T H È S

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Cancérologie
Présentée et soutenue par Ludivine BOCHET
Le 28 Octobre 2011
Titre : Rôle des adipocytes péri-tumoraux dans la progression tumorale mammaire
JURY
Pr Karine Clément, Professeur des Universités-Praticien Hospitalier
Dr Fatima Mechta-Grigoriou, Directeur de Recherche
Pr Bernard Ducommun, Professeur des Universités
Pr Catherine Muller, Professeur des Universités
Pr Philippe Valet, Professeur des Universités
Ecole doctorale : Ecole doctorale Biologie Santé Biotechnologies
Unité de recherche : IPBS CNRS UMR5089
Directeurs de Thèse : Pr Catherine Muller et Pr Philippe Valet
Rôle des adipocytes péri-tumoraux dans la progression tumorale mammaire
1
A Camille
Remerciements
Je souhaite tout d’abord remercier le Pr Karine clément et le Dr Fatima Mechta-Grigoriou d’avoir
accepté de juger ce travail, ainsi que le Pr Bernard Ducommun pour avoir présidé la soutenance de
thèse. Les discussions passionnantes que vous avez engendrées ont permis d’élargir la réflexion sur
de nouvelles voies de recherche, assurant ainsi la continuité du projet.
Mes prochains remerciements s’adressent à mes deux co-directeurs de thèse, le Pr Catherine Muller
et le Pr Philippe Valet, qui ont apporté une réelle transdisciplinarité à ce travail. Cathie, je vous
remercie sincèrement de m’avoir permis de me construire en tant que professionnelle scientifique.
Ces trois ans de thèse ont été jalonnés d’expériences enrichissantes qui ont incontestablement
ajouté de la valeur à ma formation, et assuré les fondements de ma carrière professionnelle. Merci
Philippe pour votre disponibilité et pour nos discussions passionnantes autour de « Je vais vous
dessiner un adipocyte ». Depuis le bas de la colline, nous avons tous l’impression d’avoir un angegardien qui veille sur nos manips et qui nous guide dans la bonne direction.
Les membres de l’équipe MIKA, qu’ils soient « anciens » ou « nouveaux » ont tous partagé ce
moment important de ma vie.
Marielle tout d’abord, qui est devenue, au fil du temps, une véritable amie. Merci de m’avoir aidée,
« formée » (oui, oui, c’est toi qui m’a montré comment découper les Whattman !), écoutée (des
heures et des heures), soutenue. Grâce à toi, ces 3 ans ont été surmontables !
Ma Cathy (Cathy Botanch !). Je ne te remercierai jamais assez. Tu es une véritable perle, dotée de
qualités énormes. Pour moi, tu as été aussi bien une maman, qu’une amie.
Thank you Yuanyuan, for your kindness and your good mood. Thanks to you, I discovered the Chinese
culture and I improved my English.
Merci à Camille, mon Pépinot. Ton soutien au cours de cette dernière année a été extrêmement
précieux pour moi. Je suis fière que tu reprennes le projet et te passe le flambeau avec sérénité. Bon
courage à toi pour la suite de ta thèse. Que la Force des adipocytes soit avec toi…
Merci à Steph pour tes conseils, ton soutien au quotidien, pour avoir été ma voisine de bureau
pendant un an. Merci également pour tes belles images et tes conseils en IF.
Merci à Victor, Laurence, Fred, pour les discussions professionnelles (ou non…) que nous avons pu
avoir. Je vous souhaite plein de bonheur pour la suite.
Merci aux « anciennes », Fanou (qui a tellement marqué ma thèse que j’ai recyclé ton surnom pour
mon toutou), Aline, Béa, Sandrine et Audrey pour m’avoir initiée aux techniques expérimentales et
pour avoir partagé avec moi la vie du labo.
Merci à « mes » stagiaires Adrien, Alice et Christophe qui ont d’une part fait avancer les projets, et
d’autre part m’ont permis de m’améliorer en tant que « formatrice ».
Merci aux « Cucus » qui ont toujours été là pour moi : Repié, Leyre, Guillaume, Isa. Vous avez été
d’un grand soutien. Merci pour cette complicité qui s’est tissée entre nous. Ma thèse n’aurait
définitivement pas été la même sans vous.
Merci à Sophie, Lara, Cécile & Romain number 1 (L. & F.), Cécile & Romain number 2 (G. & B.),
Camille F. pour tous ces bons moments passés ensemble.
Merci à Oriane pour ta joie de vivre, ta bonne humeur, ton sourire, ton amitié, ton chocolat. Merci de
m’avoir ouvert la voie, de m’avoir donné tous ces conseils qui m’ont aidée à en arriver là aujourd’hui.
Merci à Yvane pour ton aide logistique, ta disponibilité et ta gentillesse.
Merci à toutes les personnes qui ont travaillé sur ce projet : Ghislaine Escourrou pour les analyses
d’anapath, Bettina Couderc pour les cellules vertes et rouges, Sophie pour les « souris vertes », PO
pour son expertise en microscopie, Cédric Dray pour son point de vue toujours innovant, Romain
pour m’avoir appris la vision 3D des sphéroïdes, Annie Valette.
Merci aux enseignants avec qui j’ai pu interagir dans le cadre du monitorat : Christel, Raoul, Laetitia,
Anastassia.
Merci à Marc Pallardy et Saadia Kerdine qui m’ont guidée dans cette voie.
Merci à « mon » Camille et à ma famille.
Enfin, merci à toutes les personnes qui ont rendu ce passage à Toulouse inoubliable…
« Il faut toujours viser la lune car
même en cas d’échec,
on atterrit dans les étoiles… »
Oscar Wilde
Rôle des adipocytes péri-tumoraux dans la progression tumorale mammaire
De nombreux arguments suggèrent que la progression tumorale est non seulement dépendante des
cellules cancéreuses mais aussi des cellules normales qui entourent la tumeur. Ces cellules « saines »
sont appelées cellules du stroma tumoral ou encore cellules du microenvironnement tumoral. Parmi les
cellules du stroma tumoral, le rôle des adipocytes a été très peu étudié alors qu’ils représentent un des
types cellulaires les plus représentés du microenvironnement de certaines tumeurs comme le cancer du
sein. De plus, les adipocytes sécrètent de nombreux facteurs de croissance, cytokines et chimiokines –
regroupés sous le terme adipocytokines- susceptibles d’influencer profondément le comportement de
la tumeur.
L’objectif de mon projet a été de caractérisé le dialogue entre les adipocytes et les cellules tumorales
mammaires, et d’évaluer son effet sur la progression tumorale. Dans un premier temps, nous avons
montré que les adipocytes cocultivés avec les cellules tumorales mammaires pendant 3 jours
acquièrent un phénotype original (diminution des marqueurs adipocytaires, augmentation des
sécrétions proinflammatoires). Ces adipocytes modifiés, appelés CAA pour Cancer-Associated
Adipocyte, sont retrouvés au front invasif des tumeurs mammaires et participent à la progression
tumorale en favorisant l’acquisition d’un potentiel métastatique in vitro et in vivo. Nous avons ensuite
montré que les CAAs ont également un rôle dans la réponse des cellules tumorales aux radiations
ionisantes. En effet, après 3 jours de coculture avec les adipocytes, les cellules tumorales deviennent
radiorésistantes et sont protégées de la mort post-mitotique radio-induite. Enfin, nous nous sommes
intéressés au phénotype des adipocytes cocultivés pendant une période prolongée (5 à 8 jours) avec les
cellules tumorales. Dans ces conditions, les adipocytes perdent leur contenu lipidique ainsi que
l’expression des marqueurs adipocytaires. Ce processus s’accompagne de profonds changements
morphologiques conduisant à l’acquisition d’un phénotype fibroblastique « activé ». Nous avons donc
appelé cette population des fibroblastes dérivés des adipocytes (ADF pour « Adipocyte-Derived
Fibroblast »). Les ADFs sont capables de migrer, d’envahir une matrice et secrètent de nombreuses
molécules profibrotiques (fibronectine, collagène 1). Enfin, dans un modèle 3D de sphéroïdes cultivés
dans une matrice de collagène, les ADFs induisent une augmentation significative de l’invasion des
cellules tumorales. Ces résultats ont été confirmés in vivo ce qui suggère que les ADFs pourraient
contribuer à la réaction desmoplastique fréquemment observée dans le cancer du sein (cette réaction
est caractérisée par la prolifération localisée de fibroblastes au sein d’une matrice riche en fibres de
collagène et participe la progression tumorale).
En conclusion, nos résultats mettent en évidence un dialogue entre les cellules tumorales mammaires
et les adipocytes, à l’origine de profondes modifications du phénotype adipocytaire d’une part, et des
capacités invasives des cellules tumorales d’autre part. Ces travaux pourraient permettre d’expliquer le
mauvais pronostic des cancers du sein retrouvé chez des sujets obèses.
Role of peri-tumoral adipocytes in mammary tumor progression.
Since few years, tumor progression has been recognized as the product of an evolving crosstalk
between different cell types within the tumor and its surrounding supportive tissue or tumor. This
framework includes a specific type of ECM –the tumor matrix- as well as cellular components such as
fibroblasts, immune and inflammatory cells, and blood vessels. Among stromal cells, mature
adipocyte received relatively little attention accordingly to the view that it is merely an energy-storing
cell, relatively inert to its surrounding. Nevertheless, adipocyte is a highly endocrine cell and secretes
various cytokines including leptin, adiponectin, and growth factors (adipokines). These molecules are
potentially able to modulate tumor behavior through heterotypic signaling processes.
The goal of my (PhD) project was to investigate the crosstalk between adipocytes and breast cancer
cells, and to explore their role in tumor progression. So, as a first step, we have demonstrated that
adipocytes previously cocultivated with breast cancer cells in a 2D coculture system during 3 days,
exhibit an original phenotype, characterized, among others, by a decrease of adipocyte markers
expression and an increase of pro-inflammatory secretions. These cells are called CAA for CancerAssociated Adipocytes and are found at the invasive front of human breast tumors. Then, we have
shown that CAAs confer pro-invasive abilities and radioresistance to tumor cells. Finally, I have
investigated the phenotype of adipocytes that have been cocultivated with tumor cells during an
extended time (5 and 8 days) and revealed that, after this period, adipocytes are reoriented into
fibroblast-like cells, called ADFs for Adipocyte-Derived Fibroblasts, secreting pro-fibrotic proteins
and able to migrate and invade the surrounding tissue. Using a 3D spheroid model, tumor cells
cocultivated with ADFs show high invasive abilities in a collagen matrix. In vivo experiment disclosed
the presence of ADFs within breast tumors, suggesting that they could participate to the desmoplastic
reaction composed of several fibroblasts embedded in a rich extracellular matrix, commonly found in
breast cancer.
In conclusion, my results show, for the first time, that tumor cells establish a bi-directional crosstalk
with mature adipocytes. This work might provide an explanation for the poor prognosis observed
in localized breast cancer in obese women, since the nature of the desmoplastic reaction and
the secretion pattern of ADF might be profoundly altered in this physiopathogical condition.
Liste des abréviations
ADF
AMPc
AMPK
APC
ATGL
Adipocyte-Derived Fibroblast
Adénosine Monophosphate cyclique
AMP Activated Protein Kinase
Adenomatous Polyposis Coli
Adipocyte Triglyceride Lipase
CAA
CAF
C/EBP
CK1
CSF-1
CSM
CTGF
Cancer-Associated Adipocyte
Cancer-Associated Fibroblast
CAAT/Enhancer Binding Protein
Casein Kinase 1
Macrophage Colony-Stimulating Factor-1
Cellules Souches Mésenchymateuses
Connective Tissue Growth Factor
DFAT
DC
Dvl-1
Dedifferentiated Fat Cell
Dendritic Cell
Dishevelled-1
EGF
EndMT
EPO
ER
Epidermal Growth Factor
Transition Endothélio-Mésenchymateuse
Erythropoïétine
Récepteur aux estrogènes
FAK
FAP
FAS
FGF
FN
FSP-1
Focal Adhesion Kinase
Fibroblast Activated Protein
Fatty Acid Synthase
Fibroblast Growth Factor
Fibronectine
Fibroblast-Specific Protein-1
GSK-3β
Glycogene Synthase Kinase-3β
HGF
Hepatocyte Growth Factor
IFN
IGF-1
IL
IMC
Interféron
Insuline-like Growth Factor-1
Interleukine
Indice de masse corporelle
KLF
Kruppel-Like zinc finger transcription Factor
LEF/TCF
LHS
LRP
Lymphoid-Enhancer-binding Factor/T-Cell-specific transcription Factor
Lipase Hormono-Sensible
Low-density lipoprotein Receptor-related protein
MAGL
MAPK
MCP
MEC
MMP
MonoAcylGlycerol Lipase
Mitogen Activated Protein Kinase
Monocyte Chemotactic Protein
Matrice Extra-Cellulaire
Matrix MetalloProteinase
1
NG2
NK
Neuron-Glial Antigen-2
Natural Killer
PDGF
PI3K
PPAR
Platelet-Derived Growth Factor
PhosphoInositol-3-kinase
Peroxisome Proliferator Activated Receptor
RD
RI
Réaction Desmoplastique
Radiations ionisantes
S1P
SHBG
αSMA
SREBP
STAT
Sphingosine 1-Phosphate
Sex Hormone Binding Globulin
α-Smooth Muscle Actin
Sterol Regulatory Element Binding Protein
Signal Transducer and activators of transcription
TADC
TAM
TEM
TG
TGF
TNC
TNF
Tumor Associated Dendritic Cell
Tumor Associated Macrophage
Transition Epithélio-Mésenchymateuse
Triglycérides
Transforming Growth Factor
Tenascine-c
Tumor Necrosis Factor
UDTL
Unité Terminale Ducto-Lobulaire
VEGF
Vascular Endothelium Growth Factor
Wnt
Wingless-type MMTV integration site
ZAG
Zinc-α2-glycoprotein
2
Sommaire
INTRODUCTION
5
INTRODUCTION GENERALE
7
PARTIE I : LE MICROENVIRONNEMENT TUMORAL.
1.Rôle du microenvironnement dans la progression tumorale.
2.Composition du stroma tumoral.
2.1 Cellules du système immunitaire et molécules pro-inflammatoires
2.2 Angiogenèse
2.3 Les fibroblastes
2.4 La matrice extracellulaire (MEC)
3.La réaction desmoplastique (RD).
4.Particularités du microenvironnement tumoral mammaire.
4.1 Le développement normal de la glande mammaire
4.2 Des mécanismes communs entre le développement de la glande mammaire et le cancer du sein
8
8
10
12
17
20
28
31
32
32
33
PARTIE II : ADIPOCYTES ET CANCER.
1.Le tissu adipeux.
2.Les adipocytes.
2.1 La différenciation adipocytaire ou adipogenèse
2.2 Les adipocytes : des cellules plastiques capables de se dédifférencier
2.3 Rôle physiologique du tissu adipeux
3.Rôle des adipocytes dans la progression tumorale.
3.1 Adipocytes et cancer
3.2 Adipokines et cancer
3.3 Les adipocytes péri-tumoraux
3.4 Les précurseurs adipocytaires dans le microenvironnement tumoral
34
34
35
35
41
43
46
46
48
52
53
PARTIE III : OBESITE ET CANCER
1.Généralités.
2.Obésité et incidence du cancer.
2.1 Etudes épidémiologiques
2.2 Hypothèses
3.Relation entre obésité et pronostic du cancer du sein.
3.1 Etudes épidémiologiques
3.2 Hypothèses
55
55
56
56
57
60
60
61
RESULTATS
65
1.
Les adipocytes associés au cancer (CAAs) participent à la progression tumorale.
67
2.
Les CAAs participent à la radiorésistance des cellules tumorales mammaires.
69
3.
Un nouveau phénotype adipocytaire : les Fibroblastes dérivés des adipocytes ou ADFs.
73
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
75
BIBLIOGRAPHIE
89
3
4
INTRODUCTION
5
6
INTRODUCTION GENERALE
La progression tumorale a récemment été reconnue comme étant le produit d’une interaction
dynamique entre les cellules tumorales et leur microenvironnement (stroma). Parmi les cellules qui
constituent le stroma tumoral, les adipocytes sont probablement celles donc le rôle a été le moins
bien caractérisé malgré le fait que les adipocytes représentent un des types cellulaires prédominants
du microenvironnement du cancer du sein. De plus, outre sa fonction de stockage des graisses,
l’adipocyte est une cellule endocrine active qui sécrète une grande variété de molécules (appelées
adipokines), incluant des hormones, des facteurs de croissance, des chimiokines ou des molécules
pro-inflammatoires susceptibles de moduler la progression tumorale. L’identification d’un rôle des
adipocytes dans la progression tumorale est un point important en médecine humaine puisque
l’obésité a été reconnue comme un facteur pronostique négatif dans de nombreux cancers.
L’objectif de ma thèse a donc été de caractériser le dialogue qui s’établit entre les adipocytes
et les cellules cancéreuses, et d’évaluer ses effets sur la progression tumorale mammaire.
Avant de présenter mes résultats, je ferai le point sur l’état des connaissances actuelles au sujet
d’une part, du microenvironnement et de son rôle dans la progression tumorale, d’autre part, des
adipocytes au sein du tissu adipeux dans un contexte normal puis tumoral, et je terminerai cette
introduction en faisant le lien entre obésité et cancer.
Les résultats obtenus au cours de ma thèse se découpent également en trois parties. Dans la
première partie, nous avons pu montrer que le dialogue entre les adipocytes et les cellules du cancer
du sein est à l’origine d’une augmentation des capacités invasives des cellules tumorales et de la
modification des adipocytes qui acquièrent un nouveau phénotype appelé Cancer-Associated
Adipocyte (CAA) (Article 1). Dans une deuxième partie, j’ai montré que les CAAs participent à la
réponse à la thérapeutique car ils induisent une augmentation de la radiorésistance des cellules
tumorales (Article 2). Enfin, dans la dernière partie, j’ai mis en évidence qu’un dialogue paracrine
prolongé entre les adipocytes et les cellules tumorales induit une réorientation des CAAs en cellules
de type fibroblastique. Nous avons appelé ces cellules ADFs pour Adipocyte-Derived Fibroblast et
montré qu’elles participent clairement à la progression tumorale (Article 3).
7
PARTIE I : LE MICROENVIRONNEMENT TUMORAL.
1. Rôle du microenvironnement dans la progression tumorale.
Une tumeur se développe au sein d’un microenvironnement appelé aussi stroma tumoral, composé
de nombreux types cellulaires non tumoraux évoluant au sein d’une matrice extracellulaire (MEC).
Tous ces composants interagissent avec la tumeur et participent à la génération du tissu tumoral
(Fig. 1).
