Sujet BM session 1_corrigé

• section :
• N° d'anonymat :
Année universitaire 2010-2011
L2 BIOLOGIE MOLECULAIRE ET GENETIQUE 1"
Examen écrit 1ère session
mardi 11 janvier 2011
PARTIE BIOLOGIE MOLECULAIRE (note sur 20; durée conseillée : 45 mn)
-
Lisez très attentivement le sujet.
Répondez uniquement dans les cases de cette feuille, prévues à cet effet.
Reportez un n° d'anonymat (de votre choix) visible sur la copie et sur la feuille-réponse.
Indiquez également votre section visiblement sur la copie et sur la feuille-réponse.
L’utilisation de documents, de calculatrice et de téléphone portable est interdite.
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Exercice 1
Un ADN linéaire de 1 000 paires de bases (48% GC) est dénaturé par la chaleur dans trois
conditions expérimentales différentes :
i) absence de formamide et 0,002 M NaCl
ii) absence de formamide et 0,01 M NaCl
iii) 10% formamide et 0,002 M NaCl
La dénaturation est suivie par une mesure de la densité optique à 260 nm. Les résultats
sont montrés dans la figure 1, mais une partie de la légende a été perdue.
Figure 1 : profils de dénaturation de l'ADN
dans les trois conditions expérimentales i, ii
ou iii; les courbes correspondent...
Question 1. Pour chaque condition expérimentale, donnez l’identité de la courbe
correspondante. Justifiez très brièvement votre réponse (aucun calcul n’est demandé)
Condition expérimentale
i
ii
iii
Courbe correspondante
B
C
A
La présence de formamide déstabilise les liaisons H donc favorise la dénaturation, Tm (iii) < Tm (i)
La présence d’ions Na+ entraîne la neutralisation des charges négatives des phosphates de l’ADN, stabilisation de l’ADN sous
forme double brin, défavorise la dénaturation, Tm (i) < Tm (ii)
Donc Tm (iii) < Tm (i) < Tm (ii)
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Ecrit 1ère session (11 janvier 2011)
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Exercice 2
Une souche mutante thermosensible d'Escherichia coli mutée dans le gène codant l’ADN
polymérase I a été isolée. La protéine mutante a été purifiée et ses diverses activités ont
été étudiées par deux approches complémentaires : biochimique et génétique.
I. Approche biochimique :
Dans cette étude, trois substrats différents ont été utilisés (Figure 2A, B et C).
Figure 2 : substrats utilisés pour les tests d’activité de l’ADN polymérase I mutée. Le
substrat A ne contient aucun atome radioactif. Les substrats B et C contiennent un atome
de phosphore radioactif à la position indiquée par la flèche.
Question 1. Rappelez brièvement quelles sont les différentes activités de l’ADN
polymérase I sauvage d'E coli.
Activité polymérasique 5’ → 3’
Activité exonucléasique 3’ → 5’
Activité exonucléasique 5’ → 3’
I.1. Analyse avec le substrat A
L'ADN polymérase I sauvage ou mutante est incubée avec le substrat A, dans un tampon
approprié, en présence des quatre dNTP. Le dATP est marqué radioactivement. Après une
incubation de 30 min. à 30°C ou 37°C, la quantité de radioactivité incorporée dans le
produit de la réaction est mesurée (tableau I, ci-dessous).
ADN polymérase utilisée
pas d'ADN polymérase
ADN polymérase I sauvage
ADN polymérase I mutante
30°C
25
27 000
26 000
37°C
28
28 000
29 000
Tableau I : quantité de radioactivité incorporée en coups par minute (cpm) après
incubation à 30°C ou 37°C.
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Question 2. Précisez quelle doit être la position du phosphate radioactif sur le dATP utilisé
lors de cette expérience ? Justifiez.
Phosphate radioactif en position α, c’est celui qui est incorporé lors de la polymérisation.
Elimination des phosphates β et γ sous forme d’un pyrophosphate.
Question 3. Pourquoi l’expérience est-elle réalisée à deux températures différentes ?
Le mutant est thermosensible (cf énoncé), ce qui signifie que la mutation n’aura aucune conséquence sur l’activité de l’ADN
polymérase I incubée à une température permissive. En revanche, altération de l’activité de l’enzyme lorsque la température
restrictive est atteinte.
Question 4. Quelle(s) activité(s) particulière(s) de l'ADN polymérase I est (sont)
mesurée(s) dans cette expérience avec le substrat A ? Quelle est votre interprétation du
résultat obtenu dans le tableau I ?
La quantité de radioactivité incorporée est le reflet de l’activité de polymérisation de l’ADN par l’enzyme ADN Pol I.
L’activité polymérasique de l’enzyme mutante est identique à celle de l’enzyme sauvage quelle que soit la température
d’incubation (30 ou 37°C).
L’ADN polymérase I mutante n’est pas mutée dans la partie du gène codant le domaine à activité polymérasique.
I.2. Analyse avec le substrat B
L'ADN polymérase I sauvage ou mutante est incubée avec le substrat B, dans un tampon
approprié, en présence ou en absence des 4 dNTP non radiomarqués. Après une incubation
de 30 min. à 30°C ou 37°C, la quantité de nucléotides libres radioactifs présents dans le
milieu réactionnel est mesurée (tableau II, ci-dessous).
