Coley 2008). De plus, des mutations ponctuelles de la topo2 ont été trouvées dans des lignées résistantes à la doxorubicine. Cependant, le rôle fonctionnel de ces formes mutées est controversé car elles n’ont généralement pas été observées chez les patients présentant des tumeurs résistantes (Ganapathi and Ganapathi 2013). D’autres facteurs peuvent influencer la formation de complexes covalents ADNtopo2, comme les modifications post-traductionnelles de la topo2 (ubiquitination, sumoylation, phosphorylation) et les interactions avec d’autres protéines qui modulent son activité enzymatique (Ganapathi and Ganapathi 2013). L’ensemble de ces données suggère que les modifications de la 97 topoisomérase II peuvent avoir un rôle important dans la résistance à la doxorubicine et également aux autres poisons de la topo2 (étoposide, épipodophyllotoxines) mais ce processus ne peut pas expliquer la résistance à d’autres agents anti-cancéreux ayant des mécanismes d’action différents. 2-4) La réparation des dommages à l’ADN (figur e 29). La doxorubicine induit des dommages à l’ADN, de par son intercalation à l’ADN, son inhibition de la topo2 et la production de ROS. Les réponses cellulaires associées à la production de dommages à l’ADN sont la réparation et la mort cellulaire si les dommages sont trop conséquents. Il existe différents systèmes de réparation des dommages à l’ADN en fonction du type de lésion et de la phase du cycle où se trouvent les cellules tumorales. On distingue : la MMR (Mismatch Repair), la NER (Nucleotide Excision Repair), la BER (Base Excision Repair), la HR (Homologous Recombination), l’ICL (Interstrand Crossling) et la NHEJ (Non-Homologous End-Joining) (Bouwman and Jonkers 2012). La doxorubicine induit des cassures double-brin de l’ADN ou DSBs (DNA double strand breaks), qui sont les lésions de l’ADN les plus cytotoxiques et sont essentiellement réparées par HR et NHEJ (Asakawa et al 2010). La capacité de réponse aux dommages ou DDR (DNA Damage Repair) a une influence majeure sur l’efficacité des chimiothérapies ciblant l’ADN. Les différentes altérations de la DDR peuvent avoir des conséquences similaires. En effet, une augmentation de la DDR permet à la cellule de mieux « réparer » les lésions induites par la drogue et donc d’inhiber son action. A l’inverse, une déficience dans les mécanismes de réparation confère une chimiosensibilité aux traitements, mais en même temps génère une instabilité génomique, à l’origine de l’accumulation d’altérations génétiques supplémentaires en faveur d’une résistance aux traitements et à la progression de la tumeur (Bouwman and Jonkers 2012). Par exemple, des études ont mis en évidence qu’une augmentation de la DDR (par recombinaison homologue) est associée à des tumeurs mammaires plus résistantes au traitement néoadjuvant EC (Epirubicine-Cyclophosphamide) (Asakawa et al 2010). Cependant, des mutations sur BRCA1 entraînent une diminution de la réparation par recombinaison homologue, qui mène à une instabilité génomique et à une chimiorésistance (Coley 2008). De la même manière, une déficience dans la MMR a également été associée à une résistance aux anthracyclines mais pas aux taxanes, via l’accumulation d’altérations génétiques (Fedier et al 2001). Au final, les dommages à l’ADN induisent un arrêt du cycle cellulaire, afin de laisser le temps nécessaire aux cellules d’initier les mécanismes de réparation de l’ADN. Dans certains cancers, la régulation de l’arrêt du cycle cellulaire est altérée, liée à la surexpression d’oncogène ou la diminution de gènes suppresseurs de tumeurs. Par exemple, des mutations de p53 qui est un régulateur important de nombreux « points de contrôle » (checkpoint) du cycle cellulaire, peuvent altérer la DDR. P53 est aussi impliqué dans l’apoptose et sa mutation est fréquemment associée à une résistance aux drogues (voir sous-partie suivante) (Holohan et al 2013). 98 2-5) Echappement à la mort cellulair e (figur e 29) Outre l’efficacité de leur système de réparation, les cellules tumorales peuvent également résister aux chimiothérapies en échappant à la mort induite par le traitement. Les principaux types de mort cellulaire induits par la doxorubicine sont l’apoptose, l’autophagie et la nécrose. Ces différents types de mort cellulaire sont spécifiquement induits en fonction de la concentration de doxorubicine délivrée, la durée de traitement et le type de cancer (Tacar et al 2013). L’apoptose est la mort qui est majoritairement associée à des traitements induisant des dommages à l’ADN. L’inhibition de facteurs pro-apoptotiques (Bax, Bad, Bid) ou l’activation de facteurs anti-apoptotiques (Bcl-xL, Bcl-2) sont le plus souvent responsables d’une résistance à l’apoptose et donc à une résistance aux chimiothérapies (Holohan et al 2013). Parmi les gènes qui influencent la réponse apoptotique, p53 et Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) ont un rôle crucial (Perego et al 2001). P53, qui est un régulateur important du cycle cellulaire est activé en réponse aux dommages à l’ADN et permet l’induction de l’apoptose. Il est muté dans environ 50% des cas et sa mutation est étroitement liée à une résistance aux drogues (Chuthapisith et al 2006). Par exemple, une étude réalisée par Geisler et al. a mis en évidence dans des tumeurs mammaires, qu’une mutation sur p53 est corrélée à une résistance à la doxorubicine (Geisler et al 2001). Les protéines anti-apoptotiques inhibent l’insertion des protéines pro-apoptotiques dans la membrane mitochondriale nécessaire à la libération du cytochrome c ; processus important dans l’induction de l’apoptose. La doxorubicine est également capable de diminuer l’expression de Bcl-2, ce qui suggère l’importance de ce facteur dans l’induction de la mort induite par la doxorubicine et donc son implication potentielle dans les mécanismes de résistance (Tacar et al 2013). Comme décrite dans le paragraphe sur les mécanismes d’action de la doxorubicine, une des fonctions cytotoxiques de la doxorubicine est de cibler la production de céramide. Une modification de ce lipide peut également promouvoir la chimiorésistance. Suite à un traitement à la doxorubicine, une augmentation du céramide, pro-apoptotique, est observée. L’induction du céramide augmente également la GCS (Glucosylceramide synthase), qui permet la conversion du céramide vers sa forme glucosylée. Ce processus permet à la cellule d’enclencher une réponse adaptative face au stress et donc une chimiorésistance. Le mécanisme précis, qui permet le switch de la signalisation pro-apoptotique, via le céramide, vers une signalisation anti-apoptotique est encore mal connu (Liu et al 2008). L’autophagie est un processus de dégradation lysosomale, qui permet la dégradation des organelles cellulaires et des protéines, dans le but de maintenir la biosynthèse et la viabilité cellulaire lors d’un stress métabolique (Holohan et al 2013). Cependant, le rôle de l’autophagie dans le cancer est paradoxal : en effet, elle exerce, d’une part, un rôle suppresseur de tumeurs mais, d’autre part, favorise la résistance aux drogues, en facilitant la survie cellulaire durant un stress métabolique (Holohan et al 2013). Des études suggèrent que la doxorubicine est capable d’induire l’autophagie. Une étude a montré que l’inhibition de l’autophagie et de HMGB1 ((High mobility group box 1), qui possède un 99 rôle dans la réplication ainsi que la réparation de l’ADN et dans la régulation de l’autophagie), augmente la chimiosensibilité à la doxorubicine de cellules d’ostéosarcomes in vitro et in vivo (Huang et al 2012). 2-6) La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) Des études récentes ont établi un lien entre l’EMT et la chimiorésistance (Holohan et al 2013). Pour rappel, l’EMT est la transition d’une cellule épithéliale, qui présente une organisation polarisée et des jonctions cellule-cellule, vers un phénotype mésenchymateux plus agressif, associé à une augmentation des capacités migratoires et invasives (voir partie I). Afin de résister aux drogues, les cellules tumorales peuvent réaliser une EMT comme moyen de défense contre les agents anticancéreux. En effet, l’apparition progressive d’une résistance a été associée à un switch vers un phénotype d’EMT. De manière intéressante, ces cellules possèdent également des marqueurs de CSCs (cellules souches cancéreuses) (Housman et al 2014) (Holohan et al 2013). Ce type de processus a été notamment décrit après un traitement à la doxorubicine et a été associé à une multi-résistance (MDR) (Tsou et al 2015). De nombreux médiateurs sont à l’origine de ce phénomène, tels que des micro-ARN (miRNA), le récepteur au TGF-β et des modifications épigénétiques (Housman et al 2014) (Han et al 2014) (Jiang et al 2014). De manière intéressante, les cellules stromales peuvent exercer un rôle de support dans l’induction et le maintien de l’EMT induite par la chimiothérapie, permettant ainsi une chimiorésistance qui perdure dans le temps (voir partie I) (Housman et al 2014). 100 Figure 29. Résumé des mécanismes intra-cellulaires de résistance à la doxorubicine. Les cellules tumorales peuvent diminuer la quantité intra-cellulaire de doxorubicine, en 1) favorisant sa sortie, via un mécanisme d’efflux, en diminuant son entrée, via les pompes d’influx, et 2) en favorisant sa métabolisation et la détoxification des ROS qu’elle produit. 3) La topoisomérase peut également être modifiée, ce qui empêche l’action de la doxorubicine. 4) Une augmentation / altération des mécanismes de réparation des dommages à l’ADN peut également avoir lieu et enfin 5) des mécanismes d’échappement à la mort cellulaire peuvent se produire. DOX pour doxorubicine, GCS pour glucosylcéramide synthase, SOD pour superoxyde dismutase, CAT pour catalase, GST pour glutathion-S transferase. 3) Mécanismes d’efflux de la doxorubicine Comme mentionné précédemment, le phénotype de multi-résistance est classiquement défini par le fait que les cellules tumorales sont ou deviennent résistantes simultanément à différents médicaments antinéoplasiques qui ne possèdent pas la même structure ni les mêmes cibles thérapeutiques. Les premiers mécanismes qui ont décrit ce phénotype ont été associés à une surexpression des pompes d’efflux, telles que les transporteurs ABC. Cependant, il est maintenant clair que le processus de multirésistance est multifactoriel. Une augmentation des voies anti-apoptotiques et des mécanismes de détoxification peuvent avoir des conséquences générales sur plusieurs molécules chimiothérapeutiques. De plus, d’autres processus, tels que la séquestration de la drogue dans des 101 vésicules ou bien la surexpression de protéines impliquées dans l’efflux nucléaire, telles que la MVP / LRP (Major Vault Protein / Lung Resistance Protein) peuvent expliquer l’efflux de nombreuses thérapies (Larsen et al 2000). 3-1) Les transporteurs ABC L’implication de la famille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) figure parmi les mécanismes de multi-résistance les plus connus car ils représentent la première ligne de défense de la cellule. De plus, ces protéines constituent un des mécanismes de résistance prédominants de la doxorubicine (Kathawala et al 2015). a) Généralités La superfamille des transporteurs ABC représente l’une des plus grandes familles de protéines, tant par leur nombre que par leurs fonctions biologiques. Ce sont des protéines membranaires, présentes sur les membranes plasmiques et sur les membranes des organelles intra-cellulaires. Leur fonction principale est le transport unidirectionnel de substrats à travers la membrane plasmique, contre un gradient de concentration ; on les appelle également « pompes d’efflux » (Kathawala et al 2015). Ces transporteurs peuvent prendre en charge une grande variété de substrats, tels que des sucres, des acides aminés, des drogues hydrophobes, des antibiotiques, des lipides, des stérols, des sels biliaires, des peptides, des nucléotides, des métabolites endogènes et des ions (Sharom 2008). Actuellement chez l’Homme, 49 membres de la famille des transporteurs ABC ont été isolés et identifiés, répartis dans 7 sous-familles de ABCA à ABCG, caractérisées par la nature du substrat transporté. Il est à noter qu’une petite partie des protéines ABC est composée de protéines solubles qui ne font pas partie des transporteurs membranaires. Les transporteurs ABC présentent une grande conservation dans leur séquence et dans leur organisation structurale. Une protéine est classée en tant que membre de la famille ABC lorsqu’elle possède un domaine ATP-binding cassette. Ces domaines sont distinctifs et conservés au sein de la famille des transporteurs ABC. L’unité fonctionnelle d’un ABC transporteur entier comprend 2 domaines transmembranaires ou TMD (Transmembrane Domains), qui forment un pore permettant la fixation et le passage du substrat et 2 domaines cytoplasmiques appelés NBD (Nucleotide-Binding Domains) ou ATP-binding domains, qui permettent de lier et d’hydrolyser l’ATP (Schneider and Hunke 1998) (figure 30). Les protéines de la sous-famille ABCC possèdent un domaine transmembranaire supplémentaire en N-terminal, dont la fonction est actuellement inconnue. Il existe également des demi-transporteurs, tels qu’ABCG2 (encore appelé BCRP pour Breast Cancer Resistance Protein), qui possède uniquement un domaine TMD et un domaine NBD. ABCG2 a également la particularité d’avoir une structure inversée : le NBD est positionné du côté N-terminal. Pour former un transporteur actif, ABCG2 devra être associé sous forme d’homo- ou hétéro-dimères (figure 30) (Scotto 2003) (Sharom 2008). 102 Un des modèles proposés expliquant le mécanisme de transport des protéines ABC a été appelé « ATP switch model » ; il nécessite 7 étapes successives. Initialement sous forme « ouverte », le transporteur peut accueillir un substrat qui se fixe sur les TMD. Cette fixation permet l’initiation du cycle et induit un changement conformationnel qui rapproche les 2 domaines NBD, permettant ainsi la fixation de 2 molécules d’ATP : le transporteur passe alors sous forme « fermée ». La liaison de l’ATP provoque un nouveau changement conformationnel, propice à l’expulsion du substrat dans le compartiment opposé. Les deux molécules d’ATP sont hydrolysées successivement, ce qui déstabilise le dimère de NBD et provoque la libération de l’ADP et du Pi (phosphate inorganique). Le transporteur retrouve alors sa forme « ouverte », prêt à accueillir un nouveau substrat (Higgins and Linton 2004). Figure 30. Structure des principaux transporteurs ABC. (a) ABCB1 (MDR1) possède 2 domaines transmembranaires (TMD) et 2 domaines NBD. (b) ABCC1 (MRP1) possède 3 TMD et 2 NBD. Le TMD supplémentaire est orienté du côté N-terminal. (c) ABCG2 (BCRP) est un demi-transporteur ; il possède 1 TMD et 1 NBD. Il doit être dimérisé pour être actif (d’après (Scotto 2003)). b) Transporteurs ABC et multi-résistance La plupart des transporteurs ABC ont un rôle de protection des cellules contre des molécules endogènes toxiques et contre des xéniobiotiques, en favorisant leur expulsion. La surexpression de 103 certains transporteurs ABC dans les tumeurs a été étroitement corrélée à une résistance croisée à différentes molécules anti-néoplasiques. Ce processus peut être intrinsèque donc observé avant l’initiation du traitement ou bien acquis, c’est-à-dire qu’un traitement peut, en lui-même, initier la surexpression des protéines ABC dans les tumeurs (Videira et al 2014). De plus, des polymorphismes génétiques de ces transporteurs existent, ce qui peut expliquer les différences de chimiosensibilité au sein des populations (Sharom 2008) (Jamieson and Boddy 2011). Parmi les transporteurs ABC, ABCB1, ainsi que les transporteurs de la sous-famille ABCC et ABCG2 ont été particulièrement étudiés dans ce processus de chimiorésistance et seront décrits dans les parties suivantes. Cependant, parmi les 49 transporteurs ABC identifiés, 16 ont été associés à la chimiorésistance (Fletcher et al 2010) (figure 31). La doxorubicine est connue pour être un substrat de plusieurs transporteurs : ABCB1, quelques ABCCs et ABCG2 et également d’autres transporteurs ABC, tels qu’ABCA3, ABCB4, ABCB5 et ABCD8 (Jamieson and Boddy 2011) (Lal et al 2010). De manière intéressante, d’autres chimiothérapies majeures, telles que les taxanes, ont également été décrites comme étant substrats des transporteurs ABC (Holohan et al 2013). Les taxanes (paclitaxel et docétaxel) sont des molécules naturelles, dont le mécanisme d’action principal est la stabilisation du réseau de microtubules, ce qui induit un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose (McGrogan et al 2008). c) La glycoprotéine P Découverte en 1976 par Juliano et Ling, la glycoprotéine P, encore appelée P-gp, MDR-1 (Multidrug Resistance-1) ou ABCB1 a été le premier transporteur ABC identifié et demeure la pompe d’efflux la plus étudiée dans les mécanismes de multi-résistance (Juliano and Ling 1976). Elle est le produit du gène MDR-1, localisé sur le chromosome 7. Elle comprend 2 TMD et 2 NBD, répartis en 12 domaines transmembranaires (figures 30 et 32). Physiologiquement, la P-gp est majoritairement exprimée dans les tissus excréteurs, au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales et des cellules endothéliales (Videira et al 2014). Elle agit comme une pompe d’efflux des xénobiotiques dans plusieurs tissus, tels que les intestins, le foie, le rein, le placenta et la barrière hémato-encéphalique (Chuthapisith et al 2006) (Videira et al 2014). La P-gp transporte une variété de substrats neutres ou cationiques, de nature modérément lipophile. Sa surexpression a été associée à la résistance aux anthracyclines (doxorubicine, daunorubicine, épirubicine, mitoxanthrone), aux vinca-alcaloïdes (vinblastine, vincristine), aux taxanes (paclitaxel, docetaxel), aux épipodophyllotoxines (étoposide, ténoposide), aux camptothécines (topotecan), aux anti-métabolites (cytarabine), aux acridines (amsacrine), aux anthracènes (bisantrène), aux antibiotiques (actinomycine D) et ainsi qu’aux inhibiteurs de tyrosine kinase (Imatinib, nilotinib, erlotinib) (Chuthapisith et al 2006) (Kathawala et al 2015) (Sharom 2008) (Coley 2008). La P-gp est surexprimée dans de nombreuses tumeurs et son expression peut également être induite par différentes chimiothérapies. Ainsi, la P-gp a été associée à l’échec thérapeutique dans plusieurs cancers, tels que le cancer du rein, du côlon, du foie, du sein, de l’ovaire, de la tête et du cou, les leucémies et les lymphomes (Holohan et al 2013) (Chuthapisith et al 104 2006). Une étude portant sur plus de 400 tumeurs de côlon, du rein, du pancréas, de l’ovaire et du foie a montré que les tumeurs présentant une augmentation de l’expression de MDR-1 tendent à être plus résistantes à la chimiothérapie (Goldstein et al 1989). Figure 31. Liste des transporteurs ABC impliqués dans la chimiorésistance et leurs principaux substrats. ABC : ATP Binding Cassette, cAMP : cyclic AMP, cGMP : cyclic GMP, LT : leukotriene, ND : Not Determined, PAF : platelet activation factor, PG : prostaglandin, S1P : sphingosine-1phosphate, TX : thromboxane (d’après (Fletcher et al 2010)). 105 Figure 32. Structure de la glycoprotéine P (d’après (Fojo and Coley 2007)). Une méta-analyse réalisée par Trock et al. a mis en évidence que 41.2% des tumeurs mammaires surexpriment la P-gp et que cette surexpression est associée à des tumeurs 3 fois plus résistantes au traitement. De manière intéressante, une exposition aux chimiothérapies ou aux hormonothérapies augmente de 1.8 la proportion de tumeurs exprimant la P-gp (Clarke et al 2005) (Trock et al 1997). Certaines protéines peuvent être co-exprimées avec la P-gp comme la cyclooxygenase-2 (COX-2). Des études ont mis en évidence, que cette co-expression dans les cancers du sein est associée à des tumeurs de mauvais pronostic (Surowiak et al 2005). L’association entre la surexpression de la P-gp et la résistance à la doxorubicine est établie depuis longtemps. Les souris MDR1-/- présentent une accumulation plus importante de la doxorubicine, liée à une altération de sa pharmacocinétique. Chez ces souris, on observe une augmentation de la doxorubicine et du doxorubicinol dans de nombreux tissus, une augmentation du volume de distribution et de la demi-vie, ainsi qu’une diminution de la clairance (van Asperen et al 1999). Hormis son rôle dans l’efflux de drogues, la P-gp peut être impliquée dans de nombreux processus tumorigéniques. Par exemple, dans le cancer du sein, la surexpression de la P-gp est associée à des tumeurs mammaires, présentant un phénotype plus agressif et de plus mauvais pronostic, caractérisé par des capacités invasives et prolifératives plus importantes (Zhang et al 2014) (Raguz et al 2004). Compte tenu des conséquences importantes sur la progression tumorale, il est important de connaître les facteurs qui régulent l’expression de la P-gp. Il a été suggéré que la surexpression de la P-gp résulte de l’amplification du gène MDR-1, l’augmentation de la transcription du gène MDR-1, des modifications de l’efficacité de la traduction de MDR-1, des mutations sur le gène et des réarrangements chromosomiques qui aboutissent à la production de gènes 106 hybrides (Videira et al 2014). De nombreux facteurs peuvent réguler positivement l’expression de la P-gp, notamment certaines protéines impliquées dans la voie de signalisation MAPK, telles que c-Raf (proto-oncogene serine-threonine protein kinase), MEK1/2 (Mitogen-activated protein kinase 1/2), la PI3K, la β-caténine, le NF-κB, ainsi que les facteurs de croissance EGF et FGF (Videira et al 2014) (Housman et al 2014). A l’inverse, HSP90 (Heat schock protein-90) et p53 régulent négativement l’expression de la P-gp (Housman et al 2014) (Scotto 2003). De plus, la P-gp peut être régulée par des stress environnementaux, tels que l’hypoxie (HIF-1α) ou l’inflammation (IL-6) (Scotto 2003). De manière intéressante, un lien entre EMT et surexpression des transporteurs ABC a été démontré in vitro. En effet, une induction de l’EMT dans les cellules tumorales augmente l’expression des transporteurs ABC, ce qui est associé à une chimiorésistance, à une migration et à une invasion des cellules tumorales plus importantes (Saxena et al 2011). Ainsi, le ciblage de la P-gp représente une approche thérapeutique prometteuse. De nombreux inhibiteurs, compétitifs ou non, existent, tels que les inhibiteurs de première génération peu spécifiques (vérapamil, cyclosporine A), les inhibiteurs de deuxième génération (valspodar, biriquodar) et les inhibiteurs de troisième génération très spécifiques (zosuquidar, tariquidar, elacridar) (Videira et al 2014) (Sharom 2008). Cependant, l’exploitation clinique de ces inhibiteurs s’est révélée relativement décevante. L’utilisation clinique des inhibiteurs de première et deuxième générations a été associée à une toxicité très importante, empêchant leur utilisation (Thomas and Coley 2003). Le tariquidar (XR9576) a montré une activité limitée en combinaison avec les anthracyclines ou les taxanes dans une petite cohorte de femmes atteintes d’un cancer du sein, de stade III ou IV (Pusztai et al 2005). Le zosuquidar (LY335979), en phase III, dans les leucémies aigues s’est révélé significativement efficace, mais pas dans le cancer du sein en combinaison avec le docetaxel en phase II (Jemal et al 2009) (Ruff et al 2009). L’efficacité limitée de ces inhibiteurs peut être liée à une pharmacocinétique non optimale (demi-vie courte), un accès tumoral aux inhibiteurs limité, à une forte redondance entre les transporteurs de la famille ABC ou à l’implication des autres mécanismes de chimiorésistance (Holohan et al 2013) (Fojo and Coley 2007). d) La sous-famille des MRPs La famille ABCC ou MRP (Multidrug Resistance – associated Proteins) contient 9 membres (MRP 1 à 11), dont la plupart ont été étudiés dans la chimiorésistance (Fojo and Coley 2007). Les MRPs ont la capacité de prendre en charge des anions organiques et des drogues conjuguées au glutathion, aux sulfates ou au glucuronide (Coley 2008). Ainsi, l’efficacité de transport de certaines drogues non anioniques par les MRPs dépend du pool cellulaire de GSH (Schinkel and Jonker 2003). Chef de file de cette famille, MRP1 (ABCC1) possède une structure de base similaire à celle de P-gp mais contient en plus un domaine NBD. Sa structure globale est constituée de 17 domaines transmembranaires (figure 30). MRP1 a été isolé en 1992 par Cole et al., dans une lignée de cancer du poumon résistante à la doxorubicine (Cole et al 1992). Physiologiquement, MRP1 est localisé majoritairement dans les membranes basolatérales des cellules épithéliales polarisées (Schinkel and Jonker 2003). Il a 107 également un rôle protecteur des tissus contre les substances toxiques, tels que la moelle osseuse, le rein, les muqueuses intestinale et oro-pharyngée et dans la clairance des drogues dans les testicules, et le péritoine (Sharom 2008). L’induction précoce de MRP1 a été corrélée à des tumeurs de mauvais pronostic, mais pas à la taille tumorale, l’envahissement ganglionnaire, le grade histologique, le statut hormonal ou ménopausique (Leonessa and Clarke 2003). L’expression de MRP1 est relativement faible dans les tumeurs mammaires avant traitement, en comparaison à celles exposées à la chimiothérapie (Trock et al 1997). Dans une étude portant sur des femmes présentant un cancer du sein précoce, l’expression de MRP1 est associée à une survie globale et une survie sans maladie, plus courtes pour des patientes traitées au CMF (Cyclophosphamide, Méthotrexate, 5-FU) mais pas chez les patients ayant reçus une hormonothérapie (Filipits et al 2005). MRP1 confère une chimiorésistance aux anthracyclines, aux anti-folates, au méthotrexate, aux épipodophyllotoxines, à la mitoxanthrone, aux camptothécines, aux vinca-alcaloïdes et aux inhibiteurs de tyrosine kinases, mais pas aux taxanes ni au cisplatine (Coley 2008) (Kathawala et al 2015). MRP2 (ABCC2) possède une structure et des substrats similaires à MRP1, sauf qu’à la différence de MRP1, MRP2 est également capable de prendre en charge le cisplatine (Ishikawa and Ali-Osman 1993). MRP2 est localisé au niveau apical des membranes des cellules polarisées et possède plutôt un rôle physiologique dans l’élimination hépatobiliaire (Kruh and Belinsky 2003). MRP5 (ABCC5) a également été décrit comme étant capable de prendre en charge la doxorubicine et le 5-fluorouracile. Le 5-fluorouracile, qui appartient à la classe des anti-métabolites est un analogue des pyrimidines. Une fois métabolisé par la cellule en métabolite cytotoxique, il s’incorpore à l’ADN et à l’ARN, afin d’aboutir à la mort cellulaire. A l’inverse de ce qui est observé pour la doxorubicine, les pompes d’efflux classiques ne représentent pas le mécanisme majoritaire de résistance au 5-FU. Cependant, des études émergentes ont montré qu’il pouvait être pris en charge par certaines pompes d’efflux, telles qu’ABCB6, ABCC5 et ABCG2 (Wang et al 2013a) (Minami et al 2014) (Nies et al 2015). Il semble qu’ABCC5 exerce un rôle important dans la chimiorésistance à la doxorubicine dans le cancer du sein (Lal et al 2010). En effet, les cellules transfectées avec ABCC5 seraient 2 fois plus résistantes à cet agent anti-néoplasique (Pratt et al 2005). De par l’importance des MRPs dans la chimiorésistance, certains inhibiteurs ont été développés, tels que les leucotriènes, le MK571, le sulindac, et le Genistein (Videira et al 2014). Certains inhibiteurs, comme le vérapamil et le disulfiram, peuvent cibler plusieurs pompes d’efflux, notamment ABCB1 et ABCC1 (Sharom 2008). D’autres MRPs ont également été corrélés à la chimiorésistance de la doxorubicine, tels que MRP6, mais les mécanismes moléculaires ont été peu décrits dans ce cas (Chuthapisith et al 2006). e) La BCRP ABCG2 ou BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) a été initialement découverte en 1998 dans des cellules tumorales mammaires MCF-7 résistantes à la doxorubicine (Doyle et al 1998). C’est un demi108 transporteur, composé de 6 domaines transmembranaires (figure 30). BCRP est localisée sur la membrane apicale de certains tissus sains, tels que les ovaires, le cœur, le placenta, les intestins et les reins ainsi que sur l’endothélium microvasculaire (Kathawala et al 2015). Elle exercerait un rôle de détoxification des xénobiotiques comme les autres pompes d’efflux (Chuthapisith et al 2006) (Schinkel and Jonker 2003). Elle a également été impliquée dans la chimiorésistance aux anthracyclines, au méthotrexate, au mitoxanthrone, aux inhibiteurs du topoisomérase I, du 5-FU mais pas ou faiblement pour les taxanes, la vincristine et le cisplatine (Schinkel and Jonker 2003) (Wang et al 2013a). Même si elle a été découverte dans le cancer du sein, elle a depuis été retrouvée dans de nombreuses tumeurs solides, telles que les cancers du tractus gastro-intestinal, de l’ovaire, de l’estomac, du côlon, de l’endomètre, du poumon, le mélanome et de cancers hématologiques (Kathawala et al 2015) (Chuthapisith et al 2006). De façon intéressante, BCRP est également présente dans des cellules tumorales résistantes, qui n’expriment ni P-gp ni MRP1 (Sharom 2008). Certaines études cliniques ont établi un lien entre la surexpression de BCRP dans les leucémies myéloïdes et un mauvais pronostic ainsi qu’une mauvaise réponse au traitement (Robey et al 2007). De manière intéressante, BCRP est exprimée dans une petite sous-population de cellules, qui présentent des caractéristiques de cellules-souches (CD34+), connues pour avoir un rôle très important dans le processus de rechutes (Tang et al 2012). Parmi les facteurs de régulation de l’expression de BCRP, on trouve les œstrogènes qui inhibent sa transcription (Coley 2008). Des études ont mis en évidence que BCRP est capable d’interagir positivement avec la cavéoline-1, protéine impliquée dans la signalisation intra-cellulaire et dans les mécanismes de transport (Videira et al 2014). Les cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-1β et le TNF-α augmentent aussi l’expression de BCRP (Videira et al 2014) (Wang et al 2010) (Zhang et al 2011). A l’inverse, comme pour la P-gp, la protéine p53 inhibe son expression (Videira et al 2014). Il existe des inhibiteurs capables de bloquer efficacement l’action de BCRP. La fumitremorgine C (FTC), par exemple, s’est avérée efficace in vitro et relativement spécifique de BCRP, car elle a peu d’effets sur la chimiorésistance médiée par P-gp et MRP1 (Schinkel and Jonker 2003). Cependant, aucun de ces inhibiteurs n’a été encore évalué en clinique (Sharom 2008). 3-2) La protéine MVP / LRP a) Découverte En plus du rôle crucial des transporteurs ABC dans la chimiorésistance, d’autres mécanismes peuvent expliquer le fait que la drogue soit expulsée de son site d’action ; mécanisme à l’origine d’une chimiorésistance. La protéine LRP (Lung Resistance Protein) a été découverte en 1993 dans des cellules tumorales de poumon non à petites cellules. Ces cellules ont été exposées à des concentrations croissantes de doxorubicine et présentent un phénotype MDR, caractérisé par une résistance croisée à la doxorubicine, la vincristine et à l’étoposide. De manière intéressante, ces cellules présentent une 109 moindre accumulation intra-cellulaire de drogues, malgré l’absence de P-gp. Ainsi, la surexpression de LRP a été étroitement corrélée à la chimiorésistance et sa diminution à la chimiosensibilité des cellules (Scheper et al 1993). Par la suite, les similitudes de structure et de séquences entre LRP et MVP (Major Vault Protein) ont mis en évidence que ces deux protéines étaient identiques (Scheffer et al 1995). b) Structure et composition Les « voûtes » (vault) sont des particules de ribonucléoprotéines présentant une structure en « tonneau » (figure 33). Chez les mammifères, elles sont composées de trois protéines : la MVP, la VPARP (Vault Poly (Adenosine diphosphate Ribose) Polymérase) et la TEP1 (Telomerase-Associated Protein-1) associées à des petits ARN non traduits appelés vRNA. MVP constitue la sous-unité principale de la particule (environ 70% de la masse totale). Ainsi, l’extinction de la MVP induit la dissociation de la voûte (Herlevsen et al 2007) (Lara et al 2011). Une voûte est composée de deux demi-voûtes, constituées chacune de 39 MVP identiques et formant ainsi la structure en tonneau. De par sa taille, la voûte peut accueillir des centaines de protéines (Lara et al 2011). De manière intéressante, les demi-voûtes peuvent se dissocier à pH acide et s’assembler avec d’autres demivoûtes (Yang et al 2010). La sous-unité TEP1 et probablement VPARP et vRNA, sont localisés dans la partie « cap » de la voûte (figure 33). La composition de la voûte entière est de 79 à 96 MVP, 8 VPARP, 2 TEP1 et au moins 6 copies de vRNA (Kong et al 2000). Le gène humain codant pour MVP est localisé sur le chromosome 16, proche du gène codant pour MRP1 (Lara et al 2011). Figure 33. Structure de la voûte. La voûte est constituée de deux demi-voûtes, qui peuvent se dissocier à pH acide. La voûte est composée majoritairement de molécules de MVPs, mais également de sous-unités TEP1 et VPARP, ainsi que des ARN nommés vRNA. A l’extrémité de la voûte, on trouve des structures appelées « cap », qui contiennent les sous-unités TEP1, VPARP et vRNA. Une cavité interne est formée au sein de la voûte permettant le passage de différents éléments. Une molécule de MVP est colorée en marron (d’après (Lara et al 2011)). 110 c) Localisation et fonctions biologiques La majorité des voûtes est localisée dans le cytoplasme où elles peuvent interagir avec les éléments du cytosquelette, notamment les microtubules. De nombreuses études ont rapporté la présence des voûtes au niveau du noyau : au niveau des nucléoles, des complexes de pores nucléaires (ou NPC pour Nuclear Pore Complex) et de la membrane nucléaire (Mossink et al 2003). Les voûtes sont présentes abondamment (1.105 particules par cellule) dans différents types cellulaires, tels que les macrophages, les kératinocytes, les fibroblastes, les cellules germinatives, les cellules épithéliales ayant une fonction excrétrice et sécrétoire ainsi que dans les cellules exposées chroniquement à des xénobiotiques (cellules bronchiques et cellules intestinales) et l’endothélium de différents tissus (de Moraes et al 2013) (Lara et al 2011). Le fait qu’elles soient présentes en très grand nombre dans des variétés différentes de cellules suggère que leur fonction est essentielle dans les cellules eucaryotes, cependant leur rôle précis n’est pas encore complètement élucidé (Mossink et al 2003). Les localisations subcellulaire et intra-cellulaire des voûtes ont suggéré un rôle dans le transport intra-cellulaire, en particulier dans le transport nucléo-cytoplasmique. La co-localisation partielle des voûtes avec les éléments du cytosquelette suggère qu’elles pourraient servir de « navettes » pour transporter des protéines le long du cytosquelette et pour protéger le noyau de l’action de composés toxiques (Mossink et al 2003) (de Moraes et al 2013). Les voûtes ont été également impliquées dans le transport intra-cellulaire de ribosomes et des récepteurs aux œstrogènes, à la progestérone et aux glucocorticoïdes (Larsen et al 2000). Au sein des voûtes, le rôle précis de MVP n’est pas encore bien caractérisé. Plusieurs études ont indiqué que MVP est directement impliqué dans les cascades de transduction du signal. MVP peut interagir avec les molécules de la voie MAPK, notamment ERK et aussi de la voie PI3K/Akt, notamment PTEN (Lara et al 2011). De plus, MVP peut agir comme protéine de maintien, afin de conduire HIF-1α à l’ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome (Iwashita et al 2010). L’IFN-γ (Interferon-γ) peut réguler positivement l’expression de MVP dans les macrophages et les cellules dendritiques, via la voie de signalisation JAK/STAT, suggérant un rôle de MVP dans l’immunité (Steiner et al 2006). d) MVP et chimiorésistance La LRP/MVP a été initialement découverte dans des cellules qui présentaient un phénotype MDR, négatives pour P-gp. Depuis, la surexpression de MVP a été observée dans environ 78% de 61 lignées cellulaires tumorales (Izquierdo et al 1998) (Izquierdo et al 1996a). De plus, son niveau d’expression a été corrélé à une résistance à différents agents anti-cancéreux, tels que les anthracyclines, le 5-FU, le mitoxanthrone et le cisplatine (Laurencot et al 1997) (Lara et al 2011). De manière intéressante, une surexpression de MVP a été décrite dans de nombreuses lignées tumorales, suite à un traitement par les anthracyclines, le taxol, l’étoposide, le méthotrexate, le cisplatine et la vincristine, suggérant que le traitement lui-même peut réguler positivement l’expression de la MVP, comme c’est le cas pour les pompes d’efflux (Lara et al 2011) (de Moraes et al 2013) (Izquierdo et al 1998) (Berger et al 2000) 111 (Hu et al 2002). Ainsi, la surexpression de MVP n’est pas seulement associée à la résistance aux drogues classiques impliquées dans le phénotype MDR mais aussi à d’autres drogues (Izquierdo et al 1998). De plus, MVP est souvent exprimée précocement lors de l’apparition progressive de la chimiorésistance (Izquierdo et al 1998) (Lara et al 2011). De nombreuses études ont relié le phénotype MDR avec la surexpression de MVP dans les cellules cancéreuses. L’inhibition de MVP a également été associée à la chimiosensibilisation de cellules tumorales de côlon à la doxorubicine (Kitazono et al 1999). Cependant, son rôle dans la chimiorésistance a été controversé in vitro et in vivo. Des études portant sur des cellules tumorales ovariennes ont montré qu’une forte expression de MVP est requise, mais n’est pas suffisante, pour induire un phénotype MDR dans ces cellules. De plus, dans ce même modèle, aucune relation n’a été trouvée entre la surexpression des voûtes et la résistance à l’étoposide, la daunorubicine et la vincristine (Siva et al 2001). Les souris MVP-/- ne présentent pas une meilleure chimiosensibilité aux différents agents anti-néoplasiques, que les souris sauvages. Ces résultats suggèrent que MVP seule n’est pas suffisante pour induire une chimiorésistance et / ou que d’autres protéines pourraient être augmentées afin de compenser la perte de MVP (Mossink et al 2002). De plus, les autres sous-unités qui composent les voûtes, VPARP et TEP1 sont également surexprimées dans des lignées MDR, ce qui suggère qu’elles pourraient exercer un rôle non négligeable dans la chimiorésistance (Siva et al 2001). En clinique, plusieurs études ont mis en évidence que l’expression de MVP dans les tumeurs représente un facteur de mauvais pronostic indépendant, concernant la réponse à la chimiothérapie et / ou à la survie sans maladie et la survie globale, dans des tumeurs solides, telles que les sarcomes, le cancer du col, le cancer de l’ovaire, du poumon et le mélanome, ainsi que les leucémies, le myélome multiple et les lymphomes (Lara et al 2011) (de Moraes et al 2013) (Izquierdo et al 1998) (Lloret et al 2008) (van den Heuvel-Eibrink et al 2000). Dans le cas du cancer du sein, une étude a mis en évidence que 68% des tumeurs présentaient une expression modérée ou forte de MVP, mais les auteurs n’ont pas trouvé de corrélation avec le pronostic clinique des patientes (Pohl et al 1999). Par ailleurs, l’expression de MVP a également été corrélée à la réponse aux radiations ionisantes (Valenciano et al 2012) (Lara et al 2011). e) Hypothèses du rôle de MVP dans la chimiorésistance Les mécanismes moléculaires de son action dans le phénotype MDR ne sont pas encore bien élucidés. L’hypothèse majeure est que MVP pourrait transporter les drogues du noyau vers le cytoplasme et favoriser leur internalisation dans des vésicules cytoplasmiques, de manière ATP-indépendante. Ces vésicules libèreraient les drogues hors de la cellule par exocytose (Izquierdo et al 1996a) (Kolli et al 2004) (de Moraes et al 2013) (Meschini et al 2002) (figure 34). En effet, l’utilisation d’anticorps bloquants dirigés contre MVP ou d’ARN interférents (siMVP), empêche l’efflux nucléaire de la doxorubicine et restaure ainsi son accumulation nucléaire et la chimiosensibilité (Herlevsen et al 2007) (Kitazono et al 1999) (Han et al 2012). Les données montrant que la MVP peut se combiner à des vésicules concordent avec le fait que l’expression de MVP n’est pas souvent associée à celle des 112 transporteurs ABC. En effet, MVP est surexprimée dans des lignées cellulaires, qui n’expriment généralement pas les transporteurs ABC, suggérant que le mécanisme d’efflux cellulaire peut être indépendant des pompes d’efflux classiques (ABCB1, ABCC1, ABCC2, BCRP) (Hu et al 2002) (Meschini et al 2002). Les vésicules cytoplasmiques permettant l’efflux des drogues sont classiquement de nature acide, telles que les lysosomes, les endosomes et l’appareil de Golgi (van Zon et al 2004) (Herlevsen et al 2007). Herlevsen et al. ont montré que l’inhibition de MVP par des ARN interférents restaure l’accumulation de doxorubicine dans la cellule en empêchant sa séquestration par les lysosomes, mais n’induit pas de modification de son efflux en dehors de la cellule, ce qui suggère que d’autres processus sont requis pour expulser la doxorubicine hors de la cellule (Herlevsen et al 2007). La séquestration des drogues dans des vésicules exocytotiques peut être un mécanisme de multi-résistance en lui-même. En effet, Van Zon et al. ont estimé que l’efflux et la séquestration des anthracyclines dans des vésicules peuvent être indépendants de la surexpression de la MVP observée (van Zon et al 2004). Ce mécanisme sera décrit plus précisément dans la partie suivante. D’autres études, à l’inverse, ont suggéré que même si P-gp et MVP sont rarement surexprimées simultanément, une surexpression de MVP et de MRP-1 a été observée dans des cellules ABCB1 négatives et a été associée au phénotype MDR (Izquierdo et al 1996b). Ainsi, l’expression simultanée de MVP et de certains transporteurs ABC a été retrouvée, soulignant le fait qu’un mécanisme coopératif entre MVP et les transporteurs ABC n’est pas à exclure (figure 34) (Mossink et al 2003). Les dernières études faisant le lien entre MVP et MDR suggèrent que MVP peut moduler la chimiorésistance, via les voies de signalisation PI3K/Akt ou MAPK (de Moraes et al 2013). De par un mécanisme impliquant des phosphorylations – déphosphorylations, MVP peut moduler ces signalisations intra-cellulaires, qui sont impliquées dans la survie et la prolifération, ayant un rôle indirect sur la résistance (Kolli et al 2004). Les études qui n’ont pas trouvé de lien direct entre l’expression / l’extinction de MVP et la chimiorésistance / chimiosensibilité, suggèrent que MVP pourrait agir comme une protéine de réponse au stress et donc favoriser indirectement la chimiorésistance, probablement lorsque les cellules sont soumises à des conditions de stress environnemental (pH, chaleur …) (Huffman and Corey 2005) (van Zon et al 2004). Enfin, les voûtes (via MVP et les autres sous-unités) pourraient exercer un rôle dans la réparation des dommages de l’ADN. En effet, une corrélation inverse a été trouvée entre l’expression de MVP et des protéines KU70 et KU80, qui sont des protéines majeures de la réparation par NHEJ. Ainsi, la surexpression de MVP et des autres sous-unités des voûtes pourrait entraîner une diminution de KU70/80, diminuant l’activité de la NHEJ. Ces processus entraînent une instabilité génomique plus importante associée à une augmentation de Bcl-2, et aboutissent à une diminution de l’apoptose et à une augmentation de la survie des cellules suite à un traitement anti-néoplasique ou par radiations ionisantes (Lara et al 2011). Pour conclure, MVP semble avoir un rôle important dans la multi-résistance, probablement dans l’efflux nucléaire des drogues cytotoxiques, mais les mécanismes sous-jacents sont encore mal connus 113 et restent controversés. En effet, son induction précoce suggère que son expression est importante, mais pas suffisante, pour induire un phénotype MDR. De plus, des mécanismes compensatoires ou des interactions avec d’autres facteurs exercent probablement un rôle, masquant son implication directe dans la chimiorésistance. Enfin, les autres sous-unités des voûtes pourraient exercer un rôle important dans la résistance, mais les mécanismes moléculaires n’ont pas encore été étudiés à notre connaissance. Ainsi, d’autres études pré-cliniques et cliniques sont nécessaires afin de comprendre l’implication directe ou indirecte de cette protéine dans les phénomènes de multi-résistance. Figure 34. Mécanisme d’action hypothétique de la MVP / voûtes dans le transport nucléocytoplasmique et vésiculaire des drogues. Les voûtes peuvent être impliquées dans l’efflux nucléaire des drogues, via les pores nucléaires ou la membrane nucléaire, puis favoriser la séquestration des drogues dans des vésicules exocytotiques ou favoriser leur transport vers les pompes d’efflux (d’après (Mossink et al 2003)). 