C’est Stephen Paget en 1889 qui pose les fondations de la recherche sur le microenvironnement
tumoral en formulant la théorie du « seed and soil » (« de la graine et du sol »), née de l’observation
selon laquelle chaque type de cancer possède son (ou ses) site(s) métastatique(s) privilégié(s). Il
doit donc y avoir une adéquation entre la cellule cancéreuse (seed) et l’environnement tissulaire
(soil) pour engendrer une métastase (Paget, 1989). Ce concept est resté dormant pendant de
nombreuses années, à une époque où la génétique des tumeurs intéressait la majorité des recherches
en oncologie. En effet, les altérations des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeurs, étaient à
l’époque considérées comme nécessaires et suffisantes pour initier la tumorigenèse et induire la
progression de la tumeur. Mais au début des années 1970, la contribution du microenvironnement à
la progression tumorale commence à être reconnue par un nombre croissant de chercheurs. A
l’origine de ce mouvement, deux équipes « revisitent » les idées de S.Paget. La première, dirigée
par Isaac P.Witz, remarque que les tumeurs humaines sont généralement infiltrées par des cellules
inflammatoires (lymphocytes T et B, cellules NK, macrophages), indiquant que l’hôte n’est pas
indifférent à la tumeur et qu’il tente d’interférer avec son développement (Witz, 2009). La
deuxième, dirigée par Judah Folkman, concerne l’angiogenèse tumorale. Cette équipe réalise
rapidement que la prolifération tumorale est dépendante de l’apport sanguin et que les interactions
entre les cellules tumorales et les cellules endothéliales initient et encadrent ce processus (Folkman,
2006). L’équipe de Mina Bissell intervient très tôt dans ce courant de pensée, et fait le parallèle
entre l’importance cruciale du microenvironnement au cours du développement mammaire et son
rôle dans la progression tumorale mammaire. D’après cette équipe, « la vision actuelle selon
laquelle les lésions génétiques multiples seraient à la fois l’impulsion et le talon d’Achille de la
tumeur est insuffisante pour comprendre le développement tumoral » (Park et al., 2000).
8
Figure 1. Les modifications du microenvironnement favorisent l’invasion tumorale. La formation d’un
stroma « activé » (fibroblastes, composants inflammatoires) et le remodelage de la matrice extra-cellulaire
contribuent à la libération de facteurs pro-angiogéniques et à l’invasion tumorale (Allen and Louise Jones,
2011).
9
La maîtrise de nouvelles technologies a ensuite pu renforcer l’importance du rôle du
microenvironnement tumoral. En effet, une grande partie des gènes anormalement exprimés dans
les tumeurs codent pour des protéines secrétées et des récepteurs, impliquant des altérations de la
signalisation paracrine et autocrine au cours de l’évolution de la tumeur. Ainsi, de nombreuses
études réalisées sur des cellules en culture ou sur des modèles de xénogreffes ont démontré que les
interactions paracrines entre les cellules tumorales et les cellules stromales participent à la
tumorigenèse, la prolifération, l’invasion et le potentiel métastatique des tumeurs (Polyak et al.,
2009). L’interaction entre les composants du microenvironnement et les cellules tumorales est donc
bidirectionnelle. En effet, les cellules stromales régulent l’expression génique des cellules tumorales
pour moduler leur progression, et ces dernières agissent sur les cellules stromales pour modifier leur
phénotype (Witz, 2008).
Le cancer est donc devenu une maladie impliquant des interactions multicellulaires hétérotypiques
au sein du tissu cancéreux et de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-tumorales visant le
microenvironnement tumoral ont été développées comme par exemple l’inhibition du recrutement
des macrophages pro-tumoraux, la diminution de l’inflammation, l’inhibition de l’aromatase des
fibroblastes et des adipocytes du microenvironnement dans le cancer du sein positif pour le
récepteur aux estrogènes, la diminution de la résorption osseuse avec les biphosphonates afin de
diminuer les métastases osseuses, la diminution de l’angiogenèse, … (Kenny et al., 2007).
2. Composition du stroma tumoral.
En 1986, Harold Dvorak remarque que le processus de cicatrisation et la formation du stroma
tumoral présentent de nombreuses similitudes. Ces deux événements mettent en jeu des processus
tels que la prolifération cellulaire, la survie, la migration, qui sont contrôlés par des facteurs de
croissance, des cytokines, des signaux inflammatoires et angiogéniques. Ces signaux dérivent de
multiples sources cellulaires et extra-cellulaires présentes dans le microenvironnement. Mais alors
que la cicatrisation est auto-limitée dans le temps et dans l’espace, les tumeurs activent leur stroma
de façon permanente. D’après H. Dvorak, « les tumeurs sont des plaies qui ne cicatrisent jamais »
(Fig. 2). Ainsi, en plus des cellules inflammatoires, le stroma tumoral contient des vaisseaux
sanguins, du tissu conjonctif, des adipocytes (auxquels nous consacrerons le deuxième chapitre de
cette introduction), une MEC caractéristique et de nombreuses cellules fibroblastiques.
10
Figure 2. La cicatrisation comparée à la croissance tumorale. (a). Les tissus normaux ont une architecture
stricte et très organisée. Les cellules épithéliales sont séparées du compartiment vasculaire par la membrane
basale. Lors d’une blessure, les plaquettes sont activées et libèrent des médiateurs vaso-actifs régulant la
perméabilité vasculaire. Des facteurs chimiotactiques comme le TGFβ et le PDGF induisent l’activation des
fibroblastes et des enzymes protéolytiques nécessaires au remodelage de la matrice extracellulaire. Les
cellules épithéliales et les cellules stromales sont impliquées dans un dialogue bidirectionnel destiné à
faciliter la cicatrisation. (b). Les carcinomes invasifs sont moins organisés. L’angiogenèse et la
lymphangiogenèse associées à la tumeur produisent une organisation vasculaire chaotique. Les cellules
tumorales produisent de nombreuses cytokines et chimiokines qui sont mitogéniques et chémo-attractantes
pour les granulocytes, les monocytes/macrophages, les fibroblastes et les cellules endothéliales. De plus, les
fibroblastes activés et les cellules inflammatoires secrètent des enzymes protéolytiques, des cytokines et des
chimiokines favorisant la progression tumorale (Coussens and Werb, 2002).
11
2.1 Cellules du système immunitaire et molécules pro-inflammatoires
Les cellules inflammatoires ainsi que les molécules pro-inflammatoires comme les cytokines et les
chimiokines, dont la fonction physiologique est de protéger l’organisme contre les agents
infectieux, sont impliquées dans l’initiation de certains types de cancers (cancer liés à
l’inflammation) et dans la progression tumorale de tous les cancers.
C’est en 1863 que Rudolph Virchow détecte la présence de leucocytes au sein de tumeurs et établit
une connexion entre inflammation et cancer (Balkwill and Mantovani, 2001). Depuis, de nombreux
arguments sont venus renforcer cette connexion. Le premier est qu’il existe un lien entre des
situations inflammatoires chroniques (Papillomavirus, Helicobacter Pylori, Œsophage de Barrett,
Hépatite chronique active, Maladie de Crohn) et le développement de cancers (respectivement :
Cancer du col de l’utérus, de l’estomac, de l’œsophage, du foie et du colon) (Balkwill and
Mantovani, 2001). En fait, l’infiltration permanente des tumeurs par des leucocytes et autres
cellules phagocytaires induirait des dommages de l’ADN des cellules prolifératives, à travers la
génération d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui sont normalement produites pour
combattre l’infection. Ainsi, la répétition du cycle dommage tissulaire/régénération entraînerait des
altérations génomiques permanentes à l’origine des tumeurs (Coussens and Werb, 2002). Le
deuxième argument concerne l’importance de la composante inflammatoire dans le développement
tumoral, dans des cancers non reliés à un état inflammatoire pré-existant. En effet, les cellules
tumorales secrètent de nombreuses cytokines et chimiokines destinées à attirer les cellules du
système immunitaire qui vont chacune participer au développement tumoral.
Parmi les cellules inflammatoires du stroma tumoral, le rôle et l’importance des macrophages ont
été le sujet de nombreux travaux. En effet, ils peuvent représenter jusqu’à 50% de la masse
tumorale et ont un rôle crucial dans le comportement de la tumeur (Solinas et al., 2009). De façon
générale, ces cellules sont recrutées à partir des monocytes du sang circulant grâce aux chimiokines
MCP (Monocyte Chemotactic Protein). Au niveau du tissu, les monocytes se différencient en deux
populations de macrophages: les macrophages de type M1 (activés de façon classique) ou de type
M2 (activés de façon alternative). Les molécules induisant un phénotype M1 sont surtout
l’interféron γ (IFNγ) et les composants bactériens tels que le lipopolysaccharide. Ces macrophages
ont essentiellement un rôle dans la défense contre les bactéries, la suppression tumorale et la
stimulation de l’immunité. A l’inverse, les macrophages s’orientent vers un type M2 en réponse aux
cytokines telles que les Interleukines (IL)-4, IL-13, IL-10, et ont un rôle dans l’angiogenèse, la
réparation tissulaire, la promotion tumorale et la diminution de l’immunité adaptative (Solinas et al.,
2009) (Solinas et al., 2010) (Fig. 3).
12
Figure 3. Polarisation des macrophages. Les macrophages forment une population hétérogène, qui est
habituellement divisée en deux classes: M1 et M2 (Solinas et al., 2009).
13
Dans un contexte tumoral, les monocytes sont recrutés au niveau de la tumeur essentiellement grâce
à la protéine MCP1 (aussi appelée CCL-2). A ce niveau, ils sont soumis à nombreux signaux
capables de façonner les nouvelles cellules en fonction des besoins de la tumeur. Les monocytes se
différencient alors de façon très majoritaire en macrophages de type M2, appelés des TAMs pour
Tumor-Associated Macrophage (Macrophage associé aux tumeurs). Cette polarisation résulte
principalement de l’absence de signaux orientant vers un phénotype M1 (IFNγ, composants
bactériens). Les TAMs favorisent alors la progression tumorale en secrétant de nombreux facteurs :
des molécules pro-angiogéniques et pro-lymphangiogéniques [VEGF (Vascular Endothelium
Growth Factor), PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), TGFβ (Transforming Growth Factor),
MMP (Matrix MetalloProteinase)-2, MMP-7, MMP-9, MMP-12, CCL-5, CCL-2, CXCL-1, CXCL8, CXCL-12, CXCL-13], des molécules favorisant l’invasion des cellules tumorales et la formation
de métastases (IL-1β, TNFα (Tumor necrosis factor), MMPs et protéines de la MEC) (Solinas et al.,
2009) (Solinas et al., 2010). De plus, les TAMs sont capables de supprimer la réponse immunitaire
adaptative à travers des mécanismes induisant une inhibition de la présentation des antigènes
tumoraux ainsi qu’une inhibition de la prolifération des cellules T (Sécrétion de nombreuses
cytokines immunosuppressives, l’IL-10 ayant été la plus étudiée) (Kryczek et al., 2006).
L’importance des macrophages au cours de la progression tumorale mammaire a été démontrée
dans de nombreux travaux (De Palma et al., 2007) (Mantovani and Sica, 2010) (Pollard, 2009). In
vivo, une étude a consisté à croiser des souris transgéniques exprimant l’oncogène PyMT sous le
contrôle du promoteur MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus), qui sont susceptibles de
développer des cancers mammaires, avec des souris contenant une mutation homozygote dans le
gène CSF-1 (Macrophage Colony-Stimulating Factor-1, permettant la différenciation en
macrophage). Les résultats ont montré que l’absence de CSF-1 n’a pas de conséquence apparente
sur le développement précoce du cancer, alors que le développement vers des stades tardifs de
carcinome invasif ainsi que la formation des métastases pulmonaires sont largement atténués. Ceci
est dû à la diminution du taux de macrophages infiltrant le tissu tumoral en l’absence de CSF-1 (Lin
et al., 2001). De plus, chez l’homme, une étude a mis en évidence des signatures moléculaires
associées à un mauvais pronostic du cancer du sein incluant les gènes caractéristiques des
macrophages, comme CD68 (Paik et al., 2004).
Dans les tissus, les monocytes se différencient donc en macrophages, mais ils peuvent aussi devenir
des cellules dendritiques (DC), en fonction de la localisation du monocyte dans la tumeur. En effet,
dans les tumeurs, un gradient d’IL-10 favorise la différenciation vers les macrophages au détriment
des DCs. Ainsi, dans le cancer du sein, les TAMs sont retrouvés dans les tumeurs, alors que les
TADCs (Tumor-Associated Dendritic Cell) sont majoritairement localisées en périphérie (Solinas et
al., 2009). Le plus souvent, elles ont un phénotype immature et sont dépourvues de capacité de
14
stimulation des lymphocytes T. Les TADCs participent donc à induire une réponse effective
inefficace aux antigènes tumoraux (Balkwill and Mantovani, 2001). D’autres paramètres
interviennent dans ce défaut de réponse immunitaire comme le fait que les antigènes tumoraux sont
faiblement immunogènes, les cellules tumorales dérivant de cellules « du soi » (Ghiringhelli et al.,
2007). De plus, la majorité des lymphocytes T de la tumeur (appelés TIL pour Tumor-infiltrating
lymphocyte) sont des lymphocytes T régulateurs (Treg), qui contrôlent la tolérance immunitaire en
inhibant (i) l’action des cellules Natural Killer (NK) (qui sont très souvent absentes du tissu
tumoral), (ii) la prolifération des autres lymphocytes effecteurs (lymphocytes T CD8+ cytotoxiques)
à travers soit des mécanismes contact-dépendants soit de la sécrétion d’IL-10 et de TGFβ
(Whiteside, 2008) (Ghiringhelli et al., 2006). Le TGFβ peut également être produit par la tumeur
elle-même et par les DCs, et induire la prolifération des lymphocytes Treg, participant ainsi à une
boucle d’auto-amplification.
En plus des cellules citées précédemment, de nombreuses études ont mis en évidence une
contribution des neutrophiles, des mastocytes et des éosinophiles à la progression de la tumeur, en
relarguant des protéases extracellulaires, des facteurs pro-angiogéniques et des chimiokines (Di
Carlo et al., 2001) (Coussens et al., 1999) (Coussens and Werb, 2002). Ainsi, du fait de cet infiltrat,
le microenvironnement tumoral est riche en cytokines pro-inflammatoires (TNFα, IL-1, IL-6), en
facteurs de croissance et en chimiokines. Individuellement, toutes ces molécules sont des
médiateurs majeurs de l’inflammation. Ensemble, elles créent un microenvironnement favorisant la
prolifération cellulaire, l’instabilité génomique, l’angiogenèse et la progression tumorale (Tlsty and
Coussens, 2006). De plus, les chimiokines secrétées attirent d’autres cellules inflammatoires dans le
tissu tumoral, amplifiant le processus. Elles agissent alors de façon paracrine en se fixant à leurs
récepteurs présents à la surface des cellules tumorales pour induire leur prolifération (CXCL-1,
CXCL-2, CXCL-3, CXCL-8, CCL-20) (Coussens and Werb, 2002). Ces molécules régulent
également l’angiogenèse et ont un rôle dans la formation des métastases. En effet, de nombreuses
études ont montré une migration et une invasion des cellules cancéreuses gouvernées en partie par
des interactions spécifiques entre CXCR-4 exprimé à la surface des cellules tumorales et son ligand
CXCL-12 secrété dans les sites métastatiques (Muller et al., 2001) (Righi et al., 2011) (Liekens et
al., 2010).
Parmi les cytokines pro-inflammatoires présentes dans le microenvironnement tumoral, le TNFα,
l’IL-6 et l’IL-1β nous ont particulièrement intéressés au cours de la partie expérimentale de notre
travail.
Le TNFα. En plus d’agir comme un médiateur majeur de l’inflammation, le TNFα a des effets
pleïotropes sur de nombreux types cellulaires en activant ses deux récepteurs membranaires TNF15
R1 et TNF-R2. Le rôle du TNFα dans la progression tumorale est complexe et apparemment
paradoxal. A l’origine, le TNFα a été identifié grâce à sa capacité à induire la nécrose des tumeurs
transplantées chez la souris (Carswell et al., 1975) (Old, 1985). Des études cliniques ont ensuite
montré que l’administration locale et importante de TNFα, en association à la chimiothérapie,
induisait des dommages sélectifs et la destruction des vaisseaux sanguins intra-tumoraux à l’origine
de la rémission de la tumeur (Lejeune et al., 1998).
Cependant, de nombreuses expériences in vitro ont mis en évidence une activité mitogénique et proproliférative du TNFα sur des cellules tumorales (Kaiser and Polk, 1997) (Iocca and Isom, 2003)
(Okamoto and Oyasu, 1997) (Montesano et al., 2005). De plus, des souris déficientes pour cette
protéine ou traitées avec un anticorps anti-TNFα deviennent résistantes à la carcinogenèse dans un
modèle de cancer cutané chez la souris (Orosz et al., 1993) (Moore et al., 1999). Enfin, le TNFα
stimule l’angiogenèse dans un modèle de souris transgénique exprimant des faibles taux de cette
protéine de façon chronique (Keffer et al., 1991).
Afin de tenter d’expliquer ces effets contradictoires, il a été proposé que des fortes doses locales de
TNFα induisent la régression tumorale alors que la sécrétion endogène continue dans le
microenvironnement tumoral favorise le développement de la tumeur et la formation des métastases
(Balkwill and Joffroy, 2010).
L’IL-6. C’est une cytokine possédant également des effets pleïotropes et régulant les réponses
immunitaires et inflammatoires. La concentration circulante de cette protéine semble être souvent
dérégulée et une augmentation des taux d’IL-6 dans le sérum a été observée dans la plupart des
cancers étudiées. En effet, de nombreuses études épidémiologiques réalisées sur des patients atteints
par exemple de cancer du sein, du poumon, du colon ou de la prostate, ont identifié l’IL-6 comme
un facteur de mauvais pronostic (Knupfer and Preiss, 2010) (Schafer and Brugge, 2007) (Bachelot
et al., 2003). Cependant, le rôle de cette cytokine dans la progression tumorale est lui aussi
controversé car selon le contexte de l’étude, l’IL-6 peut soit favoriser la progression tumorale, soit
l’inhiber (Danforth and Sgagias, 1993) (Shen et al., 2002) (Conze et al., 2001) (Selander et al.,
2004) (Yeh et al., 2006).
En fait la fixation de l’IL-6 sur son récepteur (composé de la chaine IL-6α et de la sous-unité
gp130) stimule de nombreuses voies de signalisation comme la voie des PI3K, des MAPK ou
encore des STAT. De plus, l’IL-6 influence les taux circulants d’estrogènes car elle est capable
d’activer l’aromatase qui convertit les androgènes en estrogènes, ce qui peut être à l’origine d’une
augmentation de la progression de tumeurs estrogéno-dépendantes (Singh et al., 1999). Enfin, l’IL-6
agirait comme un inducteur de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) des cellules
tumorales nécessaire à la formation des métastases (Sullivan et al., 2009).