ADN polymérase utilisée
pas d'ADN polymérase
ADN polymérase I sauvage
ADN polymérase I mutante
avec les
30°C
25
35
34
4 dNTP
37°C
28
30
31
sans
30°C
32
7 000
7 100
dNTP
37°C
29
6 500
400
Tableau II : quantité de nucléotides libres radioactifs dans le milieu réactionnel (cpm)
après incubation à 30°C ou 37°C
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Question 5. Quelle(s) activité(s) particulière(s) de l'ADN polymérase I est (sont)
mesurée(s) avec le substrat B ? Quelle est votre interprétation du résultat décrit dans le
tableau II ?
La quantité de nucléotides libres radioactifs présents dans le milieu réactionnel est le reflet de l’activité exonucléasique 3’→ 5’ de
l’ADN polymérase I.
En présence de dNTP, aucune activité de ce type n’est détectée.
En l’absence de dNTP, l’ADN polymérase I sauvage possède une activité exonucléasique 3’→ 5’ importante et identique quelle
que soit la température (cette activité conduit à une libération des nucléotides préalablement bien appariés). Cette activité est
également identique à celle de l’enzyme mutante incubée à la température permissive de 30°C. En revanche, forte diminution de
l’activité pour l’enzyme mutante incubée à 37°C.
Conclusion : le gène de l’ADN Pol I est muté dans une région qui code le domaine à activité exonucléasique 3’→ 5’ de l’enzyme.
Question 6. Comment expliquez-vous les résultats obtenus en présence de dNTP ? Quelle
est l’activité de l’ADN polymérase I dans ces conditions ?
En présence de dNTP, l’ADN pol I possède une activité polymérasique 5’ → 3’ associée à une activité exonucléasique de
relecture 3’ → 5’ qui n’intervient que lorsqu’un nucléotide incorporé est mal apparié.
Ainsi, aucune libération de nucléotides radioactifs n’est observée.
I.3. Analyse avec le substrat C
L'ADN polymérase I sauvage ou mutante est incubée avec le substrat C, dans un tampon
approprié, en présence des 4 dNTP non radiomarqués. Après une incubation de 30 min. à
30°C ou 37°C, la quantité de nucléotides libres présents dans le milieu réactionnel est
mesurée (tableau III ci-dessous).
ADN polymérase utilisée
pas d'ADN polymérase
ADN polymérase I sauvage
ADN polymérase I mutante
30°C
25
3 000
2 800
37°C
28
2 800
3 000
Tableau III : quantité de nucléotides libres radioactifs dans le milieu réactionnel (cpm)
après incubation à 30°C ou 37°C.
Question 7. Quelle(s) activité(s) particulière(s) de l'ADN polymérase I est (sont)
mesurée(s) dans cette expérience avec le substrat C ? Quelle est votre interprétation du
résultat décrit dans le tableau III ?
La quantité de nucléotides libres radioactifs présents dans le milieu réactionnel est le reflet de l’activité exonucléasique 5’→ 3’ de
l’ADN polymérase I.
Cette activité est identique pour l’enzyme mutante et l’enzyme sauvage quelle que soit la température d’incubation (30 ou 37°C).
L’ADN polymérase I mutante n’est pas mutée dans la partie du gène codant le domaine à activité exonucléasique 5’→ 3’.
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II. Approche génétique :
Le gène lacZ d'E. coli code la β-galactosidase. Lorsque ces bactéries sont cultivées en
présence de l’inducteur IPTG, la β-galactosidase est exprimée et transforme le substrat
chromogène X-gal en un produit coloré, permettant ainsi la formation de colonies
bactériennes de couleur bleue.
La souche E. coli sauvage et celle exprimant l'ADN polymérase mutante sont cultivées dans
les conditions décrites ci-dessus, puis étalées sur une boite de Pétri. Seul le nombre de
colonies blanches est évalué et les résultats sont présentés dans le tableau IV ci-dessous.
Souche d'E. coli
avec ADN pol I sauvage
avec ADN pol I mutante
30°C
1
0
37°C
0
95
Tableau IV: nombre de colonies blanches obtenues après incubation à 30°C ou 37°C.
Question 9. Interprétez les résultats obtenus. Quel phénotype mettons-nous en évidence?
La présence de colonies blanches indique que ces bactéries n’ont pas de β-galactosidase fonctionnelle. Ce qui est
vraisemblablement dû à la présence d’une ou plusieurs mutations au sein de la séquence génique codant cette enzyme.
Avec l’ADN pol I sauvage, 1 colonie blanche est détectée à 30°C. Ceci est dû à un événement mutationnel sporadique.
Avec l’ADN pol I mutante, 95 colonies blanches détectées à 37°C. Ce qui traduit une augmentation de la fréquence des
mutations au sein des gènes dont le gène de la β-galactosidase.
Le phénotype ainsi mis en évidence est un phénotype "hypermutateur".
Question 10. Ce résultat confirme-t-il le résultat obtenu lors de l'analyse biochimique de
ce mutant ? Pourquoi ? (deux lignes maximum)
Ce résultat est en accord avec le résultat obtenu lors de l’analyse biochimique.
En effet, l’ADN Pol I mutée dans le domaine à activité exonucléasique 3’ → 5’ (activité de relecture) sera moins fidèle,
entrainant l’apparition de nombreuses mutations dans les gènes au cours de la réplication.
Question 11. De manière générale, pourquoi rechercher des mutants thermosensibles lors
des cribles génétiques utilisés pour l’étude de la réplication ?
L’analyse des protéines de la réplication commence par l’analyse génétique de mutants.
Les mutations qui affectent les gènes codant ces protéines sont le plus souvent létales.
L’utilisation de mutants thermosensibles permet d’amplifier ces mutants en les cultivant à une température permissive. La
mutation ne devenant létale que lorsque les bactéries sont cultivées à une température restrictive.
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