3-3) L’efflux vésiculair e a) Les vésicules intra-cytoplasmiques Les anthracyclines sont des bases faibles plutôt lipophiles, ce qui leur permet de pénétrer facilement à travers les membranes à pH normal. Lorsque ces drogues rencontrent un environnement acide, tel que l’intérieur d’organelles cytoplasmiques (lysosomes, endosomes), elles se convertissent en forme chargée, ce qui empêche toute traversée passive des membranes. Ainsi, une accumulation de drogues chargées est observée dans les vésicules acides, ce qui est suivi de leur transport vers la membrane plasmique et de leur libération dans l’espace extra-cellulaire (figure 34) (Larsen et al 2000). De 114 nombreuses études ont mis en évidence que le trafic vésiculaire peut être impliqué dans le captage, la distribution et l’efflux de molécules anti-cancéreuses. De plus, une différence dans la distribution intra-cellulaire des drogues a été mise en évidence entre les cellules sensibles et les cellules résistantes, présentant un phénotype MDR (Seidel et al 1995) (Coley et al 1993). Dans les lignées sensibles, la drogue est distribuée dans le noyau et le cytoplasme dans les premières minutes après le traitement, alors que dans les lignées résistantes, la drogue est retrouvée dans la région péri-nucléaire, qui correspond vraissemblablement à l’appareil de Golgi. Puis, ces vésicules sont acheminées vers la périphérie cellulaire (Larsen et al 2000) (Seidel et al 1995). Ainsi, ces études suggèrent que les anthracyclines peuvent s’accumuler dans des vésicules acides, telles que l’appareil de Golgi, les vésicules sécrétoires, les lysosomes et les endosomes, où elles seront acheminées vers la membrane plasmique et libérées dans l’espace extra-cellulaire par exocytose. L’exocytose est le mécanisme par lequel la cellule libère des macromolécules dans l’espace extra-cellulaire, par fusion entre les vésicules cytoplasmiques et la membrane plasmique. Il est probable qu’un tel mécanisme soit observé pour les vinca-alcaloïdes et la mitoxanthrone, qui sont aussi des bases faibles (Larsen et al 2000). De manière intéressante, des études ont mis en évidence que certains transporteurs ABC (ABCB1, ABCC1) ne sont pas uniquement localisés à la membrane plasmique, mais aussi au niveau de la membrane des vésicules cytoplasmiques, contribuant ainsi à la redistribution intra-cellulaire des drogues et à la chimiorésistance (Van Luyn et al 1998) (Yamagishi et al 2013). b) Les vésicules extra-cellulaires De nombreux facteurs régissent la communication inter-cellulaire : des facteurs solubles (cytokines, chimiokines, facteurs de croissance, enzymes, médiateurs moléculaires …) mais également des vésicules extra-cellulaires (VE). Les VE sont des vésicules à bicouche lipidique, sécrétées par les cellules dans le milieu extra-cellulaire. Hormis les corps apoptotiques, libérés lors du processus de mort cellulaire, deux grands types de vésicules existent : les microvésicules (MV) et les exosomes. Ces vésicules contiennent divers constituants moléculaires, tels que des protéines, des lipides, des ARNm et des micro-ARN et sont impliquées dans différents processus biologiques (Azmi et al 2013). Les MV sont des vésicules hétérogènes présentant un diamètre de 0.1 à 1 µm, formées par bourgeonnement de la membrane plasmique (Ratajczak et al 2006). Elles sont libérées soit de manière constitutive, soit suite à des stimuli extra-cellulaires ou à une augmentation intra-cellulaire d’ions calcium (Jorfi and Inal 2013). Les exosomes sont des vésicules plus petites, de 30 à 100 nm de diamètre, présentant une densité précise (1.13 à 1.19) (Jorfi and Inal 2013). Ils sont formés à partir des corps multivésiculaires (MVB pour Microvesicular Body), encore appelés endosomes tardifs, qui, après fusion avec la membrane plasmique, libèrent les exosomes dans le milieu extra-cellulaire (Azmi et al 2013) (figure 35). Lors de la biogenèse des exosomes, les endosomes peuvent fusionner avec les lysosomes pour former des endo-lysosomes (Huotari and Helenius 2011). Plusieurs études émergentes ont mis en évidence un rôle des vésicules extra-cellulaires dans la chimiorésistance et dans 115 l’acquisition d’un phénotype MDR (Jorfi and Inal 2013) (Azmi et al 2013). Hormis les transporteurs ABC, les drogues peuvent être effluées de la cellule par encapsulation dans des VE. De manière intéressante, Shedden et al. ont démontré que les MV provenant de cellules tumorales résistantes contiennent plus de doxorubicine que les MV provenant de cellules sensibles (Shedden et al 2003). Ainsi, la doxorubicine peut passivement s’accumuler dans ces vésicules, puis sortir de la cellule par ce processus, et ce, de manière plus importante dans les cellules chimiorésistantes que dans les cellules chimiosensibles (figure 35). Ce mécanisme de résistance, indépendant des pompes d’efflux membranaires, a été retrouvé pour d’autres drogues, moins lipophiles que la doxorubicine, ce qui suggère que la lipophilie n’est pas le seul déterminant de l’accumulation de drogues dans ces vésicules (Shedden et al 2003) (Safaei et al 2005) (Corcoran et al 2012). De plus, l’efflux vésiculaire est présent dans un large spectre de modèles tumoraux. En effet, Shedden et al. ont pu corréler le processus de libération de MV avec la chimiorésistance, pour 171 drogues dans un large panel de lignées tumorales (Shedden et al 2003) (Azmi et al 2013). Par ailleurs, les VE ont également un rôle dans le transport de la cible des drogues. Par exemple, dans un modèle de cancer du sein HER2+, Ciravolo et al. ont montré que la résistance au Trastuzumab peut être médiée par des exosomes qui surexpriment HER2 (Ciravolo et al 2012). Une étude publiée par Bebawy et al. a montré que des cellules leucémiques résistantes à la chimiothérapie peuvent transférer des MV contenant P-gp, à des cellules chimiosensibles. Ces cellules chimiosensibles accumulent P-gp et deviennent progressivement résistantes (Bebawy et al 2009). Récemment, la même équipe a confirmé ces résultats dans des cellules tumorales mammaires (Pokharel et al 2014). De manière intéressante, MRP1 peut également être transmis, via des MV, soulignant le caractère plus général de ce mécanisme (Lu et al 2013). Enfin, les exosomes et les MV peuvent contenir de nombreux facteurs, tels que des cytokines, des chimiokines ou des oncogènes susceptibles de favoriser la résistance aux drogues dans les cellules voisines (Azmi et al 2013). 116 Figure 35. Mécanisme hypothétique d’efflux des drogues via les exosomes. Les drogues peuvent être encapsulées dans des endosomes, qui deviendront endosome tardif ou MBV. Cet endosome tardif, pourra après fusion avec la membrane plasmique, libérer des exosomes contenant les molécules antinéoplasiques. Ce concept émergent offre une voie d’efflux alternative, qui contribue à la chimiorésistance. Ce processus a été démontré avec les MV qui sont libérées par bourgeonnement de la membrane plasmique (d’après (Azmi et al 2013)). 4) Rôle du microenvironnement dans la chimiorésistance 4-1) Généralités Comme nous l’avons vu dans la partie I, l’interaction entre les cellules stromales et les cellules tumorales constitue un véritable cercle vicieux, à l’origine de la progression de la tumeur, de l’initiation tumorale au processus métastatique. De nombreux arguments ont également mis en évidence que le microenvironnement représente un acteur important dans la résistance des cellules tumorales. Ainsi, ce microenvironnement protecteur permet à des cellules tumorales chimiosensibles de devenir résistantes. Le rôle du stroma dans la résistance aux drogues a été démontré dans différents modèles, notamment des lignées cellulaires tumorales et des cellules tumorales primaires, ainsi que des cellules stromales provenant de patients et ceci pour diverses molécules (chimiothérapie conventionnelle, chimiothérapie ciblée) ou radiothérapie (Bochet et al 2011) (McMillin et al 2013). Ce processus a été appelé EMDR pour Environment Mediated Drug Resistance. Un stroma protecteur permet également de favoriser les rechutes (Dittmer and Leyh 2014). Une des premières études qui suggère que le microenvironnement tumoral est impliqué dans la résistance aux drogues a été publiée 117 en 1990. Teicher et al. ont montré que des cellules tumorales mammaires résistantes à la chimiothérapie in vivo, perdent cette résistance quand elles sont isolées et cultivées in vitro en absence de stroma (Teicher et al 1990). De nombreux paramètres microenvironnementaux peuvent expliquer cette résistance. D’une part, la MEC, de structure dense, représente une barrière physique de protection et exerce en plus un rôle actif sur la tumeur. D’autre part, les cellules stromales sécrètent une variété de facteurs à l’origine de la chimiorésistance (voir partie I). De manière intéressante, la structure de la MEC évolue au fur et à mesure du traitement. En particulier, les collagènes s’accumulent suite à une chimiothérapie (collagènes I, IV et VI), ce qui renforce la rigidité de la MEC et réduit la pénétration des drogues (Hattar et al 2009) (Tokes et al 2009) (Sherman-Baust et al 2003). De plus, la MEC contribue à la chimiorésistance en fournissant des sites d’adhésion aux cellules tumorales. Ce processus est appelé CAM-DR pour Cell Adhesion-Mediated Drug Resistance et a été retrouvé dans de nombreux cancers, tels que le cancer du sein, du poumon, les leucémies et le gliome (Dittmer and Leyh 2014). Les protéines majeures qui causent le processus de CAM-DR sont les collagènes et la fibronectine, capables de se lier aux intégrines présentes à la surface des cellules tumorales (Dittmer and Leyh 2014). Un autre facteur microenvironnemental qui favorise la résistance aux drogues est la densité vasculaire. En effet, comme étudiée dans la partie I, l’angiogenèse est souvent anormale dans les cancers. Ainsi, la chimiothérapie, majoritairement distribuée par voie sanguine, n’est pas acheminée correctement à la tumeur. Une des stratégies anti-cancéreuses est d’ailleurs de « normaliser » la vascularisation tumorale (Weis and Cheresh 2011). Enfin, les cellules stromales ont un rôle actif sur la chimiorésistance. D’une part, elles participent à la sécrétion de composants de la MEC, favorisant le processus de CAM-DR. D’autre part, elles sécrètent des facteurs bioactifs qui vont considérablement influencer les cellules tumorales, quant à la réponse aux drogues (voir partie I). Enfin, elles sécrètent des vésicules extra-cellulaires, qui contiennent elles-aussi des facteurs actifs (Dittmer and Leyh 2014). Dans la partie suivante, seul le rôle des adipocytes sera décrit. Notons que dans certains cas, le microenvironnement s’est révélé être plutôt chimiosensibilisant pour les cellules tumorales (McMillin et al 2013). 4-2) Rôle des adipocytes dans la résistance aux dr ogues Comme nous l’avons mentionné dans la partie II, peu d’études se sont intéressées au rôle des adipocytes dans la chimiorésistance. L’étude de Behan a mis en évidence que les adipocytes de la lignée 3T3-L1 diminuent l’efficacité de la vincristine sur des cellules tumorales leucémiques en inhibant l’apoptose induite par le traitement. Ce mécanisme n’est pas dépendant d’un contact direct entre les adipocytes et les cellules tumorales, car l’effet protecteur des adipocytes est également retrouvé lorsque les cellules tumorales sont placées dans des inserts de co-culture (Behan et al 2009). Ces résultats suggèrent que la chimiorésistance induite par les adipocytes est liée aux sécrétions adipocytaires, qui n’ont pas encore été identifiées ici. De plus, l’effet des adipocytes n’est pas restreint 118 à la vincristine. Les cellules co-cultivées avec les adipocytes sont également plus résistantes au nilotinib, à la daunorubicine et à la dexaméthasone. Ce processus est associé à une augmentation des facteurs anti-apoptotiques Bcl-2 et Pim-2 (Proviral integrations of moloney virus 2) (Behan et al 2009). Ainsi, les adipocytes peuvent être associés à un phénotype de multi-résistance. L’équipe de Philipp Scherer a confirmé le rôle protecteur des adipocytes dans le modèle du cancer du sein. De manière intéressante, la quantité d’endotrophine (fragment clivé du collagène VI) est augmentée, suite à un traitement au cisplatine. A l’inverse, l’endotrophine cause une chimiorésistance et un processus d’EMT, en faveur de la progression tumorale. De manière intéressante, les souris KO pour le collagène VI sont plus sensibles au cisplatine, via une inhibition de l’EMT. Ces résultats suggèrent que le collagène VI d’origine adipocytaire exerce un rôle prépondérant dans la progression tumorale et en particulier dans la chimiorésistance (Park et al 2013). L’équipe de Stephen Hursting a également montré un rôle promoteur des adipocytes dans la chimiorésistance. Leurs résultats suggèrent que le milieu conditionné d’adipocytes de la lignée 3T3-L1 augmente la prolifération, l’invasion et diminue la réponse des cellules à la gemcitabine (De Angel et al 2013). Des résultats similaires ont été rapportés dans le mélanome : Chi et al. ont montré que le milieu conditionné d’adipocytes diminue la réponse des cellules de mélanome au cisplatine, au docetaxel et à l’inhibiteur d’histone déacétylase SAHA (Suberoylanilide hydroxamic acid). Ces résultats sont associés à une augmentation de l’activation des voies de signalisation PI3K/Akt et MEK/ERK. La leptine, sécrétée par les adipocytes, est en partie responsable de ce processus (Chi et al 2014). Dans l’équipe, Ludivine Bochet a mis en évidence que les CAAs induisent une résistance aux radiations ionisantes dans le cancer du sein. Ce processus est associé à une augmentation de l’IL-6 et de la phosphorylation de Chk1 (impliqué dans la réparation de l’ADN et dans l’arrêt du cycle cellulaire) dans les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes (Bochet et al 2011). Pramanik et al. ont également émis une hypothèse intéressante dans les leucémies. Ils ont mis en évidence in vitro que les cellules tumorales leucémiques sont capables de migrer vers les adipocytes de la lignée 3T3-L1 et contre des explants de TA, via SDF-1α. De plus, les explants de TA protègent les cellules leucémiques de l’apoptose. Ainsi, les auteurs suggèrent que le TA pourrait attirer les cellules tumorales, afin de les protéger de l’action des drogues anti-tumorales (Pramanik et al 2013). Hormis les adipocytes, le TA contient de nombreuses cellules, qui peuvent potentiellement favoriser un phénotype de chimiorésistance. Les ADSCs ont également été associés à une chimiorésistance. Récemment, Chen et al. ont mis en évidence que les cellules tumorales mammaires triple-négatives, mises en présence de milieu conditionné d’ADSCs, sont plus résistantes à l’action de la doxorubicine. Ce processus est associé à une augmentation de l’efflux de la doxorubicine de la cellule et une augmentation de BCRP. L’IL-8 sécrétée par les ADSCs semble être à l’origine de ce mécanisme (Chen et al 2014). 119 En conclusion, la chimiothérapie demeure un des traitements de référence pour traiter un cancer du sein. Parmi l’arsenal thérapeutique dont on dispose, la doxorubicine représente une molécule très utilisée pour diverses tumeurs. Elle exerce, en effet, de nombreux mécanismes d’action parallèles, aboutissant à la mort cellulaire. Cependant, la résistance des cellules tumorales à la doxorubicine est un processus très fréquemment retrouvé et contribue à l’apparition de rechutes. Parmi tous les mécanismes de résistance connus, l’efflux de la doxorubicine représente son mécanisme majoritaire et contribue à l’acquisition d’un phénotype de multi-résistance. Cet efflux peut être dépendant des transporteurs ABC, qui expulsent la drogue en dehors de la cellule de manière active. Moins décrit, l’efflux peut aussi dépendre de la protéine MVP, élément majeur des voûtes présentes au niveau de la membrane nucléaire et du cytoplasme. La MVP peut favoriser l’efflux des molécules en dehors du noyau. De manière dépendante ou non de MVP, une fois dans le cytoplasme, les drogues peuvent aller dans des vésicules et sortir de la cellule par exocytose. Ce mécanisme d’efflux original a été peu décrit mais représente un moyen alternatif pour la cellule tumorale d’échapper aux traitements. Des arguments émergents suggèrent que le processus de résistance ne dépend pas uniquement des cellules tumorales elles-mêmes mais aussi du microenvironnement tumoral. Ainsi, nous avons formulé l’hypothèse que les adipocytes pourraient contribuer à la résistance du cancer du sein à la chimiothérapie conventionnelle et que cette résistance pourrait être amplifiée dans un contexte d’obésité. Les deux revues ci-après, issues de notre laboratoire font un état des lieux sur le rôle des adipocytes dans la progression tumorale mammaire et les conséquences cliniques de ce dialogue délétère, notamment sur l’obésité. 120 Camille LEHUÉDÉ1,2#, Ikrame LAZAR1,2#, Laurence NIETO1,2, Yuan Yuan WANG1,2, Ghislaine ESCOURROU3, Philippe VALET1,4, Catherine MULLER1,2* Université de Toulouse, UPS, F-31077 Toulouse, France Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS UMR 5089, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077 Toulouse, France 3Service d’Anatomie pathologique et Histologie-Cytologie, CHU, Hôpital Rangueil, 1, avenue Jean-Poulhes, TSA 50032, 31403 Toulouse, France. 4Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM U1048, F-31432 Toulouse, France * Auteur correspondant : Pr Catherine MULLER – Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS UMR 5089, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077 Toulouse, France Tel : 0561175932 / Fax : 0561175994 / mail : [email protected] # Contribution équivalente 1 2 Explication du titre : Un dialogue bidirectionnel s’établit entre les tumeurs et les cellules graisseuses à proximité ce qui favorise la progression tumorale. Ce dialogue pourrait être amplifié chez les sujets obèses et expliquer ainsi l’agressivité des tumeurs dans ce sous-groupe de patients. RÉSUMÉ Il est maintenant clairement établi que l’obésité favorise la survenue et affecte le pronostic de nombreux cancers dont le cancer du sein. En utilisant le cancer su sein comme modèle, nous montrons ici qu’un dialogue bidirectionnel s’établit entre les cellules tumorales et le tissu adipeux à proximité. Les adipocytes péritumoraux présentent une délipidation et une diminution des marqueurs adipocytaires, cellules que nous avons appelé CAAs pour « Cancer-Associated Adipocytes ». Via leur capacité à sécréter des molécules pro-inflammatoires, des protéines de la matrice extra-cellulaire ou à libérer ARTICLE ORIGINAL Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse des acides gras, les CAAs stimulent la prolifération, la survie, les capacités invasives des tumeurs et favorisent la résistance aux traitements. Le propos de cette revue est de décrire comment les adipocytes affectent le comportement des tumeurs et de présenter les conséquences cliniques de ce dialogue délétère. Deux situations seront abordées. Tout d’abord, l’obésité où le tissu adipeux présente des modifications morphologiques et fonctionnelles qui le rendent plus enclin à favoriser localement la progression tumorale, pouvant expliquer le pronostic défavorable observé chez ces patientes. D’autre part, le risque carcinologique du transfert de graisse utilisé en chirurgie reconstructrice dans le cancer du sein sera décrit au regard de ces nouveaux éléments de connaissance sur le dialogue entre tissu graisseux et cancer. Mots-clés : Obésité, Tissu adipeux, Cancer du sein, Microenvironnement, Adipocytes péritumoraux. CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 1 ARTICLE ORIGINAL Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse ABSTRACT Several epidemiological studies demonstrate positive associations between the prevalence of obesity, as judged by increased body mass index (BMI), cancer incidence, and cancer-related mortality. We have recently demonstrated that a bidirectional crosstalk is established between breast cancer cells and tumour-surrounding adipocytes. Tumour cell secretions are able to modify tumour-surrounding adipocytes to an activated state that we have named Cancer-Associated Adipocytes (CAAs). CAAs, by their ability to secrete proinflammatory molecules, extracellular matrix proteins and to liberate free fatty acids, stimulate tumor growth, survival, invasive capacities as well as resistance to treatment. The purpose of this review is to emphasize the role that adipose tissue might play by locally affecting breast cancer cell behaviour and subsequent clinical consequences arising from this dialog. Two particular clinical aspects are addressed: obesity that was identified as an independent negative prognosis factor in breast cancer and the oncological safety of autologous fat transfer used in reconstructive surgery for breast cancer patients. Keywords: à nous transmettre, merci. L’OBÉSITÉ INFLUENCE LA SURVENUE MAIS AUSSI LE PRONOSTIC DE CERTAINS CANCERS Au cours des dernières décennies, l’obésité est devenue un problème de santé publique majeur. L’organisation mondiale de la santé prévoit qu’en 2015, 3 milliards d’adultes dans le monde seront en surpoids tandis que 700 millions seront obèses. Chaque année, environ 3 millions de personnes meurent du fait des complica2 CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 tions de l’obésité et ces chiffres sont en constante progression. Si les complications métaboliques et cardiovasculaires de l’obésité sont maintenant connues du grand public, le lien entre obésité et cancer reste lui largement ignoré. En 2003, une large étude épidémiologique publiée par le New England Journal of Medecine établit pour la première fois qu’aux Etats-Unis, environ 14% des décès par cancer chez l’homme et 20% chez la femme seraient dus à l’obésité [1]. Parmi les cancers les plus fréquemment concernés, on trouve des cancers digestifs (adénocarcinomes œsophagiens, cancers colorectaux et pancréatiques), des cancers gynécologiques (endomètre, sein après la ménopause) ainsi que les cancers du rein [1]. Outre l’augmentation du nombre de cancers, un des aspects du lien entre cancers et obésité qui a retenu notre attention est l’impact de cette dernière sur le pronostic, en particulier dans le cancer du sein. En effet, dans les carcinomes mammaires, l’obésité est un facteur indépendant de mauvais pronostic [2], les femmes obèses présentant une diminution de la survie globale, une diminution de la survie sans maladie ainsi qu’une augmentation des métastases. Ce caractère péjoratif semble indépendant de la ménopause, du stade de la tumeur et de son statut hormonal [pour revue [2]; [3]; [4]]. Il existe incontestablement des facteurs non biologiques qui pourraient expliquer ce résultat, en particulier des retards de diagnostic et des difficultés à utiliser une approche thérapeutique adaptée tel que le sous-dosage de la chimiothérapie [5, 6]. Cependant, des arguments convaincants montrent à l’heure actuelle que l’hôte, c’est à dire le sujet obèse, pourrait conduire à des modifications des propriétés de la tumeur à la faveur d’une augmentation de son agressivité [7] et [5]. Une des particularités du cancer du sein est sa proximité avec le tissu adipeux (TA), un contact physique s’établissant entre TA et cancer dès que ce dernier devient invasif (figure 1). Ces vingt dernières années, il a clairement été montré que la progression tumorale dépend d’une interaction dynamique avec les cellules « normales » entourant la tumeur [8]; [9]. Ces cellules normales, encore appelées cellules du microenvironnement ou stroma, sont activées localement ou recrutées par la tumeur. L’importance dans la progression tumo- Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse Figure 1. La proximité entre tissu adipeux et cellules tumorales est retrouvée dans les cancers du sein invasif. Coupe histologique de cancer mammaire après coloration à l’Hématoxyline-Eosine. Le tissu adipeux est noté TA, la tumeur T. Les flèches indiquent des zones représentatives ou les cellules tumorales sont au contact du tissu adipeux. rale de certaines de ces cellules telles que les fibroblastes associés au cancer (CAF pour Cancer Associated Fibroblast) ou encore des macrophages (TAM pour Tumor Associated Macrophage) a été clairement décrite [10]; [11]. Ainsi, dans ce contexte, parmi les cellules qui constituent le stroma tumoral, les cellules adipeuses sont probablement celles dont le rôle a été le moins bien caractérisé alors qu’ils représentent le type cellulaire prédominant du microenvironnement des carcinomes mammaires. Les adipocytes matures représentent les cellules majoritaires du TA qui contient aussi, dans une fraction dite « stroma vasculaire », d’autres cellules telles que des progéniteurs (Adipose Derived Stem Cells ou ADSCs et préadipocytes), des fibroblastes, des macrophages, des lymphocytes, des péricytes ainsi que des cellules endothéliales [12]. L’adipocyte gère les fluctuations énergétiques induites par l’apport alimentaire ou les états de jeûne en stockant l’énergie sous forme de triglycérides ou en la libérant sous forme d’acides gras (AG) [13]. Toutefois, à côté de sa fonction de réservoir d’énergie, l’adipocyte est également une cellule endocrine active qui sécrète une grande variété de molécules (appelées adipokines), incluant des hormones, des facteurs de croissance, des CAMILLE LEHUÉDÉ & COLL chimiokines ou des molécules pro-inflammatoires [12], clairement susceptible d’influencer le comportement des tumeurs. Ainsi, l’hypothèse principale de nos travaux est que le dialogue local entre adipocytes et cellules tumorales pourrait influencer la survie, la prolifération et le potentiel métastatique de ces dernières, cet effet pouvant être exacerbé au cours de l’obésité où les sécrétions adipocytaires sont altérées [12]. RÔLE DES ADIPOCYTES PÉRI-TUMORAUX DANS LA PROGRESSION TUMORALE : LE CONCEPT DE CANCER-ASSOCIATED ADIPOCYTES (CAAS) Afin d’étudier l’influence des adipocytes péritumoraux, nous avons mis en place au laboratoire un système de coculture entre cellules cancéreuses et adipocytes, les deux populations étant séparées par un insert autorisant le passage de facteurs solubles (figure 2). Après trois à cinq jours de coculture, nous avons étudié le comportement de ces cellules tumorales « éduquées » par les adipocytes. Parmi les différentes caractéristiques des tumeurs ainsi modifiées, nous avons retrouvé une augmentation de leurs propriétés invasives à la fois in vitro et in vivo, qu’il s’agisse de cellules exprimant ou non le récepteur aux œstrogènes (RE). Ainsi, des cellules tumorales mammaires « éduquées » par des adipocytes et injectées dans la queue d’une souris présentent une capacité à former des métastases pulmonaires très fortement augmentée [14]. Comment les adipocytes peuvent-ils influencer le comportement des tumeurs ? Quelle que soit la lignée de cancer du sein utilisée, ces adipocytes subissent d’importantes modifications. En effet, ils présentent une délipidation partielle et une diminution de l’expression des marqueurs adipocytaires. Cette « dédifférenciation » s’accompagne d’un état d’activation marqué par la surexpression de cytokines pro-inflammatoires (interleukine 6 ou IL6, interleukine 1β ou IL1β, Tumor Necrosis Factorα ou TNFα) ainsi que de protéines de la matrice extra-cellulaire (MEC) et de son remodelage. Fait majeur, nous avons montré que ces adipocytes modifiés sont retrouvées au front invasif des tumeurs humaines (figure 2), CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 3 ARTICLE ORIGINAL Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse Figure 2. Le dialogue entre les adipocytes et les cellules tumorales induisent des modifications phénotypiques caractéristiques dans les deux populations. A, Le dialogue entre adipocytes et cellules cancéreuses est étudié à l’aide d’un système de coculture en 2D ou les deux populations sont séparées par un insert permettant le passage des facteurs solubles entre les deux compartiments. Le phénotype des cellules tumorales et des adipocytes cocultivés est comparé respectivement à des cellules tumorales ou à des adipocytes cultivés seuls. B, Après coculture, les cellules tumorales présentent des caractéristiques différentes dont une augmentation de l’invasion. Cette augmentation de l’invasion est illustrée in vitro par un marquage de l’actine par une sonde fluorescente en rouge (panneau du haut). Les cellules cancéreuses non cocultivées (NC) montrent une organisation en îlot qui rappelle l’acinus mammaire alors que les cellules cocultivées (C) se séparent, s’étalent sur le support et montrent des extensions membranaires, modifications caractéristiques d’un phénotype invasif. In vivo (panneau du bas), les poumons des souris injectées par voie veineuse avec des cellules cancéreuses cocultivées (C) présentent des métastases (flèches blanches) dont le nombre et la taille sont fortement augmentés comparées aux cellules contrôles non cocultivées (NC). C, Les adipocytes cultivés in vitro (panneau du haut) sont marqués à l’huile rouge (marquage des lipides neutres) et observés au microscope. Les adipocytes cocultivés (C) présentent une diminution franche du nombre et de la taille des goutelettes lipidiques par rapport au contrôle non cocultivé (NC).Coupes histologiques de tissu adipeux à distance (TAD) ou péritumoral (TAP) de carcinome mammaire. Le phénotype « CAA »observé in vitro est retrouvé au front invasif dans ces tumeurs humaines. NC : non cocultivés, C : cocultivés, TAD : tissu adipeux à distance de la tumeur, TAP: tissu adipeux péritumoral. soulignant ainsi la relevance clinique des résultats obtenus dans le système de coculture [14]. Quels sont les médiateurs les plus importants expliquant l’influence des CAAs sur la tumeur ? Tout d’abord l’inflammation et en particulier l’IL6. En effet, dans une série de 32 échantillons comparant les carac4 CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 téristiques des adipocytes péritumoraux à des adipocytes normaux issus de mammoplastie de réduction, nous avons retrouvé une augmentation très importante de l’IL6 (7.5 fois) dans les CAAs. De façon très intéressante, le niveau d’expression de l’IL6 dans les CAAs est corrélé à la taille des tumeurs et à l’envahissement Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse comme constituants des membranes plasmiques, comme molécules de signalisation mais aussi comme source d’énergie pour les tumeurs. En effet, un ensemble de travaux récents montrent que les tumeurs, outre le glucose, pourraient utiliser les AGs comme substrat énergétique au travers de la β-oxydation des lipides qui a lieu dans la mitochondrie [21]. Ces résultats suggèrent qu’il pourrait exister une véritable symbiose métabolique entre les adipocytes (« donneurs d’énergie ») et les cellules tumorales (« receveuses »). S’ils étaient confirmés, l’interaction délétère entre adipocytes et cancer pourrait être efficacement interrompue via l’inhibition du transfert de lipides mais surtout via l’inhibition de la β-oxydation des lipides, des molécules comme l’etomoxir étant déjà connues pour exercer cet effet [21]. Le dialogue paracrine entre adipocytes et cancer fait aussi intervenir d’autres adipokines importantes telles que la leptine et l’adiponectine qui n’ont pas été abordées dans cette revue mais que le lecteur pourra retrouver dans les revues suivantes [22] ; [23] ; [24]. L’ensemble de ces résultats montre donc qu’il existe un dialogue permanent entre adipocytes et cancer du sein favorisant la prolifération tumorale, la survie et surtout l’invasion locale et à distance [3] ; [4]. L’interaction entre cellules tumorales mammaires et TA ne se limite pas aux adipocytes matures puisque des travaux récents montrent que les précurseurs adipocytaires sont eux aussi capables de participer activement à l’environnement de la tumeur, soit en générant des cellules proches des CAFs qui vont faire partie de la réaction desmoplasique, soit en favorisant l’angiogenèse tumorale (pour une revue détaillée, le lecteur est invité à se référer à [4]). Finalement, les CAAs sont également impliqués dans des processus de radio- et chimiorésistance. En effet, nous avons montré grâce au système de coculture précédemment décrit que les cellules tumorales mammaires cocultivées avec des adipocytes présentaient une radiorésistance associée à une diminution de la mort post-mitotique [25]. Cet effet semble dépendant de l’IL6 sécrétée par les cellules tumorales, sécrétion autocrine qui est stimulée par la présence d’adipocytes. De la même façon, il a été montré que des facteurs solubles d’origine adipocytaire protègent des cellules de leucémie aiguë lymphoblastique CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 CAMILLE LEHUÉDÉ & COLL ganglionnaire mais non à l’expression du RE, du type ou du grade de ces dernières [14]. Dans notre modèle de coculture, le blocage par des anticorps spécifiques de l’IL6 adipocytaire diminue l’effet pro-invasif des adipocytes, confirmant l’importance de l’inflammation dans le dialogue TA/cancer. Outre l’inflammation, l’importance des protéines de la MEC ou de son remodelage a été soulignée par différentes équipes. Une des protéines de la matrice qui est fortement exprimée par les adipocytes péritumoraux et qui favorise la croissance des tumeurs mammaires in vivo est le collagène VI (COL6) [15]. De plus, il a été récemment montré qu’un des fragments de clivage du collagène, l’endotrophine, agissait comme une molécule de signalisation et augmentait la fibrose, l’angiogenèse et l’inflammation dans le microenvironnement des tumeurs mammaires favorisant ainsi l’agressivité tumorale et en particulier l’apparition de métastases [16]. Les CAAs expriment aussi la MMP11 (ou Stromelysine 3) qui appartient à la famille des métalloprotéases [17]. L’expression de cette protéine de remodelage de la MEC par les CAAs favorise la progression tumorale via sa capacité à cliver la MEC (étape importante pour l’invasion), mais aussi certains de ces substrats, les rendant ainsi plus actifs [18]. C’est le cas du COL6 puisqu’il a été montré que le COL6 est un substrat de la MMP11 [18]. La dernière caractéristique des CAAs, et qui pourrait être la plus originale, est la perte des AG contenus dans les gouttelettes lipidiques, perte que nous avons observé in vitro et in vivo (Dirat et al, 2011 ; voir figure 2). Nous avons récemment montré au laboratoire que ces AGs libérés par les adipocytes sont transférés dans les cellules tumorales (Wang et al, résultats non publiés). Ce même dialogue métabolique a été montré dans le cancer de la prostate [19] et dans le cancer de l’ovaire disséminé [20]. Les cellules de cancer de l’ovaire disséminent fréquemment au niveau de l’omentum, région péritonéale riche en adipocytes. Sous l’effet d’un processus de lipolyse, les adipocytes se délipident, et les tumeurs ovariennes se chargent ainsi en lipides relargués qu’elles accumulent sous forme de gouttelettes [20]. Ce transfert de lipides est important pour la croissance de la tumeur dans l’omentum [2]. Ces AGs pourraient être utilisés 5 ARTICLE ORIGINAL Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse (LAL) de l’effet cytotoxique de la vincristine [26]. Cette protection vis-à-vis des médicaments antitumoraux a été retrouvée pour d’autres types de molécules (dexamethasone, daunorubicine et nilotinib), ce qui suggère l’émergence d’un phénotype de résistance pléiotropique (ou « multidrug résistance ») qui pourrait dépendre, dans le cadre des LAL, d’une diminution de la mort par apoptose [26]. Enfin, l’inhibition de l’endotrophine, le produit de clivage du COL6 sensibilise les tumeurs au cisplatine [27]. L’ensemble des modifications résultant de l’interaction entre cellules tumorales et adipocytes est résumé dans la figure 2. Du fait de la composition de la glande mammaire, la plupart des travaux concernant l’interaction entre TA et cancer ont été consacrés aux cancers du sein. Il n’en demeure pas moins que la plupart des cancers invasifs va se retrouver à un moment donné de l’histoire de la maladie à proximité du TA. C’est le cas du cancer de la prostate invasif qui va envahir la graisse périprostatique, du cancer du côlon qui va se retrouver au contact de la graisse périviscérale, du cancer de l’ovaire qui dissémine au niveau de l’omentum ou du mélanome qui va rejoindre les couches profondes du derme. Dans toutes ces situations, une délipidation et une dédifférentiation partielle des adipocytes est observée ([28] et résultats de notre équipe non publiés). Certaines modifications plus spécifiques identifiées dans le cancer du sein sont retrouvées dans d’autres types de cancer comme par exemple l’augmentation de l’IL6 dans la graisse périprostatique [29]. Le dialogue métabolique apparaît quant à lui assez ubiquitaire [28]. Cette « proximité dangereuse » débouchant sur un dialogue délétère pourrait donc permettre d’aboutir à des concepts plus généraux en cancérologie et surtout au développement de stratégies thérapeutiques d’application élargie. LE DIALOGUE LOCAL ENTRE ADIPOCYTES ET CANCER EXPLIQUE-T-IL LES LIENS DÉLÉTÈRES ENTRE OBÉSITÉ ET CANCER ? Il existe donc un lien maintenant établi entre l’obésité et le pronostic du cancer du sein, ce lien semblant aussi exister pour d’autres cancers tels que le cancer de la 6 CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 prostate ou du colon [2]. Comme montré précédemment, l’ensemble de nos résultats ainsi que ceux de nos collègues supportent le concept innovant selon lequel les adipocytes participent à un cercle vicieux, initié par les cellules cancéreuses et favorable à la progression tumorale [3] ; [4] ; [24]. Notre hypothèse est que les adipocytes présents à proximité des tumeurs seraient, chez l’obèse, encore plus enclins à stimuler la dissémination locale et à distance ce qui pourrait expliquer le pronostic défavorable observé chez ces patients [7]. Chez le sujet obèse, le nombre (hyperplasie), la taille (hypertrophie) ainsi que le profil de sécrétion des adipocytes est altéré [24]. Il est maintenant clairement établi que le TA viscéral (TAV), c’est à dire présent dans les couches profondes de l’abdomen, des sujets obèses présente un état d’inflammation dit de « bas bruit » participant aux nombreux effets délétères métaboliques et cardiovasculaires de l’obésité [30] ; [31]. Cet état inflammatoire est marqué par une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (dont l’IL6), et par une infiltration de macrophages entourant le plus souvent des adipocytes nécrotiques, structure en couronne encore appelée « Crown-like structures » ou CLS [12]. Enfin, dans le TAV de sujets obèses, l’expression des composants de la MEC est modulée (afin de s’adapter à l’expansion hypertrophique des adipocytes) pouvant créer un état local profibrotique. Si l’on résume, on trouve donc dans le TAV d’un individu obèse, indépendamment de tout cancer, des modifications qui sont présentes dans les CAAs telles que l’inflammation, la fibrose et une augmentation de la libération d’AGs (figure 3). Ainsi ce terrain pourrait être tout à fait favorable à un dialogue amplifié avec la cellule tumorale. Il est important ici de souligner que l’ensemble de ces modifications a été décrit pour le TAV. De façon très intéressante deux études récentes montrent que le tissu adipeux mammaire chez l’obèse présente des similitudes par rapport au TAV. Une hypertrophie adipocytaire, proportionnelle à l’IMC, est également observée dans le TA mammaire, ainsi qu’un état inflammatoire, caractérisé par la présence de CLS et l’augmentation de l’expression des cytokines proinflammatoires [32] [33]. Ces résultats sont donc tout à fait en faveur de l’hypothèse proposée dans le cancer CAMILLE LEHUÉDÉ & COLL Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse Figure 3 : Dialogue adipocyte/cancer dans un contexte d’obésité. L’hyperplasie et l’hypertrophie des adipocytes rencontrées dans le tissu adipeux (TA) des sujets obèses ont pour conséquences la modification des sécrétions adipocytaires, l’apparition d’une fibrose et un état sub-inflammatoire. Ces modifications pourraient exacerber le dialogue entre ces deux composants, expliquant le pronostic défavorable observé pour les patients obèses. L’intensité de la coloration rouge représente le degré d’agressivité des tumeurs. du sein qui reste notre modèle de prédilection. Les modèles animaux offrent une opportunité intéressante de valider cette hypothèse. Ainsi, l’équipe de Stephen Hursting a récemment montré que l’implantation orthotopique dans la glande mammaire de lignées triple négatives (M-Wnt) dans des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique, entraine une augmentation de la croissance tumorale, par comparaison à un groupe témoin. A l’inverse, des souris soumises à une restriction calorique présentent une diminution significative de la taille tumorale, comparée au même groupe témoin [34]. De la même manière, l’équipe de L. Miele a montré que la progression tumorale mammaire était également augmentée dans des souris obèses transplan- tées avec une lignée ER+, E0071, ce qui était associé à une augmentation de l’angiogenèse tumorale consécutive à une sécrétion accrue de VEGF [35]. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ces effets restent encore à caractériser de façon fine à la fois dans des tumeurs humaines, dans des modèles murins et dans des modèles de coculture utilisant du TA isolé à partir de sujets obèses et normopondéraux. Enfin, si dans la progression tumorale nous pensons que la tumeur est probablement plus encline à utiliser le TA à proximité (effet paracrine), l’importance des mécanismes endocrines ne doit pas être négligée en particulier dans les étapes initiales de la carcinogenèse. L’obésité et les modifications métaboliques qui y sont associées pourraient CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 7 ARTICLE ORIGINAL Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse favoriser la carcinogenèse via l’insulino-résistance, les modifications des taux d’adipokines circulantes (excès de sécrétion de leptine et de cytokines pro-inflammatoires, défaut de sécrétion d’adiponectine). L’augmentation de la production d’œstrogènes pour les cancers gynécologiques est aussi à prendre en compte, le TA étant pourvu d’une activité d’aromatisation des androgènes en œstrogènes, aspect important surtout en période post-ménopausique. Le lecteur intéressé par les facteurs endocrines pouvant contribuer à la carcinogenèse pourra lire les revues suivantes [24] ; [23] ; [36]. RISQUE ONCOLOGIQUE DE L’UTILISATION DE TISSU ADIPEUX EN CHIRURGIE RECONSTRUCTRICE ? Le rôle des adipocytes dans la progression tumorale, notamment dans le cancer du sein peut également avoir un impact dans l’utilisation de l’injection de TA autologue dans des processus de chirurgie réparatrice après une mastectomie partielle ou totale. Cette technique, appelée lipotransfert ou lipofilling permet de « combler » les défauts, notamment d’irrégularité et le manque de volume ou, plus rarement, de reconstruire entièrement un sein. La simplicité, les résultats esthétiques et plastiques de cette méthode suscitent un intérêt croissant [37]. Cette technique, développée par Sydney R. Coleman et connue sous le nom de « technique de Coleman » consiste à prélever du TA sous-cutané, classiquement au niveau de l’abdomen ou des cuisses et à le réinjecter dans le parenchyme mammaire, de la même patiente après une courte centrifugation, afin d’éventuellement éliminer l’huile, l’excès de fluides et les contaminants [37] [38]. Ainsi, la préparation administrée contient de nombreux types cellulaires présents dans le tissu adipeux comme des adipocytes et des précurseurs adipocytaires susceptibles de favoriser la progression tumorale [39]. En outre, on sait que la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie ne sont pas toujours suffisantes pour éradiquer toutes les cellules tumorales lors du traitement et de nombreuses études ont montré la présence de cellules quiescentes, « en dormance », cellules potentiellement très sensibles 8 CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 aux changements de leur microenvironnement [40]. Ainsi le risque carcinologique de cette technique doit être évalué, d’autant plus qu’un article récent montre chez la souris que le matériel utilisé pour le lipofilling pouvait, après tumorectomie, favoriser l’apparition de métastases secondaires [41]. Dans cette étude, les auteurs attribuent le risque carcinologique à une sous-population de cellules souches capables de favoriser la vascularisation tumorale. Une étude clinique rétrospective avec un groupe témoin a été publiée récemment par l’Institut Européen du Cancer de Milan. Cette étude ne montre pas de différence significative du taux de rechutes entre les deux groupes, toutefois une augmentation des rechutes chez les patientes ayant un cancer in situ a été noté dans le groupe ayant reçu un lipofilling [42]. Une autre étude rétrospective avec groupe témoin a été réalisée très récemment par la même équipe, centrée uniquement sur les patientes présentant des lésions intra-épithéliales, étude qui confirme les résultats précédents [43]. Si aucune conclusion définitive ne peut être tirée de ces premiers travaux (car elles concernent un faible nombre de patientes), des études supplémentaires sur des échantillons plus importants doivent être impérativement réalisées afin de confirmer ou d’infirmer les risques de cette technique sur les possibilités de récidives locales des cancers du sein in situ traités par tumorectomie. Enfin, les améliorations constantes de cette technique avec notamment l’apport de cellules souches adipocytaires nécessitent aussi des investigations cliniques spécifiques si l’on s’en réfère à la potentielle dangerosité des cellules souches révélée par les études effectuées chez la souris [41] [39] [44]. CONCLUSION De nombreux arguments soulignent maintenant le rôle du tissu adipeux dans le cancer, notamment le cancer du sein. Ce tissu complexe, majoritairement composé d’adipocytes, peut être modifié dans des contextes pathologiques en particulier l’obésité. L’ensemble de nos résultats montre le dialogue bidirectionnel néfaste qui s’instaure entre les cellules tumorales mammaires et les adipocytes présents à proximité des tumeurs, influençant notamment leur capacité métastatique [14]. Ces adipocytes « activés » par les cellules tumorales ou CAAs présentent des modifications importantes, comme une délipidation, l’acquisition d’un phénotype inflammatoire et profibrotique [14] [20]. Comprendre et cibler les acteurs impliqués dans le dialogue entre cellules tumorales et adipocytes permettraient d’apporter un bénéfice thérapeutique important pour les patients atteints de cancer en particulier dans un contexte d’obésité. REMERCIEMENTS Les travaux effectués dans nos équipes sont soutenues par l’Institut National du Cancer (INCA PL 2006– 035 et INCA PL 2010-214 GE, PV et CM), La Ligue contre le Cancer Midi-Pyrénées (Comité du Lot, de la Haute-Garonne et du Gers, CM), la Fondation de France (PV et CM), l’Association pour la Recherche sur les Tumeurs Prostatiques ARTP (CM) and l’Université de Toulouse (Appel d’offre du conseil scientifique 2009, CM). RÉFÉRENCES [6] Ewertz, M., et al., Effect of obesity on prognosis after early-stage breast cancer. J Clin Oncol, 2011. 29(1): p. 25-31. [7] Sinicrope, F.A. and A.J. Dannenberg, Obesity and breast cancer prognosis: weight of the evidence. J Clin Oncol, 2011. 29(1): p. 4-7. [8] Hanahan, D. and R.A. 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Cancer Letters 324 (2012) 142–151 Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Cancer Letters journal homepage: www.elsevier.com/locate/canlet Mini-review Adipose tissue and breast epithelial cells: A dangerous dynamic duo in breast cancer Yuan-Yuan Wang a,b,c, Camille Lehuédé a,b,d, Victor Laurent a,b, Béatrice Dirat a,b,d, Stéphanie Dauvillier a,b, Ludivine Bochet a,b,d, Sophie Le Gonidec a,d, Ghislaine Escourrou e, Philippe Valet a,d, Catherine Muller a,b,⇑ a Université de Toulouse, UPS, IPBS, F-31077 Toulouse, France Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS UMR 5089, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077 Toulouse, France c Department of Endocrine and Breast Surgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, China d Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM U1048, F-31432 Toulouse, France e Service d’Anatomo-Pathologie, Hôpital de Rangueil, 1, avenue Jean-Poulhes, TSA 50032, 31403 Toulouse, France b a r t i c l e i n f o Article history: Received 28 March 2012 Received in revised form 14 May 2012 Accepted 16 May 2012 Keywords: Adipose tissue Breast cancer Microenvironment Obesity Inflammation a b s t r a c t Among the many different cell types surrounding breast cancer cells, the most abundant are those that compose mammary adipose tissue, mainly mature adipocytes and progenitors. New accumulating recent evidences bring the tumor-surrounding adipose tissue into the light as a key component of breast cancer progression. The purpose of this review is to emphasize the role that adipose tissue might play by locally affecting breast cancer cell behavior and subsequent clinical consequences arising from this dialog. Two particular clinical aspects are addressed: obesity that was identified as an independent negative prognostic factor in breast cancer and the oncological safety of autologous fat transfer used in reconstructive surgery for breast cancer patients. This is preceded by the overall description of adipose tissue composition and function with special emphasis on the specificity of adipose depots and the species differences, key experimental aspects that need to be taken in account when cancer is considered. Ó 2012 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. 1. Introduction There is now cumulative evidence that cells immediately adjacent to a tumor are not only passive structural elements but also active actors in tumor progression (for reviews [1–3]). The tumor mass is undoubtedly a multifaceted show, where different cell types, including neoplastic cells, fibroblasts, endothelial and immune-competent cells, interact with one another continuously to favor tumor progression [1,4]. The carcinoma stroma shares many traits with conditions of chronic inflammation or wound healing and accordingly, tumors have been described as ‘‘wounds that never heals’’ [5]. Infiltration of inflammatory cells including T cells, neutrophils and macrophages, among others, is a very common feature in breast cancer lesions [6,7]. In addition, it is becoming increasingly clear that cancer-associated fibroblasts (CAFs) are also prominent modifiers of breast cancer progression [2]. Among the many different cell types surrounding breast cancer cells, the most abundant are those that compose mammary adipose tissue (MAT) (see Fig. 1), mainly mature adipocytes and progenitors (preadipocytes and Adipose-Derived Stem cells [ADSCs]). For a long time, MAT has not been considered more than a casual ⇑ Corresponding author at: Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS UMR 5089, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077 Toulouse, France. Tel.: +33 561175932. E-mail address: [email protected] (C. Muller). 0304-3835/$ - see front matter Ó 2012 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2012.05.019 observer, and certainly not a disease modifying entity. However, recent accumulating evidences bring the tumor-surrounding adipose tissue into the light as a key component of breast cancer progression. Both progenitors and mature adipocytes are not passive towards breast cancer cells and exhibit specific traits that begin to be characterized, as their ability to contribute to local inflammation through IL-6 secretion [8,9]. The effect of MAT does not appear to be limited to tumor progression but may also affect the early stages of carcinogenesis and the response to treatment of established tumors [10]. Studying the multifaceted role of MAT in breast cancer is of major clinical importance. In fact, obesity has recently emerged as an independent negative prognosis factor for breast cancer independently of menopause status [11,12]. This relationship has major consequences in public health since the prevalence of overweight and obesity has been increasing worldwide over the past decades and reaches alarming dimensions. According to the World Health Organization (WHO), by 2015 there will be 3 billion overweight and 700 million obese adults worldwide. Although not demonstrated experimentally, one might reasonably speculate that the positive contribution of MAT into tumor progression might be amplified in obese women, therefore explaining in part the poor prognosis observed in this subset of patients. The expected striking increase in the incidence of these aggressive cancers in the near future related to obesity turns the knowledge of this field of great impact. Another clinical consequence of the experimental studies Y.-Y. Wang et al. / Cancer Letters 324 (2012) 142–151 Ad IF IF IF C Fig. 1. In breast cancers, early local tumor invasion results in immediate proximity of cancer cells to adipose tissue. Histological examination of an invasive breast tumor after H&E staining (original magnification X 200). Ad, adipose tissue; IF, invasive front; C, tumor center. Note that at the invasive front, the number and size of adipocytes are reduced (indicated by arrows). on the crosstalk of epithelial cells and MAT concerns the safety of autologous fat transfer, also defined as lipofilling procedures, used to improve the results of the total or partial reconstruction in breast cancer patients [13]. The purpose of this review is to emphasize the role that MAT might play by locally affecting breast cancer cell behavior and subsequent clinical consequences arising from this dialog. This will be preceded by the overall description of adipose tissue (AT) composition and function with special emphasis on the specificity of adipose depots and the species differences, key aspects that need to be taken in account when cancer is considered. Of note, AT constitutes an active endocrine organ that can have far-reaching effects on the physiology of other tissues. To understand the endocrine effect of adipose tissue on breast cancer the reader is referred to reviews on that topic [14,15]. 143 involved mainly in the control of weight regulation, the BAT is the main tissue regulating thermogenesis in response to food intake and cold. WAT, which will be covered in this review, is mainly comprised of adipocytes, although other cell types contained in the so-called stroma vascular fraction (SVF) contribute to its growth and function, including ADSCs, preadipocytes, lymphocytes, macrophages, fibroblasts and vascular endothelial cells [16]. Mature white adipocytes have a spherical shape and a single lipid droplet, surrounded by a reduced rim of cytoplasm, which essentially occupies the fat cell volume (see Fig. 2). Mature adipocytes, first thought as energy-storing cells, have emerged this last decade as highly endocrine cells which are able to secrete hormones, growth factors, chemokines or pro-inflammatory molecules, an heterogeneous group of molecules termed «adipokines» [16]. Traditionally, the two major adipose depots considered and the more extensively studied are the visceral (VAT) and subcutaneous (SAT) adipose tissues. Differences between adipocytes from visceral and subcutaneous depots have been recognized for many years including their unique profile of adipokines production (for review see, [16]). In addition, VAT adipocytes exhibit higher rates of fatty acid turnover and lipolysis, and are less responsive to the anti-lipolytic effects of insulin and catecholamines than SAT adipocytes [17]. There is clearly a different impact on VAT versus SAT on human health. Increase in VAT is particularly linked to obesity-related complication such as type 2 diabetes, cardiovascular diseases and dyslipidemias whereas, storage of fat in subcutaneous adipose tissue (SAT) is linked to a lower risk for such conditions [16]. Accumulating evidence indicates that a state of chronic low-grade inflammation has a crucial role in the pathogenesis of obesity-related metabolic dysfunction in intra-abdominal adipose depots as opposed to subcutaneous depots. Accordingly, obese subjects were found to harbor increased AT macrophage content mainly in visceral depots [16,18]. 2.2. What are the specificities of mammary adipose tissue? 2. White adipose tissues: common features and differences, consequences on breast cancer studies 2.1. Characterization of white adipose tissues: common features and depot-specific differences in obesity conditions Mammals have two main types of adipose tissue: white adipose tissue (WAT), and brown adipose tissue (BAT), each of which possesses unique cell autonomous properties. While WAT is specialized in storing energy and is an important endocrine organ Normal Mammary Adipose Tissue The different impact of visceral versus subcutaneous fat on health during obesity conditions highlights an important concept in adipose tissue biology, namely, that fat in different body locations exhibits distinct features and functional characteristics. Regarding this later point, what is the specificity of MAT? The mammary gland is comprised of myoepithelial and luminal epithelial cells embedded in a complex stroma termed mammary fat pad composed predominantly of fibroblasts and adipocytes, and cells of both the interspersed vasculature and lymphatic systems [19]. A In vitro differentiated preadipocytes Fig. 2. Differences between in vivo mature adipocytes and in vitro differentiated cells. Left panel, Histological examination of normal mammary adipose tissue after H&E staining (original magnification X 400). Note that mature white adipocytes have a single lipid droplet (in white), which essentially occupies the fat cell volume surrounded by a reduced rim of cytoplasm. Right panel, phase contrast microscopy of preadipocytes cells after differentiation into mature adipocytes. Note that the differentiated cells have a rounded shape with multiple lipid droplets in the cytoplasm. 144 Y.-Y. Wang et al. / Cancer Letters 324 (2012) 142–151 long-standing line of evidence suggests that, at least in rodents, mammary fat pad is essential for the post-natal development of mammary epithelium by providing signals mediating ductal morphogenesis [19,20]. Adipocytes within the mammary fat pad specifically participate to the development of the normal mammary gland. For example, it has been shown that the total absence of breast fat in transgenic mice prevents normal mammary gland development [21]. The mammary adipocytes are very active during the transitions from pregnancy to lactation and into involution (corresponding to the post-lactation regression of mammary epithelium) underlying their responsiveness to local signals from the epithelium [22]. Briefly, during lactation, mammary adipocytes in close proximity to epithelial cells exhibit rapid depletion of their lipid store due to enhanced lipolysis. By contrast, the involution period is associated to a refilling of mammary adipocytes that is completed approximately within 4 days. Intimate and bidirectional interaction with adjacent epithelium is one of the hallmarks of mammary adipocytes, suggesting that this dialog might persist in physiopathological conditions such as cancer. It is also very important to underline that there is undoubtedly species differences concerning the composition and function of mammary fat pad between humans and rodents that should be taken in account when results obtained in rodents are extrapolated to humans. In contrast to rodents where the mammary fat pad consists primarily of adipocytes, human mammary adipose tissue is extensively interlaced with a network of fibroblasts and associated connective tissue [20]. Therefore, in murine mammary glands, the adipocytes are immediately adjacent to the ductal epithelial cells, whereas in human mammary glands, a fibrous layer separates the two cell types. In addition, it has been clearly shown that human mammary epithelium transplanted into the mammary fat pad of mice did not grow out unless human stromal fibroblasts are incorporated into the cleared fat pad [23]. 2.3. Models used to study the AT/breast cancer crosstalk: from established preadipose cell lines to freshly isolated cells These specificities in terms of depots as well as species raise the question of the source of adipose cells that should be used in experimental studies to study the breast cancer/adipose tissue connection. The detailed description of all the available human and murine models can be found in the extensive review recently written by Lafontan [24]. For feasibility reasons, the most common in vitro models used are the murine preadipocyte cell lines 3T3-L1 and 3T3-F442A cells. These cell lines were clonally isolated from Swiss 3T3 cells (derived from disaggregated 17- to 19-day mouse embryos). This clonality circumvents donor-to-donor variability of primary cells, providing standardized conditions [24,25]. They exhibit a fibroblast-like morphology and are already committed in the adipocyte lineage. Their differentiation into mature adipocytes can be achieved in vitro by the addition to confluent cells, in a serum-containing medium, of adipogenic stimuli, including glucocorticoids (dexamethasone), drugs that increase cyclic AMP levels (IBMX) and insulin for 3T3-L1 and insulin alone for 3T3-F442A, that are committed to a later stage of adipocyte differentiation [24,25]. Although these in vitro models share many similarities with primary adipocytes—including triglycerides storage, expression of adipocyte-specific genes and responsiveness to lipogenic and lipolytic factors, some differences persist. For example, triglycerides are stored in multiple lipid droplets in in vitro differentiated adipocytes in contrast to normal mature adipocytes that exhibit a unique large lipid droplet (see Fig. 2). This ‘‘incomplete’’ differentiation might lead to a lower expression of some genes and several adipocytes functions such as adipokines secretion. This is the case for example of leptin [26], an adipokine involved in the stimulation of the proliferative and migratory properties of cancer cells (see below). To circumvent these limits, the use of long-term culture of 3T3-L1 differentiated on 3D polymeric scaffolds has been proposed [27]. In vivo transplantation studies strongly reinforce the interest of these models, especially the 3T3-F442A preadipose cell line. In fact, when implanted subcutaneously into athymic mice at an anatomic site devoid of adipose tissue, the 3T3-F442A preadipocytes differentiate, and within few weeks, fat pads morphologically similar to normal subcutaneous adipose tissue developed at the site of injection [26]. An original 2D coculture system setup in our laboratory using human breast cancer cell lines and in vitro differentiated 3T3-F442A adipocytes mimics the adipocytes changes observed at the invasive front of breast tumors [9], underscoring the validity of these mouse models in cancer studies (see also below Section 3). More recently, a human multipotent adipose-derived stem cells (hMADS) cell line was isolated from the adipose tissue of young donors and established in culture. When differentiated into adipocytes, the cells show a lipolytic system similar to that reported in human mature adipocytes, therefore representing a promising tool in adipocyte biology [24]. Finally, mature adipocytes can be obtained from the in vitro differentiation of the SVF of adipose tissues (that contains ADSCs) from human and rodents in defined culture conditions either in 2D or 3D culture systems [24,28]. A clear limitation of the use of these human and murine preadipocyte cell lines and primary precursors present in the SVF fraction is that they are not suitable models to study obesity-related condition due to their inability to undergo hypertrophy in vitro. Therefore, the use of mature adipocytes isolated from AT of lean and obese subjects should be considered. In fact, adipocytes isolated from whole AT of either lean or obese (human or mouse) subjects exhibit similar features in vitro than in situ as far as they are maintained in appropriate culture conditions. From a structural point of view, isolated fat cells from obese are hypertrophied while those obtained from lean are smaller. Isolated adipocytes from lean and obese subject exhibit also functional differences in terms of lipid mobilization and adipokines secretion [29,30]. The isolation of adipocytes from the extracellular matrix and the SVF fraction is a technique available in many laboratories whatever the AT considered including MAT [9]. Briefly, collagenase treatment of AT release the fat cells from extracellular matrix. Fat cells, owing to their own fat content are floating whether the SVF fraction remains in the pellet [24]. Coculture system using this source of cells to obtain insight into the crosstalk with tumor cell population is clearly limited by the fact that these isolated mature adipocytes cannot be used for long terms culture. Isolated adipocytes in suspension in an appropriate culture medium remain viable for approximately 24 h but after this period both survival and function are profoundly altered [24]. Primary culture of AT explants represents a useful alternative to both improve adipocyte viability and preserve the entire tissue environment and structure. Several laboratories have been using adipose tissue explants culture to study the influence of various pharmacological or nutritional factors. Adipocytes can also be isolated from the explants after the treatment in order to focus on the fat cell itself [29]. However, such a tri-dimensional structures in vitro do not allow an accurate oxygen and nutrients supply during long -term periods leading to hypoxia-induced alterations of adipocyte function such as an increased anaerobic glycolysis or TNF-a accumulation [31]. Therefore, adipose tissue explants must be considered as useful over less than 48 h period after culture. Again, 3D culture of isolated adipocytes from lean and obese subjects on various scaffolds remains the most promising alternative for long-term coculture, model which is currently largely untapped with the exception of some studies using isolated adipocytes from rat and mice AT [32,33]. Finally, to study the in vivo cross-talk in both rodents and human breast tumors, modifications of the tumor-surrounding adipose tissue could be Y.-Y. Wang et al. / Cancer Letters 324 (2012) 142–151 characterized using either immunochemistry [9,34,35], qPCR on isolated mature adipocytes and precursors [9] or a proteomic approach [36]. To conclude, as a first step, the use of human and murine preadipocyte cell lines after in vitro differentiation represents highly useful tools to study the crosstalk with breast cancer cells. Nevertheless, the results obtained should be validated in vitro using mammary primary adipose cells in 2D (and ideally in 3D) coculture systems and in vivo in human breast tumors to ensure their relevance. 3. Paracrine role of the different components of adipose tissue in breast cancer progression There are long standing arguments in the literature showing that fat tissue is able to support and amplify breast cancer progression. In 1992, Eliott and colleagues showed that the murine carcinoma SP1 cell line grew best when injected in the mesenteric and ovarian fat pads and in the mammary gland, but very poorly in the subcutis or peritoneal cavity [37]. Moreover, mammary tumors cells transplanted into various adipose tissue depots subsequently metastasize to different organs. Massive dissemination of tumors from the ovarian and mesenteric sites occurs to the liver, spleen and diaphragm whether metastases from the mammary site occur primarily in the lung [37]. The positive influence of the local mammary fat-rich microenvironment on breast cancer growth is also sustained by the increase in xenograft success in mice when orthotopic, rather than subcutaneous, injections are employed [38]. In humans, it has been proposed that the adipose tissue invasion (ATI) at the tumor margin, as well as the invasive length of fat invasion, are indicators of tumor aggressiveness in early stage breast cancers [39]. It has been previously emphasized that adipose tissue at close distance to breast tumors is a source of pro-inflammatory cytokines such as IL-6, TNF-a, and reactive oxygen species [40]. A detailed proteomic study of fresh fat tissue samples collected from tumors of high risk breast cancer patients identified a large array of proteins, including numerous signalling molecules, hormones, cytokines, and growth factors, involved in a variety of biological processes such as signal transduction and cell communication, energy metabolism, protein metabolism, cell growth and/or maintenance, immune response and apoptosis [36]. As stated before, AT is composed of different cell types. Accordingly, regarding the specific cellular components of this tissue, namely mature adipocytes and preadipocytes/ADSCs, two important questions remain open: do they both participate in breast tumor progression and what are the signalling pathways involved? 3.1. Mature adipocytes are key actors in breast cancer progression: the concept of cancer-associated adipocytes (CAAs) As mentioned before, mature adipocytes are highly active endocrine cells and are therefore excellent candidates to play a crucial role in the control of tumor behavior through heterotypic signalling processes. One of the first evidence of their role in breast cancer progression came from the study of Manabe et al. [41], showing that the rat mature adipocytes, but not the preadipocytes, promote the growth of several oestrogen-receptor (ER)-positive breast cancer cell types. The same year, the pioneering study of the group of P. Scherer demonstrated that the full complement of adipokines, represented by the conditioned-medium of mature 3T3-L1 murine adipocytes, showed an unparalleled ability to promote the growth, cell motility and invasion of ER-negative and positive breast cancer cells in vitro [42]. Combined, these first studies shed in light the crosstalk between adipocytes and breast cancer cells and under- 145 score the need to fully understand the role of this heterotypic signalling in modulation of tumor behavior. As stated in the introduction of this review, cancer cells usually go about generating a supportive microenvironment by activating the wound-healing response of the host. For example, resident fibroblasts are capable of adapting to tissue injury (including cancer), and as a result change their phenotype to become ‘‘reactive.’’ In order to investigate if such phenotypic changes are observed in tumor-surrounding adipocytes, a 2D coculture system in which adipocytes and breast cancer cells were separated by an insert, that allows the diffusion of soluble factors, was setup in our laboratory to mimic the adipocyte-cancer cell crosstalk at the tumor invasive front [9]. Using this original model, we extensively described tumor-induced changes in adipocytes that are reproducibly displayed by both mouse and human mammary adipocytes. Adipocytes cocultivated with various human and murine breast cancer cell lines generally exhibit a loss of lipid content, a decrease in late adipose markers expression, and over-expression of inflammatory cytokines (such as IL-6 and IL-1b) and proteases (such as MMP-11 and PAI-1). We named these tumor-surrounding adipocytes, ‘‘Cancer-Associated Adipocytes’’ (CAAs). Equally important, using immunohistochemistry and quantitative PCR, we confirmed the presence of these modified adipocytes in human breast tumors. What are the effects of these CAAs on tumor progression? All murine and human tumor cells cocultivated with mature adipocytes exhibited increased invasive, but not proliferative, capacities in vitro and in vivo. In tumor cells, these increase invasive capacities were associated with incomplete epithelial to mesenchymal transition (EMT). In the case of IL-6, we further showed that it plays a key role in the acquired pro-invasive effect, and associated EMT, by tumor cells. Interestingly, the human breast tumors of larger size and/or with lymph nodes involvement exhibit the higher levels of IL-6 in tumor surrounding adipocytes [9]. Such an inflammatory state in the tumor-surrounding adipose tissue has also been described for prostate cancer. High levels of IL-6 were found in the periprostatic adipose tissue of tumor-bearing patients and the levels of IL-6 correlated with the aggressiveness of the tumors, highlighting the importance of this cytokine in the adipocyte/cancer cells crosstalk [43]. Another very important aspect of this crosstalk concerns the remodelling of the ECM. Collagen VI (COLVI) is abundantly expressed in tumor-surrounding adipocytes and adipocyte-derived COLVI production is involved in mammary tumor progression in vivo [35,42]. In the same way, adipocytes at the invasive front of human tumors consistently exhibit increased expression of metalloprotease 11 (MMP-11)/stromelysin 3 [34]. Increase local fibrosis and its permanent remodelling (generating ECM components functioning as signalling molecules) have been clearly implicated in tumor progression. This association seems to justify prominently, the role of both COLVI and MMP-11 overexpression in a tumor context. In addition, these events might directly contribute to the occurrence of the CAAs phenotype since adipocytes actively reorganize the ECM during differentiation processes [44]. For example, it has been shown that MMP-11 is a potent negative regulator of adipogenesis [34]. In fact, a relative degree of ‘‘dedifferentiation’’ is one of the hallmarks of CAAs [9,34]. Supported by epidemiological evidence, animal models and in vitro studies, two adipokines, leptin and adiponectin, have been largely involved in breast cancer occurrence and progression [15,45]. Schematically, leptin appears to promote tumor cells growth by mainly stimulating the activity of signalling pathways involved in proliferation process whereas adiponectin repressed proliferation and induced apoptosis, in breast cancer cells [15,45]. The paracrine local implication for these adipokines in breast cancer cells appears to be weaker, or at least less characterized, than their endocrine effects. We found that CAAs exhibit a decrease in late adipose markers including leptin (Dirat et al., 146 Y.-Y. Wang et al. / Cancer Letters 324 (2012) 142–151 unpublished results), suggesting that this adipokine is not primarily involved in the negative crosstalk between adipocytes and breast cancer cells at the invasive front. By contrast, adiponectin expression is absent in CAAs suggesting that its negative effect on tumor progression might be hampered in these tumor-modified adipocytes [9]. CAAs derived-factors might also affect in turn the secreted profile of tumor cells. For example, it has been shown that adipocytes stimulate the expression of genes related to immune function and wound-healing in tumor cells, such as the chemokine CCL-20, the macrophage inhibitory cytokine 1 (MIC-1) or even IL-6 [10,46,47], contributing among others things, to increase tumor invasiveness. Finally, one probably underestimated effect of adipocyte/cancer crosstalk is its role in the response to antitumor therapy. We have recently shown that CAAs contribute to the occurrence of a radioresistant phenotype in breast tumor cells [10]. In a different tumor model (i.e. acute lymphoblastic leukaemia) it has been demonstrated that adipocytes impairs leukaemia treatment by Vinca alkaloids both in vitro and in vivo [48]. Taken together, all these data strongly support the concept that an intimate crosstalk is established between cancer cells and mature adipocytes at the invasive front of the tumor, whose relevance has been clearly demonstrated in human tumors [9,34,35]. Invading tumor cells are able to modify adipocytes phenotype, which, in turn, stimulate cancer cells aggressive behavior, the stimulation of local tumor invasiveness being, to our point of view, one of the key events resulting from this crosstalk. The molecular circuitry involved in these processes as well as the resulting phenotypic changes observed in both populations is summarized in Fig. 3. 3.2. Contribution of ADSCs and pre-adipocytes to breast cancer progression Studies have provided compelling in vivo evidences that mesenchymal stem cells (MSCs) distally recruited from the bone marrow contribute to breast cancer progression [49]. Even though adipose tissue is the most abundant stromal constituent in the breast and a rich source of mesenchymal stem-like cells, only recent studies addressed the question of the involvement of this resident stem cells population in breast cancer progression [50]. Globally, these studies demonstrated that ADSCs also contribute to tumor progression. ADSCs promote in vitro and in vivo the growth and survival of breast cancer cells as well as their migratory and invasive capacities [8,51–55]. Several molecules have been involved in the proinvasive effects of ADSCs including IL-6 [8], IL-8 [52], CCL-5 [53] and CXCL-12/SDF-1 [55]. More recently, it has been demonstrated that ADSCs promote the expansion of cancer stem cells and induce EMT in the cancer cells in a PDGF dependent manner [54]. As for other components of the tumor stroma, a complex network is established between tumor cells and ADSCs. Tumor cells, through TGFb signalling, are able to «differentiate» ADSCs into CAF-like cells expressing a-smooth muscle actin (a-SMA) and tenascin C [54,56]. Interestingly, ADSCs are themselves chemo-attracted towards breast cancer cells [52,57]. Therefore, these compelling results suggest that ADSCs could directly contribute to the dense network of fibroblasts (the so-called desmoplastic reaction) frequently observed in the center of breast tumors and, as such, be considered as a subpopulation of CAFs. Of note most of these studies have been performed using ADSCs from abdominal or subcutaneous sources Fig. 3. Invading tumor cells are able to modify adipocytes phenotype, which, in turn, stimulate cancer cells aggressive behavior. In breast cancer, early local tumor invasion results in immediate proximity of cancer cells to mature adipocytes. In turns, mature adipocytes exhibit profound changes. CAAs clearly contribute to increase the aggressiveness of tumor cells by increasing tumor growth, tumor invasiveness and resistance to antitumor therapy including ionizing radiation. CAAs derived-factors might also affect the secreted profile of tumor cells. Y.-Y. Wang et al. / Cancer Letters 324 (2012) 142–151 with the noticeable exception of two studies that used MAT [8,50]. As stated before since adipose depots have different biochemical profiles, it appears important to use breast-derived ADSCs when investigating the effects of ‘‘resident’’ stem cells on breast cancer cells. ADSCs obtained from reduction mammoplasty differentiate along adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineages in vitro and exhibit similar gene expression profiles and an indistinguishable immunophenotype from ADSCs from abdominoplasty specimens and bone marrow (BM)-MSCs [50]. However, notable gene expression differences are observed between stem cells from different sources, with abdominal ADSCs being more similar to BMMSCs and breast-derived ADSCs being more similar amongst them when compared to abdominal ADSCs. A comparison of the gene expression profiles breast ADSCs with BM-MSCs demonstrated that numerous genes implicated in cell growth, matrix deposition, remodelling, and angiogenesis are expressed at significantly higher levels in the local/breast ADSCs relative to BM-MSCs, suggesting that these resident stem-like cells may play a unique role in breast cancer progression [50]. More committed preadipose cells such as preadipocytes can also interact with breast cancer cells. It has been demonstrated that adipocyte differentiation is inhibited when preadipocytes are cocultivated with various breast cancer cell lines or in the presence of breast cancer cells conditioned media, this effect being dependent of TNF-a and IL-11 secreted by breast tumor cells [58]. Finally, it has been proposed that 3T3-L1 preadipocytes favored in vitro and in vivo fibronectin deposition and remodelling within the breast tumor microenvironment [59]. Again, these data favor the concept of ADSCs/preadipocytes as constituents of the CAFs population surrounding the tumors. However, it is important to note that most of these data were obtained in coculture systems 147 using breast cancer cell lines and isolated adipose precursors. In a series of 28 samples, we observed no modifications of inflammatory or protease gene expressions between the SVF fractions of adipose tissue obtained from tumorectomy or reduction mammoplasty [9]. These results obtained in human tumors suggest that within the cellular complexity of the adipose tissue, the crosstalk with tumor cells is rather established with mature adipose cells, than with their precursors. However, we cannot exclude that changes concern a minor subpopulation that does not affect the overall level of gene expression of the SVF fraction, which remains highly heterogeneous. Further experiments are clearly needed to assess that the phenotypic changes observed with isolated adipose precursors can also be observed in human tumors. The molecular circuitry involved in adipose precursors/tumor cells crosstalk described to date as well as the resulting phenotypic changes observed in both populations are summarized in Fig. 4. 4. Adipocytes could also contribute to carcinogenesis in addition to tumor progression It has been proposed that the stroma cells do not contribute only to the progression of existing tumors but can also contribute to early events in carcinogenesis [4,60]. Key to this ‘‘tumor microenvironment’’ perspective of malignancy is the idea that ‘‘initiated ‘‘ genetically primed resident cells within a tissue have a low predisposition to develop as a tumor and will probably remain dormant unless exogenous stimuli such as factors produced by activated stroma promote the carcinogenic process. A functional link between inflammation and cancer has long been recognized. Individuals suffering from chronic inflammatory disorders harbor Fig. 4. Crosstalk between tumor cells and adipose progenitors contribute to breast cancer progression. Invasive breast cancer cells could locally activate, via diverse soluble growth factors and cytokines, adipose progenitors. These activated progenitors or Adipose-Progenitors Derived Fibroblasts (ADPFs) exhibit similar characteristics than CAFs. Their increased migratory/invasive abilities allow them to join the center of the tumor and to participate to the desmoplastic reaction. These ADPFs stimulate tumor progression. Note however that all these results have been mostly obtained in in vitro coculture studies (mostly using ADSCs from other sources than MAT) and animal models and have not been fully validated in human tumors. 148 Y.-Y. Wang et al. / Cancer Letters 324 (2012) 142–151 a greatly increased risk for cancer development, owing primarily to the procarcinogenic environment generated by activated inflammatory cells [4,60]. Several studies have shown that fibroblasts can also induce a tumorigenic process. For example, when CAFs obtained from lesions of prostatic adenocarcinoma are engrafted with initiated but non tumorigenic prostate epithelial cells in mice, these later cells form tumors [61]. Senescent fibroblasts were also shown to have protumorigenic activity, underscoring a relationship between aging and cancer [62]. In mice, deleting the activity of one of the TGF-b receptors only within the fibroblasts leads to epithelial tumors in the prostate and forestomach [63]. Is there a role for adipocytes in this ‘‘tissue-integrated’’ view of carcinogenesis? Although not directly demonstrated, several studies argue in the favor of the later hypothesis. In mice, injection of unirradiated mammary epithelial cells into irradiated epithelialcell-free (cleared) mammary fat pads resulted in neoplastic transformation of the epithelial cells [64]. Interestingly, this effect appears to be independent of the systemic radiation effects since tumor incidence was restricted to the irradiated site as tested by hemi-body irradiation [64]. Of note, adipocytes by themselves have been described to be highly resistant to ionizing radiation [65]. Similarly, Maffini and co-workers [66] demonstrated that treatment of cleared mammary fat pads with the carcinogen N-nitroso-methyl urea (NMU) generated a stroma environment that allowed the development of epithelial tumors from transplanted normal epithelial cells. They even showed that treatment of the epithelial cells with NMU was not sufficient to induce tumor in untreated stromal background, but rather, required the grafting onto NMU-treated stroma [66]. The mechanisms by which this ‘‘activated’’ fat pad contributes to carcinogenesis and the signalling events involved are poorly understood. The fat pad consists, in addition to adipocytes, of various cell types. However, while in the human mammary gland, the developing mammary epithelium is closely sheathed by stromal fibroblasts in addition to adipocytes, the mouse mammary fat pad consists primarily of adipocytes [22]. Therefore, adipocytes are probably key targets of the genotoxic compounds leading to the stroma-dependent carcinogenesis models described above. Also as part of this concept, it is important to note that many environmental chemical carcinogens are indeed lipophilic, so they can bio-accumulate into adipocytes lipid droplets [67]. The local release of carcinogens from adipocytes might directly initiate, or contribute to the carcinogenesis process in adjacent epithelial cells. All of these studies, though still preliminary and mostly conducted in mouse models, open very interesting perspectives for the prevention, detection and treatment of breast cancer in humans. 