16
L’IL-1β. L’IL-1β est une cytokine pro-inflammatoire abondante au niveau de la tumeur, où elle
affecte les processus de carcinogenèse, de croissance et d’invasion. En effet, lorsqu’elle est secrétée
en grandes quantités, elle participe à l’inflammation locale et ainsi à la sécrétion de facteurs de
croissance et de MMPs, ainsi qu’à l’angiogenèse (Apte et al., 2006).
En conclusion, la réponse inflammatoire engendrée par la tumeur favorise la progression du cancer.
En effet, les médiateurs pro-inflammatoires produits principalement par les TAMs soutiennent la
croissance tumorale et l’angiogenèse, alors que les lymphocytes T générés contre la tumeur sont
souvent dans un état d’anergie. Cependant, de nombreuses expériences réalisées dans des tumeurs
murines ou humaines indiquent qu’une infiltration lymphocytaire élevée est souvent associée à un
bon pronostic (Dunn et al., 2004). L’équipe du Dr. Jérôme Galon a récemment montré qu’une
réponse importante et coordonnée des lymphocytes T effecteurs dans le cancer colorectal réduisait
fortement le risque de rechute (Galon et al., 2006). Cette notion d’immuno-surveillance suggère une
capacité du système immunitaire à protéger l’organisme contre le développement tumoral (Dunn et
al., 2002). Ainsi, le rôle du système immunitaire adaptatif dans la progression tumorale est encore
controversé et de récents travaux indiquent que son effet anti-tumoral dépendrait de l’importance de
l’infiltration lymphocytaire et de la localisation des lymphocytes dans la tumeur (Galon et al., 2006)
(Fig. 4).
2.2 Angiogenèse
La formation d’un nouveau tissu, qu’il soit normal (au cours du développement embryonnaire ou de
processus de cicatrisation) ou tumoral, requiert la mise en place d’un réseau vasculaire permettant le
maintien de l’oxygénation et l’approvisionnement en nutriments du tissu. Ce processus est appelé
angiogenèse. Le nouveau réseau vasculaire mis en place nécessite une structure hiérarchique bien
définie d’artères, de capillaires et de veines, pour maintenir une perfusion tissulaire efficace
(Shchors and Evan, 2007).
En démontrant, en 1971, que la croissance tumorale est dépendante de la formation de nouveaux
vaisseaux sanguins, Judah Folkman est un des pionniers du domaine de l’angiogenèse tumorale
(Folkman, 1971). En fait, lorsque la tumeur atteint une certaine taille, les cellules tumorales situées
à distance des vaisseaux sanguins manquent d’oxygène et de nutriments et meurent par apoptose ou
par nécrose.
17
Figure 4. Effet des cellules inflammatoires sur la progression tumorale. La réponse inflammatoire, grâce
aux macrophages M1, aux cellules B et aux lymphocytes T cytotoxiques, inhibe la progression tumorale.
Cependant, les cytokines secrétées par la tumeur modifient ce type d’infiltration, en induisant une réponse
inflammatoire pro-angiogénique et pro-tumorale, grâce à la présence de cellules Treg et de macrophages
possédant un phénotype M2 (Allen and Louise Jones, 2011).
18
Dans ces tumeurs peu vascularisées, il y a un équilibre entre la prolifération et la mort cellulaire qui
maintient la tumeur dans un état stable. Des tumeurs « dormantes » ont ainsi été retrouvées au cours
d’autopsie de patients (Kirsch et al., 2004).
En réponse à cette inhibition de croissance, les cellules tumorales induisent la formation de
nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux pré-existants ou bien à partir du recrutement de
précurseurs hématopoïétiques. Ce processus, bien caractérisé, contribue à la progression tumorale
non seulement en fournissant l’oxygène et les nutriments nécessaires à la croissance, mais aussi en
offrant une voie de dissémination aux cellules tumorales via le flux sanguin, pour aller former des
métastases (Baeriswyl and Christofori, 2009).
La transition d’une tumeur hyperplasique peu vascularisée vers une tumeur croissante très
vascularisée est connue sous le terme de « switch angiogénique » qui survient dans les phases
précoces ou intermédiaires du développement tumoral. L’activation de ce switch a été attribuée à la
modulation de la balance entre les facteurs stimulateurs et inhibiteurs de l’angiogenèse. Dans les
tissus normaux, la quiescence vasculaire est maintenue grâce aux facteurs inhibiteurs qui maîtrisent
les facteurs stimulateurs de l’angiogenèse (Ribatti et al., 2007) (Shchors and Evan, 2007). A
l’origine, le tissu tumoral n’est donc pas pro-angiogénique mais il le devient au cours de la
progression tumorale grâce à cette balance qui favorise un environnement riche en facteur proangiogénique (produits par les cellules cancéreuses, mais aussi par les cellules du
microenvironnement) (Folkman et al., 1989) (Ribatti et al., 2007). La production de facteurs
angiogéniques peut être une réaction normale à l’hypoxie, au stress mécanique, à la réponse
immunitaire/inflammatoire ou bien le fait d’activations génétiques spécifiques.
De nombreux activateurs angiogéniques incluant les membres des familles VEGF, FGF (Fibroblast
Growth Factor) et de nombreux inhibiteurs comme la thrombospondine, l’endostatine, la tumstatine
ont été décrits. Un grand nombre de chimiokines participent également à ce processus (CXCL-1-23-5-6-7-8 sont pro-angiogéniques, CXCL-4-9-10-11 sont angiostatiques) (Keeley et al., 2011). Les
facteurs FGF-1 et FGF-2 sont connus pour stimuler la prolifération des cellules endothéliales et des
cellules musculaires lisses et diriger ainsi l’extension et la croissance des capillaires. Les facteurs
VEGFs (de VEGF-A à VEGF-D) agissent en se fixant sur leurs récepteurs à activité tyrosine-kinase
(VEGFR-1 et VEGFR-2) et sont les facteurs angiogéniques les plus puissants. Ils sont capables de
réguler la prolifération, la migration des cellules endothéliales, mais aussi la perméabilité
vasculaire.
Judah Folkman a ainsi suggéré que l’inhibition de l’angiogenèse tumorale pourrait être un outil
majeur dans l’arsenal thérapeutique anti-tumoral (Folkman, 1971). De nouvelles molécules ont
alors été développées, telles que des inhibiteurs du VEGF (bevacizumab) et des inhibiteurs des
récepteurs tyrosine-kinases du VEGF (sorafenib, sunitinib). Dans un premier temps, ces traitements
19
ont montré une efficacité certaine, en augmentant la survie des patients traités pour différents types
de cancers en association avec la chimiothérapie (Gasparini et al., 2005). Toutefois, une analyse
exhaustive des essais cliniques montre un bénéfice initial généralement suivi d’une reprise de la
croissance tumorale due à l’émergence d’une « résistance » à la thérapie. Deux nouvelles
publications créent une confusion supplémentaire en montrant que le traitement anti-angiogénique
réduit effectivement la taille de la tumeur primitive mais accentue son caractère invasif et sa
susceptibilité à engendrer des métastases (Ebos et al., 2009) (Paez-Ribes et al., 2009). Plusieurs
hypothèses peuvent expliquer l’inefficacité de ces traitements : (i) les vaisseaux tumoraux
deviennent moins sensibles aux agents anti-angiogéniques et le maintien de l’angiogenèse peut
perdurer via des mécanismes indépendants du VEGF, (ii) les anti-angiogéniques sélectionnent des
clones résistants à l’hypoxie ou encore (iii) la régression des vaisseaux complique l’accès à des
agents cytostatiques. En fait, les études menées par le groupe de Rakesh Jain ont permis d’expliquer
l’efficacité transitoire des thérapies anti-angiogéniques. Ce groupe a observé, grâce à des modèles
expérimentaux de tumeurs, une faible efficacité des réseaux vasculaires tumoraux car ils présentent
de nombreuses anomalies morphologiques (vaisseaux dilatés, non raccordés, etc.). Ainsi, R. Jain a
proposé que l’activité anti-angiogénique des traitements, dans un premier temps, induit une
normalisation du réseau vasculaire qui permet une meilleure circulation des agents cytotoxiques et
ainsi un accroissement sensible de leur efficacité (Carmeliet and Jain, 2011). Cette hypothèse a été
vérifiée sur des souris développant des glioblastomes dont le blocage du récepteur au VEGF
provoque une normalisation vasculaire temporaire de 5-6 jours pendant laquelle l’oxygénation de la
tumeur augmente, permettant ainsi une radiothérapie plus efficace (Winkler et al., 2004).
En plus de l’angiogenèse, la progression tumorale implique la lymphangiogenèse puisque les
métastases peuvent aussi emprunter la circulation lymphatique pour envahir les ganglions
régionaux. Ce processus est moins documenté que l’angiogenèse tumorale, et met en jeu une
signalisation dépendante du VEGF-C et du VEGFŔD (Stacker et al., 2002).
2.3 Les fibroblastes
Les fibroblastes sont les cellules mésenchymateuses qui forment les fibres du tissu conjonctif et
contribuent à son intégrité structurale. Ils jouent un rôle capital dans le remodelage de la MEC
puisqu’ils secrètent à la fois ses constituants majeurs (Laminine, fibronectine (FN), collagène) mais
aussi de nombreuses MMPs. Les fibroblastes participent également aux processus inflammatoires
(secrétions de facteurs chimiotactiques et d’IFNβ) et à la cicatrisation.
En conditions physiologiques, les fibroblastes ont un index de prolifération peu élevé et de faibles
capacités métaboliques. Cependant, au cours des processus de cicatrisation, ils prolifèrent, secrètent
20
d’avantage de composants matriciels et acquièrent des propriétés contractiles (Xouri and Christian,
2010). Ces fibroblastes, appelés « activés » ou myofibroblastes, vont alors secréter un grand nombre
de chimiokines conduisant au recrutement de cellules inflammatoires au site de la blessure. Comme
leur nom l’indique, les myofibroblastes sont des cellules qui ont les propriétés de cellules
musculaires lisses et de fibroblastes. Leur cytoplasme contient un grand nombre de filaments
d’actine (notamment l’actine musculaire lisse ou αSMA) et de vimentine (Fig. 5). Alors que des
fibroblastes normaux n’engagent pas de contacts cellule-cellule lorsqu’ils sont cultivés en
monocouche, les myofibroblastes sont connectés les uns aux autres par des jonctions adhérentes ou
des jonctions communicantes (Schurch et al., 1998). Après la réparation du tissu, le nombre de
fibroblastes activés diminue et leur phénotype initial est restauré (Tomasek et al., 2002).
Ces cellules particulières ne sont pas uniquement présentes dans le stroma normal mais représentent
aussi un composant majeur de différentes tumeurs solides. Elles sont appelées CAFs pour « Cancerassociated Fibroblast ». Les CAFs possèdent certaines caractéristiques des myofibroblastes de la
cicatrisation, mais restent activés de façon constitutive.
Effets des CAFs sur la progression tumorale :
Les CAFs représentent le type cellulaire le plus abondant du stroma de certaines tumeurs (cancer du
sein, du pancréas, du colon et de la prostate). Les premiers travaux portant sur le rôle des
fibroblastes dans la progression tumorale ont eu lieu à la fin des années 1980 et ont consisté à coinjecter à la souris immuno-déficiente des fibroblastes avec des cellules tumorales. Ils ont ainsi mis
en évidence l’impact important des fibroblastes sur le développement et la croissance de la tumeur
(Camps et al., 1990) (Picard et al., 1986). Par la suite, de nombreuses évidences ont indiqué une
contribution de ces cellules à la progression tumorale à travers la sécrétion de facteurs de croissance
(EGF (Epidermal Growth Factor), HGF (Hepatocyte Growth Factor), TGFβ) et de chimiokines
(Kalluri and Zeisberg, 2006) (Fig. 6).
Récemment, l’équipe de Robert Weinberg a montré que des fibroblastes isolés du stroma d’un
carcinome invasif mammaire augmentent significativement la croissance tumorale dans un modèle
de xénogreffe, comparé à des fibroblastes normaux. En fait, les CAFs produisent des taux élevés de
la protéine CXCL-12 (aussi appelé SDF-1) qui, d’une part, recrute les progéniteurs endothéliaux
dans la tumeur pour favoriser l’angiogenèse et, d’autre part, augmente la croissance tumorale via sa
liaison sur son récepteur CXCR-4 exprimé à la surface des cellules tumorales.
21
Figure 5. Les fibroblastes activés. (a). Les fibroblastes évoluent au sein d’une matrice extra-cellulaire
fibrillaire, composée majoritairement de collagène de type I et de fibronectine. Les fibroblastes interagissent
avec leur environnement grâce à des intégrines comme les intégrines α1β1. Morphologiquement, ce sont des
cellules fusiformes, avec un cytosquelette d’actine et de vimentine. (b). Les fibroblastes activés prolifèrent et
secrètent de nombreuses molécules de la matrice comme le collagène I, la ténascine-c, ainsi que la
fibronectine. Ils expriment des protéines particulières comme l’αSMA (Kalluri and Zeisberg, 2006).
Figure 6. Effet paracrine des fibroblastes activés sur le comportement tumoral. (Xouri and
Christian, 2010)
22
De façon intéressante, ces caractéristiques uniques des CAFs sont maintenues même en l’absence
de contact avec les cellules tumorales. Ceci indique que l’effet des CAFs sur la progression
tumorale n’est pas simplement une réponse cellulaire induite par les facteurs secrétés par les
cellules tumorales, mais résulte plutôt de nouvelles propriétés acquises (Orimo et al., 2005).
D’autres facteurs de croissance contribuent à l’effet pro-tumoral des CAFs. L’équipe de David
Rowley a montré que des CAFs capables d’induire la tumorigenèse de cellules tumorales
prostatiques secrètent des taux plus importants de facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF)
que des fibroblastes normaux (Yang et al., 2005). Cette protéine est sur-exprimée dans de nombreux
cancers incluant le cancer du sein, du pancréas et de l’œsophage (Allen and Louise Jones, 2011). En
utilisant un modèle de xénogreffe, cette équipe a montré que le CTGF du stroma tumoral induit une
augmentation significative de l’angiogenèse et augmente la croissance tumorale. Enfin, le
traitement de fibroblastes normaux par du TGFβ conduit à la sécrétion de CTGF et à l’acquisition
d’une activité pro-tumorale (Yang et al., 2005).
Les CAFs participent également au remodelage de la MEC car ils sont capables de secréter de
nombreux composants de la matrice, comme le collagène et la fibronectine, impliqués dans la
progression tumorale (voir chapitre MEC).
En plus de leur effet sur la croissance et la dissémination de tumeurs établies, de fortes évidences
indiquent que les CAFs ont un rôle critique dans la carcinogenèse. Dans une série d’expériences,
l’impact du stroma tumoral sur le comportement de cellules épithéliales a été démontré. La lignée
cellulaire épithéliale prostatique BPH-1 (non tumorigène mais immortalisée) a été transplantée chez
la souris avec, d’une part, des CAFs isolés de cancers prostatiques primaires, et d’autre part, des
fibroblastes normaux. Des carcinomes se sont développés avec les CAFs, alors qu’une faible
croissance épithéliale, sans développement tumoral, a été observée en présence des fibroblastes
normaux (Olumi et al., 1999). En revanche, les CAFs ne stimulent pas le développement tumoral de
cellules épithéliales non immortalisées, ce qui suggère qu’un évènement génétique initiateur est
nécessaire pour exercer cet effet pro-tumoral (Allen and Louise Jones, 2011).
De façon très intéressante, les CAFs ont également un rôle dans le métabolisme des cellules
tumorales. Les cellules tumorales dégradent le glucose uniquement grâce à la glycolyse, aboutissant
à la production de lactate (appelé effet Warburg), alors que les cellules normales catabolisent
entièrement cette molécule à travers la phosphorylation oxydative (Jones and Thompson, 2009).
L’intérêt de l’effet Warburg n’est pas clair car il aboutit à une diminution de la production d’ATP,
ce qui semble être défavorable pour la cellule tumorale. Cependant, des arguments récents
suggèrent que les cellules pourraient s’en servir pour fournir des macromolécules intermédiaires
nécessaires à la formation des nouvelles cellules et ainsi faciliter la prolifération (Vander Heiden et
al., 2009). Les fibroblastes péri-tumoraux semblent participer au métabolisme complexe des cellules
23
tumorales. En effet, les CAFs produisent du lactate et du pyruvate, des métabolites énergétiques
utilisés par les cellules cancéreuses dans le cycle de Krebs et la production d’ATP. Les CAFs
semblent donc « nourrir » littéralement la tumeur (Pavlides et al., 2009).
Origine des CAFs :
En dépit du rôle crucial des CAFs au cours de la progression tumorale, l’origine de cette population
cellulaire est encore largement débattue. La difficulté provient du fait que les CAFs n’ont pas une
mais plusieurs origines (Fig. 7).
En effet, les CAFs peuvent provenir (Allen and Louise Jones, 2011):
-
du recrutement et de l’activation de fibroblastes résidents du tissu tumoral,
-
de cellules souches mésenchymateuses,
-
de la transdifférentiation de différents types cellulaires comme les cellules musculaires lisses
ou les péricytes
-
de la transition épithélio-mésenchymateuse de cellules épithéliales ou de cellules tumorales
(TEM)
-
de la transition endothélio-mésenchymateuse des cellules endothéliales (EndMT)
-
de fibroblastes sénéscents
Les arguments suggérant que les CAFs sont issus du recrutement de fibroblastes locaux proviennent
essentiellement d’expériences in vitro. En effet, les cellules tumorales secrètent des taux importants
de facteurs de croissance comme le TGFβ, le PDGF et le FGF qui sont capables d’activer les
fibroblastes in vitro. Ces cellules expriment alors l’αSMA (α-actine musculaire lisse) et se mettent à
proliférer et à secréter des protéines matricielles (Ronnov-Jessen and Petersen, 1993) (Denk et al.,
2003). Cependant, certains aspects des CAFs ne sont pas reproduits lors de la co-culture des
fibroblastes avec des cellules tumorales, comme par exemple la sur-expression de certains gènes
(Haviv et al., 2009). In vivo, les évidences concernant le recrutement de fibroblastes environnants
proviennent principalement d’études sur la cicatrisation qui indiquent que de nombreux fibroblastes
situés en périphérie de la lésion prolifèrent activement et expriment des MMPs pro-migratoires
(Darby et al., 1997). Cependant, des travaux récents sont venus renforcer cette hypothèse. En effet,
dans un modèle de xénogreffe de tumeur du sein, les fibroblastes mammaires humains résidents
sont activés en CAFs au cours de la progression tumorale, cet effet étant attribué aux cytokines
TGFβ et CXCL-12 (Kojima et al., 2010). Ces travaux ont été confirmés dans une étude présentant
CXCL-12 comme un facteur clé impliqué dans l’activation de fibroblastes résidents dans modèle
d’adénocarcinome mammaire humain (Toullec et al., 2010).
24
Figure 7. Les multiples origines des CAFs dans le stroma tumoral, d’après Xouri et al (2010).
5 mécanismes possibles sont décrits pour expliquer l’origine des CAFs: l’activation de fibroblastes résidents,
la transdifférenciation de péricytes, le recrutement de cellules souches mésenchymateuses, la transition
éptithélio-mésenchymateuse de cellules épithéliales, la transition endothélio-mésenchymateuse (Xouri and
Christian, 2010).
25
De même, il a été suggéré que les CAFs pourraient provenir des cellules souches
mésenchymateuses (CSMs). Ces cellules sont capables de se différencier en cellules de l’os, du
tissu adipeux et du cartilage. A l’origine, les CSMs ont été isolées dans la moelle osseuse, mais de
nombreux arguments indiquent qu’elles se situent dans tous les tissus (Crisan et al., 2008). Des
modèles expérimentaux utilisant des CSMs marquées ont démontré que ces cellules contribuaient à
la mise en place d’un stroma tumoral activé et développaient des marqueurs des CAFs (αSMA,
collagène I) (Direkze et al., 2006). Cette hypothèse est controversée car il semblerait que la tumeur
ne recrute qu’un nombre très limité de cellules progénitrices (Haviv et al., 2009). De plus, la
présence des CSMs a été à la fois corrélée positivement et négativement à la progression tumorale à
travers leurs propriétés immuno-modulatrices et pro-angiogéniques, en fonction de la source de
CSMs et du modèle tumoral utilisé (Kidd et al., 2008).
Les CAFs peuvent aussi provenir de la TEM de cellules épithéliales ou tumorales (Radisky and
Radisky, 2007). Ce processus induit des changements biochimiques complexes permettant aux
cellules épithéliales polarisées d’adopter un phénotype mésenchymateux caractérisé par
l’augmentation des capacités de migration et d’invasion, ainsi que l’augmentation de l’expression
de protéines matricielles (Kalluri and Zeisberg, 2006). De nombreux facteurs comme l’HGF, l’EGF,
le PDGF et le TGFβ induisent une TEM en initiant un grand nombre de voies de signalisation qui
mènent, à terme, à l’activation de facteurs de transcription comme Snail, Slug, Twist et FOXC2
(Kalluri and Zeisberg, 2006) (Shi and Massague, 2003). Certains arguments suggèrent néanmoins
que les CAFs ne peuvent pas provenir des cellules tumorales car ils ne présentent pas (ou très peu)
d’altérations génétiques, ce qui n’est pas le cas des cellules tumorales (Campbell et al., 2009).
De la même façon que les cellules épithéliales, les cellules endothéliales peuvent aussi acquérir un
phénotype mésenchymateux grâce à un processus décrit sous le terme d’EndMT, qui est caractérisé
par la perte de marqueurs endothéliaux comme CD31, l’acquisition de marqueurs mésenchymateux
comme FSP-1 (Fibroblast-specific protein 1) et αSMA, ainsi qu’une pénétration des cellules à
travers la membrane basale (Zeisberg et al., 2007) (Potenta et al., 2008). In vivo, des études menées
sur les souris permettant de suivre les cellules endothéliales ont établi que plus de 40% des CAFs
provenaient de l’EndMT (Zeisberg et al., 2007). De la même façon que lors de la TEM, le TGFβ est
un inducteur majeur de l’EndMT (Xouri and Christian, 2010).
Les fibroblastes sénescents peuvent aussi participer à la population de fibroblastes péri-tumoraux
activés. La sénescence est induite en cas de situation critique (dommages à l’ADN, stress oxydatif,
etc). Le phénotype de sénescence n’est pas seulement un arrêt de prolifération puisque la cellule est
encore métaboliquement active et secrète des cytokines, des chimiokines, des facteurs de
croissance, des protéases et des protéines matricielles. Ainsi, les fibroblastes sénéscents stimulent la
croissance des cellules tumorales mammaires (Krtolica et al., 2001) (Coppe et al., 2008) (Parrinello
26
et al., 2005) (Coppe et al., 2010). Cependant, la majorité des travaux portant sur les CAFs indiquent
clairement un effet pro-tumoral de ces cellules, bien plus important que l’effet des fibroblastes
prélevés à distance de la tumeur, suggérant que les CAFs acquièrent des caractéristiques
biologiques supplémentaires. De plus, les profils d’expression des fibroblastes sénescents
reproduisent seulement partiellement ceux des CAFs (Haviv et al., 2009).
Bien que les CAFs ne présentent pas d’altérations génétiques, certaines évidences indiquent des
différences entre les fibroblastes normaux et les CAFs, ces caractéristiques étant transmises aux
cellules filles. Ceci suggère que d’autres mécanismes comme des modifications épigénétiques
maintiennent ce phénotype (Campbell et al., 2009).
Identification des CAFs :
En dépit des nombreuses publications illustrant le rôle des CAFs dans la progression tumorale, il
existe une certaine ambiguïté dans l’identification de ces cellules au sein du tissu tumoral. Encore
une fois, la difficulté provient du fait que les CAFs représentent une population cellulaire
hétérogène avec différentes origines (Xouri and Christian, 2010) (Allen and Louise Jones, 2011).
Pendant de nombreuses années, ils ont été identifiés uniquement par leur niveau d’expression de
l’αSMA. Cependant, des analyses immuno-histochimiques ont démontré une absence d’expression
de ce marqueur dans certains fibroblastes péri-tumoraux (Andarawewa et al., 2005). A ce jour,
l’identification de ces cellules repose donc sur leurs caractéristiques morphologiques ainsi que sur
l’expression de certains marqueurs : αSMA, vimentine, desmine, collagène I, PDGFR, FSP-1 (aussi
appelé S100A4), FAP (Fibroblast-activated protein) et NG2 (Neuron-glial antigen-2) (Sugimoto et
al., 2006). En fait, la caractérisation immuno-histochimique des CAFs de différentes tumeurs a
permis d’identifier deux sous-groupes majeurs. Le premier est positif pour le marqueur FSP-1 mais
n’exprime aucun des autres marqueurs étudiés (NG2, αSMA et PDGF), alors que le deuxième
n’exprime pas la protéine FSP-1 mais les trois autres marqueurs NG2, αSMA et PDGF (Sugimoto
et al., 2006).
Au cours de nos expériences, nous nous sommes particulièrement intéressés aux marqueurs FSP-1,
FAP et αSMA.
La protéine FSP-1 est exprimée à la fois dans les CAFs et dans les cellules cancéreuses au cours de
la progression tumorale (Ambartsumian et al., 1996). C’est une protéine liant le calcium, capable
d’interagir avec des partenaires intra et extracellulaires. Dans la cellule, elle peut interagir et
inactiver la protéine P53. Elle se lie également avec les filaments d’actine, la myosine ou la
tropomyosine, influençant ainsi le cytosquelette et régulant la motilité cellulaire (Helfman et al.,
2005). FSP-1 est également pro-angiogénique, probablement à travers l’activation du plasminogène
27
ou la sur-expression de metalloprotéases comme la MMP-13 (Egeblad et al., 2005). De nombreuses
évidences indiquent ainsi que FSP-1 est un facteur crucial régulant le potentiel métastatique. En
effet, des cellules cancéreuses, métastatiques quand elles sont injectées à une souris sauvage,
forment moins de tumeurs et aucune métastase lorsqu’elles sont injectées à une souris FSP-1-/-. De
plus, la co-injection de fibroblastes FSP-1+/+ avec les cellules tumorales restaure le développement
tumoral et les métastases dans les souris FSP-1-/- (Grum-Schwensen et al., 2005). Ceci suggère que
FSP-1, lorsqu’elle est secrétée par les fibroblastes, altère le microenvironnement, le rendant
favorable à la progression tumorale.
FAP est une sérine protéase possédant une activité enzymatique peptidase-collagénase in vitro (Park
et al., 1999). Elle est spécifiquement induite dans les CAFs de plus de 90% des tumeurs épithéliales
(Lee et al., 2011). La surexpression de cette protéine dans les cellules tumorales induit la
tumorigenèse et une croissance tumorale importante (Cheng et al., 2002). Dans les fibroblastes péritumoraux, FAP est cruciale pour le remodelage de la MEC et permet l’invasion des cellules
tumorales grâce à son activité enzymatique (Lee et al., 2011).
2.4 La matrice extracellulaire (MEC)
La MEC est définie comme un mélange complexe de protéines (collagènes, tenascine, laminine,
fibronectine, cadhérines, intégrines) et de protéoglycanes (chondroïtine sulfate, heparane sulfate,
acide hyaluronique) fournissant un support mécanique et structural aux cellules et aux tissus. La
MEC peut également réguler des processus cellulaires comme la mort cellulaire, l’adhésion, la
migration, l’invasion, l’expression génique et la différenciation (Schultz and Wysocki, 2009)
(Marastoni et al., 2008) (Assoian and Marcantonio, 1996) (Pupa et al., 2002).
Parmi les nombreux composants de la MEC, le collagène, la tenascine-c et la fibronectine ont un
rôle majeur dans la progression tumorale. Cette matrice tumorale n’est pas une structure figée mais
en constant remaniement, ce qui a également un profond impact sur la progression tumorale.
Les collagènes :
Les collagènes sont les constituants majeurs de la MEC, le collagène de type I étant la protéine
structurale majoritaire de la MEC interstitielle. Le collagène de type III est fréquemment lié au
collagène I, alors que le collagène de type IV est un composant essentiel de la membrane basale. Un
événement clé de la progression tumorale est la perte de l’intégrité de la membrane basale et
l’invasion des cellules cancéreuses dans la matrice interstitielle.
La fibrose induite par le développement tumoral est une accumulation de collagène I et de collagène
III, associée à une augmentation de la dégradation du collagène IV (Egeblad et al., 2010). De façon
28
intéressante, l’architecture du réseau de collagène dans les tumeurs est profondément altérée. En
effet, au cours de la progression tumorale, le collagène perd sa structure en hélice et devient
linéaire, notamment au niveau du front invasif de la tumeur. Les fibres linéaires sont plus rigides et
potentialisent la prolifération, la survie et la migration cellulaires (Levental et al., 2009)
(Provenzano et al., 2006) (Paszek et al., 2005) (Armstrong et al., 2004).
La Tenascine-c (TNC) :
La TNC est une protéine multifonctionnelle exprimée faiblement dans les tissus normaux adultes
mais sur-exprimée dans certaines situations comme l’embryogenèse, la cicatrisation et la réaction
desmoplastique (RD) au cours de la progression tumorale (Jones and Jones, 2000). En fonction du
type de tumeur, de nouveaux variants d’épissages sont secrétés, qui se traduisent par l’apparition de
nouveaux domaines de liaison sur la protéine. Le mécanisme d’action de ces isoformes n’est pas
entièrement connu mais il semblerait que ces nouveaux domaines créent des sites de liaison aux
intégrines, altérant ainsi la signalisation cellulaire (Meiners et al., 1999), ou conduisent à une surexpression des enzymes protéolytiques qui remodèlent la matrice (Sarkar et al., 2006).
La fibronectine (FN) :
La fibronectine est une glycoprotéine d’adhésion de haut poids moléculaire. Cette protéine subit
également un épissage alternatif qui se traduit par l’existence de plusieurs isoformes en fonction du
type cellulaire, du tissu et du stade du développement. Dans les cellules transformées, l’altération
des mécanismes d’épissage induit l’augmentation de FN oncofoetale (Kaspar et al., 2006) (Allen
and Louise Jones, 2011). Cette forme est requise pour la mise en place de la signalisation à l’origine
de l’activation des fibroblastes associés aux tumeurs (Serini et al., 1998). De plus, la FN lie les
intégrines α5β1 et αvβ3 sur-exprimées au niveau des nouveaux réseaux vasculaires de la tumeur et
participe à l’angiogenèse tumorale (Kaspar et al., 2006) (Kaczmarek et al., 1994).
Le remodelage tissulaire :
La progression tumorale nécessite une évolution constante des interactions entre les cellules
tumorales et la MEC. De plus, le remodelage extracellulaire est indispensable à la croissance de la
tumeur. Ce phénomène intervient également au cours d’événements physiologiques comme le
développement embryonnaire et les processus de cicatrisation. Il conduit à des perturbations
structurales des composants de la MEC qui modifient la survie, la prolifération et la migration
cellulaire.
Le remodelage du microenvironnement tumoral requiert la lyse des protéines de la MEC. Les
principales enzymes dégradant la MEC sont les MMPs, les cystéine-protéases (cathepsin B), les
29
protéases aspartiques (Cathepsin D) et les sérine-protéases (Elastase). Des analyses immunohistochimiques et enzymatiques de l’expression de ces protéases dans les tumeurs ont mis en
évidence qu’une augmentation de leur expression ou des changements dans leur localisation
cellulaire sont des facteurs pronostiques importants qui sont corrélés avec la progression tumorale
(Bergamaschi et al., 2008) (Madigan et al., 2008).
Le clivage des composants matriciels par ces enzymes induit non seulement la dégradation de la
membrane basale pour permettre la migration cellulaire, mais perturbe aussi les cascades de
signalisation générées par l’interaction entre la matrice et les récepteurs de surface cellulaires.
Ainsi, la lyse des protéines de la MEC modifie l’ancrage médié par les intégrines, l’adhésion
cellulaire, l’architecture du cytosquelette et induit l’expression de molécules de signalisation
comme la Kinase d’Adhésion Focale (FAK) impliquée dans la migration cellulaire (Braga, 2000)
(Fashena and Thomas, 2000).
Le clivage enzymatique des protéines matricielles libère aussi des fragments qui peuvent induire de
nouveaux effets et moduler les réponses biologiques. Par exemple le clivage de la laminine 5
(assurant un attachement stable des cellules) par la MMP-2 génère un fragment qui augmente la
migration des cellules épithéliales mammaires (Giannelli et al., 1997) (Koshikawa et al., 2000). Les
MMPs peuvent également cliver la E-cadhérine présente à la surface des cellules, ce qui libère un
fragment soluble inhibant la fonction de la E-cadhérine et induisant une augmentation de l’invasion
cellulaire (Davies et al., 2001) (Noe et al., 2001). De manière générale, ces fragments peuvent aussi
agir comme des facteurs pro-angiogéniques. Par exemple, le fragment provenant de la dégradation
du collagène XVIII induit la migration des cellules endothéliales (Kuo et al., 2001).
Un autre effet du remodelage matriciel est la libération de facteurs de croissance précédemment
emprisonnés au sein de la MEC. En effet, de nombreuses cytokines comme l’EGF, le TGFβ, le
PDGF, le FGF et l’IFN se lient aux composants de la MEC où ils sont stockés sous une forme
inactive jusqu’à leur libération et leur activation par les protéases matricielles. La MMP-3 par
exemple est capable de cliver la protéine matricielle Décorine, ce qui induit la libération du TGFβ.
De plus, certaines protéases régulent de cette manière la disponibilité du VEGF dans les cellules
endothéliales et il apparaît que l’angiogenèse est dépendante, en partie, de la libération de facteurs
pro-angiogéniques stockés dans la MEC (Park et al., 1993).
Les cellules tumorales sont capables de produire ces enzymes protéolytiques, mais la plupart
proviennent des cellules stromales. En effet, lorsqu’ils sont stimulés par les cytokines proinflammatoires, les macrophages sur-expriment l’expression de certaines MMPs (Saren et al.,
1996). Mais la majorité des protéases est secrétée par les fibroblastes péri-tumoraux qui synthétisent
également une grande partie des constituants de la MEC.
30
En conclusion, le rôle du microenvironnement dans la progression tumorale est maintenant
largement accepté. De nombreux cancers « in situ » ne progressent jamais vers un phénotype
invasif, majoritairement grâce aux facteurs de l’hôte qui empêchent son développement, un
processus appelé un « cancer sans maladie ».
Ceci souligne le fait qu’une cellule transformée seule n’est pas suffisante pour induire un cancer,
mais que la carcinogenèse requiert le recrutement d’un microenvironnement tumoral permissif à la
croissance tumorale et aux métastases.
3. La réaction desmoplastique (RD).
Certains composants du stroma cités précédemment participent à une réaction induite par la
présence tumorale, la réaction desmoplastique (RD).
Elle est définie par le développement anormal d’un tissu fibreux en réponse à une lésion. Cette
réaction est bénigne dans certains cas, mais elle peut être aussi associée à une pathologie. En effet,
en réponse à l’envahissement tissulaire par des cellules cancéreuses, il s’établit une RD autour de la
tumeur, qui peut être plus ou moins importante en fonction de l’organe atteint. Dans certains cas, la
RD peut représenter plus de 50% de la masse tumorale. Ce processus fibrotique est induit par la
présence de grandes quantités de fibroblastes péri-tumoraux qui secrètent des protéines matricielles
et des enzymes protéolytiques, créant ainsi une « MEC permissive à la progression tumorale ». La
RD est ainsi associée à un phénotype invasif caractérisé par un « turnover » matriciel dérégulé, avec
la dégradation de la membrane basale riche en collagène IV et à l’accumulation de fibres de
collagène I. Dans les cancers du sein, du pancréas et du poumon, il a été suggéré que les
changements du microenvironnement attribué à la RD permettent une augmentation de la
prolifération tumorale, l’acquisition d’un phénotype invasif et une augmentation de la chimiorésistance (De Wever and Mareel, 2003) (Armstrong et al., 2004) (Sethi et al., 1999). Ainsi, une RD
prononcée est un facteur indépendant de mauvais pronostic chez des patients atteints de certains
cancers, comme le cancer colorectal (Sis et al., 2005) (Conti et al., 2008).
31
4. Particularités du microenvironnement tumoral mammaire.
Le cancer du sein étant notre modèle d’étude, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au
microenvironnement mammaire.
La glande mammaire normale est composée de 5% de cellules épithéliales et de 95% de cellules
stromales. Le développement de cet organe met en jeu de nombreuses interactions entre les cellules
épithéliales et leur stroma, suggérant un parallèle étroit entre le développement normal de la glande
mammaire et le cancer du sein.
4.1 Le développement normal de la glande mammaire
La glande mammaire est une glande exocrine constituée de deux compartiments cellulaires : le
compartiment mésenchymateux (ou stroma) perfusé par les vaisseaux sanguins et les fibres
nerveuses, et le compartiment épithélial qui s’articule autour d’un réseau de canaux galactophores et
de lobules renfermant les alvéoles. Ces deux compartiments sont séparés par une membrane basale
de collagène de type IV, de laminine et de glycosaminoglycanes. Une coopération permanente
existe entre ces deux compartiments au cours du développement de la glande mammaire.