5. Direct clinical consequences of the epithelial adipose tissue/ crosstalk 5.1. Obesity and breast cancer prognosis One of the main clinical consequences of the intimate crosstalk between adipose tissue and breast cancer concerns the prognosis of breast cancer in obese patients. In fact, overweight (defined as a body mass index [BMI] of 25–29.9 kg/m2) and obesity (BMI P 30 kg/m2) are now established risk factors for cancer and cancer-related mortality (for reviews see [11,12,68]). Concerning breast cancer, early studies have clearly established that obese women have an increased risk of developing postmenopausal, but not premenopausal, breast cancer [68]. Interestingly, the level of association with increasing adiposity becomes stronger with increasing time since the menopause [69]. One of the major mechanism contributing to the increased risk of post-menopausal breast cancer, as well as endometrial cancer, associated to obesity is the increase in circulating levels of estrogens since after the menopause the principal site of estrogens production is in the adipose tissue [69]. Noteworthy, excess bodyweight is not only associated to increased incidence of breast cancer, but is also an independent negative prognosis factor independently of menopause status (for reviews see [11,12]). As already discussed before [12,70], multiple factors might contribute to the poorer survival rates in obese patients with breast cancer including a higher likelihood of co-morbid conditions and other ‘‘non-biological’’ effects. However, there is now clear evidences that host factors contribute to the occurrence in obese women of tumors exhibiting at diagnosis an aggressive biology defined by an increase in lymph nodes involvement and a higher propensity to distant metastasis (reviewed in [12]). In the largest retrospective clinical study published to date, Ewertz et al. report that obesity is an independent prognosis factor for the development of distant metastases and death after the diagnosis of breast cancer [71]. The increased risk for obese women of developing distant metastases after 10 years, increased by almost 50% [71]. Obesity is associated with elevated levels of pro-inflammatory cytokines in VAT and in the circulation, which generates a lowgrade, chronic inflammatory state [72]. One hallmark of obesityassociated inflammation is the recruitment of macrophages into adipose tissue, where they form characteristic ‘‘crown-like’’ structures (CLS) around apoptotic adipocytes [72]. Interestingly, we have demonstrated that obesity and the defined profile of CAAs share inflammation as common traits [9]. Furthermore, in breast human tumors, the association of high levels of IL-6 in CAAs with high tumor size and enhanced local invasion reflect those traits present in obese patients [9]. Therefore, it is tempting to speculate that CAAs within a context of obesity should be more prone to amplify the negative crosstalk with tumor cells. Therefore, this assumption underlies that such an inflammatory condition also exists in breast adipose tissue. In opposition to VAT, very little is known about MAT and inflammation in obese subjects. Nevertheless, Subbaramaiah et al. has recently shown that obese mice (involving both dietary and genetics models of obesity) exhibit necrotic adipocytes surrounded by macrophages forming CLS in both the mammary gland and visceral fat [73]. Moreover, the presence of CLS was associated with activation of NF-jB and increased levels of pro-inflammatory mediators in the MAT of obese versus lean mice. The same team has shown that these findings can be translated into women since CLS were founded in nearly 50% of breast tissue from women undergoing mastectomy and the severity of breast inflammation was correlated with both BMI and breast adipocytes size [74]. Similarly, Sun et al. has recently shown that normal breast tissue, obtained from reduction mammoplasty of obese women, exhibit macrophages infiltration and a significant enrichment for pathways involving IL-6, IL-8, CCR5 signalling, consistent with a local pro-inflammatory state [75]. Therefore, these compelling very recent results demonstrate that obesity is associated with a sub-inflammatory state of the MAT reinforcing the hypothesis of an amplified paracrine negative crosstalk between adipose tissue and tumor cells to explain the poor prognosis observed in obese patients. However, this is still a hypothesis that remains to be validated both in vitro and in vivo. In mouse models, preliminary results have been obtained that links obesity and the occurrence of high-grade adenocarcinomas, increased tumor growth, as well as angiogenesis and distant metastasis [76,77]. These mouse models will be very helpful to identify the paracrine mechanisms involved in the stimulation of tumor progression in order to setup specific strategies for the treatment of obese patients exhibiting aggressive diseases. 5.2. Safety concerns between autologous fat grafting and breast cancer occurrence and recurrence In plastic and reconstructive surgery, autologous fat grating enables soft tissue augmentation and is increasingly used for Y.-Y. Wang et al. / Cancer Letters 324 (2012) 142–151 cosmetic indications but also for correction of defect following breast cancer treatment. Schematically, this procedure first proposed by Coleman, known as the Coleman technique, consists of the harvesting of subcutaneous fat usually from the abdominal wall or the thighs by a blunt liposuction cannula connected to a syringe, followed by a short centrifugation and injection of the cellular ‘‘fat’’ into the area of interest [78]. To maximize survival, fat is generally injected in small parcels and thin strips at different levels in the sub-cutis region of the breast [79]. Therefore, the injected preparation contains mature adipocytes as well as all the cellular components of the SVF including ADSCs/preadipocytes, endothelial cells and progenitors, fibroblasts and macrophages. Because the lipoaspirate contains at least two populations of cells, adipose precursors and mature adipocytes, which are involved in tumor–stromal interaction as we discussed before, the potential risk of this approach in increasing breast cancer recurrence (and even induction) needs to be addressed. To date, very few, if any, translational studies to evaluate the risk of fat grafting using the lipofilling technique described above are available. In our hands, the coinjection of fat used for lipofilling with human breast cancer cells dramatically increases the tumor growth in mice (I. Garrido, unpublished results). However, the design of the study was different from the clinical situation since in human, autologous fat transfer is used in treated patients and is expected to interact with dormant and not actively growing tumor cells. At clinical levels, available series addressing the oncological risk of lipotransfer in breast cancer patients are also limited [80]. Only one series using a retrospective control group has been published to date [81]. For each of the 321 patients operated for a primary breast cancer between 1997 and 2008 who subsequently underwent lipofilling for reconstructive purpose, two matched patients with similar characteristics who did not undergo a lipofilling were used as a control. This study concludes that the lipofilling transfer for breast cancer patients was a safe procedure. However, it is interesting to note that when the analysis was limited to intra-epithelial neoplasia (37 patients), the lipofilling group resulted at higher risk of local events [81]. Accordingly, prospective control protocols are clearly needed to definitively assess the safety of the procedure. In addition, recent fat transfer and lipoinjection protocols have focused on the addition of autologous ADSCs or freshly isolated adipose stromal vascular cells to promote graft volume retention [82]. This type of procedures should be considered with even greater caution with respect to conventional technique. In fact, a recent study demonstrated that the coinjection of human WAT-CD34(+) endothelial precursors cells (EPCs) from lipotransfer procedures contributed to tumor vascularisation and significantly increased tumor growth and metastases in several orthotopic models of human breast cancer in immunodeficient mice compared with coinjection with CD34 EPCs or breast cancer cells alone [83]. Interestingly in this study, the increase in axillary and lung metastases in mice injected with CD34+ WAT cells was even observed when these cells are injected after surgical removal of the initially transplanted tumor. Therefore, this first translational study designed to address the question of the safety of fat grafting highlights the urgent need of controlled clinical trials when ‘‘enriched’’ fat sources are used for lipofilling. 6. Conclusion and perspectives The AT has emerged these last 5 years as an integral and active component of breast cancer microenvironment. The role of the various cellular actors of AT begins to be addressed and it is important to underline that, to date, only the tumor-induced changes of mature adipocytes, the so-called CAAs, have been demonstrated in both in vitro studies, animal models and human tumors. Since 149 population of obese people is constantly increasing, it is of fundamental and of clinical interest to further study the relationship existing between adipocytes and breast cancer cells in order to prevent and treat this subset of aggressive diseases. As found in obese patients exhibiting an increase in both local and distant invasion, one of the principal hallmarks of the adipose tissue/cancer crosstalk appears to imply the invasive properties of tumor cells. Interestingly, it is suggested from several studies that tumor-surrounding adipose tissue, by its ability to secrete pro-inflammatory cytokines such as IL-6, contributes to local inflammation that contribute to promote an aggressive phenotype in breast cancer. Therefore, limiting inflammation through inhibition of IL-6 signalling might represent an interesting strategy to block disease progression, a strategy that need to be tested in in vitro 3D coculture models as well as in lean and obese conditions in vivo. CAAs appear to promote tumor progression by acting at least directly on the target tumor cells. However, these stromal cells might also mediate disease progression by secreting factors promoting angiogenesis and/or by creating an immunosuppressive microenvironment, hypothesis that remains to be explored. It is likely that the continued characterization of these interactions, and the molecular identification of key mediators, will provide new insights into tumor biology and suggest further novel therapeutic options. Acknowledgements Studies performed in our laboratories were supported by the French National Cancer Institute (INCA PL 2006-035 to GE, PV and CM and INCA PL 2010-214 to PV and CM), the ‘Ligue Régionale contre le Cancer’ (Comité du Lot et Haute-Garonne to CM), the Fondation de France (to PV and CM) and the University of Toulouse (AO CS 2009 to CM). CL is a recipient of a PhD fellowship from the ‘‘Ligue Nationale contre le Cancer’’. The authors would like to thank Dr Max Lafontan and Pr Jean-Yves Petit for critical reading of the manuscript. References [1] M.M. Mueller, N.E. Fusenig, Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer, Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 839–849. [2] K. Polyak, R. Kalluri, The role of the microenvironment in mammary gland development and cancer, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2010) a003244. [3] A.E. Place, S. Jin Huh, K. Polyak, The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment, Breast Cancer Res. 13 (2011) 227. [4] T.D. Tlsty, L.M. Coussens, Tumor stroma and regulation of cancer development, Annu. Rev. Pathol. 1 (2006) 119–150. [5] H.F. Dvorak, Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing, N Engl. J. Med. 315 (1986) 1650–1659. [6] A. Mantovani, F. Marchesi, C. Porta, A. Sica, P. Allavena, Inflammation and cancer: breast cancer as a prototype, Breast 16 (Suppl 2) (2007) S27–S33. 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OBJECTIFS DE THESE 121 122 Il est maintenant clair que le microenvironnement tumoral est un composant extrêmement important dans la progression tumorale (Mueller and Fusenig 2004). Parmi les cellules stromales présentes dans le microenvironnement du cancer du sein, deux types cellulaires ont particulièrement retenu notre attention : les CAFs et les adipocytes. Comme nous l’avons vu dans la première partie de cette introduction, les CAFs possèdent un rôle très important à toutes les étapes de la progression tumorale. Ils permettent notamment la création de la réaction desmoplasique, définie par une prolifération accrue des CAFs, sécrétant des protéines matricielles (collagène I, fibronectine …). De nombreux arguments ont mis en évidence que la réaction desmoplasique représente un facteur de mauvais pronostic dans le cancer du sein (Ohlund et al 2014). Malgrè le rôle important des CAFs dans le cancer, il existe une certaine ambiguité quant à l’identification et l’origine de ces cellules. Cette ambiguité est probablement liée au fait que les CAFs représentent une population cellulaire hautement hétérogène, qui possède non pas une mais plusieurs origines (Augsten 2014). Moins connus, les adipocytes se sont révélés être des cellules originales, hautement plastiques, capables de sécréter de nombreuses molécules bioactives (Ouchi et al 2011). De par leurs capacités uniques et leur abondance dans le sein, ils représentent des acteurs émergents dans la progression tumorale mammaire (Nieman et al 2013). Mon équipe a été l’une des première a montré qu’un dialogue bidirectionnel s’instaure entre les cellules tumorales mammaires et les adipocytes, à l’origine de profondes modifications des deux types cellulaires, au profit de la progression de la tumeur (Dirat et al 2011). Le rôle des adipocytes dans le cancer est d’autant plus important, que l’obésité est un facteur de mauvais pronostic global pour les cancers, notamment le cancer du sein. En effet, cette pathologie, caractérisée par une augmentation du nombre et de la taille des adipocytes ainsi que par un remaniement important du tissu adipeux est liée à des cancers du sein plus agressifs (Ewertz et al 2011). Un autre aspect de la progression tumorale, potentiellement dépendant des adipocytes est la résistance à la chimiothérapie. En effet, la chimiothérapie est largement utilisée dans le traitement du cancer du sein. Cependant, de nombreux mécanismes de résistance sont connus, à l’origine d’une augmentation des rechutes et de la mortalité des patientes (Holohan et al 2013). Le rôle des adipocytes dans la chimiorésistance des cancers du sein a été peu décrit, alors qu’ils représentent un composant important du stroma mammaire. D’autre part, l’obésité est un facteur de mauvais pronostic global pour le cancer du sein, caractérisé notamment par une chimiorésistance plus importante (Litton et al 2008). Au vu de l’ensemble de ces données, l’objectif majeur de ma thèse a été d’étudier le rôle des adipocytes sur différents aspects de la progression tumorale mammaire, en évaluant plus précisément : 123 1) L’effet prolongé des sécrétions tumorales sur les adipocytes, afin de déterminer si une partie des CAFs pourrait provenir des adipocytes et d’étudier le rôle de ces cellules sur la progression tumorale. 2) Le rôle des adipocytes dans la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires et de déterminer si ce processus est amplifié dans un contexte d’obésité. 124 RESULTATS 125 126 Article 1. Un nouveau phénotype d’origine adipocytaire : Les fibroblastes dérivés des adipocytes ou ADFs (Adipocytes-Derived Fibroblasts) L’importance des adipocytes dans la progression tumorale mammaire est désormais établie. Un dialogue bidirectionnel entre les cellules tumorales et les adipocytes se met en place. Ce dialogue donne lieu à des modifications des deux types cellulaires. En particulier, les adipocytes co-cultivés avec les cellules tumorales acquièrent un phénotype activé, que l’on a appelé CAAs pour CancerAssociated Adipocytes (Dirat et al 2011). Les CAAs sont présents au niveau du front invasif des tumeurs mammaires. Au sein du tissu tumoral, plus on se rapproche du centre de la tumeur et plus le ratio fibroblastes / adipocytes est élevé. Les fibroblastes présents dans la tumeur sont appelés CAFs pour Cancer-Associated Fibroblasts et sont à l’origine d’une forte réaction fibrotique, appelée réaction desmoplasique, de par leur présence importante et leur sécrétion accrue de protéines de la MEC. De nombreux arguments ont très clairement associé la présence des CAFs et l’agressivité des cancers, notamment leur capacité métastatique (pour revue (Mao et al 2013)). Malgré le rôle avéré des CAFs dans la progression tumorale, leur origine demeure un sujet débattu, probablement car ils possèdent non pas une, mais plusieurs origines. Ainsi, l’hypothèse que nous avons avancée est que sous l’influence des cellules tumorales, les adipocytes pourraient se réorienter en CAFs. Pour valider cette hypothèse, nous avons réalisé tout d’abord des co-cultures prolongées (de 5 à 8 jours) entre les adipocytes (différenciés à partir de la lignée 3T3-F442A) et des cellules tumorales mammaires. Nous avons montré que les adipocytes co-cultivés avec les cellules tumorales adoptent progressivement une morphologie fibroblastique, associée à une diminution drastique des marqueurs adipocytaires. En injectant des cellules tumorales mammaires dans un « fat pad » exogène constitué d’adipocytes exprimant la protéine GFP, nous avons montré l’émergence de fibroblastes-GFP infiltrant les cellules tumorales, associée à la présence d’une forte réaction fibrotique. Cette expérience a permis de valider in vivo la réorientation des adipocytes en fibroblastes, que l’on a appelé ADFs pour Adipocytes-Derived Fibroblasts. L’identification des ADFs (expression de FSP-1, propriétés migratoires et invasives et expression de protéines matricielles) nous a permis de démontrer qu’ils représentent une sous-population de CAFs. La réorientation des adipocytes en fibroblastes est liée à la sécrétion de Wnt3a d’origine tumorale, qui active en aval, la voie Wnt/β-caténine dans les adipocytes. Enfin, nous avons mis en évidence que les ADFs favorisent, de manière importante, l’invasion des cellules tumorales. De manière intéressante, nous avons montré l’existence des ADFs dans les tumeurs humaines de cancer du sein. Nos résultats indiquent, pour la première fois, que les adipocytes sont capables de se réorienter en cellules fibroblastiques en présence de cellules tumorales. Ils contribuent ainsi à la réaction desmoplasique et favorisent la progression tumorale. Ce travail a fait l’objet d’une publication dans le journal Cancer Research. 127 128 Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 Adipocyte-Derived Fibroblasts Promote Tumor Progression and Contribute to the Desmoplastic Reaction in Breast Cancer Ludivine Bochet, Camille Lehuédé, Stéphanie Dauvillier, et al. Cancer Res 2013;73:5657-5668. Published OnlineFirst July 31, 2013. Updated version Supplementary Material Cited Articles E-mail alerts Reprints and Subscriptions Permissions Access the most recent version of this article at: doi:10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 Access the most recent supplemental material at: http://cancerres.aacrjournals.org/content/suppl/2013/07/30/0008-5472.CAN-13-0530.DC1.html This article cites by 35 articles, 12 of which you can access for free at: http://cancerres.aacrjournals.org/content/73/18/5657.full.html#ref-list-1 Sign up to receive free email-alerts related to this article or journal. To order reprints of this article or to subscribe to the journal, contact the AACR Publications Department at [email protected]. To request permission to re-use all or part of this article, contact the AACR Publications Department at [email protected]. Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 Cancer Research Microenvironment and Immunology Adipocyte-Derived Fibroblasts Promote Tumor Progression and Contribute to the Desmoplastic Reaction in Breast Cancer de 1,2,3, Ste phanie Dauvillier1,2, Yuan Yuan Wang1,2,3, Be atrice Dirat1,2,3, Ludivine Bochet1,2,3, Camille Lehue 1,2 1,3 1,2 1,2 dric Dray , Romain Guiet , Isabelle Maridonneau-Parini , Sophie Le Gonidec1,3, Victor Laurent , Ce 4 Bettina Couderc , Ghislaine Escourrou5, Philippe Valet1,3, and Catherine Muller1,2 Abstract Cancer-associated fibroblasts (CAF) comprise the majority of stromal cells in breast cancers, yet their precise origins and relative functional contributions to malignant progression remain uncertain. Local invasion leads to the proximity of cancer cells and adipocytes, which respond by phenotypical changes to generate fibroblast-like cells termed as adipocyte-derived fibroblasts (ADF) here. These cells exhibit enhanced secretion of fibronectin and collagen I, increased migratory/invasive abilities, and increased expression of the CAF marker FSP-1 but not a-SMA. Generation of the ADF phenotype depends on reactivation of the Wnt/b-catenin pathway in response to Wnt3a secreted by tumor cells. Tumor cells cocultivated with ADFs in two-dimensional or spheroid culture display increased invasive capabilities. In clinical specimens of breast cancer, we confirmed the presence of this new stromal subpopulation. By defining a new stromal cell population, our results offer new opportunities for stroma-targeted therapies in breast cancer. Cancer Res; 73(18); 5657–68. 2013 AACR. Introduction One of the features of breast cancer is the presence of a dense collagenous stroma, the so-called desmoplastic response, comprising of fibroblast-like cells known as cancer-associated fibroblasts (CAF; ref. 1). Accumulating experimental evidence has shown that CAFs play an active role in breast cancer progression through the release of growth factors and chemokines and by contributing to the remodeling of the extracellular matrix (for review see refs. 2–4). CAFs are "activated" fibroblasts and were first identified upon morphologic criteria and a-smooth muscle actin (a-SMA) expression, in the same manner as wound-healing myofibroblasts (5). However, this marker is not ubiquitous, highlighting that CAFs is a heterogeneous cell population (6). Indeed, CAFs are alternatively reported to stem from resident local fibroblasts, bone marrow– derived progenitor cells, or trans-differentiating epithelial/ endothelial cells (for review, see refs. 4, 7). At present, neither de Toulouse, UPS; 2CNRS; Institut de Authors' Affiliations: 1Universite et Pharmacologie et de Biologie Structurale; 3Institut National de la Sante dicale, INSERM U1048; 4Institut Claudius Regaud, de la Recherche Me ^ pital de Rangueil, TouEA3035; and 5Service d'Anatomo-Pathologie, Ho louse, France Note: Supplementary data for this article are available at Cancer Research Online (http://cancerres.aacrjournals.org/). de contributed equally to this work. L. Bochet and C. Lehue Corresponding Author: Catherine Muller, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex, France. Phone: 33-56117-5932; Fax: 33-56117-5994; E-mail: [email protected] doi: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 2013 American Association for Cancer Research. the origin of these cells, nor the extent to which their origin determines their contribution to tumor progression can be unanimously agreed upon. We have recently shown that invasive cancer cells have a dramatic impact on surrounding adipocytes. Both in vitro and in vivo, these adipocytes exhibit a decrease in lipid content, a decreased expression of adipocyte markers, and an activated state indicated predominantly by the overexpression of proinflammatory cytokines (8). These cells are present in vivo at the tumor invasive front and retain an adipocyte-like rounded morphology. We named them cancer-associated adipocytes (CAA; reviewed in refs. 8–10). CAAs also display overexpression of extracellular matrix (ECM, such as collagen VI) and ECMrelated molecules (11–13), events contributing to breast cancer progression. As the origin of CAFs is unclear, one attractive hypothesis is that during tumor evolution, peritumoral adipocytes undergo "dedifferentiation", first into CAAs then into fibroblast-like cells that may account for a part of the CAFs population present in the desmoplastic reaction of breast cancers. Although suggested in several reviews (14, 15), this hypothesis has never been directly shown experimentally using combined in vitro and in vivo approaches. Independent of the effect of cancer cells, several recent studies have shown that mature adipocytes are in fact plastic cells capable of "dedifferentiation" towards fibroblast-like cells (16). Although limited data exists on the mechanisms that could potentially be involved in this effect, the role of soluble factors such as TNF-a, Wnt3a (17), or specific mitochondrial uncoupling (18) has been described. In vitro, recombinant MMP-11 is also able to "dedifferentiate" mature adipocytes (11). However, the existence of this phenomenon in human pathology remains elusive. In the present study, we use both in vitro and in vivo (including human www.aacrjournals.org Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. 5657 Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 Bochet et al. tumors) approaches to show that breast cancer cells are able to force mature adipocytes towards fibroblast-like cells, named adipocyte-derived fibroblasts (ADF), in a Wnt-dependent manner. We also extensively describe the distinctive phenotype of these new stromal cells, expressing some CAFs markers like fibroblast-specific protein 1/S100A4, but not a-SMA, and underline their ability to promote the spread of breast cancer cells. Materials and Methods Antibodies, probes, and drugs All the primary antibodies used in this study are presented in Supplementary Table S1. The Wnt/b-catenin inhibitor, ICG001 (19) was from Enzo Life Sciences and was used at 2.5 and 5 mmol/L final concentrations. The bodipy lipid probe (used at 1 mg/mL) and TO-PRO-3 (used at 1 mmol/L final concentration) were obtained from Invitrogen. Cell culture, cell lines, and isolation of primary adipocytes The murine 3T3-F442A preadipocytes cell line was differentiated as previously described (20). To estimate the adipocyte phenotype, triglyceride content was quantified using a colorimetric kit (Wako Chemicals) and Red Oil staining was conducted as previously described (20). The murine 4T1 breast cancer cell line (provided by Dr. S. Vagner, INSERM U563, Toulouse, France) was cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 5% fetal calf serum (FCS). The human breast cancer cell line SUM159PT (provided by Dr. J Piette, IGMM, Montpellier, France) was grown in Ham F12 (50:50) medium complemented with 5% FCS, 1 mg/mL hydrocortisone (Sigma), and 0.2 UI/mL insulin. All the cell lines were used within 2 months after resuscitation of frozen aliquots. Cell lines were authenticated on the basis of viability, recovery, growth, and morphology. The expression status of E-cadherin, N-cadherin, and vimentin using immunofluorescence approaches, as well as their invasive behavior, was confirmed before they were used in the experiments (8). Coculture of tumor cells and adipocyte was carried out using a Transwell culture system (0.4 mm pore size, Millipore) as previously described (8). In certain experiments, cells genetically modified by lentiviral vectors encoding either eGFP (Genethon, Evry; 3T3-F442A) or Hc-Red (vector core ICR; SUM159PT) were used. The isolation of mammary adipocytes either from tumor or reduction mammoplasty was carried out as previously described by our group (8). In vivo GFP-subcutaneous fat pad formation and tumor injection A total of 1 107 confluent GFP-3T3-F442A preadipocytes were injected into the flank of athymic nude mice, as described (21). Fat pad formation was allowed to proceed for 5 weeks, after which fat pads were injected with 4 104 4T1 breast cancer cells. Mice with fat pad alone or tumor cells alone were used as controls. Five mice were used in each group. After 10 days, mice were sacrificed and fat pad, tumors, and fat pads containing tumors were embedded in paraffin after 48 hours of 5658 Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 fixation in buffered formalin. The local Institutional Animal Care and Use Committee approved the experimental protocol used in our study. Immunofluorescence and immunohistochemistry Adipocytes differentiated on coverslips grown alone, or cocultivated for the indicated times with breast cancer cells were processed for immunofluorescence as previously described (8). Fluorescence images were acquired with a confocal laser microscopy system (Leica SP2). The image resolution was 512 512 pixels and scan rate was 400 Hz. For each sample, more than 100 cells were examined in at least three independent experiments. Immunohistochemistry was conducted as previously described (11). Adjacent sections were stained with hematoxylin and eosin or Masson trichrome to visualize collagen fibers (murine fat pad experiments). Images were captured on a Leica DMRA2. Western blot analysis Whole-cell extracts and immunoblots were prepared as previously described (22). All the antibodies used in this study are presented in Supplementary Table S1. RNA extraction and quantitative PCR RNA extraction and quantitative PCR (qPCR) were conducted as previously described (23). All the primers used in this study are presented in the Supplementary Table S2. Migration and invasion assays (two-dimensional) After 3 or 8 days of coculture in the presence of SUM159PT cells, adipocytes were trypsinized and used to conduct migration or Matrigel invasion assays as previously described (23). Similar Matrigel invasion assays were conducted with tumor cells grown alone or cocultivated with ADFs or with mature adipocytes during 3 days (8). In these assays, FCS (10%) was used as a chemoattractant, and similar experiments were run in parallel in the absence of serum (no chemoattractant, negative control). Spheroids formation and invasion in a threedimensional collagen matrix The hanging-drop method has been adapted to produce spheroids of similar diameter (24). Drops (20 mL) containing 1,000 tumor cells alone or mixed with 1,000 ADFs or preadipocytes were suspended on the lid of 2% agar-coated 24-well dishes containing culture media. After the 7 days required for cell aggregation, the spheroids were transferred to the bottom of a well containing culture medium. Multicellular spheroids were then allowed to grow for 14 days and the spheroids used in the invasion experiments had an average diameter of 500 mm. The spheroid invasion in collagen I matrix was conducted as previously described (25). Glucose uptake experiments Differentiated adipocytes cocultivated or not during 3 and 8 days with SUM159PT cells were used to measure the uptake of 2-deoxy[3H]glucose in the presence or not of insulin as previously described (26). Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 ADF, a Novel Tumor-Promoting Cell Type Statistical analysis The statistical significance of differences (at least three independent experiments) was evaluated using Student t test or ANOVA using Prism (GraphPad Inc.). P values less than 0.05 ( ), 0.01, ( ), and 0.001 ( ) were deemed as significant while "NS" stands for not significant. Results and Discussion Breast tumor cells are able to cause mature adipocytes to revert to fibroblast-like cells in vitro and in vivo To test our main hypothesis in vitro, we took advantage of the coculture model recently set up in our laboratory. As previously described, mature 3T3-F442A adipocytes cocultivated in the presence of breast cancer cells exhibited a decrease in the number and size of lipid droplets (8). We show here that this decrease is time-dependent and, after 8 days of coculture, these cells were almost devoid of lipid droplets (Fig. 1A, top). In contrast with CAAs (typically obtained after 3 days of coculture), which retain their rounded morphology (8), adipocytes that have been cocultivated for longer times in the presence of tumor cells took on a highly elongated, fibroblastic shape (Fig. 1A, middle). Preadipocyte factor 1 (Pref-1) expression, a preadipocyte transmembrane protein that inhibits adipogenesis (27), is progressively detected in cocultivated adipocytes (Fig. 1A, bottom). After 8 days of coculture, we also observed that mature adipocytes exhibit a loss in adipose markers expression that was more accentuated than in CAAs (8). An overall dramatic reduction of all the tested adipogenic markers including Adipisin, Adiponectin (APN), Ap2, HSL, as well as C/EBPa and PPARg2 mRNA was observed by qPCR analysis (reduced by more than 70% for all tested genes, P < 0.001, Fig. 1B). These results were confirmed by Western blots for HSL, Adiponectin, PPARg2, and C/EBPa expression, whose expression was no longer detected in cocultivated adipocytes (Supplementary Fig. S1A). Similar results were obtained by cocultivating adipocytes with the human ZR 75.1, HMT3522-T4.2 or mouse 4T1 breast cancer cell lines (Supplementary Fig. S1B), as well as when human mammary adipocytes derived from ex-vivo differentiation of progenitors, purified from mammary adipose tissue of healthy donors undergoing reduction mammoplasty, were used (Supplementary Fig. S1C). At 8 days, cocultivated Figure 1. Breast cancer cells revert mature adipocytes into fibroblast-like cells in vitro. A, mature adipocyte cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during the indicated times were stained with Bodipy (top), Pref-1 antibody (bottom; scale bars, 20 mm), or observed through phase contrast microscopy (middle; scale bar, 50 mm). Nuclei were labeled with TO-PRO-3. Similar experiments were conducted with 3T3-F442A preadipocytes used as a control. B, expression of the indicated genes analyzed by qPCR in mature adipocytes cocultivated for 8 days in the presence (C) or in the absence (NC) of SUM159PT tumor cells. C, GLUT4 and GLUT1 gene expression in mature adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of SUM159PT cells during the indicated times (left). Analysis of Glut1 and Glut4 protein expression was done by Western blot analysis with extracts from mature adipocytes cultivated in the presence (þ) or in the absence () of SUM159PT cells for the indicated times (right). D, glucose uptake assay in the presence of the increasing concentrations of insulin conducted in adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3 and 8 days. Bars and errors flags represent the means SD of at least three independent experiments; statistically significant by Student t test; , P < 0.01; , P < 0.001 relative to NC cells or to untreated cells for glucose uptake experiments. www.aacrjournals.org Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. 5659 Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 Bochet et al. adipocytes exhibited a marked decrease in GLUT4 expression and a concomitant increase in GLUT1 expression (Fig. 1C) and became resistant to insulin (Fig. 1D). No gain of proliferative ability was observed in these cocultivated adipocytes exhibiting insulin resistance and a fibroblast-like shape. Indeed, the cell number, as well as the cell-cycle distribution, remained unchanged during the coculture period (see Supplementary Fig. S2). We next investigated whether this process might be observed in vivo. To address this critical issue, we used GFP-tagged confluent 3T3-F442A preadipocytes implanted subcutaneously into athymic BALB/c nude mice, where they developed into typical fat pads after 5 weeks (21). Murine breast cancer cells 4T1 were then either injected into the newly formed fat pads or used alone as a control, whereas untreated fat pads also provided a separate control. Immunohistochemical staining for GFP was conducted in fat pads removed 10 days after the injection (Fig. 2A). Tagged-mature adipocytes were used to ensure that the cells with a fibroblast-like shape present in the tumors did in fact arise from local adipocytes and not from other sources. The fat pads derived from 3T3-F442A–confluent preadipocytes exhibited histologic features of adipose tissue. Adipocytes were positive for GFP whereas tumor cells were not (Fig. 2B, bottom). In the case of tumors injected into the fat pads, adipose tissue at the tumor periphery was composed of adipocytes of small size and elongated cells containing many small lipid droplets—all cells that are GFP positive (Fig. 2B, bottom, indicated by arrows). Within the tumor, GFP-positive cells with fibroblast-like shape appear to interdigitate with tumor cells (Fig. 2B, bottom, indicated by asterisks). Staining of the tissue sections with Masson trichrome revealed a significant amount of collagen fibrils in the tumor grown within the fat pad, whereas few collagen fibrils were seen in tumor grown alone (Fig. 2B, top). Taken together, these results are consistent with the fact that breast tumor cells induce phenotypical changes in mature adipocytes, leading to cells exhibiting low (if any) lipid content and profound morphologic changes associated with a marked increase in the expression of matrix proteins in the tumors. Therefore, our results compellingly suggest that cells with a fibroblast-like shape could be derived from mature adipocytes in a tumor-context both in vitro and in vivo. ADFs overexpress FSP-1, but not aSMA, and exhibit an activated phenotype We then investigated the expression of major markers, previously used to identify CAFs in these cells (6). As shown in Fig. 3A, adipocytes cocultivated with tumor cells exhibit a gradual increase in FSP-1 expression, as opposed to a-SMA or FAP expression that remains very low. We confirmed that mature adipocytes cocultivated for 8 days with tumor cells overexpressed FSP-1 mRNA by 3-fold, compared with mature adipocytes grown alone (P < 0.01), whereas the difference in mRNA levels of a-SMA between these two conditions was not statistically significant (Fig. 3B). These results were confirmed with human mammary adipocytes (Supplementary Fig. S3). Functionally activated fibroblasts surrounding tumors are highly contractile and motile and also display increased ECM 5660 Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 expression (3). As shown in Fig. 3C, increased expression of the ECM proteins, type I collagen and fibronectin, was also observed during adipocyte conversion. The fibrotic network produced by these cells in vitro is in accordance with the results obtained with Masson trichrome staining in vivo (see Fig. 2). As shown in Fig. 3D (top), coculture of adipocytes with tumor cells was associated with a profound reorganization of actin cytoskeleton, marked by the occurrence of stress fibers and the formation of punctuate spots of vinculin at the ends of actin bundles. Accordingly, cocultivated adipocytes, as they acquire a fibroblast-like phenotype, progressively exhibit increased migratory (Fig. 3D, bottom left) and invasive (Fig. 3D, bottom right) abilities. Therefore, our compelling results show that tumor cells can cause mature 3T3-F442A adipocytes, as well as human mammary adipocytes, to revert to an activated FSP-1 fibroblastic cell population. Because of the common characteristics of CAFs and these cells, highlighting that they represent a subpopulation of CAFs, we named them ADFs. In vitro, the CAA to ADF transition is time dependent (Figs. 1 and 3) and intermediate forms of adipocyte phenotypical changes (from small adipocytes to fibroblast-like cells that may or may not still contain small lipid droplets) could be observed in vitro and in vivo (Figs. 1 and 2). Once modified at the tumor invasive front, where the cross-talk between breast tumor and adipocytes is established (8), our data strongly suggests that ADFs are able to join the center of the tumor and participate in the desmoplastic reaction by exhibiting increased migratory and invasive abilities (Fig. 3), as shown in the murine fat pad experiments (Fig. 2). The Wnt/b-catenin pathway is reactivated in ADFs and contributes to the occurrence of the ADFs phenotype Among the many signaling networks involved in relaying information from extracellular signals during adipogenesis, the Wnt/b-catenin pathway plays a prominent role (28). This pathway negatively regulates precursors' commitment and differentiation along the adipocyte lineage (28) and its activation has recently been shown to also induce a "dedifferentiated" state in mature adipocytes (17). As shown in Fig. 4A (top), adipocytes cocultivated with tumor cells exhibit a gradual increase in b-catenin expression, associated with its redistribution from the cell membrane to the cytoplasm. During activation of this pathway by Wnt ligands (the so-called canonical pathway), the b-catenin is hypophosphorylated and translocated into the nucleus where it contributes to the activation of Wnt target genes (28). A progressive increase in active b-catenin in the nucleus of cocultivated adipocytes was detected (Fig. 4A, bottom). In accordance, cocultivated adipocytes exhibit an upregulation of all Wnt target gene mRNAs analyzed as described for Dishevelled-1 (Dvl1), Wnt10b, Endothelin-1 (EDT1), and metalloprotease-7 (MMP7; Fig. 4B). Taken together, our results show that the canonical Wnt/b-catenin pathway is reactivated during coculture and is likely to contribute to the occurrence of the ADFs. Given our results, we reasoned that targeted inhibition of this signaling using ICG001, a unique small molecule that selectively inhibits TCF/ b-catenin transcription in a CBP-dependent fashion (19) might be able to mitigate the tumor-induced changes in adipocytes. Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 ADF, a Novel Tumor-Promoting Cell Type Figure 2. The phenotypic changes of mature adipocytes towards fibroblast-like cells are observed in vivo. A, GFP-tagged confluent 3T3-F442A preadipocytes were implanted subcutaneously into athymic BALB/c nude mice, where they develop into fat pads after 5 weeks. Murine breast cancer cells 4T1 were then injected into the newly formed fat pads or assayed separately. Immunohistochemical staining for GFP was conducted in fat pads removed 10 d after the injection, tumor cells alone being also used as a control. B, representative Masson trichrome–stained sections from fat pads alone, tumors grown alone, or tumors grown into the fat pads with collagen stained in blue and nucleus in red (top). Representative images of the expression of GFP (brown) visualized in fat pads alone, tumors grown alone, or tumors grown into the fat pads (lipids, white; nucleus, blue; middle). Arrows indicate GFP-positive elongated cells with small lipid droplets present at the tumor periphery, whereas asterisks identify GFP-fibroblast–like cells within the tumor; scale bars, 50 mm. The bottom panel shows a two-fold magnified view of the framed areas. As shown in Fig. 4C, exposure to ICG-001 for 3 days significantly inhibits the increase in Wnt10b expression induced by coculture (about 3-fold decrease in 5 mmol/L ICG-001–treated cells compared with untreated cells, P < 0.05) and partially restores lipid accumulation in cocultivated adipocytes in a dose-dependent manner. We next investigated the signal emanating from tumor cells that could have reactivated the www.aacrjournals.org canonical Wnt/b-catenin pathway. Soluble Wnt3a or TNF-a has been recently shown to induce the "dedifferentiation" of murine and human adipocytes through activation of the Wnt/ b-catenin pathway (17). TNF-a was undetectable in the supernatant of all breast cancer cell lines that were cultivated with or without adipocytes. In contrast, Wnt3a was expressed and secreted by the breast cancer cells, as shown in Fig. 4D for the Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. 