La glande mammaire est l’unique organe se développant majoritairement après la naissance. Ce
développement post-natal intervient à des périodes liées au développement sexuel. A la naissance,
la glande mammaire est réduite à un système de tubules. En période pré-pubère, elle subit une
évolution lente et régulière avec une croissance et une ramification des canaux galactophores en
canaux de 2ème et 3ème ordre. A la puberté, les estrogènes sont responsables de la prolifération des
structures épithéliales, de l’augmentation du tissu conjonctif et de la vascularisation du tissu
adipeux. A l’adolescence, les canaux galactophores se divisent par dichotomie en canaux de plus en
plus étroits jusqu’à l’unité terminale ducto-lobulaire (UDTL). Chaque UDTL est constituée d’un
canalicule extra et intra-lobulaire se terminant par les alvéoles. En l’absence de grossesse, la glande
reste dans cet état. Au cours de la grossesse, les ramifications terminales des canaux se multiplient
et de nombreuses alvéoles se développent. La glande mammaire n’achève son développement
qu’avec la première lactation. Les alvéoles régressent lors du sevrage et la glande revient à son état
initial. Le déclin des fonctions ovariennes à la ménopause provoque une régression des structures de
la glande ; les canaux galactophores sont maintenus mais les alvéoles restantes continuent de
régresser avec l’âge (processus appelé involution) (McGee et al., 2006).
32
4.2
Des mécanismes moléculaires communs entre le développement de la glande
mammaire et le cancer du sein
Au cours de la vie, le compartiment épithélial subit donc de nombreux cycles de
prolifération/remodelage/apoptose et garde la capacité d’envahir le stroma environnant, de relancer
la prolifération en réponse à certains facteurs, d’induire l’angiogenèse, de remodeler la MEC ou
encore d’inhiber l’apoptose (mécanisme de protection contre l’involution précoce) (Wiseman and
Werb, 2002). Tous ces processus peuvent être exploités au cours de la progression tumorale.
De plus, comme au cours de la progression tumorale, le développement de la glande mammaire est
le fruit d’une étroite collaboration entre les cellules épithéliales et leur stroma environnant. En effet,
la croissance et le développement de la glande mammaire sont régulés au niveau systémique par les
hormones ovariennes et hypophysaires (estrogènes et hormone de croissance respectivement), et au
niveau local par des interactions paracrines entre les cellules épithéliales mammaires et leur stroma
environnant (McGee et al., 2006). Ce fait a été illustré pour la première fois par des expériences de
transplantation tissulaire chez la souris, dans lesquelles l’épithélium mammaire embryonnaire a été
injecté chez la souris en présence de mésenchyme salivaire. L’épithélium mammaire a alors
développé des caractéristiques morphologiques similaires à la glande salivaire, tout en conservant
les capacités fonctionnelles de l’épithélium mammaire : capacité à répondre à une situation
hormonale et à secréter les protéines du lait (Sakakura et al., 1976). La structure morphologique de
l’épithélium est donc dépendante de son contact avec le stroma, alors que la différenciation
fonctionnelle est dépendante des composants épithéliaux. Chez l’Homme, le stroma mammaire est
un tissu hétérogène complexe, composé principalement d’adipocytes, de pré-adipocytes, de
fibroblastes, de vaisseaux sanguins, de cellules inflammatoires et de la MEC. Les cellules stromales
agissent sur les cellules épithéliales en produisant des facteurs de croissance (stimulateurs ou
inhibiteurs), des composants de la MEC comme le collagène, la FN, la laminine. Les cellules
épithéliales secrètent aussi des facteurs influençant la prolifération et la fonction des cellules
épithéliales adjacentes et des cellules stromales (Wiseman and Werb, 2002).
Ce stroma riche et très développé conduit à la mise en place d’une RD importante au cours de la
progression tumorale mammaire. De nombreuses cellules et molécules de la MEC participent à
l’élaboration du tissu tumoral mammaire particulier. Parmi ces cellules, le rôle des adipocytes dans
le microenvironnement tumoral mammaire a été très peu étudié, alors qu’ils représentent la majorité
des cellules stromales.
33
PARTIE II : ADIPOCYTES ET CANCER.
Jusqu’aux années 2000, très peu d’études se sont intéressées au rôle des adipocytes dans la
progression tumorale. Ce sont pourtant les cellules majoritaires du microenvironnement de certains
cancers, notamment du microenvironnement tumoral mammaire. De plus, les adipocytes possèdent
des fonctions métaboliques uniques et une activité paracrine importante, qui leur permettent
d’interagir avec de nombreux types cellulaires.
1. Le tissu adipeux.
Le tissu adipeux est organisé en lobules délimités par des cloisons (septa) de tissu conjonctif
richement vascularisé et innervé. Les adipocytes représentent entre 35 et 70% de la masse adipeuse
chez l’adulte, correspondant approximativement à 25% de la population cellulaire totale.
L’adipocyte n’est cependant pas la seule cellule du tissu adipeux. Un nombre important d’autres
cellules composent ce que l’on appelle la partie stroma-vasculaire du tissu. Elle est formée de toutes
les cellules permettant le maintien et le développement du tissu adipeux. On y trouve des
précurseurs adipocytaires (pré-adipocytes), des cellules endothéliales, des cellules sanguines, des
fibroblastes, des macrophages, des cellules souches ou encore des terminaisons nerveuses (Cousin
et al., 2006).
Il existe deux sortes de tissu adipeux : un tissu adipeux blanc décrit précédemment, et un tissu
adipeux brun qui participe à la thermogenèse en oxydant les acides gras sans production d’ATP
grâce au découplage de la chaîne respiratoire mitochondriale, produisant ainsi de la chaleur.
Le tissu adipeux blanc, dont nous parlerons exclusivement dans la suite de ce travail, se trouve à
différents endroits de l’organisme. Il existe le tissu adipeux profond ou viscéral (mésentérique,
omental, rétro-péritonéal, épidydimaire), sous-cutané (inguinal, fémoral, abdominal), mammaire et
celui de la moelle osseuse. Les propriétés métaboliques du tissu peuvent varier en fonction de sa
localisation. Par exemple, une augmentation du tissu adipeux viscéral est associée à une
augmentation du risque de développer une insulino-résistance et des maladies cardio-vasculaires,
alors qu’une augmentation de la masse adipeuse sous-cutanée ne l’est pas. De plus, les adipocytes
du tissu viscéral sont plus sensibles à la lipolyse que les autres (Rosen and MacDougald, 2006).
34
2. Les adipocytes.
L’adipocyte est une cellule originale : cellule ronde et volumineuse (diamètre allant d’une vingtaine
de micromètres à plus d’une centaine), possédant un cytoplasme réduit, saturé par une large vacuole
contenant les triglycérides (TG).
2.1
La différenciation adipocytaire ou adipogenèse
La différenciation adipocytaire conduit à une modification morphologique importante de la cellule
puisque l’on passe d’une cellule de type fibroblastique (petite, forme allongée) à un adipocyte
(grosse cellule, forme ronde). Cette modification s’accompagne d’importants changements
d’expression génique, avec l’apparition progressive de marqueurs adipocytaires. La différenciation
adipocytaire s’étudie, entre autres, in vitro grâce aux lignées pré-adipocytaires 3T3-L1 et 3T3F442A établies à partir du sous-clonage de la lignée fibroblastique 3T3 provenant d’un embryon
total de souris Swiss (Rosen and MacDougald, 2006).
Les adipocytes dérivent de CSMs multipotentes qui peuvent aussi donner naissance aux cellules de
l’os, du cartilage, ou des muscles. Bien qu’il y ait eu de nombreuses tentatives pour décrire les
intermédiaires cellulaires entre ces cellules souches et les adipocytes matures, de tels intermédiaires
ont été difficiles à caractériser au niveau moléculaire. Ainsi, l’adipogenèse est communément
décrite en deux grandes phases (Fig. 8) :
-
La première phase, appelée détermination, implique l’engagement d’une cellule souche
multipotente vers la lignée adipocytaire. La détermination est la conversion d’une cellule souche
vers un adipoblaste, qui devient ensuite un pré-adipocyte. L’adipoblaste et le pré-adipocyte sont des
cellules d’allure fibroblastique, ne pouvant pas être différenciées de façon morphologique de leur
précurseur (et ne possédant pas de marqueur spécifique) mais qui ont perdu la capacité de
différencier vers un autre type cellulaire. Jusqu’à ce stade, les cellules possèdent encore la capacité
de proliférer.
-
Dans la seconde phase, connue sous le terme de différenciation terminale, les pré-adipocytes
acquièrent progressivement les caractéristiques des adipocytes matures (la machinerie enzymatique
nécessaire au transport du glucose et à la synthèse lipidique, à la réponse à l’insuline et à la
sécrétion de nombreuses protéines). Au début de cette seconde phase, les pré-adipocytes subissent
quelques mitoses post-confluentes qui sont suivies d’une perte irréversible des capacités de
prolifération. Une fois acquis l’ensemble des propriétés métaboliques de l’adipocyte, les adipocytes
matures commencent à accumuler des lipides.
35
Figure 8. La differentiation adipocytaire, d’après (Feve, 2005).
36
Le contrôle transcriptionnel de la différenciation adipocytaire :
Le programme de différenciation adipocytaire est sous l’étroit contrôle de certains facteurs de
transcription. Parmi eux, l’attention s’est majoritairement portée sur les protéines de la famille des
C/EBPs (CAAT/Enhancer Binding Proteins) et des PPARs (Peroxisome Proliferator Activated
Receptor). Mais d’autres facteurs de transcription interviennent également dans ce processus
comme les SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Protein) ou les KLFs (Kruppel-Like zinc
finger transcription Factor).
Ces protéines sont exprimées et activées de façon séquentielle au cours de l’adipogenèse. Lors des
phases précoces de la différenciation, C/EBPβ et C/EBPδ sont les premiers à être induits. Leur
induction transitoire permet l’apparition des deux facteurs majeurs de l’adipogenèse : C/EBPα et
PPARγ. Une fois activés, ces deux facteurs s’autorégulent afin de maintenir leur expression, même
après la diminution de l’expression de C/EBPβ et C/EBPδ. C/EBPα et PPARγ activent alors la
transcription de nombreux gènes codant pour des protéines impliquées dans le métabolisme ou dans
l’acquisition du phénotype adipocytaire (Du et al., 2010).
PPARγ, « le maître régulateur » de l’adipogenèse. PPARγ, un membre de la superfamille des
récepteurs nucléaires, est suffisant et nécessaire pour l’induction de l’adipogenèse (Rosen et al.,
2000). En effet, l’expression forcée de PPARγ est suffisante pour induire la différenciation en
adipocyte mature, et, jusqu’à présent, aucun facteur induisant l’adipogenèse en l’absence de PPARγ
n’a été découvert (Tontonoz et al., 1994).
Ces observations sont en accord avec le fait que la plupart des facteurs pro-adipogéniques semble
agir, au moins en partie, en activant l’expression ou l’activité de PPARγ. En fait, les facteurs proadipogéniques C/EBP et KLF induisent au moins un des deux promoteurs de PPARγ. A l’inverse, le
facteur anti-adipogénique GATA inhibe son expression (Tong et al., 2000). De plus, des voies de
signalisation cruciales dans l’adipogenèse convergent vers la régulation de l’expression ou de
l’activation de ce facteur.
Il existe deux isoformes de PPARγ, générées par épissage alternatif et induites au cours de la
différenciation adipocytaire, PPARγ1 et PPARγ2. A ce jour, les rôles relatifs de ces deux isoformes
dans l’adipogenèse ne sont pas complètement élucidés.
PPARγ n’est pas seulement crucial pour l’adipogenèse, il l’est aussi dans les adipocytes matures
pour maintenir l’état différencié. En effet, l’introduction grâce à un adénovirus d’un dominant
négatif PPARγ dans un adipocyte différencié 3T3-L1 induit une dédifférenciation avec une perte de
l’accumulation lipidique et une diminution des marqueurs adipocytaires (Tamori et al., 2002). Chez
la souris, un KO inductible de PPARγ dans des adipocytes différenciés conduit à la mort des
adipocytes matures. Ils sont alors remplacés par des nouveaux adipocytes exprimant PPARγ,
37
différenciés à partir des pré-adipocytes. PPARγ est donc indispensable à la survie in vivo des
adipocytes matures (Imai et al., 2004).
De nombreux C/EBPs participent à l’adipogenèse. De nombreux membres de cette famille,
incluant C/EBPα, C/EBPβ, C/EBPδ et C/EBPγ sont exprimés dans les adipocytes.
C/EBPα induit de façon directe de nombreux gènes adipocytaires. Les études in vivo indiquent un
rôle important de ce facteur dans le développement du tissu adipeux. En effet, les souris KO sont
presque totalement dépourvues de tissu adipeux blanc (excepté dans la glande mammaire, suggérant
des différences dans l’adipogenèse en fonction de la localisation du tissu) (Linhart et al., 2001).
C/EBPα a aussi un rôle crucial dans les adipocytes différenciés, ce facteur étant indispensable à
l’acquisition de la sensibilité à l’insuline (Wu et al., 1999). Encore une fois, les C/EBPs ne peuvent
pas fonctionner efficacement en l’absence de PPARγ. Par exemple, C/EBPβ ne peut pas induire
l’expression de C/EBPα en l’absence de PPARγ qui est requis pour la dissociation de HDAC1 du
promoteur de C/EBPα (Zuo et al., 2006).
La régulation extra-cellulaire de l’adipogenèse :
Comme discuté précédemment, le programme d’adipogenèse est la conséquence d’une activation
séquentielle des facteurs de transcription. Ces facteurs interviennent en aval de voies induites par
des signaux extra-cellulaires. Ils sont nécessaires pour assurer le dialogue réciproque entre les
cellules de la fraction stroma-vasculaire et les adipocytes matures, afin de corréler la croissance des
adipocytes existants et la différenciation de nouveaux adipocytes à la demande énergétique.
L’insuline et les gluco-corticoïdes par exemple, sont parmi les facteurs pro-adipogéniques les plus
décrits et ont démontré leurs effets in vivo (Rosen and MacDougald, 2006). Parmi les inhibiteurs de
l’adipogenèse, nous pouvons citer Pref1, le TGFβ, ou encore les membres de la famille Wnt
(Wingless-type MMTV integration site) dont le rôle est crucial au cours de la différenciation
adipocytaire (Rosen and MacDougald, 2006) et qui nous ont particulièrement intéressés dans ce
travail.
Les Wnts ralentissent l’adipogenèse. Les membres de la famille Wnt sont des glycoprotéines
secrétées par un grand nombre de cellules, agissant de façon autocrine ou paracrine pour réguler le
développement embryonnaire (prolifération, migration, polarité, apoptose), ainsi que l’homéostasie
et le remodelage tissulaire chez l’adulte. A ce jour, 19 protéines Wnt ont été recensées chez
l’Homme.
38
Au niveau cellulaire, les Wnts activent des voies de signalisation canoniques et non canoniques.
La cascade de signalisation canonique converge vers l’activation du régulateur transcriptionnel βcaténine (Fig. 9). En l’absence de Wnt, la β-caténine cytoplasmique est recrutée par un complexe de
dégradation composé, entre autres, des protéines Axine et APC (Adenomatous Polyposis Coli) qui
facilitent sa phosphorylation par la Caseine Kinase I (CK-1) et GSK-3β (Glycogene Synthase
Kinase-3beta).
Ceci conduit à l’ubiquitination et à la dégradation par le protéasome de la β-caténine. Lorsque les
Wnts se lient aux récepteurs Frizzled et aux co-récepteurs LRP5/6 (Low-density lipoproteinReceptor-related Protein-5 ou -6) extracellulaires, l’activation du récepteur induit la
phosphorylation d’un médiateur cytoplasmique, Dishevelled-1 (Dvl-1), responsable de l’inhibition
de GSK-3β permettant finalement l’inactivation du complexe de dégradation et l’accumulation
cytoplasmique d’une β-caténine dé-phosphorylée. Cette protéine transloque alors au noyau et se lie
aux facteurs de transcription de la famille LEF/TCF (Lymphoid-Enhancer-binding Factor/T-Cellspecific transcription Factor) pour activer ses gènes cibles (Christodoulides et al., 2009). Ces gènes
sont majoritairement cycline D1, c-myc, PPARδ, Tcf-1, matrilysine et CD44 (Mulholland et al.,
2005). Dans la cellule, la β-caténine est donc retrouvée dans 3 localisations différentes : dans les
jonctions adhérentes en association avec le récepteur transmembranaire E-cadhérine et l’α-caténine,
dans le cytoplasme, ou encore dans le noyau en association avec d’autres facteurs de transcription
(Mulholland et al., 2005).
Les voies de signalisation non canoniques induites par les Wnts sont moins définies. Elles
impliquent principalement des événements indépendants de la β-caténine et sont plutôt impliquées
dans le développement embryonnaire (Christodoulides et al., 2009).
Les travaux de l’équipe d’Ormond MacDougald ont été les premiers à impliquer la signalisation
Wnt/β-caténine dans la régulation de la différenciation adipocytaire. En fait, la β-caténine semble
agir comme un régulateur crucial de l’adipogenèse (Fig. 10) (MacDougald and Mandrup, 2002). En
effet, l’activation canonique de cette voie dans les pré-adipocytes 3T3-L1, à travers la surexpression de Wnt1 ou de Wnt10b par exemple, inhibe l’adipogenèse. De la même façon, des
traitements avec des inhibiteurs pharmacologiques de GSK-3β bloquent la différenciation
adipocytaire (Ross et al., 2000). A l’inverse, la perturbation de la signalisation Wnt/β-caténine par
l’expression constitutive de l’axine conduit à une différenciation spontanée des adipocytes (Bennett
et al., 2002). Ces travaux indiquent que, dans des conditions physiologiques, les Wnts retiennent et
ralentissent la différenciation des pré-adipocytes.
39
Figure 9. Activation et inactivation de la voie Wnt/beta-caténine. (A) Les ligands Wnt se lient au
récepteur membranaire Frizzled et activent la protéine Dishevelled (Dsh) qui inhibe l’activité de GSK-3β et
induit la dissociation de l’Axine. La β-caténine cytosolique s’accumule alors et transloque au noyau pour
activer, en se liant aux facteurs de transcription Tcf/Lef-1, les gènes cibles de cette voie. (B) L’absence de
ligand Wnt conduit à la formation d’un complexe Axine/GSK-3/APC, la phosphorylation de la β-caténine
par la caséine kinase-1 (CK1) et par GSK-3β, suivie de la dégradation de la β-caténine par le protéasome
(D’après Mulholland, 2005) (Mulholland et al., 2005).
Figure 10. La voie Wnt/beta caténine inhibe l’adipogenèse. (d’après (Christodoulides et al., 2009)).
40
En fait, la cascade de signalisation activée par les Wnts induit la prolifération des pré-adipocytes et
l’inhibition de l’adipogenèse en bloquant l’induction de PPARγ et C/EBPα (Christodoulides et al.,
2009). La cycline D1 et c-myc facilitent cet effet en se liant ces deux facteurs de transcription. En
présence de stimuli adipogéniques, l’induction de PPARγ et C/EBPβ facilite la diminution de
l’expression des protéines Wnts. L’expression de C/EBPβ et C/EBPα coïncide aussi avec la
dégradation protéosomale de la β-caténine (Mulholland et al., 2005).
Les facteurs Wnt les plus étudiés au cours de l’adipogenèse sont Wnt10b, Wnt10a, Wnt6, Wnt3a et
Wnt1 (Mulholland et al., 2005).
L’adipogenèse n’est pas seulement régulée par l’expression de ligands spécifiques de la voie Wnt/βcaténine mais aussi par l’expression de facteurs qui inhibent cette voie. Ainsi, un inhibiteur de la
voie, Dickkopf-1 est transitoirement exprimé au cours de l’adipogenèse et induit la différenciation
des cellules 3T3-L1 (Christodoulides et al., 2006). De plus, certains signaux Wnt peuvent être proadipogéniques. En effet, Wnt5b est transitoirement induit au cours de l’adipogenèse et induit la
différenciation, indiquant que les pré-adipocytes doivent intégrer différentes signalisations Wnt
concurrentes (van Tienen et al., 2009).
L’adipogenèse a lieu majoritairement pendant la première partie de la vie, jusqu’à l’adolescence, ou
au cours de processus physio-pathologiques comme l’obésité. Cependant, il semblerait que ce
mécanisme ne soit pas irréversible puisque certaines équipes ont mis en évidence une
dédifférenciation des adipocytes, dans certaines conditions.
2.2 Les adipocytes : des cellules plastiques capables de se dédifférencier
Il semblerait que les adipocytes matures ne soient pas figés au sein de la différenciation terminale
mais soient capables, dans certaines conditions, de se dédifférencier. Les premiers travaux ayant
corroboré cette hypothèse ont été réalisés en 1986 par une équipe japonaise. En utilisant une
technique appelée « ceiling culture », cette équipe a étudié la dédifférenciation in vitro d’adipocytes
matures isolés à partir de tissus humain ou murins en cellules de type fibroblastique, capables de
proliférer (Sugihara et al., 1986). Brièvement, le « ceiling culture » consiste à isoler des adipocytes
matures après digestion à la collagénase du tissu adipeux puis à les cultiver 7 jours dans un flacon
rempli de milieu de culture (les adipocytes vont donc flotter et adhérer progressivement à la surface
supérieure du flacon). Le flacon est ensuite retourné et les cellules, ayant perdu leurs gouttelettes
lipidiques, se mettent à proliférer. Elles sont ensuite cultivées dans des conditions normales (Fig.
11) (Matsumoto et al., 2008).
41
Figure 11. La technique du “ceiling culture” permettant de dédifférencier les adipocytes (Matsumoto et
al., 2008).
42
Ces cellules, qui seront appelées plus tard DFAT pour « Dedifferentiated Fat Cells » par le groupe
de Koichiro Kano, perdent l’expression des marqueurs adipocytaires et adoptent un profil proche de
celui des cellules souches du tissu adipeux (expression de gènes spécifiques de la lignée
mésenchymateuse comme RUNX2 et SOX9, présence d’antigènes de surface similaires aux cellules
souches du tissu adipeux) (Matsumoto et al., 2008). In vitro, les cellules DFATs sont capables de se
différencier en adipocytes, en chondrocytes, en ostéoblastes et en cardiomyocytes et représentent
par conséquent une source cruciale de progéniteurs multipotents (Matsumoto et al., 2008).
Ainsi, cette équipe a récemment transplanté des cellules DFATs dans un modèle murin d’infarctus
du myocarde et a observé la régénération des cardiomyocytes et la mise en place d’une
néovascularisation (Jumabay et al., 2009), susceptibles d’améliorer les capacités cardiaques.
Le traitement d’adipocytes par des cytokines permet également d’induire une dédifférenciation. En
effet, le traitement d’adipocytes différenciés à partir de cellules 3T3-L1 par le ligand Wnt3a ou par
le TNFα induit une perte des gouttelettes lipidiques, une diminution de l’expression des gènes
adipocytaires comme PPARγ, C/EBPα et Glut4, associé à une insulino-résistance (Gustafson and
Smith, 2010). Les adipocytes dédifférenciés adoptent une forme fibroblastique, prolifèrent et
présentent des capacités de migration (Gustafson and Smith, 2010).
Enfin, la perturbation des fonctions mitochondriales de la cellule, en modifiant le métabolisme
lipidique des adipocytes, conduit également à une dédifférenciation, qui est PPARγ-indépendante
(Tejerina et al., 2009).
2.3
Rôle physiologique du tissu adipeux
A l’origine, l’adipocyte était uniquement considéré comme une cellule de stockage des réserves
énergétiques, les restituant lorsque les apports font défaut (exercice, exposition au froid). Mais
depuis quelques années, il est également considéré comme une véritable cellule endocrine, capable
de secréter de nombreuses molécules impliquées dans diverses fonctions.
Fonctions métaboliques du tissu adipeux (Pour revue (Vazquez-Vela et al., 2008)) :
Le rôle du tissu adipeux est primordial dans le maintien de l’homéostasie énergétique. En effet, les
adipocytes sont capables de stocker les acides gras sous forme de TG, grâce à l’insuline. Dans les
situations où les besoins énergétiques sont importants, sous l’effet principalement des
catécholamines, la dégradation des TG (lipolyse) permet la libération des acides gras dans la
circulation sanguine.
43
La synthèse des TG. Deux mécanismes différents permettent de synthétiser les TG au sein de
l’adipocyte : le captage des acides gras provenant de la circulation sanguine, et la synthèse d’acides
gras à partir de précurseurs glucidiques (appelée lipogenèse de novo). Dans les deux cas, les acides
gras sont ensuite greffés sur un squelette glycérol pour former après estérification un TG. La
lipogenèse est une activité primordiale puisqu’en cas de perturbation, la diminution du stockage des
lipides entrainerait une augmentation importante des lipides circulants, capables d’induire de
nombreux processus pathologiques (lipotoxicité) comme la résistance à l’insuline.
La lipolyse. La lipolyse est l’hydrolyse des TG contenus dans la vacuole lipidique, en acides gras et
en glycérol. Les acides gras ainsi libérés sont alors secrétés par l’adipocyte et servent de substrat
énergétique aux cellules. Cette réaction est sous le contrôle de plusieurs lipases, la lipase hormonosensible (LHS), la lipase des triglycérides adipocytaires (ATGL), et la Monoacylglycérol lipase
(MAGL) (Langin et al., 2005).
L’AMPc (Adénosine Monophosphate Cyclique) se trouve au centre de la régulation de la lipolyse
en contrôlant la phosphorylation de la LHS par la protéine kinase A. L’insuline est ainsi un puissant
inhibiteur de la lipolyse puisqu’elle entraîne la diminution des taux intracellulaires d’AMPc
(Kitamura et al., 1999). Les cathécholamines telles que l’adrénaline et la noradrénaline constituent
également un important système de contrôle, inhibant ou activant la lipolyse, en fonction du type de
récepteur adrénergique sur lequel elles agissent. Enfin, l’équipe du Pr. Max Lafontan a mis en
évidence une nouvelle voie de régulation de la lipolyse dépendante du GMPc, activée par les
peptides natriurétiques et indépendante des autres voies lipolytiques (Sengenes et al., 2005).
Activités sécrétoires du tissu adipeux : (Pour revue (Ronti et al., 2006) (Wang et al., 2008)) :
En dehors de son rôle dans l’équilibre énergétique, la cellule adipeuse a progressivement acquis un
statut de cellule endocrine. En effet, en 1994, le groupe de Friedman découvre que les adipocytes
secrètent la leptine, une protéine agissant via la circulation sanguine sur la régulation de la prise
alimentaire, la dépense énergétique et le métabolisme glucidique (Zhang et al., 1994). Les études
suivantes ont mis en évidence un très grand nombre de facteurs secrétés par les adipocytes,
regroupés sous le terme d’adipokines (Fig. 12). Certains de ces facteurs ont un rôle général dans le
contrôle des grandes fonctions de l’organisme (action endocrine), d’autres ont un rôle plus local
dans le contrôle du métabolisme et/ou du développement du tissu adipeux (mode d’action autocrine
et paracrine). Ainsi, les adipocytes interviennent dans le métabolisme glucidique et lipidique
(leptine, adiponectine, TNFα, résistine, apeline,…), et influencent le système cardio-vasculaire
(angiotensinogène, angiotensine, inhibiteur des activateurs du plasminogène-1 ou PAI-1…) ou
encore le système immunitaire et inflammatoire (protéines du complément, cytokines pro44
Apelin
Figure 12. Les adipocytes secrètent de nombreuses adipokines susceptibles d’agir de façon autocrine,
paracrine ou endocrine, d’après (Hauner, 2004).
45
inflammatoires comme le TNFα et l’IL-6, chimiokines, prostaglandines,…). La plupart de ces
molécules sont d’origine protéique (leptine, adiponectine, résistine,…), mais les adipocytes
synthétisent également des médiateurs lipidiques (prostaglandines, acide lysophosphatidique,
stéroïdes,…).
Grâce à leur activité sécrétoire, les adipocytes ne sont pas des cellules inertes et influencent les
cellules du microenvironnement (les pré-adipocytes par exemple).
Dans un contexte pathologique comme le cancer, quel est donc l’impact des adipocytes, et plus
précisément des secrétions adipocytaires, sur le comportement des cellules tumorales ?
3. Rôle des adipocytes dans la progression tumorale.
Comme nous l’avons vu dans la première partie de cette introduction, la progression tumorale est
fortement
dépendante
d’une
signalisation
hétérotypique
provenant
des
cellules
du
microenvironnement. Parmi ces cellules, les cellules du système immunitaire et les fibroblastes ne
sont pas les seuls à être présents puisque les adipocytes matures sont largement majoritaires dans le
microenvironnement de certains cancers, comme le cancer du sein (Fig. 13). Dès que leur activité
sécrétoire a été mise en évidence, des études se sont intéressées au rôle paracrine des adipocytes
matures sur le comportement de la tumeur, et notamment à l’influence de la leptine, de
l’adiponectine et des molécules inflammatoires.
3.1
Adipocytes et cancer
Les adipocytes du microenvironnement modifient la progression tumorale in vitro et in vivo. La
première étude allant dans ce sens a été réalisée en 1992 et a consisté à travailler avec une lignée
cellulaire murine de carcinome mammaire, la lignée SP1, ne développant pas de tumeur lorsqu’elle
est injectée en sous-cutané chez la souris. Lorsque ces cellules sont co-transplantées avec des
fragments de tissu adipeux mammaire ou ovarien dans le derme des souris, la croissance tumorale et
la formation de métastases sont augmentées. Les auteurs de cette étude ont impliqué les estrogènes
produits par le tissu adipeux dans cet effet, sans préciser le rôle exact des adipocytes matures, étant
donné les nombreux types cellulaires présents dans le tissu adipeux (Elliott et al., 1992). Des
modèles de culture en 3 dimensions ont ensuite permis d’attribuer un effet pro-prolifératif aux
adipocytes matures.
46
Cellules tumorales
mammaires
Adipocytes
Figure 13. Les adipocytes sont majoritaires dans le microenvironnement du cancer du sein. (Coloration
Hemalun-Eosine d’une coupe de cancer du sein).
47
En effet, ces études ont consisté à co-cultiver des adipocytes matures (isolés à partir de tissu
adipeux murin) placés dans une matrice de collagène 3D avec des cellules tumorales (prostatiques,
mammaires ou du colon), dont la prolifération et l’indice apoptotique sont mesurés. Alors que les
adipocytes n’influencent pas la mort des cellules tumorales, la prolifération est significativement
augmentée en co-culture. Cet effet a pu être attribué aux facteurs secrétés par les adipocytes matures
(leptine, facteurs de croissance, estrogènes) (Tokuda et al., 2003) (Amemori et al., 2007) (Manabe
et al., 2003).
Curieusement, très peu d’études se sont intéressées à l’influence des adipocytes matures sur
l’invasion ou l’angiogenèse tumorale. En effet, de nombreuses adipokines ont été impliquées
individuellement dans ces évènements, mais jusqu’à présent, l’effet global des adipocytes sur ces
paramètres de la progression tumorale a été peu étudié.
L’équipe de Philipp Scherer s’est néanmoins intéressée à l’effet du milieu conditionné d’adipocytes
différenciés à partir de la lignée fibroblastique 3T3-L1, sur la survie, la tumorigenèse, la
prolifération et l’invasion des cellules tumorales mammaires in vitro et in vivo. Les résultats de cette
étude indiquent que les adipokines favorisent chacun de ces évènements, en induisant par exemple
la sur-expression de certaines MMPs (augmentant l’invasion) ou facteurs de transcription impliqués
dans la formation des métastases ou encore en activant des voies de signalisation anti-apoptotiques.
Parmi les adipokines potentiellement impliquées dans cet effet, le collagène VI pourrait être un
candidat intéressant car il active des voies de signalisation pro-oncogéniques dans les cellules
tumorales, liées à la stabilisation et l’activation de la β-caténine (Iyengar et al., 2003). De façon
intéressante, ces travaux montrent également que le milieu conditionné d’adipocyte contient des
chimiokines capables d’attirer les cellules tumorales dans un modèle de migration en 2D.
3.2
Adipokines et cancer
Une étude réalisée en 2005 a identifié les adipokines produites dans le tissu adipeux mammaire
tumoral grâce à une approche protéomique. Ainsi, 359 protéines spécifiques des adipocytes ont été
répertoriées, incluant des cytokines, des facteurs de croissance, des hormones… (Celis et al., 2005).
Toutes ces adipokines sont susceptibles d’influencer la progression tumorale. Dans ce chapitre,
nous nous attacherons à détailler le rôle des adipokines les plus étudiées comme la leptine et
l’adiponectine.
48
La leptine :
La leptine, produit du gène ob, est une hormone de 16 KDa, secrétée majoritairement par les
adipocytes matures, mais aussi par les cellules épithéliales du sein et des ovaires, et par les cellules
cancéreuses. Son expression est d’ailleurs plus importante dans le tissu tumoral comparé au tissu
sain (Ishikawa et al., 2004). Cette protéine a été identifiée comme étant un facteur de satiété faisant
le lien entre le statut nutritionnel de l’organisme, le contrôle de la prise alimentaire et la dépense
énergétique (Rayner and Trayhurn, 2001). La leptine agit également sur de nombreux types
cellulaires, contrôlant ainsi l’installation de la puberté, l’angiogenèse et l’hématopoïèse, ainsi que
l’immunité adaptative (Muoio and Lynis Dohm, 2002). Elle agit en se liant à son récepteur LEP-R
ce qui induit l’activation de nombreuses voies de signalisation telles que la voie des PI3K
(PhosphoInositol-3-Kinase), la voie des MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) et la voie JAK2/STAT-3 (Janus tyrosine Kinase-2/Signal Transducer and Activators of Transcription 3) (Friedman
and Halaas, 1998), toutes ces voies étant décrites comme pro-tumorales. Non seulement le récepteur
de la leptine est fortement exprimé par de nombreuses cellules tumorales (Howard et al., 2010)
(Ishikawa et al., 2004), mais la leptine elle-même est secrétée par ces cellules et peut alors agir de
manière autocrine (Ishikawa et al., 2004). L’insuline, l’hypoxie, l’IGF-1 et l’estradiol stimulent la
production de leptine dans les adipocytes et dans les cellules cancéreuses (Garofalo et al., 2006).
Cette protéine a été largement étudiée in vitro grâce à ses fonctions mitogéniques, antiapoptotiques, pro-angiogéniques, et pro-métastatiques (Schaffler et al., 2007). De façon
intéressante, la leptine est également capable d’activer le récepteur aux estrogènes (ERα) et régule
ainsi des gènes estrogéno-dépendants, même en l’absence d’estradiol (Catalano et al., 2004).
A l’inverse, les études in vivo évaluant l’impact direct de la leptine sur le développement du cancer
ont été difficiles. En effet, la manipulation génétique de la leptine chez la souris (ob) ou de son
récepteur (db) en utilisant des souris mutantes ob/ob ou db/db altère significativement le
métabolisme de l’organisme (hyper-insulinémie, hyper-glycémie et dyslipidémies), susceptible
d’interférer avec l’étude (Friedman and Halaas, 1998). De plus, il a été montré qu’aucune tumeur
mammaire ne se développe dans les souris ob/ob ou db/db à cause de la perturbation du
développement de la glande mammaire (Cleary et al., 2004) (Cleary et al., 2003).
Ainsi, l’équipe de Philipp Scherer a examiné pour la première fois le rôle précis de la leptine dans la
progression tumorale mammaire en utilisant des souris déficientes pour le récepteur périphérique de
la leptine (ne développant aucune des pathologies liées au manque cérébral de leptine (de Luca et
al., 2005). Leurs observations indiquent que la leptine, en activant les voies MAPK et JAK2/STAT-3, favorise la progression tumorale, les métastases et le métabolisme des cellules
cancéreuses (Park et al., 2010). Une étude récente a également impliqué la leptine dans la
progression tumorale puisque l’inhibition de sa sécrétion dans les adipocytes murins (induite par
49
une signalisation β-adrénergique liée à l’évolution des souris dans un environnement enrichi)
diminue la croissance tumorale (Cao et al., 2010). Enfin, des essais in vitro et in vivo ont révélé que
la leptine possède de fortes propriétés angiogéniques, le récepteur LEP-R étant exprimé au niveau
des vaisseaux sanguins (Sierra-Honigmann et al., 1998) (Bouloumie et al., 1998).
L’adiponectine :
L’adiponectine est une protéine de 30 KDa exclusivement exprimée par le tissu adipeux, et plus
particulièrement par les adipocytes. Les récepteurs de l’adiponectine sont localisés dans le muscle
squelettique (AdipoR1), le foie (AdipoR2) et les cellules endothéliales (AdipoR1), mais aussi dans
les cellules cancéreuses (du sein, du colon, du poumon, de l’endomètre et du pancréas) (Yoneda et
al., 2008) (Petridou et al., 2007) (Takahata et al., 2007) (Takemura et al., 2006) (Dalamaga et al.,
2009). La stimulation de ces récepteurs active les voies de signalisation dépendantes de l’AMPK
(AMP Activated Protein Kinase), c-Jun et des MAPK. Il en résulte divers effets physiologiques :
augmentation de la translocation des transporteurs Glut4 du cytoplasme vers la membrane
plasmique, diminution de la production de glucose dans le foie, augmentation de l’oxydation des
acides gras, diminution de la résistance à l’insuline et de la libération de cytokines proinflammatoires.