5661 Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 Bochet et al. Figure 3. ADFs overexpress FSP-1, but not a-SMA, and exhibit an activated phenotype. A, 3T3-F442A mature adipocytes were grown on coverslips and cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, and D8). After this period, cells were fixed and stained with the indicated antibodies. 3T3-F442A preadipocytes served as a control. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bars, 20 mm. B, a-SMA and FSP-1 gene expression was evaluated by qPCR in adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 8 days with tumor cells. Bars and errors flags represent the means SEM of at least three independent experiments; statistically significant by Student t test, , P < 0.01 relative to NC cells. NS, non significant. C, fibronectin and collagen 1 expression were assessed by immunofluorescence in adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, and D8). 3T3-F442A preadipocytes served as a control. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bars, 20 mm. D, top, 3T3-F442A mature adipocytes were grown on coverslips and cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, and D8). After this period, cells were fixed and stained with the indicated antibodies. 3T3-F442A preadipocytes served as a control. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bars, 20 mm. Bottom, adipocytes grown alone (NC) or in the presence of tumor cells (C) for 3 (D3) and 8 (D8) days. Adipocytes were then trypsinised and used for migration (left) or Matrigel invasion (right) assays towards a medium containing either 0% (white bars) or 10% FCS (black bars). Bars and errors flags represent the means SEM of three independent experiments; statistically significant by Student t test; , P < 0.05, , P < 0.01, , P < 0.001 relative to NC cells. SUM159PT cells. The levels of Wnt3a expression and secretion were not regulated by coculture. Similar results were obtained with the human breast cancer cell lines ZR 75.1 and MDAMB231 (Supplementary Fig. S4). As shown in Fig. 4E (left), in the presence of Wnt3a blocking antibody, we observe a clear inhibition of b-catenin upregulation and redistribution induced by coculture, suggesting that Wnt3a is indeed upstream of the b-catenin stabilization. Of note, cells that have been treated with Wnt3a blocking antibody exhibit a significant decrease of Wnt10b mRNA expression (1.6-fold decrease in antibody-treated cells compared with untreated cells, P < 0.05) and conversely, an increase in lipid content as compared with untreated cells (Fig. 4E, right). Therefore, the occurrence of ADFs is 5662 Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 associated with activation of the Wnt/b-catenin pathway and blocking this pathway partially reversed the ADFs phenotype (Fig. 4C and E). Elevated levels of cytoplasmic and/or nuclear b-catenin are detectable by immunohistochemistry in the majority of breast tissue samples and high b-catenin activity significantly correlated with poor prognosis of the patients (29). This activation might rely on Wnt ligands because several studies have described overexpression of Wnt protein themselves, including Wnt3a, in breast cancer cells lines as well as breast tumors relative to normal tissue (30). Expression of these ligands is generally thought to activate the canonical Wnt/b-catenin pathway in tumor cells by an autocrine mechanism (31) to favor tumor growth, migration, inhibition of Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 ADF, a Novel Tumor-Promoting Cell Type Figure 4. The Wnt/b-catenin pathway is reactivated in ADFs and contributes to the occurrence of this new stromal cell population. A, adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, D8) and 3T3-F442A preadipocytes were fixed and stained with the indicated antibodies. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bars, 20 mm. B, mRNA expression (qPCR) of the indicated Wnt/b-catenin targets was evaluated in adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, D8). C, Wnt10b mRNA expression (right) and Bodipy accumulation or morphology observed through phase contrast microscopy (left; scale bars, 20 mm) were evaluated in adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells for 3 days with tumor cells in the presence of increasing concentrations of ICG-001. D, Wnt3a expression and secretion was measured in the SUM159PT cells cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of adipocytes. E, adipocytes were cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of breast tumor cells in the presence (þ) or absence () of a Wnt3a blocking antibody. In these adipocytes, the expression of Wnt10b mRNA was measured by qPCR (right), and the b-catenin expression and lipid accumulation were evaluated by immunofluorescence. Nuclei were labeled with TO-PRO-3 (left); scale bars, 20 mm. Bars and errors flags represent the means SEM of three independent experiments; statistically significant by Student t test or ANOVA; , P < 0.05, , P < 0.01, , P < 0.001 relative to NC cells. www.aacrjournals.org Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. 5663 Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 Bochet et al. apoptosis, and potentially stem cell renewal in certain tissues (32). We propose here a new and paracrine effect of Wnt ligands in promoting the occurrence of a subpopulation of CAFs. ADFs stimulate tumor cells' invasive phenotype in twodimensional and three-dimensional coculture systems Mature adipocytes were cocultivated with breast cancer cells for 5 days to obtain ADFs, which were then used to carry out two-dimensional (2D) coculture experiments or to produce mixed spheroids with "na€ve or unprimed" tumor cells. In 2D coculture experiments, ADFs strongly stimulated the invasive properties of SUM159PT cells (increase of 2.4-fold compared with tumor cells grown alone, P < 0.01; Fig. 5A), this effect being more pronounced in the presence of ADFs than in the presence of mature adipocytes (1.5-fold increase as compared with tumor cells grown alone, P < 0.05; 1.6-fold increase in cells cocultivated with ADFs as compared with mature adipocytes, P < 0.05). In addition to the increased cell invasive abilities, we have previously shown that cocultivated SUM159PT exhibit morphologic changes along with the reorganization and polarization of vimentin (8). As shown in Fig. 5B, after 3 days of coculture, ADFs induce similar but more pronounced effects Figure 5. ADFs enhance tumor cells invasion in 2D and 3D coculture models. A, tumor cells cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of mature adipocytes or ADFs for 3 d were used for Matrigel invasion assay toward a medium containing either 0% (white bars) or 10% (black bars) FCS. Representative images of Matrigel invasion assay conducted towards a medium containing 10% FCS are shown below each graph; scale bar, 50 mm. Bars and errors flags represent the means SD of three independent experiments; statistically significant by Student's t test; , P < 0.05, , P < 0.01 relative to NC cells. B, immunofluorescence experiments using monoclonal antibody against vimentin or rhodamin phalloidin were conducted on tumor cells cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of mature adipocytes or ADFs for 3 days. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bar, 20 mm. C, a representative picture of spheroid invasion in a collagen matrix [left, scale bar, 250 mm and measurement of the invasion distance (in mm) 48 h after collagen embedding (right)]. Bars and errors flags represent the means SEM of three independent experiments, statistically significant by Student t test; , P < 0.01 relative to spheroids composed by tumor cells alone (SUM), NS, nonsignificant. D, confocal microscopy analysis of spheroids invasion 48 hours after collagen inclusion, spheroids being composed by HcRed-SUM, by mixed HcRed-SUM þ GFP-3T3-F442A, or by HcRed-SUM159PT þ GFP-ADF; scale bar, 100 mm. SUM159PT, SUM. 5664 Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 ADF, a Novel Tumor-Promoting Cell Type on vimentin expression that was associated with profound actin reorganization, leading to the occurrence of stress fibers. As three-dimensional (3D) invasion models more closely follow the cell behavior observed in vivo (33), we confirmed our results using a spheroid invasion model within a collagen matrix (25; see Fig. 5C, left, for a representative experiment). We found that mixed ADFs/tumor cells spheroids exhibit higher invasive capacities compared with spheroids of tumor cell alone (P < 0.01), yet the presence of preadipocytes had no effect on 3D tumor cells' invasion (Fig. 5C, right), in accordance with the results previously obtained in 2D (8). HcRed-SUM159PT cells, GFP-preadipocytes, and GFP-ADFs were used to investigate the invasive behavior of each cell subpopulation. Interestingly, ADFs (and preadipocytes) remained in the center of the spheroids in contrast with tumor cells that invaded the collagen matrix (Fig. 5D). These combined results indicate that ADFs stimulate the invasive behavior of tumor cells. Reorientation of mature adipocytes into ADFs is observed in human tumors We next investigated whether ADFs are present in primary human tumors. To address this critical issue, we first conducted a histologic analysis of human breast tumors to investigate the presence of cells exhibiting ADF traits. As defined in vitro and in vivo in murine fat pads, ADFs originate from progressive changes of the morphology of adipocytes, giving rise to small adipocytes and of elongated cells containing many small lipid droplets. As shown in Fig. 6A, we observed a profound reorganization of the adipose tissue at the tumor invasive front (see left for the adipose tissue aspect at distance of the tumors) with numerous cells exhibiting the features of intermediate forms of ADFs. Of note, elongated cells with lipid droplets could be observed within the dense desmoplastic reaction surrounding the tumors (Fig. 6A, bottom, indicated by arrows). Figure 6. ADFs are found in human tumors. A, histologic examination of human breast cancers showing distant adipose tissue (left) and tumor tissue containing reorientated adipocytes (middle) after H&E staining (original magnification, 200; scale bar, 50 mm.). The right panels show a 2-fold magnification of the framed area. Results of representative experiments were obtained using tumors issued from 2 independent donors. B, histologic examination of adipose tissue (lipids, white; nucleus, blue) in a representative breast tumor after anti FSP-1 staining (brown). The results obtained in different areas from the adipose tissue away from the tumor to the tumor center are shown (scale bar, 50 mm). C, left, the expression of FSP-1 and aSMA was visualized (brown) in adipocytes (lipids, white; nucleus, blue) located adjacent to invading cancer cells (TU) as compared with normal adipose tissue [reduction mammoplasty (RM)]. Right, the expression of the indicated genes was analyzed by qPCR in mature adipocytes obtained from RM or TU (8 independent samples per group), statistically significant by Student t test; , P < 0.05. NS, nonsignificant. www.aacrjournals.org Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. 5665 Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 Bochet et al. To further characterize these cells, we investigated FSP-1 expression in the breast-cancer surrounding adipocytes at variable distances from the tumor center. As shown in Fig. 6B, the mature adipocytes further from the tumor are negative for FSP-1 expression, whereas those closer to the tumor exhibit FSP-1 expression. FSP-1 positive fibroblasts were present in the center of the tumors as previously described (6). Therefore, as observed in vitro, we consistently observed a gradient of FSP-1 expression in mature adipocytes exhibiting first CAA, then ADF phenotype (Fig. 6B). Finally, we investigated the differential expression of both aSMA and FSP-1 in tumor-surrounding adipocytes by immunohistochemistry. In fact, one of the key findings of our study is that ADFs, at least in vitro, express FSP-1 but not aSMA (see Fig. 3A and B). Interestingly, using experimentally generated tumors in mice, Sugimoto and colleagues found unique FSP-1-expressing CAFs, which are clearly distinct from the a-SMA–positive myofibroblasts (6). This subpopulation of CAFs is very important functionally, because FSP-1–positive fibroblasts promote tumor metastasis (34). Mammary carcinoma cells injected into FSP1/ mice showed significant delay in tumor uptake and decreased tumor incidence (34). Coinjection of carcinoma cells with FSP1þ/þ mouse embryonic fibroblasts partially restored the kinetics of tumor development and the ability to metastasize, underlying the role of this specific subset of stromal population in invasive processes (34). As shown in Fig. 6C (left), we found that a-SMA expression was not upregulated in adipocytes close to tumors when compared with normal breast adipose tissue (reduction mammoplasty) whereas in the same sample, an upregulation of FSP-1 expression was found. To further assess the expression of these markers by a quantitative approach, adipocytes were isolated from fat samples associated with tumors or reduction mammoplasty. A series of 16 samples, with 8 samples in each group (Supplementary Table S3 for the clinical characteristics of the patients), was used, matched with respect to age (mean: 54.5 10.4 vs. 51.1 8.3 years) and BMI (mean: 26.1 3.5 vs. 24.9 2.3 kg/m2). Adipocytes isolated from tumor samples overexpressed FSP-1 mRNA when compared with adipocytes isolated from normal mammary glands, whereas the mRNA levels of a-SMA were not statistically different between the two groups (Fig. 6C, right). Therefore, the phenotype described here both in vitro and in vivo for ADFs is clearly reminiscent of the one of FSP-1– positive CAFs, including the absence of a-SMA expression and the invasion-promoting effect. Because mature adipocytes represent the most abundant cellular type in breast cancer stroma, the process of adipose "dedifferentiation" is likely to provide a large part of this CAFs subpopulation. Interestingly, the impact of tumor cells on various component of adipose tissue might also participate in the heterogeneity of CAFs phenotype. In fact, it has been shown both in vitro and in vivo that breast cancer cells activate adipose stem cells towards a CAFs-like phenotype associated with a-SMA overexpression (for review see refs. 35, 10). Therefore, mature and precursor adipose cells could contribute to divergent CAFs subpopulation, whose relative contributions in cancer progression remain to be determined in lean and obese conditions. 5666 Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 Figure 7. Mechanism of ADFs occurrence and role in tumor progression. Schematic representation of the described bidirectional crosstalk established between breast cancer and adipose cells, underlying the presence of ADFs in the desmoplastic reaction of breast cancers. To conclude, the proposed mechanism to explain the occurrence and the role of ADFs in breast cancer is summarized in Fig. 7. In our model, early local tumor invasion in breast cancer results in immediate proximity of tumor cells and adipocytes. Cancer cells secrete soluble factors, including Wnt3a, that are able to activate Wnt/b-catenin pathway in mature adipocytes, leading to adipocyte "dedifferentiation". Adipocytes undergo morphologic changes, first marked by a decrease in adipocyte size and lipid content (CAAs), then by acquiring a fibroblast-like morphology (ADFs), yet still containing small lipid droplets. At the start of this process, tumorprimed adipocytes express FSP-1. ADFs exhibit increased migratory and invasive abilities and are able to join the center of the tumor, where they significantly promote tumor invasion. In the center of the tumor, these cells no longer express adipose markers nor exhibit lipid droplets, which render them indistinguishable from other CAFs cell population. Studying the process of occurrence of ADFs in breast cancer is of major clinical importance. In fact, the occurrence of specific stromal cells, such as ADFs, is critical to the aggressiveness of nearby tumor cells and they need to be identified to develop targeted therapeutic strategies inhibiting their development and/or tumor-promoting activity. Implicating adipose tissue in this crosstalk is also of major interest because several studies pointed out that obese women exhibit higher propensity for local invasion and distant metastasis (10). Obesity condition is also associated with an increase in adipose tissue fibrosis (15). Therefore, further studies should address whether ADFs are over-represented in the breast tumor stroma of obese patients Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst July 31, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530 ADF, a Novel Tumor-Promoting Cell Type in which they would provide an invasion-promoting population. Such studies will provide unique opportunities to set up specific strategies for the treatment of the subsets of patients exhibiting aggressive diseases. Acknowledgments The authors thank Pr. Laurence Nieto for helpful technical advices for qPCR, Guillaume Andrieu, Emilie Mirey, and Nathalie Ortega for critical reading of the manuscript. The authors also thank Jamie Brown for the language editing of the manuscript and Françoise Viala for iconographic assistance. Disclosure of Potential Conflicts of Interest No potential conflicts of interest were disclosed. Authors' Contributions Conception and Design: L. Bochet, C. Lehuede, P. Valet, C. Muller Development of methodology: L. Bochet, B. Couderc Acquisition of data (provided animals, acquired and managed patients, provided facilities, etc.): L. Bochet, S. Dauvillier, Y.Y. Wang, V. Laurent, C. Dray, R. Guiet, I. Maridonneau-Parini, S. Le Gonidec, G. Escourrou Analysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics, computational analysis): L. Bochet, C. Lehuede, S. Dauvillier, Y.Y. Wang, B. Dirat, V. Laurent, C. Dray, G. Escourrou, P. Valet Writing, review, and/or revision of the manuscript: L. Bochet, C. Lehuede, C. Muller Administrative, technical, or material support (i.e., reporting or organizing data, constructing databases): S. Le Gonidec Study supervision: C. Muller Grant Support Studies conducted in our laboratories were supported by the French National Cancer Institute (INCA PL 2006–035 and INCA PL 2010-214; P. Valet, G. Escourrou, and C. Muller), the 'Ligue Regionale Midi-Pyrenees contre le Cancer' (Comite du Lot, de la Haute-Garonne et du Gers; C. Muller), the Fondation de France (P. Valet and C. Muller), and the University of Toulouse (AO CS 2009; C. Muller). In addition, the Fondation pour la Recherche Medicale, ANR Migre Flame 2010, and ARC #2010-120-1733 supported this work (R.Guiet and I. Maridonneau-Parini). C. Lehuede is a recipient of a PhD fellowship from the Ligue Nationale Contre le Cancer. The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. Received February 19, 2013; revised July 5, 2013; accepted July 13, 2013; published OnlineFirst July 31, 2013. References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Polyak K, Kalluri R. The role of the microenvironment in mammary gland development and cancer. 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Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on January 21, 2014. © 2013 American Association for Cancer Research. Figure S1. The occurrence of the ADFs phenotype is reproductively observed with various human and murine breast cancer cells lines and with i h human h mammary adipocytes. di A Analysis A, A l i off protein i expression i off the h indicated i di d markers k d done b Western by W bl blots with i h extracts from f mature adipocytes cocultivated (+) or not (-) with SUM159PT for the indicated times. B, Upper panel: Western-blot analysis of HSL and C/EBPα expression in murine mature adipocytes cocultivated (+) or not (-) with the indicated tumor cell lines during 3 and 8 days (D3 and D8). Lower panel: mature murine adipocytes cocultivated in the presence (C) or absence (NC) of indicated breast cancer cell lines were stained with red oil, scale bars 50µm. C, Upper panel: human mammary adipocytes issued from the ex vivo differentiation of the SVF fraction of adipose tissue obtained from reduction mammoplasty were cocultivated (C) or not (NC) for 6 days in the presence of indicated cell lines. mRNAs were extracted and the levels of expression of the indicated genes evaluated by qPCR. Data represent the results obtained from 6 independent donors ± SEM; statistically significant by Student's t-test, * p<0.05, **p< 0.01, *** p<0.001, relative to NC cells. Shown a representative experiment of Red oil staining of human mammary adipocytes cocultivated (C) or not (NC) in the presence of ZR 75. 1 cells for 6 days. Bochet et al, SuppS1 A B Figure S2. Mature adipocytes dedifferentiation is not associated with changes in cell number or cell cycle distribution. A, Murine adipocytes were cocultivated (C) or not (NC) with SUM159PT cells for the indicated times and counted using a Malassez chamber after Trypan blue staining. B, cell cycle distribution of adipocytes cocultivated or not (NC) ( ) during 3 (D3) ( ) and 5 days (D5) ( ) with tumor cells. Shown the result of a representative experiment. Bochet et al, SuppS2 Figure S3. Cocultivated human mammary adipocytes overexpress FSP-1, but not αSMA, and exhibit an activated phenotype. Human mammary adipocytes, grown on coverslips, issued from the ex vivo differentiation of the SVF fraction of adipose tissue obtained from reduction mammoplasty were cocultivated (C) ( ) or not (NC) ( ) with ZR 75.1 during 5 days. Adipocytes were then fixed and stained with the indicated antibodies. Nuclei were labeled with TO-PRO-3, scale bar 20µm. Bochet et al, SuppS3 Figure S4. Breast tumor cells express and secrete Wnt3a. Wnt3a expression and secretion was measured in the ZR-75.1 cells (A) and MDAMB231 cells (B), cocultivated (C) or not (NC) with mature adipocytes. Bochet et al, SuppS4 Supplementary information Cell Culture. The breast cancer cell line ZR 75.1 (gift of Pr K. Bystricky, LBME, Toulouse, France) was cultured in DMEM medium supplemented with 10% FCS. HMT-3522-T4-2 mammary epithelial cells (gift of Dr E. Liaudet-Coopman, IRCM, Montpellier, France) were cultured in H14 medium (Weaver et al, 1997) consisting in DMEM/F12 with 250 ng/ml insulin, 10 mg/ml transferrin, 2.6 ng/ml sodium selenite, 10-10 M estradiol and 1.4 x10-6 M hydrocortisone. The breast cancer cell line MDA-MB231 (gift of Pr K. Bystricky, LBME, Toulouse, France) was cultured in RPMI medium supplemented with 10% FCS. Antibodies. The polyclonal Ab directed against Adiponectin (APN) was obtained from Thermoscientic. The polyclonal Ab directed against Horomono-Sesitive Lipase (HSL) was from Cell Signaling. Both the polyclonal Ab that recognized CEBP/α and the monoclonal Ab against PPARγ (clone E-8) were from Santa-Cruz. Ex-vivo differentiation of human mammary adipocytes. Breast adipose tissue samples were collected from reduction mammoplasty according to the guidelines of the Ethical Committee of Toulouse-Rangueil. All subjects gave their informed consent to participate to the study, and investigations were performed in accordance with the declaration oh Helsinki as revised in 2000. Adipose tissue pieces were immediately used for collagenase digestion as previously described (Daviaud et al, 2006) and centrifuged to separate adipocytes from the stromavascular fraction pellet, SVF). The SVF fraction issued from mammoplasty reduction adipose tissue samples was used for ex vivo differentiation as previously described (Bour et al, 2007). Briefly, the stromal vascular pellets were incubated overnight with DMEM/Ham F12 medium supplemented with 10% FCS. Then, the medium was replaced by an adipogenic induction medium (DMEM/Ham's F12 (1:1) medium supplemented with 1µg/ml ciglitazone, 10 mg/ml transferrin, 33 mM biotin, 66 mM insulin, 1 nM triiodothyronine, and 17 mM pantothenate). Cells were cultivated in this condition during 3 days before the ciglitazone was removed. Cells are differentiated after 10 days of culture. Cell cycle. Adipocytes were cocultivated or not with SUM159PT cell lines during 3 or 5 days. Cells were harvested by trypsinization and pelleted by centrifugation. The pellets were incubated 10 minutes on ice, then resuspended in 300 µl phosphate-buffered saline containing 25 μg/ml propidium iodide (PI), 100 μg/ml RNaseA and 0.01 % triton X-100. After staining, 10 000 cells were analysed on a FACScan flow cytometer utilizing CellQuest software (Becton Dickinson) to determine the cell cycle distribution. 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The Journal of cell biology 137: 231-245 1 Supplementary Table 1: Characterization of the antibodies used in the study Target Type Clone Supplier Use Reference Actin α-tubulin αSMA β-catenin Active β-catenin Collagen-1 FAP Fibronectin FSP-1=S100A4 GFP Glut1 Glut4 Pref-1=DLK Vimentin Vinculin Wnt3a Wnt3a m m m m m p p m p m p m p p m m p ACTN05 DM1A E184 14 8E7 FBN11 7.1/13.1 1F-8 R28 hVIN-1 217804 - Thermoscientific Thermoscientific Abcam BD biosciences Millipore Chemicon Abcam Thermoscientific Abcam Roche Neomarkers Cell Signaling Abcam Cell Signaling Sigma-aldrich R&D System Abcam WB WB IF/IHC IF IF IF IF IF IF/IHC IHC WB WB IF IF IF Blocking Ab WB (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) Abbreviations used: m, monoclonal ; p, polyclonal ; IF, immunofluorescence ; IHC, immunohistochemistry ; WB, Western Blot. References 1. Lessard JL. Two monoclonal antibodies to actin: one muscle selective and one generally reactive. 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Name Forward Reverse Adipsin GCCTGATGTCCTGCATCAACT GCGCAGATTGCAGGTTGTC Concentrations (nM) 300 Adiponectin TGGAATGACAGGAGCTGAAGG TATAAGCGGCTTCTCCAGGCT 900 Ap2 TTCGATGAAATCACCGCAGA GGTCGACTTTCCATCCCACTT 900 C/EBPα CAAGAACAGCAACGAGTACCG GTCACTGGTCAACTCCAGCAC 100 Dvl-1 CCTTCCATCCAAATGTTGC GTGACTGACCATAGACTCTGTGC 100 Endothelin-1 CCTG-GACATCATCTGGGTC TGTGGCCTTATTGGGAAG 900 FSP-1 GCTGCCCAGATAAGGAACCC TGCGAAGAAGCCAGAGTAAGG 300 Glut1 GGTGTGCAGCAGCCTGTGT CACAGTGAAGGCCGTGTTGA 300 Glut4 CCGGATTCCATCCCACAAG CATGCCACCCACAGAGAAGA 300 HSL GGCTTACTGGGCACAGATACCT CTGAAGGCTCTGAGTTGCTCAA 900 MMP7 CACTCACTGGGTCCTCCATT GAAGAGGGAAACAGGTGCAG 900 PPARγ CCGAAGAACCATCCGATTGA TTTGTGGATCCGGCAGTTAAG 900 αSMA GGAGAAGCCCAGCCAGTCGC AGCCGGCCTTACAGAGCCCA 900 Wnt10b ATGCGGATCCACAACAACAG TGACGTTCCATGGCATTTG 300 (APN) (EDT-1) Supplementary Table 2B: Sequences and concentrations of the primers used to detect human genes expression by qPCR. Name Forward Reverse aP2 GCATGGCCAAACCTAACATGA CCTGGCCCAGTATGAAGGAAA Concentrations (nM) 300 C/EBPα ACCCTCAGCCTTGTTTGTACTGTAT GGACTGATCGTGCTTCGTGTT 300 FSP-1 TTGGGGAAAAGGACAGATGAAG TGAAGGAGCCAGGGTGGAAAAA 300 HSL GTGCAAAGACGGAGGACCACTCCA GACGTCTCGGAGTTTCCCCTCAG 900 PPARγ GAACCACCGCACGATGTTG AAGTCGAACACGCTGCTGAA 900 αSMA AGGCACCCCTGAACCCCAA CAGCACCGCCTGGATAGCC 300 Supplementary Table 3A :Age and anthropometric characteristics of control and cases series. Variables Controls (n=8) n (%) Cases (n=8) n (%) Age in years [35-50[ ≥ 50 4 (50) 4 (50) 3 (37.5) 5 (62.5) Body Mass Index in kg/m2 [18-25[ [25-30[ ≥ 30 4 (50) 4 (50) 0 (0) 2 (25) 5 (62.5) 1 (12.5) Supplementary Table 3B: clinical characteristics of the breast cancer patients. Variables Sub-groups Tumor histology Lobular Canalar I II III Pre-menopausal Post-menopausal ]0-2] ]2-5] >5 nc N0 N1 N2 ER (-) ER (+) HER2 (-) HER2 (+) Breast cancer stage Menopausal status Tumor diameter in cm Clinical node involvement Tumor estrogen receptors status Tumor HER2 status Cases (n=14) n (%) 1 (12.5) 7 (87.5) 0 (0) 5 (62,5) 3 (37,5) 3 (62.5) 5 (62.5) 1 (12.5) 3 (37.5) 2 (25) 2 (25) 1 (12.5) 2 (25) 5 (62.5) 2 (25) 6 (75) 7 (87.5) 1 (12.5) Article 2. Les adipocytes péritumoraux participent à la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires à la doxorubicine, potentiellement via un mécanisme dépendant de LRP/MVP et des vésicules. La chimiothérapie demeure un des traitements de référence du cancer du sein. Parmi les molécules présentes dans l’arsenal thérapeutique, la doxorubicine, qui appartient à la famille des anthracyclines, est considérée comme étant une des molécules les plus efficaces dans ce type de cancers (Tacar et al 2013). Cependant, des processus de résistance sont fréquemment observés et vont contribuer à l’apparition de rechutes, de la diminution de la survie globale et de la survie sans maladie. Les cellules tumorales peuvent présenter une résistance croisée à diverses molécules, appartenant à différentes classes anti-néoplasiques et présentant des mécanismes d’actions différents. Ce processus est appelé multi-résistance ou MDR (Multidrug resistance) et représente une cause majeure d’échec thérapeutique (Kathawala et al 2015). Des arguments émergents suggèrent que le stroma tumoral pourrait également participer à l’acquisition d’une chimiorésistance par les cellules cancéreuses (Dittmer and Leyh 2014). Parmi les différents composants du stroma mammaire, les adipocytes représentent des acteurs émergents dans la progression tumorale. Dans l’équipe, nous avons montré qu’ils favorisent l’acquisition d’une résistance aux radiations ionisantes par les cellules tumorales mammaires (Bochet et al 2011). D’autre part, le rôle des adipocytes dans la progression tumorale est d’importance en médecine car l’obésité a été reconnue comme un facteur de mauvais pronostic dans le cancer du sein, indépendamment du statut ménopausique (Ewertz et al 2011). Des arguments cliniques suggèrent que les femmes obèses présentent une résistance augmentée à l’association anthracyclines/taxanes administrée en thérapie adjuvante et néoadjuvante ou dans le cadre d’un cancer métastatique (Ewertz et al 2011) (Litton et al 2008) (de Azambuja et al 2010). Nous avons ainsi formulé l’hypothèse selon laquelle les adipocytes pourraient contribuer à la résistance des carcinomes mammaires à la chimiothérapie et que l’obésité pourrait amplifier ce processus. Nos résultats montrent que les adipocytes favorisent un phénotype MDR (doxorubicine, paclitaxel, 5fluorouracile) dans un large panel de lignées tumorales mammaires (représentatives des différents sous-types du cancer du sein). La chimiorésistance médiée par les adipocytes est liée à un efflux nucléaire et extra-cellulaire de doxorubicine plus important, qui empêche l’action de la drogue au niveau de son site d’action : l’ADN. Etonnamment, cet efflux est indépendant des principaux transporteurs ABC (ATP-binding Cassette) classiquement responsables de ce mécanisme de résistance. Cependant, nous avons mis en évidence que la protéine MVP (Major Vault Protein) semble être responsable de l’efflux nucléaire observé. De manière intéressante, nos résultats (bien que préliminaires) suggèrent que les adipocytes favorisent l’encapsulation des drogues dans des vésicules extra-cellulaires, ce qui permet l’efflux de la doxorubicine hors de la cellule. Enfin, nos résultats ont montré que la chimiorésistance médiée par les adipocytes est amplifiée dans un contexte d’obésité. Les résultats obtenus sur ce projet ont été rédigés en anglais sous forme d’un article, bien qu’à l’heure 129 actuelle, ce travail n’est pas encore finalisé. Des nouvelles données devraient être disponibles et présentées lors de la soutenance orale. 130 Tumor surrounding adipocytes contribute to doxorubicin resistance: Potential role of a MVP/vesicle dependent mechanism and amplification by obesity Camille Lehuédé1,2,3, Xia Li1,2,3, Stéphanie Dauvillier1,2, Victor Laurent1,2, Ikrame Lazar1,2, Emily Clement1,2, Sophie Le Gonidec1,3, Philippe Valet1,3, Laurence Nieto1,2, Frédérique Fallone1,2 and Catherine Muller1,2 * 1 Université de Toulouse, UPS, F-31077 Toulouse, France. 2 CNRS ; Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale F-31077 Toulouse, France. 3 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM U1048, F-31432 Toulouse, France. Running title: Key words: Adipocytes - Breast cancer – Doxorubicin – Multidrug resistance - Obesity MANUSCRIPT IN PREPARATION 1 Abstract Emerging evidence demonstrates that tumor-surrounding adipocytes are key players in breast cancer progression, particularly through promotion of the invasive properties of tumor cells. This effect could be amplified in obesity, which is a negative prognosis factor in breast cancer. Clinical studies suggested that obesity, in addition to favoring the occurrence of aggressive tumors, is associated with a decrease in the efficacy of chemotherapy. The mechanism(s) linking tumor-surrounding adipocytes to drug resistance remain elusive. The anthracycline Doxorubicin (DOX) is one of the major drugs used in the treatment of breast cancer. Using a 2D coculture system, we demonstrated that adipocytes promote DOX resistance in a large panel of human and murine breast cancer cell lines, independently of their subtypes. Cocultivated cells exhibit a multidrug resistance (MDR) phenotype with crossresistance to paclitaxel and 5-fluorouracil. We further demonstrated that DOX resistance was due to an increased nuclear and extracellular efflux in cells cocultivated with adipocytes. These processes were mediated by an original pathway implicating the MVP (Major Vault Protein), followed by the release of extracellular vesicles-containing DOX. Finally, using a 3D coculture system, we demonstrated that adipocyte-induced chemoresistance is amplified by obesity. This study may explain, at least in part, the poor prognosis of obese patients suffering from breast cancer. 2 Introduction Cancer is now considered a complex tissue comprised not of only malignant but also stromal cells, including fibroblasts, infiltrating immune cells and endothelial cells, all contained within the extracellular matrix (ECM) [1]. Tumor and stromal cells establish a constant bidirectional crosstalk, which can promote tumor progression. Among the different cell types present in the tumor microenvironment, recently increasing interest has been given to adipocytes, which have long been overlooked as an active component of tumor stroma [2]. Mature adipocytes, first thought of only as energy-storing cells, have emerged this last decade as highly endocrine cells which are able to secrete hormones, growth factors, chemokines and pro-inflammatory molecules: a heterogeneous group of molecules termed «adipokines» [3] [4]. Studying the multifaceted role of adipocytes in cancer, and particularly in breast cancer, is of major clinical importance. Indeed, obesity, where the normal balance of adipose tissue secretions is perturbed, is a negative prognosis factor for breast cancer independently of menopause status (for review see [5] [3]). There is now clear evidence that host factors contribute to the occurrence, in obese women, of tumors exhibiting an aggressive phenotype at diagnosis defined by an increase in lymph node involvement and a higher propensity to distant metastasis (reviewed in [3]). In the largest retrospective clinical study published on this subject to date, Ewertz et al. report that obesity is an independent prognosis factor for the development of distant metastasis and death after diagnosis of breast cancer [6]. We have previously demonstrated in vitro and in vivo, that tumor surrounding adipocytes in breast cancer exhibit a decrease in lipid content, a decreased expression of adipocyte markers and an activated state characterized predominantly by the overexpression of pro-inflammatory cytokines, ECM and ECM-related molecules [7]. We named these cells “Cancer-Associated Adipocytes” (CAAs) [7] [8] [3]. Upon prolonged exposure to tumor cells, adipocytes adopt a highly elongated fibroblast-like morphology, highlighting that a subset of Cancer-Associated Fibroblasts (CAFs) are in fact derived from adipocytes [9]. One of the major hallmarks of the adipocyte/cancer crosstalk appears to involve an increase in the invasive properties of tumor cells. In fact, CAAs increase breast tumor cell invasion in vitro, as well as the number and size of lung metastasis in vivo [7]. This process implies pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-6, as well as extensive extracellular matrix remodeling [3] [10] [11]. One probably underestimated effect of the adipocyte/cancer crosstalk is its role in the response to antitumor therapy. At clinical levels, it has been consistently demonstrated that obesity is associated with a decrease in response to adjuvant and neoadjuvant chemotherapies [12] [13]. Limited data exist at laboratory levels to explain these effects. We have shown that CAAs contribute to the occurrence of a radioresistant phenotype in breast tumor cells through an increased activation of the effector kinase Chk1 [14]. In a different tumor model (i.e. acute lymphoblastic leukemia), it has been demonstrated that adipocytes impair leukemia treatment by Vinca alkaloids both in vitro and in vivo [15]. In this model, adipocytes prevented chemotherapy-induced apoptosis, therefore contributing to resistance to various chemotherapeutic 3 agents, and this was associated with increased expression of the two pro-survival proteins Bcl-2 and Pim-2 [15]. In vivo, De Angel et al. reported that obesity induced a chemoresistance to gemcitabine, using ovarietomized diet-induced obese mice with transplanted mammary tumors (MMTV-Wnt1 model) [16], but the mechanisms underlying obesity-induced chemoresistance remain poorly identified. Chemotherapy remains the basic treatment for an aggressive or metastatic breast cancer [17]. Since its multiple mechanisms of action lead to DNA damage and tumor cell death, doxorubicin (DOX) (anthracycline family) is considered to be among the most effective agents for the treatment of breast cancer [18] [19] [20]. Despite extensive clinical utilization, intrinsic or acquired resistance to this drug is frequent and represents one of the major obstacles in breast cancer treatment. Resistance to DOX implies multiple mechanisms including quantitative and qualitative modifications of its intracellular target, Topo-isomerase II [21]. However, DOX-resistant cancer cells frequently exhibit crossresistance to multiple unrelated classes of anticancer drugs. This mechanism is known as multidrug resistance (MDR) and represents an important cause of therapeutic failure [22]. One of most predominant processes underlying MDR is an increase of drug efflux, leading to a decrease of drug accumulation at intracellular targets. In this process, the role of the ABC (ATP-binding proteins) transporter family has been extensively studied. This family of proteins can extrude several substrates from cells in an ATP dependent manner against a concentration gradient [23] [24] [25]. Among all human ABC transporters, three of them are highly involved in the MDR process: ABCB1 (P-gp for Pglycoprotein), ABCC1 (MRP-1 for Multidrug Resistance related protein 1) and ABCG2 (BCRP for Breast cancer resistance protein) [22]. In addition to ABC transporters, other mechanisms may exist which prevent drugs from reaching intracellular targets, thereby conferring MDR [26]. More recently, overexpression of a protein, termed LRP (Lung resistance protein) has been identified in a number of tumor cells that exhibit a MDR phenotype, especially P-gp negative cells [27] [28]. Subsequently LRP was identified as the human MVP (Major Vault Protein), which is the main component of vault particles [26] [29]. Vaults exhibit a hollow barrel-like structure and are localized mainly in the cytoplasm and associated with the nucleus [30] [31]. Despite some controversy, the overexpression of MVP has been correlated with drug resistance in cells, the aggressiveness of tumors and worse prognosis for cancer treatment for several drugs including DOX [26] [32]. In the present study, we demonstrated for the first time that adipocytes promote DOX resistance in a large panel of human and murine breast tumor cell lines. DOX resistance was associated with a MDR phenotype, with cross-resistance to other chemotherapeutic agents used in the treatment of breast cancer. We further decipher the molecular mechanisms involved by showing that adipocytes stimulate an increase of nuclear and extracellular efflux of DOX mediated by an original pathway dependent on the MVP protein followed by release of extracellular vesicles-containing DOX. Of importance, using an original 3D coculture system, we demonstrated that this pathway is amplified in obesity. This study could provide unique opportunities to set up specific strategies for the treatment of obese patients 4 exhibiting aggressive breast cancer. 