Le rôle de l’adiponectine dans la progression tumorale n’est pas encore élucidé et reste controversé.
En effet, des études épidémiologiques ont d’abord mis en évidence une diminution des taux
d’adiponectine dans le sérum de patients atteints de cancer du sein (Chen et al., 2006) (Miyoshi et
al., 2003). De nombreux chercheurs ont alors suggéré qu’un faible taux d’adiponectine pouvait être
lié au risque de cancer, et ont donc émis l’hypothèse d’une action anti-tumorale de l’adiponectine.
Ainsi, in vitro, il a été mis en évidence que le traitement de cellules tumorales mammaires par
l’adiponectine induisait une diminution de la croissance cellulaire à travers une augmentation de
l’activité apoptotique, cet effet n’étant pas retrouvé dans les cellules positives pour le récepteur aux
estrogènes (ERα +) (Kang et al., 2005). Contrairement à cette étude, des travaux sur des cellules
ERα +, les MCF-7, ont démontré une augmentation de l’apoptose suite à un traitement par
l’adiponectine, cet effet étant attribué à l’induction de molécules pro-apoptotiques p53 et Bax et à la
diminution de l’ARNm de la molécule anti-apoptotique Bcl-2 (Dieudonne et al., 2006). Enfin,
l’adiponectine a été impliquée dans l’inhibition de l’angiogenèse car elle ralentit fortement la
croissance des cellules endothéliales à travers l’activation des caspases induisant l’apoptose
(Brakenhielm et al., 2004). D’après ces études, l’adiponectine semble donc avoir des effets
inhibiteurs sur la croissance tumorale, à travers une action anti-apoptotique sur les cellules
cancéreuses elles-mêmes ou sur les cellules endothéliales.
50
Cependant, la pertinence de ces études est limitée car l’adiponectine utilisée est d’origine
bactérienne. Hors cette protéine a une organisation complexe en structures tertiaire et quaternaire
obtenue uniquement dans une cellule mammifère. Ainsi, des expériences plus convaincantes ont été
réalisées in vivo dans des modèles de souris KO pour cette protéine, exprimant l’oncogène PyMT
sous le contrôle du promoteur MMTV, développant des cancers mammaires. Elles ont montré que
la diminution d’adiponectine était à l’origine d’une augmentation de la progression tumorale. Tout
d’abord, la perte de cette protéine ralentit la croissance tumorale dans les stades précoces, grâce à
l’inhibition de l’angiogenèse. Cela induit un stress anti-angiogénique à l’origine d’une
augmentation de la sécrétion de VEGF et d’autres protéines pro-angiogéniques, responsables de la
mise en place d’un réseau vasculaire fonctionnel et de qualité au sein de la tumeur. La progression
vers des stades plus agressifs est alors plus rapide chez ces souris, comparé aux souris sauvages
(Landskroner-Eiger et al., 2009) (Denzel et al., 2009). L’adiponectine serait donc considérée
comme une protéine angio-mimétique. De nouvelles observations renforcent cette hypothèse et
indiquent que les récepteurs de l’adiponectine ont une activité céramidase (Holland et al., 2011) et,
lorsqu’ils sont activés, produisent la Sphingosine 1-Phosphate (S1P). Hors des taux élevés de S1P
sont associés à une augmentation de la survie cellulaire et à une activité pro-angiogénique locale
(Takabe et al., 2008).
Les autres sécrétions adipocytaires :
En dehors de la leptine et de l’adiponectine, les adipocytes secrètent de nombreuses adipokines
susceptibles d’influencer le comportement tumoral.
En effet, ils jouent un rôle dans les réponses immunitaires et adaptatives en secrétant des cytokines
pro-inflammatoires et des chimiokines comme CSF-1, CCL-2, IL-6, TNFα qui peuvent participer à
la progression tumorale et à l’inflammation associée à la tumeur. L’IL-6 adipocytaire a ainsi été
impliquée dans la prolifération de cellules tumorales prostatiques. Dans cette étude, les auteurs ont
montré que cette cytokine agissait en synergie avec la leptine et l’IGF-1, également d’origine
adipocytaire, pour stimuler la prolifération de cellules tumorales non dépendantes aux androgènes
(Onuma et al., 2003). Les adipocytes secrètent aussi du TNFα bien que les cellules de la fraction
stroma-vasculaire (essentiellement les macrophages) du tissu adipeux en produisent une plus grande
quantité (Weisberg et al., 2003) (Fain et al., 2004). Cependant cette sécrétion reste plutôt modeste
dans des conditions normales, et augmente avec l’inflammation du tissu adipeux, retrouvée par
exemple dans un contexte d’obésité (Kern et al., 1995).
D’autre part, les adipocytes ont un rôle important dans la synthèse de la matrice extracellulaire à
travers la sécrétion et la maturation du collagène VI. Cette protéine est exprimée de façon
abondante par les adipocytes et stimule la prolifération en se fixant sur son récepteur présent à la
51
surface des cellules tumorales mammaires. Ceci induit la phosphorylation de la protéine GSK-3β,
active la β-caténine et stabilise la cycline D1. Ainsi, la croissance tumorale est significativement
réduite chez les souris n’exprimant pas cette protéine, en partie à cause d’une diminution de la
fibrose environnante (Iyengar et al., 2005). De plus, le collagène VI peut être clivé au niveau de la
tumeur et le produit de clivage, le domaine carboxy-terminal de la chaine α3, a des effets proprolifératifs sur des cellules tumorales mammaires (Iyengar et al., 2005).
Enfin, la nouvelle adipokine Zinc-α2-glycoprotein (ZAG), secrétée par les adipocytes mais aussi
par les cellules tumorales, est retrouvée dans le sérum de patients atteints de certains cancers et
pourrait être utilisée comme bio-marqueur de la progression tumorale (cancer de la prostate, du
sein) (Hassan et al., 2008). Cette protéine induit la lipolyse des adipocytes et est associée à la
cachexie (perte de poids de plus de 5%) fréquemment observée chez des patients atteints de cancer,
et plus particulièrement de cancer du tractus gastro-intestinal, de la prostate ou des poumons
(Hassan et al., 2008).
3.3
Les adipocytes péri-tumoraux
Les adipocytes secrètent donc de nombreuses adipokines susceptibles d’influencer le phénotype
tumoral. Comme nous l’avons vu dans la première partie de cette introduction, les cellules
cancéreuses modifient le comportement des cellules stromales, comme les fibroblastes et les
macrophages, afin de rendre le microenvironnement permissif à la progression tumorale. Ainsi, en
réponse aux exigences de la tumeur, la physiologie des adipocytes ne pourrait-elle pas être
modifiée ? Très peu d’études se sont intéressées au comportement des adipocytes dans un contexte
tumoral. Cependant, dans le sein, lorsque les cellules tumorales commencent à envahir le tissu
environnant, les premières cellules qu’elles rencontrent sont les adipocytes. Ensuite, la réaction
desmoplastique progresse et les cellules tumorales sont rapidement entourées d’une matrice dense.
Cette adaptation de la MEC est associée à une profonde altération du ratio de cellules stromales, les
adipocytes disparaissant au profit des cellules fibroblastiques qui s’accumulent.
L’un des seuls travaux apportant des éléments de réponse a été réalisé par le groupe du Dr. MarieChristine Rio. Cette équipe a mis en évidence une interaction entre les adipocytes péri-tumoraux et
les cellules tumorales, à l’origine d’une augmentation de la progression tumorale. En effet, les
cellules cancéreuses invasives établissent un dialogue réciproque avec les adipocytes, induisant la
sécrétion de MMP-11 dans les adipocytes péri-tumoraux. In vitro, la MMP-11 est capable
dédifférencier les adipocytes en cellules de type fibroblastique. Cette MMP régule aussi
négativement l’adipogenèse et pourrait engendrer une diminution de la différentiation adipocytaire
et l’accumulation de cellules fibroblastiques exprimant la MMP-11. Ces cellules agiraient alors sur
52
les cellules tumorales invasives adjacentes pour favoriser leur survie et établir ainsi un cercle
vicieux à l’origine d’une potentialisation de l’effet (Motrescu and Rio, 2008) (Andarawewa et al.,
2005).
A ce jour, en dehors de la sécrétion de la MMP-11, les adipocytes péri-tumoraux n’ont jamais été
caractérisés, que ce soit en termes morphologique, phénotypique ou sécrétoire.
En revanche, un autre travail souligne le rôle des adipocytes péri-tumoraux dans la progression
tumorale, notamment dans la réponse aux traitements. En effet, l’équipe de Steven Mittelman a cocultivé des adipocytes différenciés à partir de cellules de la lignée 3T3-L1 avec des cellules de
leucémie lymphoïde aigue et a mis en évidence une inhibition de l’apoptose induite par la
vincristine dans les cellules co-cultivées. Cet effet serait dû aux sécrétions adipocytaires, qui
induisent une augmentation de l’expression de deux protéines impliquées dans la survie, Bcl-2 et
Pim-2 (Behan et al., 2009).
3.4
Les précurseurs adipocytaires dans le microenvironnement tumoral
Le tissu adipeux contient majoritairement des adipocytes matures, intégrés dans une MEC
contenant d’autres types cellulaires comme des cellules endothéliales, des macrophages, des préadipocytes ou encore des cellules souches adipocytaires.
De nombreux travaux convergent vers la même évidence : le dialogue réciproque entre les cellules
tumorales et les cellules du tissu adipeux inhibe la différenciation adipocytaire et pourrait contribuer
à la réaction desmoplastique en induisant l’accumulation de cellules fibroblastiques dans le
microenvironnement tumoral. En effet, les sécrétions tumorales, comme le TNFα ou l’IL-11
inhiberaient l’activation des deux facteurs de transcriptions majeurs, PPARγ et C/EBPα dans les
pré-adipocytes péri-tumoraux (Meng et al., 2001). De plus, la MMP-11 sécrétée par les adipocytes
en réponse aux cellules tumorales agirait aussi en inhibant l’adipogenèse (Andarawewa et al.,
2005).
Les cellules souches adipocytaires pourraient également influencer la progression tumorale. En
effet, ces cellules secrètent un grand nombre de molécules, dont l’IL-6 qui a récemment été
impliquée, in vitro, dans des processus de migration et d’invasion de cellules tumorales mammaires
(Walter et al., 2009).
53
En conclusion, les adipocytes sont des cellules originales et s’adaptent considérablement à leur
environnement :
-
Dans certaines conditions, ils sont capables de se dédifférencier en cellules de type
fibroblastique,
-
Ils modifient leur métabolisme en fonction des besoins énergétiques de l’organisme,
-
Au sein du tissu tumoral, ils pourraient établir un dialogue réciproque avec les cellules
tumorales, basé sur le large panel d’adipokines qu’ils sont capables de secréter,
De plus, lors d’apports nutritionnels trop élevés, les adipocytes sont à l’origine d’altérations
dramatiques du tissu adipeux, conduisant à l’obésité. Comme nous allons le voir dans la troisième
partie, les secrétions adipocytaires sont alors largement modifiées, et peuvent potentialiser le
dialogue qui s’établit avec les cellules tumorales.
54
PARTIE III : OBESITE ET CANCER
L’obésité est une maladie chronique qui existe dans les pays développés comme dans les pays en
développement et qui touche les enfants comme les adultes. En fait elle est désormais si répandue
qu’elle se substitue aux problèmes de santé publique traditionnels que sont la dénutrition et les
maladies infectieuses et constitue l’un des facteurs les plus importants de mauvaise santé. L’obésité
est le plus souvent la conséquence d’un déséquilibre énergétique, associé à un développement
pathologique du tissu adipeux. Elle est liée à un grand nombre de pathologies comme les maladies
cardiovasculaires et le diabète de type 2. De plus, l’obésité est à l’origine d’une augmentation de
l’incidence de nombreux cancers et représente un facteur de mauvais pronostic dans certains
cancers comme celui du sein.
1. Généralités.
L’obésité est définie comme une accumulation anormale ou excessive de graisse essentiellement
dans le tissu adipeux. La cause fondamentale du surpoids ou de l’obésité est une balance
énergétique positive, dans laquelle les apports excèdent la dépense énergétique pendant une durée
prolongée, conduisant à la prise de poids et à l’accumulation de graisse sous-cutanée et viscérale.
Cependant, l’obésité est une maladie complexe qui apparaît comme étant la conséquence de
nombreux facteurs incluant une prédisposition génétique, l’alimentation, le mode de vie et les
facteurs environnementaux (Moreno-Aliaga et al., 2005). La prévalence de l’obésité parmi les
enfants, les adolescents et les adultes a augmenté dramatiquement pendant ces dernières décennies
(Prieto-Hontoria et al., 2011). L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime qu’il y a
actuellement plus de 1,6 milliard d’adultes en surpoids, dont 400 millions de personnes obèses. De
plus, cet organisme prédit qu’en 2015 il y aura 2,3 milliards de personnes en surpoids et 700
millions d’obèses (Prieto-Hontoria et al., 2011). L’obésité acquiert donc les caractéristiques d’une
pandémie.
En pratique, l’obésité est définie sur la base d’un indice de masse corporelle (IMC), calculé par le
rapport du poids sur la taille au carré (IMC= Poids (kg)/taille2 (m)). Il existe 5 classes d’IMC :
-
Poids normal : IMC [19-24,9]
Surpoids : IMC [25-29,9]
Obésité modérée : IMC [30-34,9]
Obésité moyenne : IMC [35-39,9]
Obésité sévère (morbide) : IMC ≥ 40
Deux types de répartition de la masse grasse ont été décrits : le type androïde, défini par des dépôts
de graisse au niveau du ventre, et le type gynoïde défini par un excès de graisse au niveau des
55
cuisses. L’obésité associée au type androïde est à l’origine de maladies cardio-vasculaires
(hypertension artérielle et insuffisance coronarienne) et métaboliques (diabète de type 2 et
dyslipoprotéinémies). L’obésité associée à une répartition gynoïde est plutôt liée à des
complications mécaniques (arthrose), biliaires (lithiase) ou veineuses (thrombose, varices).
L’accumulation de la masse adipeuse est la conséquence de l’augmentation de la taille des
adipocytes (hypertrophie) et/ou de l’augmentation du nombre d’adipocytes (hyperplasie). En fait il
semblerait qu’au cours de périodes d’excès caloriques, les adipocytes accumulent les lipides, ce qui
provoque leur hypertrophie. Lorsqu’ils ont atteint une taille critique, de nouveaux adipocytes sont
recrutés à partir de la différenciation des pré-adipocytes locaux (Lemonnier, 1972). Une étude plus
récente a légèrement contesté cette hypothèse. En effet, l’équipe du Pr Peter Arner a montré que le
nombre d’adipocytes reste constant tout au long de la vie d’adulte, que le sujet soit obèse ou non.
Cependant, il y a un important renouvellement des adipocytes, ce qui suggère que leur nombre est
étroitement régulé, indépendamment de la balance énergétique (Spalding et al., 2008).
Au cours de l’obésité, le tissu adipeux subit de nombreux dérèglements (hypoxie, stress oxydatif,
inflammation) qui modifient les voies de sécrétion des protéines et induisent une diminution de la
neutralisation des lipides potentiellement toxiques. Ainsi, la perturbation des adipocytes au cours de
la prise de poids est la cause majeure des désordres métaboliques liés à l’obésité incluant l’insulinorésistance, le diabète de type 2, les maladies cardio-vasculaires, l’inflammation chronique et le
cancer.
2. Obésité et incidence du cancer.
2.1
Etudes épidémiologiques
Actuellement, de nombreuses études épidémiologiques ont démontré une association positive entre
l’obésité et l’incidence du cancer. Une des plus rigoureuses a entrepris une méta-analyse incluant
28 2137 patients et a révélé une forte association entre le surpoids ou l’obésité et une augmentation
du risque de développer un cancer (Renehan et al., 2008):
-
Tous sexes confondus : cancer de la thyroïde, du colon, du rein, de l’œsophage, ainsi que
des leucémies et des lymphomes non-Hodgkinien,
-
Chez l’homme : cancer rectal,
-
Chez la femme : cancer de l’endomètre, de la vésicule biliaire, du pancréas, des ovaires et
cancer du sein. L’obésité associée au cancer du colon, du sein, de l’endomètre étant
strictement dépendante du statut ménopausique.
56
Cas du cancer du sein : De nombreuses études épidémiologiques ont mis en évidence une
association positive entre les mesures anthropométriques et l’incidence du cancer du sein
(Trentham-Dietz et al., 2000) (Trentham-Dietz et al., 2007) (Lahmann et al., 2004). Cette
association dépendrait du statut ménopausique ; les femmes obèses ayant un risque important de
développer un cancer du sein en période de ménopause mais pas en pré-ménopause. En effet, avant
la ménopause, il y aurait une réduction du risque chez les femmes ayant un IMC important,
expliquée par des cycles menstruels anovulatoires et des faibles taux d’hormones stéroïdes (Calle
and Kaaks, 2004) (Bianchini et al., 2002).
2.2
Hypothèses
Le système insuline/IGF :
La résistance à l’insuline est très souvent associée à l’obésité. Un des mécanismes permettant de
l’expliquer implique des phosphorylations multiples inhibitrices du récepteur à l’insuline,
conduisant à la perte de son activité. De nombreux signaux associés à l’obésité sont capables
d’engendrer ces phosphorylations tels que les acides gras libres, le diacylglycérol, les acylCoA, le
glucose, ainsi que les cytokines pro-inflammatoires comme le TNFα, l’IL-1β, ou l’IL-6 (Dunaif et
al., 1995). Une stimulation insulinique de longue durée inactive également le récepteur en
provoquant son clivage (DeLano and Schmid-Schonbein, 2008). Enfin, l’hyperglycémie induit une
diminution de la quantité d’ATP intracellulaire, inhibant l’autophosphorylation du récepteur et la
signalisation de l’insuline (Guilherme et al., 2008). La résistance à l’insuline s’accompagne d’une
augmentation de la glycémie (les cellules étant incapables de capter le glucose) qui peut être à
l’origine d’un diabète de type 2, et d’une hyper-insulinémie pour tenter de réguler la glycémie.
Cette hyper-insulinémie est directement corrélée à des effets pro-tumorigènes (Fig. 14) (Calle and
Thun, 2004):
-
L’insuline agit en se fixant sur ses récepteurs membranaires exprimés par les cellules
cancéreuses, induit la prolifération cellulaire et inhibe l’apoptose,
-
L’insuline induit la synthèse et augmente l’activité biologique de l’IGF-1 (Insulin-like
Growth Factor-1), une hormone peptidique possédant une structure moléculaire et des effets
biologiques similaires à ceux de l’insuline. L’IGF-1 a également été reconnu comme
possédant de forts effets mitogéniques sur les cellules cancéreuses et inhibe l’apoptose,
-
L’insuline augmente la synthèse et la biodisponibilité des hormones stéroïdes sexuelles,
incluant les androgènes, la progestérone et les estrogènes, connus pour être pro-tumorigènes.