5 Materials and methods Antibodies, probes and chemical reagents: The mouse monoclonal antibody against MVP was purchased from BD Biosciences (San Jose, CA USA) and used for Western Blot and immunofluorescence experiments. The rabbit polyclonal antibody against BCRP (H-70) was obtained from SantaCruz biotechnology (Dallas, TE, USA) and were used for Western Blot experiments. The monoclonal antibody anti-P-gp (C219) and the monoclonal antibody anti-β Tubulin (DM1A) were respectively purchased from GeneTex (Irvine, CA, USA) and NeoMarkers (Fremont, CA, USA) and used for Western Blot experiments. Doxorubicin, Paclitaxel and 5-Fluorouracil (5-FU) were purchased from Sigma (Saint-Louis, MO, USA) and were used at final concentrations of 0.5 to 2.5 µg/mL for Doxorubicin (DOX), 100 to 250 nM for Paclitaxel and 2 to 20 µg/mL for 5-Fluorouracil (5-FU). The P-gp inhibitors Verapamil (Vp) (used at a final concentration of 40 µM) [33] and Tariquidar (Tar) (used at a final concentration of 75 nM) [34] were respectively purchased from Sigma (Saint-Louis, MO, USA) and Selleckchem (Houston, TX, UA). The MRPs family inhibitor, MK-571 (MK) [35], and the BCRP inhibitor, Fumitremorgin-C (FTC) [36], were purchased from Sigma (Saint-Louis, MO, USA) and used at a final concentration of 30 µM. All the reagents were diluted in DMSO (except DOX, which was diluted in water) and used within the efficient pharmacological range of doses described in the literature. MTT assays were performed to ensure that the used doses were non-toxic for cells. The Bodipy lipid probe coupled to Alexa Fluor 488 (used at 1 µg/ml) and DAPI were obtained from Life Technologies (Grand Island, NY, USA). For immunofluorescence experiments, a goat anti-mouse secondary antibody (IgG F(ab’)2 fragment conjugated to Alexa Fluor 488) obtained from Invitrogen (Auckland, NZ) was used. Cell culture: The human breast cancer cell lines T47D and MDA-MB231 (provided by Pr K. Bystricky, LBME, Toulouse, France), as well as MDA-MB453 and BT-474 (provided by Pr C. Dumontet, CRCL, Lyon, France) were cultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Auckland, NZ). The human breast cancer cell line MDA-MB436 (provided by Dr I. Martin Padura, IEO, Milan, Italy) was cultured in DMEM/F-12 (1:1) medium (Invitrogen, Auckland, NZ). The murine breast cancer cell lines M-Wnt [37] (provided by Pr S. Hursting, Austin, Texas, USA) and E0771 [38] (provided by Dr J. Nunes, CRCM, Marseille, France) were cultured in RPMI 1640 medium (supplemented with 10 mM of HEPES buffer for the E0771 cell line). All cell lines were cultured in media supplemented with 10% Fetal Calf Serum (FCS) and antibiotics (125 mg/mL streptomycin and 125 UI/mL penicillin) (Invitrogen, Auckland, NZ) and were grown in a humid atmosphere with 5% CO2. NIH3T3-MDRG185 (positive for P-gp) and HEK-ABCG2 (positive for BCRP) (provided by L. Payen, CRCL, Lyon, France) were cultured in DMEM medium, supplemented with 10% FCS. Cells were transfected as previously described [39]. All cell lines were used within 1 to 2 months after resuscitation of frozen aliquots and were authenticated based on viability, recovery, growth and morphology. The murine 3T3-F442A preadipocyte cell line was grown in DMEM medium and differentiated into mature 6 adipocytes as previously described [7]. The term “adipocyte” represents cells that have been differentiated for 10 to 14 days (with 80 to 100% of lipid droplets). Coculture system: Co-culture between tumor cells and adipocytes, was performed using a Transwell culture system (0.4 µm pore size, Millipore). Murine or human breast tumor cells were seeded in the upper chamber of the Transwell system in the same culture medium as adipocytes and were then cocultivated or not with adipocytes (grown in 2D for 3T3-F442A mature adipocytes or in 3D for primary isolated adipocytes) for the indicated times (3 to 6 days). Adipocytes or tumor cells cultivated alone in similar conditions served as controls. Drug treatment and viability determination: Breast tumor cells were seeded in the upper chamber of a Transwell culture system with or without adipocytes during 3 days (preincubation period). After this period, tumor cells were incubated with medium containing DOX, paclitaxel or 5-FU for 4 hours. Then, the treatment medium was removed and cells were washed with fresh medium once and incubated with adipocytes for 3 days (postincubation period). Cell survival after treatment was estimated by Toluidine Blue staining as follows. Briefly the Transwell chamber containing tumor cells was fixed with methanol, then immediately incubated with Toluidine Blue 1% in 0.1 M borax (Sigma, Saint-Louis, MO, USA). After washing, the remaining cells were therefore stained blue. The Transwell chamber membranes were then placed in a lysis buffer (Tris-Hcl 6.25 mM (pH 6.8), 10% glycerol, 2% SDS, 5% β- mercaptoethanol) and the absorbance of the obtained solution was measured at 570 nm (MicroQuant from Biotek Instrument Inc, Winooski, VT, USA). For the experiments, the term of “viability” was used to estimate the survival of cells, because we have previously shown that coculture with adipocytes does not influence the tumor cell proliferation [7]. Mice: Mice were handled in accordance with National Institute of Medical Research (INSERM) principles and guidelines. C57Bl6/J male mice were obtained from Janvier (Le Genest St Isle, France). Mice were housed conventionally in an animal room at constant temperature (20–22°C) and humidity (50–60%), and with a 12h light–dark cycle. All the mice had free access to food and water throughout the experiment. The C57Bl6/J mice were assigned to a normal diet (ND) (PicoLab Rodent Diet 20, Purina Mills Inc., Brentwood, MO, USA) or high-fat diet (HFD) (Research Diets Inc., New Brunswick, New Jersey, USA). The energy contents of the diets were as follows: 16 % protein, 81 % carbohydrate, and 4 % fat for the ND; and 20 % protein, 20 % carbohydrate, and 60 % fat for the HFD. C57Bl6/J mice (initially 10 weeks old) were fed a ND or a HFD for 12 to 15 weeks. This previous described period of HFD is used to mimic the development of obesity in humans associated with the onset of insulin resistance and low grade inflammation [40] [41]. At 25 weeks, mice were sacrificed by cervical dislocation to collect perigonadal adipose tissue (VAT). 7 Murine adipose tissue digestion, isolation of primary adipocytes and 3D culture: VAT was dissected immediately after sacrifice and weighed. Then 1g of tissue was immediately placed in 5 mL of DMEM (Invitrogen, Auckland, NZ) supplemented with 1% BSA (Sigma, Saint-Louis, MO, USA). The adipocytes and SVF cells were isolated from whole VAT as previously described [42]. Briefly, 25 µg/mL of liberase (Roche Applied Science, Meylan, France) was added and the tissue was incubated for 30 minutes at 37°C under shaking. After digestion, FCS at a final concentration of 10% was added to inhibit the liberase. The samples were then centrifuged (3 min, RT, 200 rpm) to separate adipocytes (floating cells) from the SVF (pellet and supernatant). Primary adipocytes were embedded in a threedimensional collagen gel matrix. The collagen gel culture system was prepared as follows: type I collagen (final concentration of 2 mg/mL) (Nitta Gelatin Co Ltd, Osaka, Japan) was mixed with DMEM 10X (final concentration 1X), FCS (final concentration 10%) and with reconstruction buffer (final dilution 10%). This collagen gel solution was mixed with primary adipocytes. A total of 1.5 ml of collagen gel solution (containing 6 x 105 adipocytes) was poured into 6 wells plates or 300 µL (1 x 105 cells) for 24 wells plates. The culture dish was immediately warmed at 37°C to allow the gel to form. The gel was further covered with 1.5 mL per dish of DMEM containing 10% FCS and insulin. Western blot analysis: Whole-cell extracts were prepared as follows: cells were harvested with trypsin and after centrifugation pellets were lysed on ice for 20 minutes in Tris-HCl (10 mM, pH 7.5) containing 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 and proteases and phosphatases inhibitors (Sigma, Saint-Louis, MO, USA). Insoluble material was removed by centrifugation (16,000g for 20 minutes at 4°C) and the supernatant was collected and stored at -80°C [43]. Proteins were then electrophoresed on SDS-polyacrylamide gels and transferred onto polyvinyl difluoride (PVDF) membranes. After being blocked with 5% skimmed milk in PBS1X, the membranes were incubated with appropriate primary antibodies. Then, the membranes were washed with 0.1% PBS-tween and incubated with HRP-conjugated secondary antibodies. The immunoreactive protein bands were detected by ECL. DOX extracellular efflux by Flow Cytometry Assay: To estimate DOX extracellular efflux, after 3 days of coculture with adipocytes or incubation with Adipocyte-conditioned medium (AdCM), tumor cells were incubated with medium containing DOX at a final concentration of 2 µg/mL during 4 hours at 37°C. AdCM was obtained as follows: mature 3T3-F442A adipocytes were cultivated overnight with DMEM medium supplemented with 1% BSA. Then medium was collected and centrifuged at 3,000 g for 30 minutes (to eliminate cell debris contamination) and stored at –80°C before use. After incubation, cells were washed once with DMEM supplemented with 10% FCS. Then, fresh medium was added and cells were left to recover for the indicated times allowing DOX efflux from cells. In indicated experiments, cocultivated and non-cocultivated cells were treated or not with ABC transporter inhibitors after drug exposure for 24h. At the end of the incubation, cells were harvested with trypsin, washed with PBS and analyzed with FACScalibur (Becton Dickinson, Rutherford, NJ, 8 USA) using a 488 nm excitation and 670 nm long-pass filter (FL3-H). Mean fluorescence intensity was quantified by CellQuest software (Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA). For each analysis 20,000 events were collected. DOX nuclear efflux assays: To estimate nuclear efflux of DOX, cells were seeded on glass coverslips and treated with DOX, as above. Then, cells were fixed with a 3.7% paraformaldehyde (PFA) solution for 20 minutes at room temperature. PFA was quenched with 50 mM NH4Cl and cells were incubated with DAPI for 5 minutes. After washing twice with PBS, cells were mounted in Vectashield medium (Abcys). Fluorescence images were acquired with a confocal laser microscopy system with 60X oil PLAPON OSC objective (Confocal TIRF Olympus FV1000). The intensity of staining in the nuclei was quantified on original images using Fiji software. Images were processed to filter the noise with Fiji software and a similar filter was used to analyze all acquisitions for the experiments. Immunofluorescence experiments: After fixation (3.7% PFA) cells were permeabilized with PBS 0.2% TritonX-100 for 5 minutes. After blocking with PBS, 10% FCS, 2% BSA for 60 minutes, cells were incubated with the anti-MVP monoclonal antibody for 12 hours at 4°C or with Bodipy for 30 minutes at RT and washed twice. For MVP visualization, cells were then incubated with the appropriate secondary antibody for 30 minutes at RT. Then, cells were stained with DAPI and mounted in Vectashield medium. Images acquisition and quantification were performed as above. siRNA transfection: Transient transfection of breast tumor cells (MDA-MB436) was performed with Lipofectamine siRNAIMAX (Life Technologies) according to the manufacter’s instructions. In brief, transfection was performed in 6-well plates containing 50% confluent cells, in 1.8 ml DMEM, 5% FCS to which 200µL of the transfection mix was added for a final concentration of 100 nM of siRNA in the medium. Five hours after transfection, either medium was refreshed with DMEM 10% FCS or with AdCM during 48 hours. siMVP’s sequence is UAGGAGUCACCAUGGCAAC and the negative control nontargeting siRNA’s sequence is UUCUCCGAACGUGUCACGU. For the DOX accumulation experiments, cells were incubated with siRNA (for 5h) then treated with DOX 24h after transfection (for 4h). Immunofluorescence or FACS experiments were performed as described below 24h after DOX exposure (and therefore 48h after transfection). Tumor cell exosome and microvesicle preparation: Tumor cells were incubated for 48h in complete DMEM medium without phenol red (Invitrogen, Auckland, NZ) (to avoid fluorescence contamination) previously depleted in contaminating bovine vesicles by overnight centrifugation at 100,000g. This tumor cell conditioned medium was then collected and stored at -80°C. For vesicle purification: conditioned medium was centrifuged once at 3,000g for 30 min to remove cell debris contamination. The resulting supernatant was further centrifuged for 30 min at 10,000g to isolate microvesicles. The pellet of microvesicles was suspended in PBS and again centrifuged for washing. The exosomes contained in the 10,000g supernatant were pelleted by ultracentrifugation at 100,000g for 90 min. The 9 pellet of exosomes was washed in PBS and again ultracentrifuged. The resulting pellets containing either exosomes or microvesicles were finally suspended in PBS for quantification by NanoSight and functional analysis. All steps were carried out at 4°C. Adipocyte exosome, microvesicle and soluble factor preparation: The adipocyte conditioned medium (AdCM) was prepared as follows: mature 3T3-F442A adipocytes were cultivated for 72h with complete DMEM medium previously depleted of contaminating bovine vesicles by overnight centrifugation at 100,000g. Then medium was collected and centrifuged at 3,000 g for 30 minutes (to eliminate cell debris contamination) and stored at –80°C before use. For purification: AdCM was centrifuged for 60 minutes at 10,000 g, the obtained pellet being composed of microvesicles (MV) and the supernatant containing exosomes and soluble factors. This supernatant was ultracentrifuged at 100,000g 90 minutes to isolate exosomes (pellet) and soluble factors (supernatant). Pellets of exosomes and MV were suspended in DMEM medium. The different conditions (AdCM, MV, exosomes, soluble factors and exosomes plus soluble factors) were diluted to half in DMEM complete medium and incubated with the tumor cells. NanoSight analysis: Exosome and MV concentration and size distribution were analyzed with a NanoSight LM10-HS (Malvern, Orsay, France), equipped with a 405 nm laser. The assays were performed according to the recommended protocols of the machine's manufacturer. Briefly, three independent replicates of diluted exosome preparations (about 109 particles/mL) in PBS were injected into the NanoSight chamber. The specimens were tracked and measured at room temperature for 60s. Shutter and gain were manually adjusted for optimal detection and were kept at this setting for all samples. The data were captured and analyzed with NTA Build 127 software (version 2.2). Three measurements of the same sample were performed. FACS analysis of DOX in vesicles: To determine the intensity of fluorescence of DOX in vesicles, purified tumor cell microvesicles and exosomes were coated onto aldehyde/sulfate latex beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Briefly, vesicles were incubated with 4 µm-diameter aldehyde/sulfate latex beads diluted in PBS (final volume 600-1000µL) for 15 minutes at RT under gentle agitation, followed by overnight incubation at 4°C. The number of beads was proportional to the number of vesicles previously determined by NanoSight analysis (1600 vesicles per bead). Then, these vesicle-coated beads were analyzed with FACScalibur (Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA). Mean fluorescence intensity was quantified by CellQuest software (Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA). For each analysis 20,000 events were collected. Statistical analysis: The statistical significance of differences (at least three independent experiments) was evaluated using ANOVA or Student t-tests in Prism (GraphPad Inc.). P values below 0.05(*), <0.01 (**), <0.001 (***) and <0.0001 (****) were deemed as significant while “NS” stands for not significant. 10 Results and discussion Coculture with mature adipocytes promotes a MDR phenotype in a wide panel of human and murine breast cancer cell lines. To characterize the potential effect of mature adipocytes on the response of breast tumor cells to doxorubicin (DOX) exposure, we used a coculture system previously set up in our team [7]. In this experimental model, which reproduces the phenotypical changes observed in human tumors [7] [9], the two populations are separated by an insert, which allows the diffusion of secretions from both cell types. As shown in fig. 1A, tumor cells were grown for 3 days on Transwells in the presence or not of mature adipocytes (obtained after in vitro differentiation of the murine preadipocyte cell line, 3T3-F442A [44]). After 3 days of coculture (preincubation period), tumor cells were treated with DOX at indicated concentrations and incubated again with (C) or without (NC) adipocytes for 3 days (postincubation period). At the end of the postincubation period, the viability of tumor cells was determined. These experiments were performed in a panel of human and murine cell lines representative of the different subtypes of breast cancer (ER+, HER2+, triple negative [TN]) (see fig. 1B and 1C). As shown in fig. 1C, for all the studied cell lines, the viability after DOX exposure of cocultivated tumor cells was significantly higher than the control cells grown alone. The amplitude of the effect was close for all the tested models (between 1.3 and 2.4-fold increase in cell viability), except for the murine ER+ E0771 cell line that exhibits higher resistance (6fold increase in cell viability). For the following experiments, we selected two human cell lines, the poorly aggressive well-differentiated ER+ T47D cell line and the aggressive TN cell line MDAMB436. Using similar coculture experiments, we found that adipocytes induce a MDR phenotype in tumor cells. In fact, cocultivated tumor cells exhibit significant resistance (around 1.5-fold) to the microtubule inhibitor, paclitaxel [45], as well as to the pyrimidine analog 5-Fluorouracil (5-FU) [46] as compared to control cells grown alone (fig. 1D). Having described the effects of adipocytes on DOX-induced cytotoxicity in tumor cells, we sought to further understand this chemoresistance using our in vitro coculture system. We first investigated whether coculture with adipocytes before exposure to the drug was sufficient to promote the chemoresistant phenotype (preincubation period). As shown in fig. 2A, no differences in cell viability were observed in cocultivated cells as compared to control. On the contrary, the presence of adipocytes only during the postincubation period recapitulated the chemoresistant phenotype (fig. 2B), although to a lesser extent than when adipocytes were present at all steps (preincubation and postincubation, fig. 2C). These results highlight that the presence of adipocytes after exposure to the drug during the cell damage response is important for the chemoresistant phenotype oberved. We previously demonstrated that coculture with adipocytes confers a radioresistant phenotype in breast cancer and this radioprotective effect is fully conferred by the changes induced in tumor cells during the coculture period prior to irradiation [14]. Therefore, the protective mechanisms conferred by adipocytes towards cytotoxic strategies possess specificities. Concerning chemotherapy, our results demonstrate that adipocyte-dependent modifications induced in 11 tumor cells “educate” them to resist to the drug to a certain extent but that the regulation of the cell damage response is a key event in the appearance of a chemoresistant phenotype. Adipocytes decrease intracellular DOX accumulation independently of major ABC transporters. Since the predominant mechanism underlying MDR is associated with drug efflux, we next investigated if DOX intracellular accumulation is altered by the presence of adipocytes. For this, we took advantage of the intrinsic fluorescent properties of DOX, allowing the detection of its intracellular accumulation by flow cytometry. Previously cocultivated or non-cocultivated breast tumor cells were incubated with DOX for 4h and, after washing, cells were left to recover in the presence or not of adipocytes in DOX-free medium for up 72 hours. DOX accumulation was evaluated by flow cytometry at different time points. As shown on fig. 3A, no significant differences in initial DOX uptake were observed between cocultivated and non-cocultivated cells (0h). As expected, the intracellular fluorescence of DOX decreased in a time-dependent manner in both conditions, but this effect was significantly increased in cocultivated cells as compared to tumor cells grown alone for both cell lines used (fig. 3A). These data suggest that adipocytes promote DOX extracellular efflux independently of the cell lines used, leading to reduced drug toxicity that we observed (fig. 1). This process is often due to the overexpression of ABC transporters [22]. As DOX is a well-known substrate of some ABC transporters, such as P-gp and BCRP, the expression of these efflux pumps was studied by Western Blot in non-cocultivated and cocultivated cells, treated or not with DOX. As shown in fig. 3B, the expression of P-gp and BCRP was weak and not affected by coculture in T47D cells, compared to cells overexpressing P-gp or BCRP, which were used as positive controls. We next investigated if the activity of these major ABC transporters could be affected by adipocytes, despite the low levels of expression in these cell lines and the absence of their regulation by coculture, using pharmacological inhibitors. The activity of P-gp was first investigated using verapamil (Vp), a calcium channel blocker and the first P-gp chemosensitizer described [47]. As shown in fig. 3C, Vp was able to inhibit drug extracellular efflux in both cell lines used, but the difference in drug accumulation was still present between cocultivated and non-cocultivated cells in both cell lines (fig. 3C). Because it has been described that Vp lacks specificity [48], we also used tariquidar (Tar), which is a highly specific inhibitor of P-gp [34]. A slight but significant effect was observed in MDA-MB436 drug accumulation in the presence of Tar, in opposition to the T47D cell line. However in both cases, the differences in DOX accumulation between non-cocultivated and cocultivated cells remained effective in the presence of the inhibitor. Taken together, these results suggest that P-gp participates in DOX efflux especially in MDA-MB436 cells, despite a very low level of expression. Such dissociation between expression and function of P-gp has been previously described in leukemia cell lines [49]. Nevertheless, the differences in drug extracellular efflux between cocultivated and non-cocultivated cells cannot be explained by an increase in P-gp function induced by adipocytes. Similar results were 12 obtained using MRP family inhibitor (MK-571) and BCRP inhibitor (Fumitremorgin-C) in both cell lines (fig. 3D and 3E). Despite a slight increase in DOX accumulation, indicating that these pumps could be functional in both cell lines, the differences between non-cocultivated and cocultivated cells persist in the presence of these inhibitors. Collectively, these results show that despite the inhibition of major ABC transporters, cocultivated cells continue to release DOX at higher rates than noncocultivated cells. These surprising results strongly indicate that other mechanisms are responsible for adipocyte-induced chemoresistance. We have demonstrated that resistance to DOX mediated by adipocytes correlated with resistance to paclitaxel and 5-fluorouracil (fig. 1D). Paclitaxel is also a well-known substrate of P-gp transporter, but not, or to a much lesser extent, of MRP-1 and BCRP [50] [22] [23] [51]. Moreover, 5-fluorouracil is not transported by P-gp, MRP-1 and weakly by BCRP [52] [50] [53]. Therefore, this pattern of cross-resistance is not in favor of the involvement of P-gp, MRP or BCRP in DOX resistance and is in accordance with the results of our efflux studies in the presence of inhibitors of these different transporters. Other ABC transporters exist that could induce DOX extracellular efflux, such as ABCA3, ABCB4, ABCB5 and ABCD8 but their role in chemoresistance remains poorly known and their implication in adipocyte-induced chemoresistance was not evaluated in the present study [54] [55]. An original mechanism implicating MVP and vesicles is potentially involved in the increased DOX efflux mediated by adipocytes. As stated in the introduction, in addition to ABC transporters, other mechanisms exist, that can prevent DOX from reaching its intracellular target, DNA, thereby conferring MDR phenotype to tumor cells [26]. Accordingly, the intracellular localization of DOX in cocultivated and non-cocultivated cells was investigated by confocal microscopy. At the end of the 4h incubation period with the drug (0h), DOX showed a strong nuclear staining (fig. 4A for T47D and 4B for MDA-MB436 cell lines). This nuclear staining decreased over time, with no visible staining in the cytoplasm in these conditions of cell fixation. Interestingly, a stronger decrease of DOX intranuclear accumulation was observed in cocultivated, compared to non-cocultivated cells, from 12 hours after drug exposure (fig. 4A and 4B, see right panels for quantification of nuclear fluorescence). These data suggest that coculture with adipocytes induces an important nuclear efflux. The protein MVP is the major component of vault particles, implicated in the nucleocytoplasmic transport of drugs. As its overexpression has been shown to be correlated with DOX chemoresistance [56] [57] [58] [26], we studied MVP expression in our coculture experiments. As shown in fig. 4C, overexpression of MVP was observed in non-cocultivated cells after drug exposure, compared to non-treated cells, suggesting that DOX treatment itself upregulates MVP expression, potentially contributing to the cell damage response to protect cells against DOX toxicity. Noteworthy, this induction was greater after coculture with adipocytes in the two cell lines studied (see fig. 4C). Overexpression of MVP in DOX-treated cells, with an increase of this effect in cocultivated cells was confirmed by preliminary 13 immunofluorescence results (fig. 4D). Surprisingly, MVP was mainly localized in the nucleus of tumor cells in our conditions of fixing, unlike several studies that have reported the presence of MVP mainly in the cytoplasm [59] [60] [61]. Further immunofluorescence experiments using different fixation approaches (acetone, methanol) are therefore required to study the precise subcellular localization of MVP in cells. To investigate the role of MVP in the observed chemoresistance, a RNA silencing strategy is mandatory since to our knowledge, no pharmacological inhibitor of this protein is available. Transfection of cells in coculture inserts is less efficient than in culture wells, possibly because the transfection solution diffuses into the lower chamber. For this reason, we decided to use tumor cells incubated with adipocyte conditioned-medium (AdCM). Therefore, we began by determining if AdCM recapitulated the effects of coculture. As shown on fig. 4E, exposure of tumor cells to AdCM induced an increase of MVP expression and an increase in nuclear and extracellular efflux of DOX, as compared to control cells. Using siRNA, we then investigated the effect of MVP knockdown (fig. 4F), which is considered an equivalent to vault knockdown [61]. Preliminary results suggest that MVP knockdown increases the nuclear accumulation of DOX, this effect being more pronounced in cells incubated with AdCM, than in control cells (increase of DOX nuclear concentration of 1.7 and 1.3-fold respectively at 24h after DOX exposure) (fig. 4G). In the MVPdepleted cells the differences in DOX nuclear accumulation between control and AdCM exposed cells was almost abolished (fig. 4G). Taken together, these preliminary results suggest that adipocytes induce an increase of MVP expression, which may promote a nuclear efflux of DOX, leading to the chemoresistance observed. Because we also observed an increase in DOX extracellular efflux in cocultivated cells compared to control cells (fig. 3A), we next investigated whether or not MVP knockdown inhibits this effect. Preliminary results suggested that downregulation of MVP by siRNA does not induce changes in DOX extracellular efflux at 24h after drug exposure as investigated by flow cytometry in MVP-depleted cells compared to control cells (fig. 4H). Other experiments using different siMVP are needed to confirm these results in order to verify the specificity of the observed biological effect. Taken together, these data suggest that MVP might induce a nuclear, but not an extracellular efflux of DOX, indicating that others mechanisms could be needed to expel DOX from the cells. Similar results were obtained by Herlevesen et al., who demonstrated that the knockdown of MVP did not influence the extracellular efflux but disrupted the intracellular distribution of DOX, leading to increased sensitivity of tumor cells to the drug [61]. Further experiments are therefore needed to confirm these preliminary results and to determine if the knockdown of MVP inhibits the drug resistance induced by adipocytes in breast tumor cells. It has been suggested that MVP may mediate a MDR phenotype by transporting the drugs away from their subcellular targets, followed by their sequestration into exocytotic vesicles to eliminate them from the cells [58]. To test this last hypothesis, breast tumor cell-conditioned medium (Bc-CM) was prepared. Bc-CM was obtained from cells previously cocultivated or not with adipocytes and treated or not with DOX. Microvesicles (MV) and exosomes were then purified from this Bc-CM by successive centrifugations (see Material and 14 Methods). Vesicle number and size distribution were analyzed by NanoSight technology. Our results confirmed the presence of both MV and exosomes within their characteristic size ranges (around 100 nm for exosomes and heterogeneous size between 0.1 and 1 µm for MV) [62] [63] (fig. 5A and 5B). We then determined if the vesicles secreted by breast tumor cells in the different conditions were qualitatively and quantitatively different using NanoSight technology. As shown on fig. 5, very little variation in the quantity of exosomes and microvesicles secreted by cocultivated cells, as compared to control cells, was observed in the absence of DOX treatment. However, an important increase in secreted particles was observed in DOX-treated cells and this effect was more pronounced for both MV and exosomes in cocultivated, compared to control, cells (increase of 1.9-fold for exosomes and 2.1-fold for microvesicles secreted, p<0.05 for both vesicle types) (fig. 5C). These data are in accordance with a previous study, which demonstrated that paclitaxel, etoposide, irinotecan and carboplatin enhance exosomal secretion [64]. Moreover, Shedden et al. have demonstrated that DOX may be encapsulated in extracellular vesicles, and this process is amplified in chemoresistant cells [65]. In order to determine if microvesicles and exosomes secreted by breast tumor cells contain DOX, we set up an experimental system, where vesicles were coated onto aldehyde/sulfate latex beads and were analyzed by FACS. Our preliminary results suggest that both exosomes and microvesicles secreted from cells treated with DOX were able to encapsulate this drug (fig. 5D). Further experiments are now needed to determine if MV and exosomes from cocultivated cells contain more DOX than control cells. Taken together, our preliminary results suggest that adipocytes may induce a nuclear efflux of DOX, mediated by MVP. The encapsulated DOX might then be secreted by MV and/or exosomes into the extracellular medium, this combined mechanism leading to drug resistance. The adipocyte signal contributing to the nuclear efflux of DOX in cancer cells is mediated by both exosomes and soluble factors. We then sought to identify the signal emanating from adipocytes that induces the increase of nuclear efflux of DOX from tumor cells. Although the role of soluble factors has been extensively studied, greater interest has developed in recent years on the role of extracellular vesicles in intercellular communication mechanisms in the context of tumor progression [66]. Accordingly, the different components contained in adipocyte-conditioned medium (AdCM) were purified according to the experimental protocol shown in fig. 6A. AdCM was separated into microvesicles (MV), soluble factors and exosomes together, as well as exosomes alone and soluble factors alone (fig. 6A). The T47D cell line was then incubated with these different isolated fractions and DOX nuclear efflux as well as MVP expression was analyzed using immunofluorescence experiments. As shown by the preliminary experiment presented in fig. 6B and 6C, only the fraction containing both soluble factors and exosomes recapitulated the effect of unfractionated AdCM, by increasing both DOX nuclear efflux and overexpression of MVP to a similar extent. Very interestingly, proteomic analysis of adipocyte exosomes performed in the laboratory by another PhD 15 student (Ikrame Lazar) has revealed that MVP is abundantly present in adipocytes exosomes. It is now well known that exosomes secreted by donor cells can be uptaken by recipient cells [66]. Therefore, adipocyte exosomes containing large amounts of MVP might be transferred to tumor cells, thereby leading to an increase of MVP in cocultivated breast tumor cells. This molecular transfer has been reported in several studies, for example vesicles are able to transfer P-gp or MRP-1 transporters from drug-resistant cancer cells to drug-sensitive tumor cells, leading to multidrug resistance in various models [67] [68] [69] [70]. Nevertheless, in our present study, adipocyte exosomes alone did not induce a nuclear efflux of DOX, suggesting that additional soluble factors present in AdCM are needed to recapitulate the chemoresistance observed in cocultivated cells. We postulate that soluble factors could impact some pathways in tumor cells, which can contribute to synergize with the MVP contained in exosomes, leading to an increase in the nuclear efflux of DOX. Further experiments are needed to determine if MVP is indeed transferred from adipocytes to tumor cells and which soluble factor(s) could “activate” MVP. If verified, this mechanism would represent a highly original pathway of drug resistance conferred by the tumor microenvironment. Adipocyte-mediated chemoresistance is increased by obesity. Since obesity is associated with a poor response to chemotherapy in breast cancer, we next investigated if obesity could amplify the deleterious crosstalk between adipocytes and breast cancer [6]. Murine visceral adipose tissue was isolated from lean and obese mice, obesity being induced by a high fat diet (HFD). At the time of euthanasia, high fat diet mice weighed significantly more than normal diet mice (ND) (fig. 7A). After digestion of adipose tissue by liberase, adipocytes were isolated by flotation as previously described [41] [7]. It has been formerly demonstrated that isolated adipocytes in suspension in an appropriate culture medium remain viable for approximatively 24 hours but from then on both survival and function are profoundly altered [71]. To circumvent this problem, we set up a 3D coculture system in the lab in which isolated adipocytes are embedded in a collagen I matrix as previously proposed (fig. 7A) [72] [73]. As shown on fig. 7B and 7C, adipocytes embedded in a collagen I matrix retain their round morphology in culture for up to 6 days, with a significant and long-lasting increase in size of about 2-fold in adipocytes isolated from HFD mice, compared to ND mice. Moreover, these adipocytes remain functional, as demonstrated by their ability to respond to a lipolytic signal induced by Isoproterenol (beta adrenergic agonist) (data not shown). To investigate the effect of obese adipocytes on drug resistance, cocultures with several breast tumor cell lines were performed with these adipocytes (fig. 7A). As shown on figure 7D, an increase of viability after DOX exposure was observed in cells cocultivated with adipocytes as compared to cells grown alone (increase of 1.35 to 1.9-fold) and this effect was amplified when adipocytes were isolated from obese mice (increase of 1.7 to 2.8-fold when compared to control). Similar results were obtained with mammary adipose tissue (preliminary results, data not shown). The increase of viability after DOX treatment was associated 16 with a parallel decrease in the nuclear accumulation of DOX (fig. 7E). Comparison of MVP expression in breast tumor cells cocultivated with adipocytes isolated from lean or obese mice as well as the quantity of vesicles secreted by tumor cells, after drug exposure in these conditions are currently being investigated. Collectively, these data demonstrate that the chemoresistance conferred by obesity is dependent on a paracrine mechanism involving a crosstalk between adipocytes and tumor cells. The fact that the DOX nuclear efflux is further increased by obesity strongly suggests that obesity could amplify the level of MVP in recipient cells, and probably the vesicle-mediated extracellular efflux. Moreover, several data obtained in the laboratory by another phD student (Emily Clement) demonstrated that adipocytes from obese mice secrete a huge quantity of exosomes, compared to adipocytes from lean mice, potentially conferring more MVP to recipient cells. Although additional experiments are needed to confirm our main hypothesis, our work reveals an exciting new role for tumor surrounding adipocytes, which confer a MDR phenotype to breast cancer cells, and the associated mechanistic pathway, which is summarized in fig. 8. We propose that DOX, which enters into tumor cells by passive diffusion and accumulates in the nucleus, is transported to the cytoplasm by MVP, followed by an extracellular efflux of DOX by vesicles that are secreted by tumor cells. Adipocyte-derived exosomes contain high levels of MVP that, in synergy with soluble factors, increases nuclear efflux and subsequent vesicle encapsulation of drug, resulting in a chemoresistant phenotype. In obesity, this mechanism is amplified leading to an increased chemoresistance. These results account for the poor prognosis observed for obese women with breast cancer, which is due in part to resistance to chemotherapy [6] [12] [13]. When fully validated in vitro, this original mechanism would be validated in mice and human tumor samples. 17 References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Mueller, M.M. and N.E. Fusenig, Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer, 2004. 4(11): p. 839-49. Laurent, V., et al., [Adipose tissue and cancer: a high risk tandem]. Med Sci (Paris), 2014. 30(4): p. 398-404. Wang, Y.Y., et al., Adipose tissue and breast epithelial cells: a dangerous dynamic duo in breast cancer. 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(B) Genomic characteristics and origins of cell lines used. ER (Estrogen Receptor), PR (Progesterone Receptor), HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor-2). (C) Results of viability assays of various breast tumor cells cocultivated with adipocytes (C) (white bars) or cultivated alone (NC) (black bars), treated or not with DOX (0, 0.5, 1 and 2.5 µg/mL doses). (D) Left panel, viability assays of T47D and MDA-MB436 cell lines cocultivated (C) or not (NC) with adipocytes, treated or not with paclitaxel (0, 50 and 200 nM doses). Right panel, similar experiments were performed using 5-fluorouracil (0, 2 and 20 µg/mL doses). Error bars represent the means ± SEM of 3 independent experiments, statistically significant by ANOVA, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, *** p<0.0001 relative to NC cells. A B C Figure 2. Incubation of cells with adipocytes after DOX exposure is mandatory to observe a chemoresistance. (A) Effects of preincubation with adipocytes on DOX resistance in breast tumor cells. Upper, experimental design: breast tumor cells were cocultivated (C) or not (NC) with adipocytes for 3 days and incubated with DOX. After DOX exposure, both cells were left to recover without adipocytes for 3 days. Lower, viability assays for T47D (left) and MDA-MB436 (right) cell lines. (B) Effects of postincubation with adipocytes on DOX resistance. Upper, experimental design: breast tumor cells previously treated with DOX were cocultivated (C) or not (NC) with adipocytes for 3 days. Lower, results of viability assays for indicated cell lines. (C) Comparison of the different experimental designs. Results were expressed in ratio of C versus NC cells. Black bars represent viability results using the preincubation experimental process, grey bars for postincubation alone and white bars for pre and postincubation. 0, 1 and 2.5 represent doses of DOX used (in µg/mL). Error bars represent the means ± SEM of 3 independent experiments, statistically significant by ANOVA (A, B, C) or student’s t-test (D), * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, ns for not significant. A NC C NC C h B NC C 0h C NC 4h C NC C h 24h NC C D Pgp+ NC 0h C NC 4h C NC 24h C NC C BCRP+ P-gp BCRP Tubulin Tubulin E Figure 3. Adipocytes decrease intracellular DOX accumulation independently of major ABC transporters. (A) Representative experiments showing the intracellular accumulation of DOX detected by flow cytometry at 12 hours after DOX exposure for indicated cell lines. Black lines: non-cocultivated cells (NC), red lines: cocultivated cells (C), continuous lines: cells treated with DOX, dotted lines: non-treated cells. Histograms represent the quantification of intracellular fluorescence of DOX for each cell line at indicated times after drug exposure. Black bars for NC and red bars for C cells. (B) Expression of major ABC transporters (P-gp, BCRP), determined by Western blot in T47D cells. NIH3T3-MDR-G185 and HEK-ABCG2 were used as positive controls for each ABC transporter. (C) Quantification of intracellular DOX at indicated times after drug exposure, in presence or not of P-gp inhibitors, Verapamil (Vp) and Tariquidar (Tar), detected by flow cytometry in T47D (upper) and MDA-MB436 (lower) cells. Similar experiments were performed using the MRPs family inhibitor, MK-571 (MK) (D), and the BCRP inhibitor, Fumitremorgin-C (FTC) (E). Error bars represent the means ± SEM of at least 3 independent experiments, statistically significant by Student’s t-test, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, ns for not significant. A 12h 0h NC 24h NC C NC C DOX/ DAPI DOX C 0h B 24h NC NC C NT C NC C 0h NC C 12h NC C 24h NC C C DOX MVP Tubulin DOX/ DAPI NT NC 0h C NC 12h C NC MVP Tubulin D NT NC 0h NC C 24h NC C NC C DOX / MVP DOX MVP LRP/MVP C 12h NT E NC AdCM C NC 24h AdCM C NC AdCM MVP MVP DOX / MVP DOX Tubulin G F H siMVP NT NC NT siCtl siMVP DOX MVP Tubulin AdCM NC AdCM C 24h C NC C Figure 4. DOX nuclear efflux is potentially dependent on MVP. (A,B) Left, intracellular localization of DOX visualized by confocal microscopy in noncocultivated (NC) and cocultivated (C) cells at indicated times after DOX exposure in T47D (A) and MDA-MB436 (B) cells. Nuclei were labeled with DAPI (Scale bars, 10 µm). Right, corresponding quantification of fluorescence intensity (DOX) in the nuclei using Fiji software. Error bars represent the mean ± SEM of 3 independent experiments, statistically significant by ANOVA, * p<0.05, ** p<0.01, ns for not significant. (C) Immunoblots for MVP in non-cocultivated (NC) and cocultivated (C) T47D (upper) and MDA-MB436 (lower) cells at indicated times after DOX exposure. Tubulin is shown as a control for equal protein loading. (D) Immunofluorescence staining visualized by confocal microscopy of MVP expression in T47D cells at indicated time after DOX treatment (scale bar, 20 µm). (E) Comparison of MVP expression in control T47D cells (NC) and after incubation with Adipocyte-conditioned medium (AdCM) cells after treatment, or not, with DOX as determined by Western blot (upper, left) and immunofluorescence (right). Quantification of extracellular efflux (lower, right) and nuclear efflux (right, Immunofluorescence of DOX) (scale bar, 20 µm). (F) MVP protein levels were analyzed after transfection with MVP siRNA, control siRNA or in non-transfected cells by Western blot. Tubulin is shown as a control for equal protein loading. (G) Left, DOX labeling using confocal microscopy in MDA-MB436 cultivated alone (NC) or with AdCM, in presence of siRNA against MVP, compared to non-transfected cells. Right, fluorescence quantification of DOX in the nuclei (scale bar, 20 µm). Error bars represent the mean ± SEM of one experiment. (H) MDA-MB436 previously incubated with AdCM or DMEM (NC), transfected with siMVP, siControl or non-transfected were treated with DOX. 24h after DOX exposure, intracellular fluorescence of DOX was analyzed by flow cytometry. particles / million cells (E8) 80 B NC NT C NT 60 NC doxo 50 C doxo 40 30 20 10 0 C NC NT C NT 6 NC doxo 5 C doxo 4 3 2 1 0 0 -10 8 7 70 Particles / million cells (E8) A 200 400 600 800 1000 Particles size 0 -1 200 400 600 800 1000 Particles size D NT DOX NT DOX Figure 5. Coculture stimulates vesicle secretions by tumor cells and these vesicles contain DOX. T47D cells previously cocultivated with adipocytes (C) or not (NC) were incubated in the presence (DOX) or in absence (NT) of DOX, and were then cultivated in media previously depleted in contaminating vesicles. The microvesicles (MV) and exosomes (Exo) contained in these conditioned media were then isolated by differential centrifugations and analyzed using NanoSight technology. (A) Representative analysis of the size distribution of exosomes for indicated conditions. (B) Representative analysis of the size distribution of MV for indicated conditions. (C) Ratio of the number of vesicles of C versus NC cells previously treated with DOX was represented. Error bars represent the means ± SEM of 3 independent experiments statistically significant by ANOVA, * p<0.05 relative to NC cells. (D) Exosomes (left) and MV (right) secreted by T47D cells subjected to DOX or under basal conditions were subsequently coupled onto latex beads and analyzed by flow cytometry. Red lines represent vesicles from cells treated with DOX. Black dotted lines represent vesicles from control cells. A B AdCM Soluble factors Exosomes Soluble factors + exosomes MV DOX / MVP DOX MVP DMEM C DOX quantification MVP quantification Figure 6. Identification of the adipocyte secretions responsible for chemoresistance. (A) Experimental process for AdCM purification: AdCM previously depleted in cell debris was centrifugated at 10,000g for 30 minutes to obtain MV (pellets) and soluble factors + exosomes (supernatant). The supernatant obtained was ultracentrifugated at 100,000g for 90 minutes in order to isolate exosomes (pellets) from soluble factors (supernatant). (B) Immunofluorescence staining using confocal microscopy of MVP expression in T47D cells incubated with the different fractions obtained from AdCM and treated, or not, with DOX (scale bar, 20 µm). (C) Nuclear quantification of the DOX signal (left) and MVP (right) at 24h after DOX exposure, using Fiji software. Error bars represent the mean ± SEM of one experiment. A B HFD C Bodipy Transmission ND Viability D C E ND HFD DOX / DAPI DOX NC Figure 7. Adipocyte-mediated chemoresistance is amplified by obesity. (A) Left, representative weights of lean (ND) and obese (HFD) mice from one representative experiment. Right, experimental design of 3D coculture experiments: Primary adipocytes were isolated from visceral adipose tissue, obtained from either lean (ND) or obese (HFD) mice and subsequently embedded in a collagen I matrix. Then, coculture experiments were performed, in which breast tumor cells were seeded in transwells. Breast tumor cells seeded in transwells with collagen I matrix without adipocytes, were used as NC cells. (B) Lipid accumulation using bodipy (green) and morphology (transmission) of primary adipocytes embedded in a collagen I matrix, isolated from ND or HFD mice (scale bar, 100 µm). (C) Mean size of the adipocytes embedded in a collagen I matrix at indicated times, measured using Fiji software. (D) Viability assays after DOX exposure of different breast cancer cell lines cocultivated (C), or not (NC), with adipocytes from lean (ND) or obese (HFD) mice. Graphs represent the ratio of C versus NC cells. (E) Left, intracellular localization of DOX using confocal microscopy in cells non-cocultivated (NC) or cocultivated (C) with adipocytes from ND or HFD mice at 24h after DOX exposure. Nuclei were labeled with DAPI (Scale bars, 10 µm). Right, corresponding quantification of fluorescence intensity (DOX) in the nuclei using Fiji software. Error bars represent the means ± SEM of 3 independent experiments, statistically significant by Student’s t-test, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, indicated p-value. Figure 8. Schematic representation of the role of tumor surrounding adipocytes in breast cancer resistance to DOX. DOX enters tumor cells by passive diffusion and accumulates in the nucleus. Upon adipocyte stimulation, through both soluble factors and exosomes containing a high level of MVP, vault particles may promote a nuclear efflux. This is followed by an extracellular efflux of DOX, possibly mediated by vesicles encapsulating DOX secreted by tumor cells. This adipocyte-mediated mechanism contributes to a MDR chemoresistance phenotype. In obesity, this mechanism is amplified leading to an increase in the chemoresistance observed. CONCLUSION ET PERSPECTIVES 131 132 En dépit de l’amélioration des techniques de dépistage et des progrès de la médecine, le cancer du sein demeure une cause majeure de décès dans le monde (Fojo and Coley 2007). D’autre part, des données épidémiologiques convaincantes ont mis en évidence que l’obésité représente un facteur de mauvais pronostic global pour le cancer du sein, caractérisé notamment par un envahissement local et à distance plus important, une diminution de la survie globale et de la survie sans maladie, une augmentation des rechutes et une chimiorésistance (Ewertz et al 2011). Le sein étant composé majoritairement d’adipocytes, une proximité importante est observée entre les adipocytes et les cellules tumorales mammaires. Ainsi, au cours de mon doctorat, je me suis intéressée à l’effet de l’interaction entre ces deux types de cellules dans la progression tumorale mammaire et la chimiorésistance, ainsi que la régulation de ce dialogue dans un contexte d’obésité. Quand je suis arrivée au laboratoire, l’équipe du Pr. Muller avait déjà identifié l’existence d’un dialogue bidirectionnel entre les cellules tumorales et les adipocytes, à l’origine de modifications des deux types cellulaires, ceci au profit de la tumeur. En effet, les cellules tumorales ont la capacité de modifier les adipocytes en un nouveau phénotype que nous avons appelé CAAs pour « Cancer-Associated Adipocytes ». Ces cellules modifiées vont en retour promouvoir l’invasion et la radiorésistance des cellules tumorales (Dirat et al 2011) (Bochet et al 2011). Ludivine Bochet, alors doctorante dans l’équipe a, par la suite, poursuivi la caractérisation de l’interaction entre adipocytes et cellules tumorales. Elle a ainsi mis en évidence qu’une co-culture prolongée entre ces deux types de cellules donne lieu à des modifications profondes des adipocytes, ceux-ci adoptant une morphologie fibroblastique et que l’on a nommé ADFs pour « Adipocytes-Derived Fibroblasts ». Dans la continuité de ces travaux, l’objectif de ma thèse a donc été, dans un premier temps, de participer à la caractérisation du phénotype ADFs et à son rôle dans la progression tumorale, en m’axant principalement sur la détermination de la (ou des) sécrétion(s) tumorale(s) responsable(s) de la réorientation des adipocytes en fibroblastes et également sur l’évaluation de ce phénotype dans les tumeurs humaines. Dans un deuxième temps, je me suis intéressée au rôle des adipocytes dans la résistance à la chimiothérapie. J’ai alors étudié (i) l’effet potentiel des adipocytes sur la réponse d’un large panel de lignées tumorales à différentes chimiothérapies conventionnelles, (ii) les mécanismes moléculaires impliqués et (iii) la régulation de la chimiorésistance médiée par les adipocytes dans un contexte d’obésité. L’ensemble de ces résultats montre que les adipocytes représentent des acteurs importants dans la progression tumorale : ils peuvent, en effet, se réorienter en fibroblastes activés et participent ainsi à la réaction desmoplasique et ils peuvent également promouvoir la résistance à la chimiothérapie. 133 Rôle des adipocytes dans la réaction desmoplasique Un nouveau phénotype d’origine adipocytaire : les ADFs. Nous avons pu montrer que sous l’influence prolongée des cellules tumorales, les adipocytes adoptent progressivement un phénotype de CAFs. Ce phénotype, que l’on a appelé ADF est notamment caractérisé par : une morphologie fibroblastique, la perte importante des marqueurs adipocytaires (Adipsine, Adiponectine, Ap2, LHS, Glut4), la sécrétion accrue de protéines de la matrice extracellulaire (fibronectine et collagène I) et l’expression de FSP-1 (Fibroblast Specific Protein-1). Par contre, les ADFs n’expriment pas α-SMA (α-Smooth Muscle Actin), qui représente un marqueur classique de CAFs. Le fait que les ADFs expriment uniquement FSP-1 et non α-SMA, est en accord avec l’hypothèse d’une population hétérogène au sein des CAFs et d’une expression de marqueurs différents en fonction de leur origine cellulaire. Comme nous l’avons vu dans la première partie de l’introduction de ce manuscrit, l’équipe de R. Kalluri a mis en évidence un différentiel d’expression de certains marqueurs dans les CAFs, ainsi classés en 2 groupes majoritaires : ceux qui expriment FSP-1 mais qui n’expriment pas NG2, α-SMA et PDGFR-β et ceux qui expriment ces 3 marqueurs mais qui n’expriment pas FSP-1 (Sugimoto et al 2006). De la même manière, dans un modèle syngénique de cancer du sein et de l’ovaire, Kidd et al. ont montré que les BMSCs (Bone-Marrow Stem Cells) se différencient préférentiellement en CAFs, exprimant FSP-1 et FAP et sont majoritairement localisés à la périphérie de la tumeur. A l’inverse, les ADSCs se différencient en CAFs exprimant α-SMA et NG2 et sont retrouvés à proximité des vaisseaux sanguins (Kidd et al 2012). Il serait maintenant intéressant de déterminer la proportion relative de CAFs α-SMA-/FSP-1+ par quantification de co-marquages sur des coupes de tumeurs mammaires et d’identifier leur localisation et leur rôle dans la progression tumorale. Etant donné l’abondance des adipocytes dans le sein, notre hypothèse est que la proportion de CAFs α-SMA-/FSP-1+ provenant d’adipocytes serait quantitativement importante. Cette population cellulaire est d’autant plus intéressante à étudier, que la protéine FSP-1 exerce un rôle important non seulement dans la motilité cellulaire (qui pourrait expliquer le potentiel migratoire des ADFs) mais aussi dans l’effet pro-métastatique des CAFs, son expression étant associée à un mauvais pronostic dans les cancers (Grum-Schwensen et al 2005) (Rasanen and Vaheri 2010). En effet, nous avons pu mettre en évidence que les ADFs favorisent l’invasion des cellules tumorales in vitro, en 2D ainsi qu’en 3D (sphéroïdes). Il serait donc intéressant de co-injecter les ADFs avec des cellules tumorales à des souris, afin de déterminer leurs capacités pro-métastatiques et d’observer leur localisation intratumorale in vivo. D’autre part, afin de déterminer l’implication de FSP-1 dans l’effet pro-invasif observé, une approche d’invalidation génique dans les ADFs pourrait être envisagée in vitro (sphéroïdes mixtes composés de cellules tumorales et d’ADFs) et in vivo (co-injection de cellules tumorales et d’ADFs). Initialement identifié dans le modèle du cancer du sein, le phénotype CAA a été retrouvé dans d’autres modèles, tels que les cancers de l’ovaire, de la prostate invasif, du côlon et le mélanome (Finley et al 2009) (Nieman et al 2013) (Kushiro et al 2012). Tout comme les CAAs, il est 134 probable que les ADFs soient retrouvés dans des cancers autres que celui du sein. Il serait donc intéressant de les identifier dans d’autres modèles, tels que les cancers de la prostate et du côlon (connus pour présenter une forte réaction desmoplasique) in vitro, in vivo et sur des coupes de tumeurs humaines, afin de déterminer s’ils expriment le même phénotype que dans le cancer du sein (expression de FSP-1+, α-SMA-, propriétés migratoires et invasives, sécrétion de protéines de la MEC, effet sur les cellules tumorales), ainsi que leur proportion relative dans ces tumeurs. Sécrétions tumorales à l’origine de la réorientation des adipocytes en ADFs Nos résultats ont montré que l’apparition du phénotype ADFs dépend de la voie de signalisation Wnt/β-caténine en réponse au ligand Wnt3a sécrété par les cellules tumorales. Ainsi, le blocage de cette voie de signalisation par un inhibiteur (ICG-001) ou par un anticorps bloquant dirigé contre Wnt3a, restaure partiellement l’accumulation de lipides et la morphologie arrondie des adipocytes, perdues au cours de la co-culture. Ces résultats pourraient être confirmés in vivo sur des coupes de tumeurs humaines, en étudiant l’expression de la voie Wnt/β-caténine sur les populations fibroblastiques FSP-1+. D’autre part, nous avons mis en évidence que différentes lignées tumorales mammaires expriment et sécrètent Wnt3a, suggérant que la réorientation des adipocytes en ADFs est un mécanisme général. La voie de signalisation Wnt/β-caténine exerce un rôle pivot dans le développement embryonaire, la migration cellulaire, le maintien du caractère « cellules-souches » et la transition épithélio-mésenchymateuse (O'Toole et al 2013). Plusieurs études ont mis en évidence que la dérégulation de cette voie de signalisation dans les tumeurs représente un critère d’agressivité et est associée à un potentiel métastatique plus important, notamment pour les cancers du sein triple-négatifs (Dey et al 2013). Il serait intéressant de comparer l’expression et la sécrétion de Wnt3a dans différentes lignées cellulaires mammaires agressives ou non, afin de déterminer si les cellules tumorales agressives sécrèteraient plus de Wnt3a et donc participeraient potentiellement plus à la réorientation des adipocytes en ADFs. Cette hypothèse serait en accord avec le fait que le dialogue entre cellules tumorales et adipocytes représente un véritable cercle vicieux initié par les cellules tumorales. L’étude de l’expression et la sécrétion de Wnt3a ainsi que son invalidation dans le système de co-culture utilisé pourraient également être réalisées dans d’autres modèles que le cancer du sein. Les ADFs, la fibrose, l’inflammation et l’obésité ? Nos travaux confirment que la fibrose, associée à la présence de fibroblastes activés (ADFs) sécrétant des composants de la MEC, est un paramètre important dans la progression tumorale mammaire. A notre connaissance, aucune étude n’a jusqu’à présent étudié la fibrose dans le TA mammaire de patientes obèses dans un contexte normal et tumoral. Toutefois, des arguments de la littérature suggèrent que l’obésité est associée à une fibrose plus importante, au moins dans le TA viscéral. Concernant le TA mammaire, l’équipe de Philipp Scherer a mis en évidence que l’endotrophine (fragment de clivage du collagène VI) est augmentée dans la glande mammaire des souris obèses, 135 suggèrant la présence d’une fibrose importante, au même titre que dans le TA viscéral (Park and Scherer 2012). Au cours de ma thèse, j’ai eu l’opportunité de réaliser des marquages d’immunohistochimie sur des coupes de tumeurs mammaires murines, provenant de l’injection orthotopique de cellules murines M-Wnt ou E-Wnt à des souris normopondérales ou obèses (blocs donnés par Stephen Hursting (Austin, Texas, USA)) (Dunlap et al 2012). Les résultats préliminaires que j’ai obtenus suggèrent que les tumeurs de souris obèses présentent une fibrose (présence de fibres de collagène I) plus importante que les tumeurs de souris normopondérales (résultats non montrés). Ces résultats pourraient être confirmés sur des coupes de tumeurs humaines. La caractérisation complète du TA mammaire dans un contexte tumoral permettrait de faire le lien entre obésité – fibrose et progression tumorale. D’autre part, la caractérisation des ADFs dans un contexte d’obésité pourrait être intéressante. L’étude de l’expression de FSP-1 et d’α-SMA sur des coupes de tumeurs de patientes présentant des IMC différents permettrait de déterminer la présence et l’éventuelle amplification des ADFs dans un contexte d’obésité. D’autre part, une étude très récente a mis en évidence que FSP-1 est associé à une inflammation chronique et pourrait établir un lien entre inflammation et métastases (Hansen et al 2015). Comme nous l’avons vu dans la deuxième partie de l’introduction, l’obésité est associée à un état inflammatoire dit de « bas-bruit » dans le TA viscéral et dans le TA mammaire. Ainsi, FSP-1 pourrait être augmenté dans un contexte d’obésité, ce qui pourrait, en partie, expliquer les données épidémiologiques observées qui montrent que les femmes obèses présentent un cancer du sein plus agressif, avec un envahissement local et à distance plus importants (Ewertz et al 2011). Notre hypothèse est que les adipocytes représentent une source majeure de CAFs dans le cancer du sein, d’autant plus dans un contexte d’obésité, où une hyperplasie des adipocytes est observée. Cette étude est actuellement en cours de réalisation par Dr Charlotte Vaysse (chirurgienne à l’Institut Universitaire du Cancer, affiliée à notre équipe) qui est actuellement en stage d’une année dans l’équipe d’Inger Thune (Centre anti-cancéreux, Oslo, Norvège). Elle a déjà recensé une collection annotée de tumeurs mammaires, provenant de femmes d’IMC différents et présentant tous les paramètres métaboliques connus (30 tumeurs de patientes obèses et 30 tumeurs de patientes de poids normal), qui sont en cours de caractérisation. Enfin, au cours de mon doctorat, j’ai participé à la mise en place d’un système de co-culture en 3D permettant d’étudier l’impact de l’obésité sur le dialogue adipocytes / cellules tumorales in vitro. L’utilisation de ce système de co-culture permettra d’étudier in vitro les modifications des adipocytes primaires induites par les cellules tumorales (expression de FSP-1, changements morphologiques, diminution des marqueurs adipocytaires, activation de la voie Wnt/β-caténine) dans un contexte normopondéral mais aussi d’obésité. 136 Rôle des adipocytes dans la chimiorésistance Les adipocytes favorisent la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires, via un mécanisme d’efflux original. Les résultats obtenus au cours de ma thèse montrent que les adipocytes protègent les cellules tumorales de la cytotoxicité induite par des chimiothérapies conventionnelles, classiquement utilisées dans le cancer du sein, telles que la doxorubicine, le paclitaxel et le 5-fluorouracile. Pour compléter ces travaux, une autre molécule, le cyclophosphamide (très utilisé dans le traitement du cancer du sein) pourrait également être utilisée. Le cyclophosphamide doit être métabolisé par le foie en mafosfamide pour exercer son effet cytotoxique (Goldstein et al 1989) (Krasna et al 2003). Ainsi, le traitement au mafosfamide des cellules tumorales incubées avec des adipocytes avant et après traitement permettrait d’étendre nos résultats sur le rôle protecteur des adipocytes concernant un large panel de protocoles cliniquement utilisés dans le traitement des cancers du sein. Afin de déterminer le mécanisme d’action de la chimiorésistance accrue des cellules tumorales en présence d’adipocytes, nous nous sommes axés sur la doxorubicine. Cette molécule présente l’avantage d’avoir des propriétés intrinsèques de fluorescence, facilitant son suivi au sein des cellules. Nos résultats ont mis en évidence que les adipocytes entraînent une diminution de la quantité de doxorubicine dans le noyau et dans la cellule. Cette diminution de doxorubicine pourrait être liée à une diminution de l’influx, une dégradation plus importante ou une augmentation de l’efflux de la drogue. Un seul transporteur d’influx a été décrit, capable de prendre en charge la doxorubicine : le SLC22A16 (Huang and Sadee 2006). Cependant de par sa structure lipophile, la doxorubicine rentre majoritairement dans la cellule par voie passive et les transporteurs d’influx n’exerceraient qu’un rôle minoritaire dans la résistance observée. D’autre part, nous avons montré dans l’équipe, qu’un transfert de lipides est observé entre les adipocytes et les cellules tumorales (YuanYuan Wang, résultats non publiés). Nous pouvons imaginer, que la doxorubicine peut être stockée dans les gouttelettes lipidiques des cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes, empêchant son action au niveau du noyau. En réalisant un marquage bodipy (qui marque les lipides neutres) dans les cellules tumorales, j’ai pu montrer que la doxorubicine n’est pas localisée au niveau de ces gouttelettes, ce qui réfute cette hypothèse (résultats non montrés). Ainsi, l’hypothèse que les adipocytes favorisent l’efflux de doxorubine, d’abord du noyau vers le cytoplasme, puis du cytoplasme vers le milieu extra-cellulaire, reste l’hypothèse la plus convaincante, d’autant plus que l’efflux représente le mécanisme de chimiorésistance majoritaire de la doxorubicine (Holohan et al 2013). D’autre part, nous avons retrouvé la présence de doxorubicine dans les vésicules extra-cellulaire (voir chapitre suivant). Nos résultats préliminaires suggèrent que la protéine MVP/LRP (Major Vault Protein / Lung Resistance Protein) exercerait un rôle dans l’efflux nucléaire observé. Bien que le mécanisme d’action de cette protéine ne soit pas bien caractérisé, il a été démontré que MVP favorise le transport nucléo137 cytoplasmique de drogues, via les particules voûtes (Scheffer et al 1995) (Scheper et al 1993) (Izquierdo et al 1996a). Nos résultats ont mis en évidence une augmentation de l’expression de MVP dans les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes. De plus, des données préliminaires suggèrent que l’invalidation de cette protéine (par des ARN interférents) restaure l’accumulation de doxorubicine dans le noyau et ce processus est d’autant plus marqué dans les cellules incubées avec le milieu conditionné d’adipocytes. Ces résultats très encourageants sont actuellement en cours de confirmation. L’analyse de la viabilité des cellules co-cultivées ou non avec des adipocytes et traitées à la doxorubicine devra également être réalisée après invalidation de MVP, afin de confirmer l’implication de cette protéine dans la chimiorésistance médiée par les adipocytes. Comme nous l’avons vu dans la 3ème partie de l’introduction de ce manuscrit, les voûtes sont composées majoritairement de MVP mais elles contiennent également deux autres sous-unités (VPARP et TEP1) et des ARNs (Lara et al 2011). Des études ont mis en évidence que les sous-unités VPARP et TEP1 sont également surexprimées dans les cellules présentant un phénotype MDR (Siva et al 2001). Bien que le rôle de ces sous-unités ne soit pas bien caractérisé, il est possible qu’elles exercent un rôle important dans le mécanisme observé. Ainsi, l’expression des autres composants des voûtes pourrait être étudiée dans les cellules tumorales co-cultivées ou non avec les adipocytes, après traitement à la doxorubicine. De plus, il serait intéressant d’étudier la localisation intra-cellulaire précise des voûtes par microscopie électronique dans ces conditions. En effet, de manière surprenante, nous observons une localisation plutôt nucléaire de la protéine MVP en immunofluorescence. Ces résultats sont en désaccord avec les données de la littérature, qui ont rapporté la présence de MVP majoritairement dans le cytoplasme (Eichenmuller et al 2003) (van Zon et al 2006) (Herlevsen et al 2007). Des expériences sont actuellement en cours de réalisation au laboratoire afin de confirmer ces résultats, en comparant différentes conditions de fixation. Les données relatives aux mécanismes d’action de MVP suggèrent qu’en plus de favoriser le transport des drogues du noyau vers le cytoplasme, MVP pourrait promouvoir l’internalisation des drogues dans des vésicules cytoplasmiques, qui expulsent ensuite les drogues de la cellule par exocytose (Izquierdo et al 1996a) (Kolli et al 2004) (de Moraes et al 2013) (Meschini et al 2002). Parmi les organelles ayant un rôle dans la résistance aux drogues, un intérêt croissant a été porté aux lysosomes (Groth-Pedersen and Jaattela 2013). Pendant longtemps considérés comme de simples organelles à l’origine de la dégradation de macromolécules, ils sont maintenant décrits comme capables de participer au processus MDR, par séquestration et/ou par efflux des drogues dans l’espace extra-cellulaire (Groth-Pedersen and Jaattela 2013) (Federici et al 2014). En effet, les drogues peuvent diffuser dans les vésicules acides, qui peuvent ainsi convertir les drogues en formes chargées, empêchant leur diffusion à travers les membranes. Dans l’équipe, nous avons montré que les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes sont métaboliquement remaniées, à l’origine d’une augmentation de la production de lactacte et à la diminution du pH (YuanYuan Wang, résultats non publiés). Parmi les compartiments intra-cytoplasmiques, plusieurs sont connus pour avoir un pH acide, tels que l’appareil de Golgi (pH 6.2-6.4), les endosomes précoces (pH 6–6.5), les 138 endosomes tardifs (pH 5.2–5.8) et les lysosomes (pH 4.8–5.2) (Larsen et al 2000). De plus, il a été rapporté que MVP peut favoriser la séquestration des drogues, notamment la doxorubicine, dans les lysosomes (Herlevsen et al 2007). Ainsi, la doxorubicine pourrait être séquestrée de manière importante dans des organelles intra-cytoplasmiques (lysosomes, endosomes) des cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes, empêchant son action au niveau du noyau. Il serait intéressant de comparer l’expression et la co-localisation de LAMP-1 (Lysosomal-Associated Membrane Protein) avec la doxorubicine dans les cellules tumorales co-cultivées ou non avec les adipocytes. Dans un deuxième temps, l’invalidation de MVP pourrait être réalisée dans ces conditions, afin de déterminer son implication fonctionnelle dans la séquestration de la doxorubicine dans les lysosomes dans nos conditions expérimentales. Hormis l’efflux nucléaire observé, les adipocytes induisent également un efflux cellulaire de la drogue. Nos résultats suggèrent que l’efflux cellulaire médié par les adipocytes semble indépendant des 3 pompes d’efflux majoritairement impliquées dans la chimiorésistance (P-gp, MRP1 et BCRP). Ces résultats sont en accord avec le fait que MVP est souvent surexprimé dans des lignées qui n’expriment pas ces transporteurs ABC classiques (Hu et al 2002) (Meschini et al 2002). Cependant, il a été rapporté dans les mécanismes de résistance de MVP, que cette protéine peut dans certains cas coopérer avec les transporteurs ABC pour faire augmenter l’efflux des drogues hors de la cellule (Mossink et al 2003). Au cours de nos travaux, nous n’avons étudié que les transporteurs ABC majoritairement impliqués dans la chimiorésistance. Ainsi, l’expression des autres transporteurs ABC connus pour exercer un rôle dans la résistance pourrait être évaluée dans les cellules tumorales co-cultivées ou non, notamment ABCA3, ABCB4, ABCB5 et ABCD8 capables de prendre en charge la doxorubicine (Lal et al 2010) (Jamieson and Boddy 2011) (Mossink et al 2003). Toutefois, il semble que l’implication des transporteurs ABC dans l’efflux cellulaire médié par les adipocytes soit à exclure, car nos résultats préliminaires montrent d’une part une très faible expression de ces pompes dans nos modèles cellulaires et suggèrent d’autre part un autre mécanisme d’efflux de la doxorubicine via sa séquestration dans des vésicules extra-cellulaires (VE) (exosomes, microvésicules). En effet, nous avons pu montrer que les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes et traitées à la doxorubicine sécrétaient plus de VE que les cellules non co-cultivées et, de manière intéressante, les VE sécrétées contiennent de la doxorubicine. Ces résultats confirment que la doxorubicine est bien effluée de la cellule et non dégradée. La comparaison de la quantité de doxorubicine contenue dans les VE de cellules co-cultivées ou non est actuellement en cours de réalisation au laboratoire. Nos résultats préliminaires, basés sur l’étude de la taille des VE et sur les résultats préalables trouvés dans l’équipe (Ikrame Lazar, résultats non publiés), suggèrent que les deux types majoritaires de VE, exosomes et microvésicules, seraient impliqués dans l’efflux observé (augmentation par la co-culture et capacité de stocker la doxorubicine), en accord avec des données de la littérature. En effet, plusieurs études ont mis en évidence que les MV peuvent contenir de la 139 doxorubicine et ainsi permettre son expulsion de la cellule (Gong et al 2013) (Shedden et al 2003) (Jorfi and Inal 2013). D’autre part, les exosomes ont également été impliqués dans l’encapsulation et l’efflux de cisplatine (Azmi et al 2013) (Federici et al 2014). Cependant, des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer la nature de ces VE (caractérisation de la densité, de l’expression de marqueurs de ces VE (flotilline-1, tétraspanines, Alix…) et de leur morphologie (microscopie électronique)). Ces deux types de vésicules sont différenciés par leur taille, leurs fonctions biologiques et aussi par leur origine cellulaire(S et al 2013)(S et al 2013)(S et al 2013)(S et al 2013)(S et al 2013) . A l’inverse des MV, qui sont formées par bourgeonnement de la membrane plasmique, les exosomes proviennent de la voie d’endocytose, libérés par la fusion des endosomes tardifs multivésiculaires ou MVB (Multivesicular bodies) avec la membrane plasmique (figure 36) (Kowal et al 2014). Il a été montré que les endosomes peuvent soit fusionner avec la membrane plasmique soit avec les lysosomes, cependant, les mécanismes impliqués ne sont pas encore bien caractérisés (Kowal et al 2014). Il est possible, qu’après avoir été expulsée du noyau, la doxorubicine soit encapsulée dans les endosomes, qui deviendront des MVB et pourront soit fusionner avec la membrane plasmique, à l’origine de la libération des exosomes dans le milieu extra-cellulaire, soit fusionner avec les lysosomes (Colombo et al 2014). Peu d’études ont déterminé si la formation de lysosomes et la sécrétion d’exosomes représentent des mécanismes contradictoires ou s’ils agissaient en symbiose pour promouvoir la résistance aux drogues (Safaei et al 2005). La biogenèse et la sécrétion des exosomes (de la formation des vésicules intra-luminales à la libération des exosomes dans l’espace extra-cellulaire) impliquent plusieurs molécules, telles que le complexe ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport), les tétraspanines, les RAB GTPases, les SNAREs (Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptors), les ions calcium et le céramide (figure 36) (Kowal et al 2014) (Raposo and Stoorvogel 2013). L’implication du céramide dans la biogenèse des exosomes pourrait expliquer pourquoi les cellules traitées à la doxorubicine libèrent plus d’exosomes que les cellules non traitées (Eytan 2005) (Trajkovic et al 2008). En effet, un des mécanismes d’action de la doxorubicine est de favoriser la production de céramide, aboutissant à la mort cellulaire (Liu et al 2008). La biogénèse des MV à partir de la membrane plasmique reste peu caractérisée à ce jour. Il a été rapporté que ce processus pourrait dépendre de la machinerie Actine-Myosine, de l’action des petites GTPases, telles qu’ARF6 (ADP-ribosylation factor 6), du complexe ESCRT (Alix) et aussi des ions calcium ce qui suggère que la libération des exosomes et des MV pourrait dépendre de facteurs communs. Ainsi, l’inhibition de la libération de la sécrétion des VE pourrait être envisagée, en bloquant par exemple RAB27a et/ou RAB27b ou les tétraspanines (ARN interférence) dans les cellules tumorales co-cultivées ou non avec les adipocytes dans le but de chimiosensibiliser les cellules à la doxorubicine (figure 36) (Azmi et al 2013) (Kowal et al 2014) (Raposo and Stoorvogel 2013) (S et al 2013). Dans un second temps, il serait intéressant de déterminer si la protéine MVP 140 favorise la séquestration des drogues dans ces vésicules, faisant un lien direct entre l’efflux nucléaire et l’efflux cellulaire observés, en comparant la sécrétion de VE de cellules invalidées pour MVP ou non dans notre système de co-culture. Figure 36. Mécanismes de biogenèse et de sécrétions des exosomes et des MV. La biogenèse des exosomes implique la formation des endosomes en MVB, qui pourra libérer les exosomes dans l’espace extra-cellulaire par fusion des MVB avec la membrane plasmique. Ces mécanismes sont dépendants du complexe ESCRT, des protéines RAB et des protéines SNAREs. Les MV sont libérées dans l’espace extra-cellulaire par bourgeonnement de la membrane plasmique (d’après (Kowal et al 2014)). En conclusion, notre hypothèse est que les adipocytes favorisent la surexpression de MVP dans les cellules tumorales mammaires, ce qui induit un efflux nucléaire plus important de doxorubicine et puis sa séquestration dans des compartiments acides. Ces vésicules intra-cytoplasmiques peuvent fusionner avec la membrane plasmique afin de libérer des VE contenant des quantités importantes de doxorubicine, à l’origine de l’efflux cellulaire et de la chimiorésistance observés. Ce mécanisme d’efflux original a déjà été rapporté dans différents modèles pour diverses chimiothérapies (Shedden et al 2003) (Safaei et al 2005). Identification des sécrétions adipocytaires responsables de la chimiorésistance. Nos résultats ont mis en évidence que le milieu conditionné d’adipocytes (AdMC) reproduit les effets de la co-culture sur la chimiorésistance, en termes de viabilité, d’efflux cellulaire, d’efflux nucléaire de la doxorubicine et de la surexpression de MVP. Ces résultats suggèrent que ce sont les sécrétions adipocytaires qui sont directement responsables de l’effet chimioprotecteur des adipocytes et non des modifications épigénétiques des cellules tumorales induites par les adipocytes co-cultivés. Pour 141 déterminer la nature des sécrétions adipocytaires responsables de la chimiorésistance observée, nous avons séparé les facteurs solubles, les MV et les exosomes de l’AdMC, avant d’incuber les cellules tumorales avec ces différentes fractions. Nos résultats préliminaires suggèrent que seule la fraction contenant les exosomes et les facteurs solubles reproduit l’effet du milieu conditionné sur la surexpression de MVP et l’efflux nucléaire observé. Des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer le rôle des exosomes et des facteurs solubles dans la chimiorésistance médiée par les adipocytes (viabilité et efflux cellulaire par FACS). L'étude de l'exoprotéome adipocytaire par spectrométrie de masse a permis d'identifier la protéine MVP. En effet, par une approche de "spectral counting" et sur 5 expériences indépendantes, nous avons montré la présence extrêmement abondante de cette protéine dans les exosomes sécrétés par les adipocytes (Ikrame Lazar, résultats non publiés). Il serait donc intéressant de vérifier que MVP contenu dans les exosomes adipocytaire est bien transférée aux cellules tumorales. Pour cela, une approche SILAC (Stable isotope labeling by amino acid in cell culture), mise au point dans l’équipe pourrait être intéressante (Ikrame Lazar, résultats non publiés). Cette technique consiste à marquer les protéines adipocytaires à l’aide d’acides aminés contenant des isotopes lourds, puis à purifier les exosomes sécrétés par ces adipocytes. Les cellules tumorales, préalablement incubées avec de la doxorubicine, seraient ensuite traitées par ces vésicules modifiées et la présence de ces protéines « lourdes » pourra ainsi être analysée dans ces cellules par spectrométrie de masse. Le fait que les exosomes d’adipocytes seuls n’exercent pas d’effet sur l’efflux nucléaire de la doxorubicine suggère une action synergique de ces vésicules et des facteurs solubles dans l’effet observé. Pour le confirmer, différentes cinétiques d’incubation pourraient être réalisées : les cellules tumorales pourraient être d’abord cultivées avec les exosomes seuls, puis avec les facteurs solubles et inversement. Il sera intéressant de déterminer quel(s) facteur(s) soluble(s) active la MVP, présente dans les exosomes d’adipocytes. Certaines modifications post-traductionnelles ont été rapportées, telles que des phosphorylations et des acétylations (Lara et al 2011) (Kolli et al 2004) (Kim et al 2006). En particulier, sous l’influence de l’EGF, Src peut phosphoryler MVP sur une tyrosine, à l’origine de son activation (Kolli et al 2004) (Kim et al 2006). Il est fortement probable que de nombreuses modifications post-traductionnelles de MVP existent, mais ne sont pas encore élucidées. D’autre part, la protéine MVP exerce son effet via les particules voûtes, qui sont composées de différentes sous-unités. L’analyse protéomique des exosomes d’adipocytes suggère qu’hormis MVP, la sous-unité TEP-1 (mais pas VPARP) est également retrouvée (Ikrame Lazar, résultats non publiés). Il serait intéressant de déterminer si la sous-unité VPARP est présente dans les facteurs solubles. Ainsi, la combinaison exosomes et facteurs solubles permettrait d’apporter tous les composants de la particule voûte entière, responsable du transport nucléo-cytoplasmique de la doxorubicine. De plus, les autres sous-unités de la voûte peuvent également être soumises à des régulations post-traductionnelles, pouvant également jouer un rôle (Szaflarski et al 2013). La formation de la particule voûte requiert différentes sous-unités de nature différente. Ainsi, la localisation intra-cellulaire des différentes sousunités, ainsi que des régulations qui ne sont pas encore identifiées, doivent probablement jouer un rôle 142 important (van Zon et al 2002). Il serait intéressant d’étudier ces régulations dans notre système de coculture et de visualiser les différentes sous-unités dans la cellule, par microscopie confocale. Il existe peu d’études portant sur le rôle des exosomes dans la chimiorésistance. Cependant, un transfert, via les exosomes de protéines impliquées dans la chimiorésistance (P-gp, MRP1) a déjà été démontré dans différents modèles (Bebawy et al 2009) (Pokharel et al 2014) (Lu et al 2013). Le rôle des exosomes du stroma dans la chimiorésistance a récemment été montré. En effet, les résultats obtenus suggèrent que les exosomes provenant de cellules stromales (fibroblastes activés) peuvent conférer une chimio et une radiorésistance aux cellules tumorales mammaires (Boelens et al 2014). En conclusion, les résultats préliminaires que nous avons obtenus suggèrent un rôle important des exosomes sécrétés par les adipocytes. Une hypothèse originale serait le transfert de MVP par ces vésicules et qui agirait en synergie avec d’autres partenaires sécrétés par les adipocytes mais non associés aux VE. La chimiorésistance observée est amplifiée dans un contexte d’obésité L’obésité est maintenant reconnue comme étant un facteur de mauvais pronostic dans le cancer du sein, notamment en termes de chimiorésistance et de rechutes (Ewertz et al 2011). En utilisant un modèle de co-culture original en 3D comprenant cellules tumorales et adipocytes primaires isolés à partir du TA périgonadique de souris normopondérales ou obèses, nous avons mis en évidence que l’effet chimioprotecteur des adipocytes sur les cellules tumorales mammaires est amplifié dans un contexte d’obésité. Cet effet est dû à une amplification de l’efflux nucléaire de la doxorubicine, ce qui suggère que le mécanisme de chimiorésistance précédemment identifié est amplifié dans des conditions d’obésité. Des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer ce mécanisme, notamment l’étude de la surexpression et de l’invalidation de MVP dans les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes provenant de souris obèses. La purification des VE provenant de cellules tumorales co-cultivées avec des adipocytes primaires de souris normopondérales et obèses ainsi que leur quantification et la détermination de la quantité de doxorubicine encapsulée dans ces VE permettrait de comprendre leur rôle dans cet effet. Dans un second temps, l’implication des VE pourra être confirmée par des tests de chimiosensibilisation des cellules par l’inhibition de la sécrétion des VE en ciblant par exemple RAB27. Il serait également intéressant de déterminer la quantité de MVP dans les exosomes purifiés à partir d’adipocytes obèses, en les comparant à des adipocytes provenant de souris normopondérales et d’évaluer l’effet de la fraction contenant les exosomes et les facteurs solubles d’adipocytes (obèses ou non) sur l’efflux nucléaire de doxorubicine. D’autre part, l’étude de l’expression de MVP sur des coupes de tumeurs mammaires de patientes présentant des IMC différents, pourrait confirmer le mécanisme observé, in vivo. Cette étude est actuellement en cours de réalisation par Dr. Charlotte Ngo (chirurgienne dans le service de chirurgie 143 mammaire de l’hôpital Georges Pompidou, en collaboration avec le service d’Anatomo-pathologie de ce même hôpital, Paris). Dans notre système de co-culture, les adipocytes utilisés sont isolés à partir du TA viscéral de souris normopondérales ou obèses. Il serait intéressant de reproduire ces expériences en utilisant des adipocytes provenant du TA mammaire de patientes de poids normal et obèses. D’autre part, Crawford et Al. ont isolé des CAFs de tumeurs chimiosensibles et à l’inverse, de tumeurs résistantes aux antiVEGF. De manière intéressante, ils ont pu montrer qu’à la différence des fibroblastes normaux ou des CAFs provenant de tumeurs sensibles, les CAFs provenant de tumeurs résistantes pouvaient promouvoir la croissance in vivo de tumeurs sensibles, même en présence d’anti-VEGF (Crawford et al 2009). La purification d’adipocytes provenant de patientes obèses, ou non, qui ont présenté une chimiorésistance ou une chimiosensibilité à un traitement à base d’anthracyclines pourrait permettre d’étudier le rôle des adipocytes sur le long terme dans la protection à la chimiothérapie. Conclusion générale Les travaux effectués lors de mon doctorat ont permis d’identifier des nouvelles fonctions des adipocytes péri-tumoraux dans la progression tumorale mammaire. D’une part, sous l’action des sécrétions tumorales, les adipocytes se réorientent progressivement en cellules fibroblastiques, présentant des caractéristiques de CAFs, telles que des propriétés migratoires et invasives, la sécrétion de protéines de la MEC et l’expression de FSP-1. L’apparition de ce nouveau phénotype adipocytaire est liée à la réactivation de la voie Wnt/β-caténine, sous l’influence de la sécrétion tumorale de Wnt3a. De manière intéressante, les ADFs sont retrouvés dans les tumeurs humaines mammaires et favorisent, de manière importante, l’invasion des cellules tumorales. Ces résultats suggèrent que les adipocytes peuvent être une source de CAFs et participent ainsi à la réaction desmoplasique, fréquemment retrouvée dans les tumeurs humaines mammaires. D’autre part, nous avons mis en évidence que les adipocytes protègent les cellules tumorales mammaires de l’action de la chimiothérapie, en favorisant son expulsion hors du noyau puis hors de la cellule, par un mécanisme original, qui impliquerait la protéine MVP et des vésicules extra-cellulaires. De manière intéressante, l’induction de ce mécanisme de chimiorésistance semble provenir des exosomes adipocytaires, qui agiraient en synergie avec des facteurs solubles adipocytaires, actuellement non identifiés. Enfin, nous avons également montré que la chimiorésistance médiée par les adipocytes est amplifiée dans un contexte d’obésité. Ces travaux pourraient expliquer, au moins en partie, le mauvais pronostic des cancers du sein chez les patientes obèses et ouvrent donc, à plus long terme, des perspectives thérapeutiques intéressantes, destinées à interrompre le dialogue délétère entre adipocytes et cellules tumorales, en particulier chez les patientes obèses. 144 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 145 Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer (2012). Menarche, menopause, and breast cancer risk: individual participant meta-analysis, including 118 964 women with breast cancer from 117 epidemiological studies. The Lancet Oncology 13: 1141-1151. Allen M, Louise Jones J (2011). Jekyll and Hyde: the role of the microenvironment on the progression of cancer. The Journal of pathology 223: 162-176. Amemori S, Ootani A, Aoki S, Fujise T, Shimoda R, Kakimoto T et al (2007). Adipocytes and preadipocytes promote the proliferation of colon cancer cells in vitro. 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Tumor necrosis factor-alpha stimulates aromatase gene expression in human adipose stromal cells through use of an activating protein-1 binding site upstream of promoter 1.4. Mol Endocrinol 10: 1350-1357. 173 174 ANNEXE 175 Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Cancer Research Microenvironment and Immunology Cancer-Associated Adipose Tissue Promotes Breast Cancer Progression by Paracrine Oncostatin M and Jak/STAT3 Signaling Lore Lapeire1, An Hendrix2, Kathleen Lambein3, Mieke Van Bockstal3, Geert Braems4, Rudy Van Den Broecke4, Ridha Limame5, Pieter Mestdagh6, Jo Vandesompele6, Christian Vanhove7, Dawn Maynard8, de 9, Catherine Muller9, Philippe Valet10, Christian P. Gespach11, Marc Bracke2, Camille Lehue Veronique Cocquyt1, Hannelore Denys1, and Olivier De Wever2 Abstract Increasing evidence supports the critical roles played by adipose tissue in breast cancer progression. Yet, the mediators and mechanisms are poorly understood. Here, we show that breast cancer–associated adipose tissue from freshly isolated tumors promotes F-actin remodeling, cellular scattering, invasiveness, and spheroid reorganization of cultured breast cancer cells. A combination of techniques, including transcriptomics, proteomics, and kinomics enabled us to identify paracrine secretion of oncostatin M (OSM) by cancer-associated adipose tissue. Specifically, OSM, expressed by CD45þ leucocytes in the stromal vascular fraction, induced phosphorylation of STAT3 (pSTAT3-) Y705 and S727 in breast cancer cells and transcription of several STAT3-dependent genes, including S100 family members S100A7, S100A8, and S100A9. Autocrine activation of STAT3 in MCF-7 cells ectopically expressing OSMinduced cellular scattering and peritumoral neovascularization of orthotopic xenografts. Conversely, selective inhibition of OSM by neutralizing antibody and Jak family kinases by tofacitinib inhibited STAT3 signaling, peritumoral angiogenesis, and cellular scattering. Importantly, nuclear staining of pSTAT3-Y705 identified at the tumor invasion front in ductal breast carcinomas correlates with increased lymphovascular invasion. Our work reveals the potential of novel therapeutic strategies targeting the OSM and STAT3 axis in patients with breast cancer harboring nuclear pSTAT3-Y705. Cancer Res; 74(23); 6806–19. 2014 AACR. Introduction Cancer progression is the result of a complex interaction between the cancer cells and their microenvironment (1, 2). 1 Department of Medical Oncology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium. 2Laboratory of Experimental Cancer Research, Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium. 3Department of Pathology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium. 4Department of Gynaecology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium. 5Center for Oncological Research (CORE), University of Antwerp, Antwerp, Belgium. 6Center for Medical Genetics, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium. 7Institute Biomedical Technology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium. 8Medical Genetics Branch, National Human Genome Research Institute, Bethesda, Maryland. 9Institut de Toulouse, UPS, de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Universite et de la Recherche Toulouse, France. 10Institut National de la Sante dicale, INSERM U1048, Universite Paul Sabatier, Toulouse, France. Me 11 et de la Recherche Me dicale, INSERM U938, Institut National de la Sante Paris VI Pierre et Marie Curie, Molecular and Clinical Oncology, Universite Paris, France. Note: Supplementary data for this article are available at Cancer Research Online (http://cancerres.aacrjournals.org/). Corresponding Author: Olivier De Wever, Laboratory of Experimental Cancer Research, Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University Hospital, De Pintelaan 185, GHENT, Belgium B-9000 GENT, Belgium. Phone: 32-9-332-3073/3008; Fax: 32-9332-4991; E-mail: [email protected] doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 2014 American Association for Cancer Research. 6806 Breast tumors are surrounded by type I collagen-rich tissue, including fibroblasts, blood and lymph vessels, and adipose tissue. Insights in the function of adipose tissue have shifted from a static organ for energy storage to a dynamic one, excreting growth factors, cytokines, and hormones, identifying the adipose tissue as an active player in the communication between the tumor and its microenvironment (3). Human adipose tissue–derived adipocytes, stem cells, stromal cells, CD34þ progenitor cells, and macrophages stimulate growth, migration, and invasion of breast cancer cells by secretion of CCL5 (Rantes), IL6, IL8, and PAI-1 (4–7). A mouse mammary cancer model revealed tumor progression through secretion of adipocyte-derived type VI collagen (8). Dirat and colleagues (9) showed that mature adipocytes promote the invasiveness of estrogen receptor a (ERa)–positive and negative breast cancer cells. IL6-mediated induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) was identified as key component of adipocyte-enhanced invasiveness of breast cancer cells (9). Zhang and colleagues (10) reported stimulation of tumor growth and angiogenesis by recruitment of adipose stromal cells and endothelial cells in a breast cancer mouse model. All together, the interaction between breast cancer cells and associated adipose tissue is a multifactorial phenomenon driving breast cancer progression. STATs are important in cytokine receptor signaling. Several STATs contribute to normal mammary gland development Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Paracrine Oncostatin M Promotes Breast Cancer Progression and cellular response during pregnancy, lactation, and involution. However, recent studies revealed their seemingly contradictory participation in breast cancer progression (11). STAT3 is frequently activated in human breast cancer and correlates with poor prognosis (12). Materials and Methods Cell lines and transfections MCF-7, T47D, SKBR3, and MDA MB 231 cell lines were obtained from the ATCC (http://www.lgcstandards-atcc.org). Cells were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin (Invitrogen), and 2.5 mg/mL fungizone (Bristol-Meyers Squibb). All cell lines have been validated in-house by short tandem repeat profiling using the Cell ID System (Promega) according to the manufacturer's instructions. Upon receipt, cells were passaged and stored in liquid nitrogen. Every 6 months, a new aliquot of cells was resuscitated and used for experimentation. Every month cell cultures were tested for mycoplasma contamination by using the MycoAlert Plus Kit (Lonza). MCF-7 cells secreting turbo green fluorescent protein (tGFP)–oncostatin M (OSM) fusion protein (MCF-7–OSM) were generated by Fugene Transfection (Promega). tGFP–OSM cDNA was purchased at Origene, Inc. Antibodies and reagents Primary and secondary antibodies are described in Supplementary Materials and Methods. Recombinant human (rh) OSM, (rh)IL6, (rh)IL8, (rh)LIF, (rh)G-CSF and their respective neutralizing monoclonal antibodies were from R&D Systems. Tofacitinib citrate was purchased at Bio-Connect Diagnostics. A neutralizing (n)OSM antibody, Akt (GSK2142795) and MEK inhibitors (GSK1120212 or trametinib) were kindly provided by GlaxoSmithKline (13). Conditioned medium of cancer-associated adipose tissue, isolation of tumor-associated adipocytes, and stromal vascular fraction CAAT (cancer-associated adipose tissue) was obtained from patients with breast cancer undergoing a mastectomy at Ghent University Hospital (Ghent, Belgium) in accordance with the local ethics committee (Supplementary Table S1). Preparation of CMCAAT (conditioned medium of cancer-associated adipose tissue) and separation of adipose tissue in tumor-associated adipocytes (TAA) and stromal vascular fraction (SVF) and isolation of CD45þ and CD31þ fractions from SVF are described in Supplementary Materials and Methods. Supplementary Fig. S1 demonstrates the use of CMCAAT throughout the article. Functional assays Experimental set-up for studying morphologic changes induced by CAAT or CMCAAT is described in Supplementary Materials and Methods. Factor shape was calculated as (perimeter)2/(4 p area) for quantification. MCF-7, T47D, and MDA MB 231 type I collagen gel invasion assays are performed and quantified as described in Supplementary Materials and Methods and ref. 14. www.aacrjournals.org Matrigel invasion of MDA MB 231 and migration of MCF-7 and SKBR3 cells were performed using xCELLigence RTCA DP instrument (ACEA Biosciences; ref. 15). Protein analysis Samples for Western blot analysis were prepared, run, and immunostained as described in ref. 16. Human phospho-kinase antibody array (R&D Systems) was used to detect relative phosphorylation levels of 44 kinases. OSM concentrations in CMCAAT were measured with a human OSM ELISA Kit (Sigma-Aldrich). Scanning densitometry was carried out with the Quantity One Program (Bio-Rad). Microarray analysis Total RNA was isolated using the Nucleospin RNA II Kit (Macherey-Nagel), including DNAse I treatment. Quality control was performed using Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies). Total RNA (0.5 mg) was processed and analyzed on Human GE Agilent 4 44 K microarrays. Four biologic samples were studied. Data can be found on GEO (GEO accession number GSE58574). Quantitative real-time PCR RNA was isolated using the RNeasy Plus Universal Kit (Qiagen), including DNAse I treatment. cDNA synthesis and SYBR Green I RT-qPCR were carried out as described in ref. 17. Prime PCR assays for S100A7, S100A12, OSM, NTN4, LRG1, LIFR, and GP130 were purchased at Bio-Rad. Other primer sequences are described in Supplementary Table S2. The RNA quality index (RQI > 8) was assessed using Experion software (version 3.2; Bio-Rad). Mass spectrometry CMCAAT samples were run on NuPAGE 4% to 20% Bis-Tris gradient gels (Invitrogen) in denaturating SDS buffer, stained with 0.5% Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad) in 40% methanol and 10% acetic acid for 20 minutes, and destained. Gel bands were processed and analyzed by LS/MS-MS as described in Supplementary Materials and Methods and ref. 16. Animal studies Animal studies were approved by the Local Ethics Committee of Ghent University Hospital (ECD 09/32). Immunodeficient mice were orthotopically injected with 1 106 cancer cells. After 4 weeks, the mice were sacrificed and tumors were resected for IHC. Details can be found in Supplementary Materials and Methods. Patient samples and IHC Clinical data and paraffin-embedded primary breast carcinoma samples were collected at Ghent University Hospital (Supplementary Table S3). Written informed consent was obtained according to the recommendations of the local ethics committee. To evaluate nuclear pSTAT3-Y705, we considered an intensity score that was semiquantitative scaled as score 0, weak or absent nuclear staining; score 1, between 5% and 30% nuclear staining; score 2, more than 30% nuclear staining. Three observers quantified independently. Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. 6807 Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Lapeire et al. Figure 1. CAAT stimulates invasion. A, hematoxylin and eosin staining of MCF-7 spheroids cultured in CAAT or collagen and quantification by factor shape. CAAT CAAT B, phase-contrast images of MCF-7 cells treated with control medium or CM for 48 hours. Afterwards, CM was replaced by control medium CAAT for 48 hours (rescue). Images represent one of 25 experiments. C, confocal images of F-actin stained control- or CM -treated MCF-7 cells (left; scale bar, 15 mm) and quantification of seven representative cells for each condition by factor shape (right). Data, one of three experiments. D, phase-contrast images of MCF-7 cells on type I collagen gel; arrows, invasive extensions (left) and quantification (right). Data, one of four experiments. E, graph representing migration of MCF-7 cells and quantification by calculating the slope increment of three replicates for each condition. Graph, one of three experiments; CAAT , P ¼ 0.021. F, phase-contrast images of control- or CM -treated T47D cells. Images, one of five experiments. G, T47D cells on type I collagen gel; arrows, invasive extensions (left) and quantification (right). Data, one of three experiments. H, phase-contrast images of MDA MB 231 cells treated with CAAT control medium or CM for 48 hours. Images, one of four experiments. I, hematoxylin and eosin staining of MDA MB 231 Transwell collagen invasion assay. Double-head arrows, distance between front of infiltrating cells and bottom of collagen gel. Single-head arrow, single cells reaching bottom of collagen gel (top). Graph, Matrigel invasion of MDA MB 231 cells and quantification by calculating the slope increment of three replicates for each condition; , P ¼ 0.002 (bottom). Data, one of three experiments for each. Statistical analysis Statistical analyses were performed using IBM SPSS Statistics 21.0 software. Continuous data were analyzed with the Mann–Whitney test (mean SD) or the Student t test (difference of means and 95% confidence interval) in which 6808 Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 appropriate. Spearman correlation was used to assess correlations. Categorical data were analyzed with the Fisher exact test. All data are representative of at least three independent experiments. Statistical tests were two-sided, P values less than 0.05 were considered statistically significant. Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Paracrine Oncostatin M Promotes Breast Cancer Progression Figure 2. CAAT-secreted factors activate STAT3 signaling. A, phospho kinase array demonstrating the relative phosphorylation levels of 44 kinases CAAT on CM -treated MCF-7 cells (top, only the upper part of the test with 28 kinases is shown) and measurement of the fold change (bottom). B, Western blot CAAT analysis of pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 in CM -treated MCF-7 cells. Duration of treatment is indicated: 50 (5 minutes), 100 (10 minutes), CAAT 48 hours (2 days). Rescue, 48 hours treatment with CM , followed by 48 hours with control medium. Total STAT3 and tubulin were loading controls. C, pSTAT3-Y705 staining of paraffin-embedded MCF-7 pellets treated as indicated (scale bar, 50 mm). D, pie chart for the distribution of at least 5-fold up- or CAAT downregulated genes in CM -treated MCF-7 cells in comparison with control-treated MCF-7 cells according to their functional category (DAVID CAAT database). E, relative mRNA levels of indicated genes in MCF-7 cells treated for 48 hours with control medium or CM . F, Western blot analysis of S100 CAAT or after rescue. proteins in MCF-7 cells treated for 48 hours with control medium, CM Results The role of CAAT in morphologic reorganization and invasion of breast cancer cells CAAT was confronted with MCF-7 aggregates in type I collagen, the main structural component of the mammary gland. CAAT induced aggregate reorganization resulting in infiltration of CAAT by MCF-7, engulfing single adipocytes www.aacrjournals.org (Fig. 1A). In contrast, MCF-7 aggregates not confronted with CAAT maintained a round shape up to 14 days of culture. The mean factor shape of CAAT-confronted MCF-7 aggregates was 4-fold that of controls (control vs. CAAT; 1.290 0.095 vs. 4.017, 0.603; P ¼ 0.004; Fig. 1A). We next questioned whether CMCAAT could mimic the effects induced by direct coculture. Within 48 hours, 25 of 27 CMCAAT (93%) induced cellular extensions and Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. 6809 Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Lapeire et al. 6810 Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Paracrine Oncostatin M Promotes Breast Cancer Progression reduced cell–cell contacts in MCF-7 (Fig. 1B). Rescue experiments showed restoration of cobblestone-shaped morphology and tight cell–cell contacts. F-Actin staining of single cells revealed a rounded appearance for control cells and an elongated morphology with multiple protrusions upon CMCAAT treatment (Fig. 1C). The mean factor shape of CMCAAT-treated MCF-7 cells was 2.5-fold higher than in controls (control vs. CMCAAT; 1.221, 0.123 vs. 4.070, 1.652; P ¼ 0.002; Fig. 1C). EMT markers showed no major expression changes in control versus CMCAAT treatment (Supplementary Fig. S2). Confocal immunocytochemistry revealed a reorganized F-actin cytoskeleton and relocation of E-cadherin and b-catenin from the plasma membrane to the cytoplasm (Supplementary Fig. S2). CMCAAT stimulated invasion of MCF-7 into type I collagen after 24 hours (control vs. CMCAAT; 9.750%, 2.790% vs. 46.750%, 2.408%; P ¼ 0.001, Fig. 1D) and increased migration of MCF-7 with a 14-fold slope increment (P ¼ 0.021, Fig. 1E). Similar morphologic changes (Fig. 1F) and stimulation of type I collagen invasion were seen upon CMCAAT treatment of T47D (control vs. CMCAAT; 9.340%, 3.872% vs. 33.880%, 5.065%; P ¼ 0.008, Fig. 1G). Although induction of scattering is hard to assess in MDA MB 231 given their mesenchymal phenotype (Fig. 1H), CMCAAT increased type I collagen invasion of MDA MB 231 in a 14 days assay (Fig. 1I, top). In addition, CMCAAT stimulated Matrigel invasion of MDA MB 231 with a 4.5-fold slope increment (P ¼ 0.002, Fig. 1I, bottom). Paracrine activation of STAT3 by CAAT in breast cancer cells Phospho-kinase screening in CMCAAT-treated MCF-7 cells revealed higher phosphorylation levels of STAT3 (Y705), ERK, JNK, AKT, and CREB (Fig. 2A). Because pSTAT3-Y705 showed the highest relative increase, we explored CMCAAT-stimulated pSTAT3-Y705 and pSTAT3S727. Short-term exposure of MCF-7 to CMCAAT increased pSTAT3-Y705 whereas long-term CMCAAT exposure is necessary for pSTAT3-S727 (Fig. 2B). A rescue experiment decreased pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 (Fig. 2B). Increased pSTAT3-Y705 was confirmed in MCF-7 incubated with 9 of 9 CMCAAT. In agreement, confrontation of MCF-7 with CMCAAT revealed strong nuclear pSTAT3-Y705 compared with control (Fig. 2C). Because activated STAT3 is a transcriptional regulator, we performed transcriptomics of MCF-7 cells under control conditions or with CMCAAT prepared from 2 patients with breast cancer. Using expression value cutoff of 5-fold, 67 upregulated genes and 112 downregulated genes were identified and assigned to clusters involving migration, inflammatory response, secretion, and angiogenesis (Fig. 2D). A proportion of these genes was associated with increased STAT3 transcriptional targets such as the most upregulated genes S100A7 (70-fold), S100A8 (40-fold), and S100A9 (23-fold; ref. 18). Downregulated genes belonged to the connective tissue growth factor family (19) such as CTGF (40-fold), NOV (13fold), CYR61 (6-fold), SERPINA1 (20), SERPINA3, and IGFBP5. Differential expression of STAT3 transcriptional targets was validated through RT-qPCR (Con vs. CMCAAT, P ¼ 0.004 for all reported genes, except SERPINA1 P ¼ 0.002, Fig. 2E). Western blot analysis confirmed increased expression of S100A7, S100A8, and S100A9 in CMCAAT-treated MCF-7 cells (Fig. 2F). A rescue experiment showed restoration of S100A8 and S100A9 levels to basal conditions, whereas S100A7 levels were reduced by 32.5%. Expression and secretion of OSM by CAAT Using a biotin label–based assay, CMCAAT from 2 patients revealed the presence of six proteins with a reported capacity to activate STAT3 signaling: OSM, IL6, IL8, G-CSF, LIF, and leptin (Supplementary Fig. S3). Addition of rhOSM dose dependently increased Y705 and S727 pSTAT3 in MCF-7 cells. In contrast, only high concentrations of rhIL6 and rhG-CSF phosphorylated STAT3 Y705 but not STAT3 S727 (Fig. 3A), suggesting a reduced transcriptional activator capacity (as compared with rhOSM or CMCAAT). Moreover, only rhOSM upregulated S100A7 protein levels (Fig. 3A). rhIL6, rhIL8, and rhLIF had no effect on morphology and addition of their neutralizing antibodies to CMCAAT did not counter CMCAAT-induced morphologic changes (Supplementary Fig. S3). Only neutralizing (n)IL6 antibody partially inhibited CMCAAT-induced phosphorylation of STAT3 Y705 but had no effect on S727 phosphorylation (Supplementary Fig. S3). rhLeptin was not tested because it lacked the capacity to induce cellular scattering (21). Mass spectrometry of CMCAAT revealed 10 unique OSM peptides at the expected molecular weight of 25 to 30 kDa with 55% sequence coverage (Fig. 3B). Western Blot analysis identified OSM protein in CMCAAT from 3 patients. ELISA of CMCAAT from 16 patients revealed an OSM concentration between 3.7 and 15.7 pg/mL (Fig. 3C). There was no correlation between the OSM concentration in CMCAAT and body mass index (BMI) of these patients (P ¼ 0.948, Spearman Rho ¼ 0.115). To determine the source of OSM production, tumor-associated adipose tissue from 10 patients with breast cancer was separated into TAA and the SVF. RT-qPCR revealed a 20-fold Figure 3. CAAT-derived OSM phosphorylates Y705 and S727 STAT3, upregulates S100A7, and stimulates migration through OSMR. A, Western blot analysis of pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 in MCF-7 cells treated with rhOSM, IL6, IL8, and G-CSF (top). Western blot analysis of S100A7 in MCF-7 cells CAAT treated with rhOSM, IL6, or G-CSF (bottom). B, OSM peptides and peptide hits identified by CM mass spectrometry. C, Western blot analysis of OSM in CAAT CAAT CM of 3 patients (P26, P29, and P33). rhOSM (20 ng) served as positive control (top). Scatter plot, OSM concentration in CM from 16 patients measured by ELISA (bottom). D, scatter plot, relative OSM mRNA levels in TAA and SVF of CAAT from 10 patients with breast cancer (bottom). þ þ Western blot analysis of CD45 and OSM in total SVF and in isolated CD45 , CD31 and "Rest" fractions of SVF. E, pSTAT3-Y705 staining of breast cancer cells and CD163 staining of activated macrophages (scale bar, 300 mm for top and 50 mm for bottom). F, relative mRNA levels of OSMR expression in four breast cancer cell lines. G, phase-contrast images of four different breast cancer cells treated with control medium or rhOSM (1 ng/mL) for 48 hours. H, graphs, migration of MCF-7 and SKBR3 cells treated with control medium or rhOSM at indicated concentrations using xCELLigence migration assay and quantified by calculating the slope increment of five replicates of each condition; MCF-7: , P ¼ 0.071 and , P ¼ 0.001; SKBR3: , P ¼ 0.941 and , P ¼ 0.422. After the experiment, membranes of control and rhOSM 1 ng/mL were stained with crystal violet, indicating migrated cells. www.aacrjournals.org Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. 6811 Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Lapeire et al. increased expression of OSM mRNA in the SVF compared with adipocytes (P < 0.001). OSM mRNA levels in TAA and SVF were not correlated with the BMI of the patients (OSM in TAA, P ¼ 0.650, Spearman Rho ¼ 0.164; OSM in SVF, P ¼ 0.235, Spearman Rho ¼ 0.413). OSM protein was found in the CD45þ leucocyte fraction and not in the CD31þ endothelial fraction or "Rest" fraction containing CD34þ/CD31 adipocyte progenitor cells (Fig. 3D; ref. 22). Macrophages are CD45þ and an increased presence of tumor-associated macrophages (TAM) has been associated with poor prognosis in human breast cancer. CD163 staining revealed an accumulation of TAMs in the adipose tissue at sites of cancer cells with high nuclear pSTAT3-Y705 infiltrating the adipose tissue (Fig. 3E). OSM engages heterodimeric receptors involving gp130 and either the OSM receptor (OSMR) or the leukemia inhibitory factor receptor (LIFR). The gp130/OSMR complex is specifically activated by OSM and is implicated in morphologic changes (23). RT-qPCR revealed the relative expression of OSMR in MCF-7, T47D, and MDA MB 231 whereas SKBR3 show a 60.000-fold lower OSMR expression (Fig. 3F). rhOSM treatment of these cell lines induces morphologic changes in all except SKBR3 (Fig. 3G). Moreover, migration of MCF-7 and not SKBR3 is dose dependently stimulated by rhOSM with a 5-fold (100 pg/mL, P ¼ 0.071) and 9.9-fold (1 ng/mL, P ¼ 0.001) slope increment in MCF-7 compared with 1.4-fold (100 pg/mL, P ¼ 0.941) and 1.6-fold (1 ng/mL, P ¼ 0.422) slope increment in SKBR3 (Fig. 3H). rhOSM treatment of MCF-7 leads to an increase of OSMR (2.7-fold) and STAT3 (2.2-fold) expression (P ¼ 0.029 for both genes), suggesting positive feedback. The OSMR and STAT3 mRNA response is not observed in SKBR3. In both cell lines, LIFR and GP130 mRNA levels are not affected by rhOSM (Supplementary Fig. S4). Functional role of OSM and STAT3 signaling in CAATmediated morphologic changes To quantify CMCAAT potency on STAT3 phosphorylation, MCF-7 cells were treated with rhOSM. pSTAT3-Y705 was significant at 0.01 ng/mL rhOSM, with a STAT3 phosphorylation capacity of CMCAAT equivalent to 0.5 ng/mL rhOSM (Fig. 4A). rhOSM induced a gene signature (Con vs. rhOSM, P ¼ 0.029 for all reported genes except IGFBP5 with P ¼ 0.200, Fig. 4B) and morphologic changes (Fig. 3G) similar to CMCAAT treatment. Preincubation of rhOSM with nOSM antibody or addition of the pan-Jak inhibitor tofacitinib abolished STAT3 phosphorylation (Fig. 4C). Preincubation of CMCAAT with nOSM antibody reversed STAT3 activation (Fig. 4C, bottom left) and morphologic responses (Fig. 4D). Tofacitinib blocked CMCAAT-induced STAT3 activation and S100A7 expression (Fig. 4C), morphologic responses (Fig. 4D), and nuclear localization (Fig. 4E). The AKT pathway (inhibited by GSK2141795) but not the MEK/ERK pathway (inhibited by trametinib) is necessary for pSTAT3-S727 and transcriptional activity (Supplementary Fig. S5). We established MCF-7 cells that ectopically secreted OSM (MCF-7–OSM) to examine the impact of constitutive OSM secretion and signaling in breast cancer progression. MCF-7– OSM cells have a decreased proliferation rate, lost the ability to 6812 Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 form aggregates, and show an increased expression of OSMR compared with control MCF-7–GFP cells (Supplementary Fig. S6). OSM in the secretome coincided with constitutive pSTAT3-Y705 and increased expression of S100A7 (Fig. 5A). Tofacitinib reduced pSTAT3-Y705 and S100A7 expression (Fig. 5A). Histology revealed that MCF-7–GFP cells organized into clusters with a compact pattern separated by Matrigel, whereas MCF-7–OSM xenografts displayed disorganized strands and single cells (Fig. 5B). Quantification of cellular organization by calculating factor shape indicated a statistically significant deviation (GFP vs. OSM, 1.4 0.09 vs. 4 1.4, difference, 2.6; 95% CI, 1.24–3.95; P ¼ 0.0016). Pan-cytokeratin and vimentin showed no differential expression between MCF-7–GFP and MCF-7–OSM tumors. However, E-cadherin membrane expression and ERa expression was reduced in OSM-secreting tumors compared with control (Supplementary Fig. S2). Staining of pSTAT3-Y705 showed that 3.3% of MCF-7–GFP is positive compared with 69.8% of MCF-7–OSM cells (difference, 66.5%; 95% CI, 59%–73%; P < 0.0001; Fig. 5B). All MCF-7–GFP xenografts had poor peritumoral vascularization (6/6) whereas MCF-7–OSM tumors developed strong peritumoral vascularization (11/12) as evidenced by macroscopic evaluation (Fig. 5B) and contrast-enhanced microcomputed tomography (mCT; Fig. 5B). Microarray data revealed the, respectively, 11- and 7-fold upregulation of angiogenic factors NTN4 (24) and LRG1 (25) in CMCAAT -treated MCF-7 cells. rhOSM and ectopic expression of OSM mimicked CMCAAT-induced effects on NTN4 and LRG1 (CON vs. CMCAAT, P < 0.0001; CON vs. rhOSM and CON vs. OSM, P ¼ 0.004; Fig. 5C). Treatment with nOSM antibody alleviated OSM-induced peritumoral angiogenesis as demonstrated by reduced number of mice (1/6) showing peritumoral blood vessels and blocks OSM-induced pSTAT3-Y705 (Fig. 5B), with 21.1% of MCF-7– OSM cells showing a positive nuclear signal (difference compared with untreated, 47.9%; 95% CI, 38%–57%; P < 0.0001). Administration of tofacitinib prevented OSM-induced peritumoral angiogenesis in 4 of 6 mice and reduced pSTAT3-Y705 (Fig. 5B) with 20% of MCF-7–OSM cells showing nuclear STAT3 (difference compared with untreated, 49%; 95% CI, 42%–56%; P < 0.0001). Both the nOSM antibody and tofacitinib restored MCF-7 cluster organization (Fig. 5B). The mean factor shape of cell clusters from MCF-7–OSM tumors treated with nOSM antibody and tofacitinib was, respectively, 1.78 0.44 and 1.62 0.26, indicating compacted organization (difference nOSM antibody vs. untreated, 2.2; 95% CI, 0.8–3.63; P ¼ 0.0058; difference tofacitinib vs. untreated, 2.3; 95% CI, 1.00–3.75; P ¼ 0.0032). Nuclear expression of pstat3-y705 in invasive ductal breast cancer We studied the expression of nuclear pSTAT3-Y705 by IHC in 50 patients with ER-positive invasive ductal carcinoma with histologically confirmed adipose tissue infiltration. Nuclear pSTAT3-Y705 staining was present at sites of adipose tissue infiltration in 18% of the samples (9/50). Interestingly, pSTAT3Y705–positive samples showed a statistically significant Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Paracrine Oncostatin M Promotes Breast Cancer Progression CAAT Figure 4. Tofacitinib and nOSM antibody inhibit rhOSM- and CM -induced scattering and STAT3 activation. A, Western blot analysis of pSTAT3-Y705 and CAAT pSTAT3-S727 in MCF-7 cells treated with a range of rhOSM or CM from 3 patients (P36, P40, and P44). pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 by P36, P40, and P44 equals approximately 0.64, 0.86, and 0.90 ng/mL rhOSM, respectively. B, relative mRNA levels of indicated genes in MCF-7 cells treated for 48 hours with rhOSM (2 ng/mL). C, Western blot analysis of pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 in MCF-7 cells treated for 48 hours with rhOSM (5 ng/mL; CAAT top) or CM (bottom), combined with a range of an nOSM antibody (left) or tofacitinib (right). D, phase-contrast images of MCF-7 cells treated for 48 hours CAAT CAAT , or CM combined with nOSM antibody (from R&D Systems) or tofacitinib at the indicated concentrations. E, pSTAT3-Y705 with control medium, CM CAAT CAAT staining of paraffin-embedded MCF-7 cell pellet treated for 48 hours with CM or CM combined with tofacitinib (scale bar, 50 mm). www.aacrjournals.org Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. 6813 Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Lapeire et al. Figure 5. Treatment with nOSM antibody or tofacitinib inhibits OSM-induced effects in MCF-7 xenografts. A, left, validation of MCF-7 cells stably transfected with OSM cDNA (MCF-7–OSM) compared with transfection with GFP control plasmid (MCF-7–GFP). Western blot analysis of OSM, pSTAT3-Y705, and pSTAT3-S727, S100A7, S100A8, and S100A9 in cell lysates (LYS) and conditioned medium (CM) of MCF-7–GFP and MCF-7–OSM cells. Total STAT3 and tubulin serve as loading control. Right, Western blot analysis of pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 and S100A7 in MCF-7–OSM cells treated for 48 hours with control medium or 500 nmol/L tofacitinib. MCF-7–GFP serves as the control cell line. B, Swiss nu/nu mice injected with MCF-7–GFP or MCF-7–OSM cells in the right lower mammary fat pad and treated with neutralizing OSM antibody or tofacitinib. First row, macroscopic external view of tumors (indicated by arrows); second row, macroscopic internal view of tumors; third row, contrast-enhanced mCT images of the blood vessels surrounding the tumor (asterisk, the right hind leg bone; arrow, enhanced peritumoral angiogenesis); fourth and fifth rows, hematoxylin and eosin and pSTAT3-Y705 staining of CAAT resected tumors (scale bar, 50 mm). C, relative mRNA levels of NTN4 and LRG1 expression in MCF-7 cells treated with control medium, CM , or rhOSM (2 ng/mL) and in MCF-7–OSM cells. 6814 Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Paracrine Oncostatin M Promotes Breast Cancer Progression Figure 6. pSTAT3-Y705 in breast cancer cells at the invasion front is correlated with LVI in patients with breast cancer. A, pSTAT3-Y705 staining of breast cancer cells invading surrounding adipose tissue in patients with breast cancer [scale bar, 100 mm (top) and 25 mm (bottom)]. B, contingency table showing association of pSTAT3-Y705 scores with LVI for þ 50 patients with ER IDCA. association with lymphovascular invasion (LVI; P ¼ 0.0032, Fig. 6). LVI is a poor prognostic factor in patients with lymph node– negative IDCA (26). Discussion Adipose tissue is an endocrine organ producing effectors with local and systemic actions. Tumor infiltration into the adjacent fat is a risk factor for breast cancer progression (27). We investigated the impact of CAAT in breast cancer infiltration and progression. OSM is a CAAT-secreted factor activating STAT3 and inducing proinflammatory genes, cellular scattering, and peritumoral angiogenesis (Fig. 7). Although adipose tissue has been shown to secrete a number of cytokines potentially affecting breast cancer cells, our studies demonstrate that OSM is the most relevant factor stimulating cancer progression. First, in comparison with IL6, IL8, and G-CSF, OSM is the only inducer of cellular scattering and the most potent inducer of pSTAT3-Y705. Second, pSTAT3-S727, important for transcription, was only seen upon OSM stimulation. Third, only OSM stimulates S100A7 expression described as poor prognosis marker in breast cancer (28). Fourth, two distinct OSM-neutralizing antibodies (R&D Systems and GSK) abolish CMCAAT-induced morphologic changes www.aacrjournals.org and STAT3 activation. Fifth, besides STAT3, CMCAAT activates downstream intermediates of OSM such as AKT, JNK, ERK, and CREB (23, 29), and AKT activation is necessary for pSTAT3S727. Sixth, nIL6, nIL8, and nLIF antibodies do not affect CMCAAT-induced scattering. Seventh, nIL6 antibody partly inhibits CMCAAT-induced pSTAT3-Y705 but not pSTAT3S727. nIL8 and nLIF antibodies do not affect CMCAAT-induced pSTAT3-Y705. Finally, CMCAAT induces OSMR and STAT3 in a similar fashion as rhOSM. These findings are in agreement with Xiao and colleagues (30) showing a positive feedback loop for further amplification of OSM-induced signaling. OSM and CMCAAT increase expression of S100 proteins. A rescue experiment showed a relative higher S100A7 protein level compared with S100A8/9 after rescue procedure. All studied S100 proteins have an intracellular and secreted pool, are associated with the actin cytoskeleton, and contribute to increased scattering and migration. S100A8/9 proteins are uniquely reported as promigratory. However, S100A7 has a described pro- and antimigratory function. This effect might be concentration dependent. Higher levels of S100A7 may stimulate migration; slightly lower levels support the inhibition of lamellipodia formation and restore the nonmigratory state (31). OSM and CMCAAT shift E-cadherin membrane localization to the cytoplasm but have no impact on vimentin, Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. 6815 Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Lapeire et al. Figure 7. Schematic illustrating the role of CAAT-secreted OSM in the tumor microenvironment. Binding of OSM to its receptor (OSMR) on breast cancer cells (BCC) recruits gp130 to form a heterodimeractivating gp130-bound Jak. Activated Jaks lead to pSTAT3Y705 that form homodimers translocating into the nucleus to regulate transcription. OSM phosphorylates STAT3 S727 through Akt signaling, potentiating transcriptional regulation. OSMinduced Jak/STAT3 signaling stimulates invasion and peritumoral angiogenesis. fibronectin, or cytokeratin expression. Reduction of cell surface E-cadherin expression is a prerequisite for cellular scattering (32) and a marker of EMT. In contrast with Guo and colleagues and West and colleagues (33, 34), we do not observe a full EMT in our set-up. Although all studies used breast cancer cells, both West and colleagues and Guo and colleagues (33, 34) used higher OSM concentrations (100 ng/ mL) and longer treatments that stimulate fibronectin, snail, and vimentin expression. In accordance with West and colleagues, withdrawal of OSM restores the epithelial phenotype, indicating that OSM does not induce permanent phenotypic changes. Concentrations of OSM provided at the adipose invasion front, a 1.000- to 10.000-fold lower compared with West and colleagues and Guo and colleagues, were capable of activating STAT3 and increasing adipose tissue infiltration by reduced cell surface E-cadherin. Although OSM has been shown to inhibit cellular proliferation of MCF-7 and T47D (35, 36) and cell culture experiments with MCF-7 constitutively secreting OSM show a reduced growth compared with control transfected cells, our xenograft experiments revealed similar tumor sizes between control and OSM groups, most probably as a result of enhanced peritumoral angiogenesis. OSM may directly stimulate angiogenesis (37) and stimulate the secretion of VEGF by T47D cells (38). We discovered the stimulatory role of OSM on the expression of NTN4 and LRG1 genes encoding the proangiogenic factors netrin-4 and LRG1. OSM stimulates expression and secretion of S100 proteins, which promote angiogenesis by stimulating endothelial cell proliferation (31). Whether in the xenograft model, the 6816 Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 increased presence of blood vessels is caused directly by OSM or indirectly by OSM-induced netrin-4, LRG1, S100 proteins, or a combination of them, is not known. OSM mRNA is high in the SVF and immune-isolation of CD45þ leucocytes revealed the presence of OSM protein compared with the endothelial and preadipocyte/fibroblast fraction. A study using subcutaneous adipose tissue supports our findings showing that mature adipocytes are not the main source of OSM but derives from cells in SVF, including macrophages (39). CAAT is infiltrated by CD163þ macrophages and accumulate at sites of high pSTAT3-Y705 in cancer cells. CD163þ macrophages are defined as TAMs correlated with poor prognosis in breast cancer (40) potentially by contribution of proinflammatory cytokines stimulating invasion (9). Mature adipocytes express OSMR and OSM provided by infiltrated macrophages may contribute to dedifferentiation of mature adipocytes (41). The underlying mechanisms linking obesity to breast cancer risk and progression are not yet fully understood. Obesity is involved in STAT3 activation by at least two mechanisms. First, high plasma levels of leptin, correlated with obesity, are mainly implicated in breast tumorigenesis and growth (42). Second, obesity is associated with a chronic state of low-grade inflammation, attracting macrophages, and lymphocytes producing STAT3-activating cytokines (43, 44). Our data show no clear contribution of obesity mediated through CMCAAT. First, CMCAAT from 9 patients showed similar STAT3 activation, regardless of their BMI (5 normal, 3 overweight, and 1 obese). Second, CMCAAT from 25 patients with a BMI ranging from 19.1 to 41 (2 underweight, 10 normal, 9 overweight, and 4 obese) Cancer Research Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160 Paracrine Oncostatin M Promotes Breast Cancer Progression induced cellular scattering. Third, from the 9 IDCA samples with high pSTAT3-Y705 staining only one was an obese patient (6 normal, 2 overweight, and 1 obese). Fourth, OSM mRNA levels in SVF from 10 patients with breast cancer were not correlated with BMI. Fifth, we found no correlation between OSM concentration in CMCAAT from 16 patients and their respective BMI. Admittedly, the number of patient samples in our study is low. Therefore, further studies using large series of breast CAAT samples from age-matched patients, including more detailed fat deposit information and metabolic biomarkers, will yield more information whether OSM secretion by activated macrophages and pSTAT3-Y705 in infiltrating cancer cells is associated with obesity. Alternatively, recruitment of inflammatory cells is a consistent feature of the local tumor environment and an enabling characteristic of cancer progression (45). In agreement with Queen and colleagues (38), local production of chemokines by cancer cells may recruit inflammatory cells at the adipose tissue invasion front leading to increased secretion of OSM. Nuclear pSTAT3-Y705 at sites of adipose tissue infiltration revealed an association with LVI, a poor prognosis marker in breast cancer. Although all investigated CAAT and SVF samples expressed OSM, only one fifth of patients with ER-positive breast cancer showed pSTAT3-Y705 at invasion front. This apparent contradiction may be explained by differential expression of OSMR in breast cancer cells. Conflicting data exist about activated STAT3 as a marker for prognosis. One explanation is the use of tissue microarray cores representing the bulk of the tumor, not allowing to discriminate cancer cells at the invasion front (46, 47). We used whole-tissue slides allowing examination of cancer cell–CAAT interactions. Our data are endorsed by recent findings underlining the link between pSTAT3 at the invasion front and tumor progression (48). Second, primary breast tumors displaying tyrosine phosphorylation of STAT3 and STAT5 are more differentiated and display more favorable prognostic characteristics than those with selective STAT3 activation. Indeed, both STATs mediate opposing effects on several key target genes, with STAT5 exerting a dominant role (49). In accordance, we observed a 2.3-fold higher STAT3 tyrosine phosphorylation compared with STAT5 tyrosine phosphorylation by CMCAAT (data not shown). The OSM/STAT3 loop may have therapeutic potential in breast cancer. CMCAAT activates STAT3 through Jak family kinases as evidenced by tofacitinib. Tofacitinib has received FDA approval as treatment of rheumatoid arthritis. Here, STAT3 plays a critical role in survival and proliferation of synoviocytes, the main component of the pannus that invades bone (50). Tofacitinib has been suggested for patients with natural killer T-cell lymphoma harboring constitutive Jak mutations (51). OSM-neutralizing antibodies have been used in multiple xenograft models (52, 53). We used a monoclonal OSM-neutralizing antibody that efficiently blocks OSMinduced peritumoral angiogenesis. Further studies should indicate the potential impact of OSM and Jak targeting in breast cancer. This is the first report demonstrating a paracrine OSM/ STAT3 activation loop at the level of adipose tissue versus epithelial interactions in ER-positive breast cancer. Disclosure of Potential Conflicts of Interest No potential conflicts of interest were disclosed. Disclaimer The study sponsors have no role in the design of the study; the collection, analysis, and interpretation of the data; the writing of the article; or the decision to submit the article for publication. Authors' Contributions Conception and design: L. Lapeire, G. Braems, P. Valet, M. Bracke, V. Cocquyt, H. Denys, O. De Wever Development of methodology: L. Lapeire, K. Lambein, C. Lehuede, C. Muller, P. Valet, H. Denys, O. De Wever Acquisition of data (provided animals, acquired and managed patients, provided facilities, etc.): A. Hendrix, K. Lambein, R. Van Den Broecke, R. Limame, J. Vandesompele, C. Vanhove, D. Maynard, M. Bracke, H. Denys, O. De Wever Analysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics, computational analysis): A. Hendrix, K. Lambein, M. Van Bockstal, G. Braems, R. Limame, P. Mestdagh, C. Vanhove, C. Gespach, V. Cocquyt, H. Denys, O. De Wever Writing, review, and/or revision of the manuscript: L. Lapeire, A. Hendrix, K. Lambein, M. Van Bockstal, G. Braems, R. Van Den Broecke, R. Limame, J. Vandesompele, C. Vanhove, C. Lehuede, C. Muller, P. Valet, C. Gespach, M. Bracke, V. Cocquyt, H. Denys, O. De Wever Administrative, technical, or material support (i.e., reporting or organizing data, constructing databases): K. Lambein, G. Braems Study supervision: L. Lapeire, G. Braems, M. Bracke, V. Cocquyt, H. Denys, O. De Wever Acknowledgments The authors thank G. De Bruyne, M. De Meulemeester, S. Decloedt, K. Van Wesemael, E. Wauters, S. De Geyter, and S. Jeurissen for excellent technical assistance. M. Mareel is gratefully appreciated for critical revision of the article. Grant Support This research was supported by Fund for Scientific Spearheads of Ghent University Hospital and Research Council of Ghent University, the National Cancer Plan (KPC_29_012), a grant from the "Bijzonder Onderzoeksfonds" (BOF) of Ghent University (to H. Denys), a postdoctoral grant (to A. Hendrix), and a travel grant (L. Lapeire) from Fund for Scientific Research-Flanders. The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. Received January 18, 2014; revised August 29, 2014; accepted September 1, 2014; published OnlineFirst September 24, 2014. References 1. 2. Hanahan D, Coussens LM. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell 2012;21:309–22. De Wever O, Van Bockstal M, Mareel M, Hendrix A, Bracke M. 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