57
Figure 14. Effets de l’hyper-insulinémie chronique au cours de l’obésité sur le développement tumoral
(d’après (Calle and Thun, 2004)). Au cours de l’obésité, l’augmentation des acides gras libres (FFA), du
TNFα et de la résistine, et la diminution de l’adiponectine conduisent au développement de l’insulinorésistance et d’une hyper-insulinémie compensatoire. Les taux élevés d’insuline induisent une diminution de
la synthèse hépatique des IGFBP (IGF-Binding Protéin), induisant une augmentation de la disponibilité en
IGF-1. L’insuline et l’IGF-1 agissent en se fixant sur leurs récepteurs et induisent la prolifération cellulaire et
inhibent l’apoptose. Ces effets contribuent au développement tumoral (Calle and Kaaks, 2004).
58
Ainsi, des expériences in vivo ont montré que l’insuline induisait le développement de tumeurs et la
croissance tumorale (Shafie and Grantham, 1981). D’autres expériences ont également pu mettre en
évidence une diminution de la croissance tumorale après inactivation du récepteur à l’IGF-1 ou
diminution des taux circulants et tissulaires d’IGF-1 (Khandwala et al., 2000).
Les hormones sexuelles :
L’obésité influence la synthèse et la biodisponibilité des hormones stéroïdes sexuelles à travers trois
mécanismes :
-
Le tissu adipeux exprime certaines enzymes (comme l’aromatase par exemple) métabolisant
ces hormones et induisant la formation d’estrogènes à partir de précurseurs androgéniques
secrétés par les gonades ou les glandes surrénales. Chez l’homme et chez la femme
ménopausée, le tissu adipeux est la principale source d’estrogènes, et l’IMC est directement
corrélé aux taux circulants d’estrogènes (Bray, 2002).
-
L’augmentation des taux circulants d’insuline et d’IGF-1 diminue la synthèse hépatique de
la protéine plasmatique SHBG (Sex Hormone Binding Globulin), se liant aux estrogènes.
Ainsi, la diminution des taux de SHBG induit une augmentation des fractions biodisponibles
d’estrogènes (Calle and Thun, 2004).
-
Les taux importants d’insuline augmentent la synthèse d’androgènes à partir des ovaires et
des glandes surrénales.
De nombreuses évidences indiquent que les hormones stéroïdes régulent la balance entre la
différenciation cellulaire, la prolifération et l’apoptose, favorisant ainsi la croissance des cellules
cancéreuses, notamment dans un contexte de cancer du sein estrogéno-dépendant (Simpson et al.,
2005). Ainsi, le Tamoxifène, un antagoniste des estrogènes, a été largement utilisé dans le
traitement de tumeurs estrogéno-dépendantes chez des femmes ménopausées.
L’inflammation chronique :
Les perturbations du tissu adipeux au cours de l’obésité sont à l’origine d’un état inflammatoire, dit
« de bas grade », caractérisé par une élévation systémique modérée mais chronique d’un ensemble
de molécules pro-inflammatoires (Clement and Vignes, 2009). Comme nous l’avons vu dans la
première partie de cette introduction, un état inflammatoire peut être lié au développement d’un
cancer. Des études épidémiologiques ont par exemple associé une inflammation chronique
systémique avec le cancer du colon, du foie, de l’estomac, de l’intestin, de la thyroïde, de la
prostate, de l’estomac ou du sein (Coussens and Werb, 2002). Ainsi, des évidences récentes
indiquent un effet bénéfique des anti-inflammatoires non stéroïdiens sur la prévention et le
traitement de certains cancers comme celui du sein (Ulrich et al., 2006).
59
3. Relation entre obésité et pronostic du cancer du sein.
3.1
Etudes épidémiologiques
Les études évoquées précédemment ont clairement montré l’association entre la masse adipeuse et
le risque de développer un cancer. Depuis quelques années, une association est également apparue
entre l’obésité et le pronostic du cancer du sein. En effet, de nombreuses études ont mis en évidence
une augmentation des récurrences, de l’apparition de cancer du sein contra-latéral, de l’apparition
d’autres cancers et de la mortalité liée au cancer du sein chez des patientes obèses. Ces études sont
néanmoins controversées dans la littérature. En effet, alors que 26 études impliquant 29 460
patientes ont montré que l’obésité était un facteur de mauvais pronostic dans le cancer du sein, 8
études impliquant 3 727 patientes n’ont pas montré une telle association (Carmichael, 2006). Ces
différences peuvent être partiellement expliquées par l’utilisation de définitions différentes de
l’obésité dans les études. En effet, dans certains travaux, aucune différence n’est faite entre le
surpoids et l’obésité, ceci masquant l’effet réel de l’obésité sur le pronostic du cancer du sein. De
plus, l’effet négatif de l’obésité sur le pronostic du cancer du sein étant relativement faible, les
études à petite échelle ne sont pas assez puissantes pour le mettre en évidence. Enfin, certaines
études peuvent introduire un biais quant à la taille tumorale ou l’atteinte ganglionnaire au moment
de l’inclusion des patientes (Carmichael, 2006) (Majed et al., 2009).
Malgré ces controverses, de nombreux travaux indiquent que l’obésité est un facteur de mauvais
pronostic dans le cancer du sein (augmentant le risque des récurrences d’un facteur d’environ 1,5 et
de la mortalité d’un facteur entre 1,5 et 2) (Dal Maso et al., 2008) (Chlebowski et al., 2002) (Petrelli
et al., 2002), et ce, quels que soient les traitements utilisés. La prise de poids après le diagnostic, le
manque d’activité physique et le mode de vie sont également à l’origine d’un tel effet (Pierce et al.,
2007) (Saxton et al., 2006) (Kroenke et al., 2005).
Des travaux ont également été menés afin de mettre en évidence des éventuelles différences
concernant le statut ménopausique de la patiente et le statut estrogéno-dépendant de la tumeur dans
ce mauvais pronostic attribué à l’obésité. L’équipe de Lawrence Wickerham a alors étudié le
pronostic du cancer du sein chez des femmes obèses atteintes d’une tumeur estrogénoindépendante, sans atteinte du ganglion axillaire au moment du diagnostic. Cette étude n’a pas
montré d’augmentation des récurrences mais une augmentation du risque de cancer secondaire, de
cancer du sein contra-latéral et une augmentation de la mortalité chez les patientes obèses (Dignam
et al., 2006). Une étude sur 5 ans réalisée sur 1360 patientes a démontré une augmentation des
récurrences, de la mortalité, de la taille tumorale chez des patientes obèses atteintes de cancer du
sein, qu’elles soient pré-ménopausées ou ménopausées (Loi et al., 2005). Ces résultats ont été
confirmés dans une étude publiée en 2007, qui a mis en évidence que l’obésité était un facteur de
60
mauvais pronostic indépendant du statut ménopausique et du statut estrogéno-dépendant de la
tumeur. Cependant, l’effet négatif de l’obésité sur le pronostic du cancer du sein est plus prononcé
si la tumeur est dépendante aux estrogènes (Majed et al., 2008) (Berclaz et al., 2004).
De plus, une étude prospective réalisée entre 2002 et 2004 concernant le diagnostic de cancer du
sein invasif primaire a établi que les femmes obèses avaient, au moment du diagnostic, un stade
tumoral plus avancé ainsi qu’une atteinte ganglionnaire métastatique plus importante que les
patientes non obèses (Porter et al., 2006).
3.2
Hypothèses
De nombreuses hypothèses ont été apportées afin d’expliquer l’association entre l’obésité et le
mauvais pronostic du cancer du sein : un dépistage tardif ou un sous-traitement des personnes
obèses, l’augmentation du taux d’estrogènes libres au cours de l’obésité, ou encore les perturbations
du tissu adipeux incluant le rôle paracrine des adipocytes.
Le dépistage tardif :
Le mauvais pronostic associé au cancer du sein des patientes obèses peut être relié à un retard de
diagnostic et donc à une maladie plus étendue au moment du diagnostic (Hunt and Sickles, 2000).
Le retard de diagnostic serait expliqué par des difficultés d’identification des lésions à
l’autopalpation, à cause d’une augmentation de la taille du sein chez la personne obèse. Le mauvais
pronostic du cancer du sein chez la personne obèse dû à un dépistage tardif ne concerne donc que
les cas de cancers détectés par la patiente elle-même (Hall et al., 1999). En effet, la méthode de
détection (mammographie) n’est pas altérée par l’adiposité (Hunt and Sickles, 2000).
Le sous-traitement des patientes obèses :
Les doses de chimiothérapie adjuvante sont communément calculées sur la base de la surface
corporelle. En dépit des doses recommandées en fonction de cette surface corporelle, il est fréquent
de les diminuer chez les personnes obèses (surface corporelle > 2 m2). Ces réductions empiriques
ayant pour but de diminuer la toxicité des chimiothérapies, comme la myélotoxicité.
Mais de nombreux rapports suggèrent que la réduction des doses conduit à un pronostic compromis
(Dignam et al., 2006). En effet, une étude portant sur 249 femmes obèses a montré qu’une grande
proportion d’entre elles (Saxton et al., 2006) a reçu moins de 85 % de la dose prévue dans le
protocole de traitement. Dans le cas de tumeurs estrogéno-indépendantes, les patientes traitées avec
plus de 85% de la dose préconisée ont une survie sans récidive et une survie globale plus
importantes que les patientes ayant reçu moins de 85% de la dose recommandée. Néanmoins, le
61
sous-dosage de tumeurs estrogéno-dépendantes ne semble pas avoir d’effets sur le pronostic du
cancer du sein. Les études montrent également que les femmes obèses recevant des doses de
chimiothérapie prévues dans le protocole ne subissent pas plus d’effets de toxicité que celles
recevant des doses inférieures (Colleoni et al., 2005).
L’augmentation du taux d’estrogènes libres :
Au cours de l’obésité, l’augmentation du taux d’estrogènes libres favorise la croissance des cellules
tumorales estrogéno-dépendantes, pouvant expliquer un plus mauvais pronostic dans le cas d’une
femme obèse atteinte de cancer du sein. Néanmoins, les études épidémiologiques impliquant
l’obésité dans les facteurs de mauvais pronostic du cancer du sein ont été réalisées sur des tumeurs
dépendantes et indépendantes aux estrogènes (Dignam et al., 2006). Le taux élevé d’estrogènes ne
suffit donc pas à rendre compte du pronostic négatif lié à l’obésité dans le cas du cancer du sein.
Les perturbations du tissu adipeux (pour revue : (Park et al., 2011)) :
MEC et fibrose. La MEC du tissu adipeux est particulière car elle doit rester flexible pour pouvoir
s’adapter à une expansion rapide au cours d’un apport énergétique excessif ou à une réduction
drastique lors d’une restriction calorique. Les adipocytes secrètent donc de nombreuses molécules
modifiant la MEC, comme des MMPs ainsi que leurs inhibiteurs tissulaires, des collagènes, des
cathepsines, la FN, la laminine (Halberg et al., 2008) (comme nous l’avons vu précédemment, dans
un contexte tumoral, les adipocytes secrètent le collagène VI et la MMP-11). Au cours de périodes
de forte demande en stockage de lipides, les adipocytes réorganisent la MEC pour supporter
l’expansion hypertrophique des cellules graisseuses. Ainsi, l’expression des composants de la MEC
est modulée par l’obésité et peut influencer la progression tumorale. L’augmentation de fibroblastes
pro-fibrotiques dans le microenvironnement tumoral mammaire étant un facteur pronostique négatif
établi, la composante fibrotique est particulièrement intéressante dans le modèle du cancer du sein
(Van den Eynden et al., 2007) (Boyd et al., 2005).
Hypoxie et angiogenèse. Au cours de l’expansion du tissu adipeux, des zones hypoxiques se créent
et l’établissement d’un réseau vasculaire devient vital pour maintenir l’intégrité du tissu (Cao,
2007). Bien que les adipocytes soient capables d’élaborer un tel réseau vasculaire grâce à la
sécrétion de facteurs pro-angiogéniques comme la leptine, l’HGF, le VEGF, l’adiponectine, le
TGFβ et l’angiopoietine (Cao, 2007), le tissu adipeux de patients obèses est fréquemment dans un
état hypoxique dû à une angiogenèse insuffisante (Hosogai et al., 2007). Le manque d’oxygène
entraine une dérégulation de la sécrétion des adipokines, ce qui peut conduire à une fibrose et à une
62
inflammation chronique (Hosogai et al., 2007) (Wood et al., 2009). En plus de ces effets qui
peuvent influencer la progression tumorale, l’hypoxie et l’angiogenèse du tissu adipeux ont un
impact évident sur les cellules tumorales, en termes de croissance et de survie.
Les métabolites lipidiques. L’insulino-résistance liée à l’obésité induit une lipolyse des adipocytes
et la libération locale ou systémique de métabolites lipidiques comme les acides gras, le
diacylglycérol, les céramides et l’acylcarnitine. Ces molécules, disponibles pour une tumeur se
développant chez un patient obèse, peuvent induire de nombreuses voies de signalisation à l’origine
d’une augmentation de la prolifération, de la croissance et de la migration. En effet, le
diacylglycérol et les céramides sont des seconds messagers activant de nombreuses voies comme la
voie des PI3K et la voie NF-κB (Reynolds et al., 2004) (Schutze et al., 1994). De plus, les acides
gras, en contribuant à la biosynthèse des nouvelles membranes lipidiques et à la β-oxydation,
participent à la prolifération des cellules cancéreuses. Ainsi, une étude récente a suggéré un rôle
crucial de la MAGL (MonoAcylGlycérol Lipase), responsable de la production d’acides gras libres,
dans la croissance tumorale (Nomura et al., 2010). De plus, une augmentation de l’expression de
l’enzyme FAS (Fatty Acid Synthase) avait déjà été associée à un pronostic négatif dans de
nombreux types de cancers (Kridel et al., 2007). En conclusion, bien que l’énergie des cellules
cancéreuses semble être fournie de façon prédominante par la glycolyse, l’oxydation des acides gras
offre une voie alternative intéressante, notamment lors de l’augmentation des taux d’acides gras
libres disponibles, fréquemment retrouvée en cas d’obésité (Buzzai et al., 2005) (Schafer et al.,
2009).
Les effets endocrines des adipocytes du tissu adipeux obèse. Comme nous l’avons décrit dans la
deuxième partie de cette introduction, les adipocytes possèdent un rôle endocrine important,
sécrétant de nombreuses molécules comme la leptine, l’adiponectine, des molécules proinflammatoires, etc. De nombreux travaux ont établi un lien entre ces sécrétions adipocytaires et la
progression tumorale.
Au cours de l’obésité, les perturbations du tissu adipeux et l’hypertrophie des adipocytes modifient
le niveau de sécrétion de ces adipokines. En effet, certaines sont augmentées avec l’obésité (leptine,
molécules pro-inflammatoires comme le TNFα, l’IL-6) alors que d’autres sont diminuées
(Adiponectine) (Boucher et al., 2005). Ainsi, les modifications de ces sécrétions au cours de
l’obésité sont susceptibles de potentialiser l’effet des adipocytes sur la progression tumorale.
63
En conclusion, il existe une association évidente entre l’obésité et la progression tumorale
mammaire, et ce, indépendamment du statut ménopausique. En effet, il est désormais admis que
l’obésité est un facteur pronostique négatif indépendant dans la prise en charge du traitement du
cancer du sein (Majed et al., 2008). Les hypothèses permettant d’expliquer cette augmentation de la
progression tumorale dans un contexte d’obésité sont nombreuses, mais les plus convaincantes
impliquent les perturbations du tissu adipeux obèse qui contribuent à créer un microenvironnement
permissif à la tumeur. L’importance du dialogue paracrine que les adipocytes établissent avec la
tumeur serait alors majorée en cas d’obésité.
La revue ci-après, issue de notre laboratoire, récapitule le rôle des adipocytes du
microenvironnement tumoral dans la progression du cancer du sein, dans un contexte d’obésité.
64
Levy-Marchal C, Pénicaud L (eds): Adipose Tissue Development: From Animal Models to Clinical Conditions.
Endocr Dev. Basel, Karger, 2010, vol 19, pp 45–52
Unraveling the Obesity and Breast Cancer
Links: A Role for Cancer-Associated
Adipocytes?
Béatrice Dirata–c ⭈ Ludivine Bocheta–c ⭈ Ghislaine Escourroud ⭈
Philippe Valeta,c ⭈ Catherine Mullera,b
a
University of Toulouse, bInstitute of Pharmacology and Structural Biology CNRS UMR 5089, cInstitut
National de la Santé et de la Recherche médicale, INSERM U858 Equipe 3, IFR31, and dDepartment of
Anatompathology and Cytology, CHU Rangueil, Toulouse, France
Abstract
In addition to diabetes and cardiovascular diseases, epidemiological evidence demonstrates
that people who are obese or overweight are at increased risk of developing cancer – colon,
breast (in postmenopausal women), endometrial or kidney cancer being among the most frequent. In addition to the increase in tumor occurrence, obesity also affects tumor prognosis,
especially in breast and prostate cancers. In breast cancer, obesity is associated with reduced
survival and increased recurrence independent of menopausal status. Host factors seem to contribute to the occurrence of tumors exhibiting an aggressive biology defined by advanced stages
and high grade. Mature adipocytes are part of the breast cancer tissue and as highly endocrine
cells susceptible to profoundly modify breast cancer cell behavior. Tumor progression has
recently been recognized as the product of an evolving crosstalk between tumor cells and the
surrounding ‘normal’ cells. We propose that such a bidirectional crosstalk exists between breast
cancer cells and tumor-surrounding adipocytes, and that the tumor-modified adipocytes (or
cancer-associated adipocytes) are key actors in tumor progression. The positive contribution of
cancer-associated adipocytes into tumor progression might be amplified in obese women and
explains at least in part the poor prognosis observed in this subset of patients.
Copyright © 2010 S. Karger AG, Basel
The prevalence of overweight and obesity has been increasing worldwide over the
past decades and reached alarming dimensions [1]. According to 2005 projections
by the World Health Organization (WHO), there are 1.6 billion overweight and
400 million obese adults worldwide. WHO predicts that by 2015 these numbers
will increase to 2.3 billion overweight and 700 million obese adults Studies from
EDV019045.indd 45
2/17/2010 11:17:59 PM
different countries with different lifestyles have shown consistently that obesity, as
measured using body mass index (BMI), is associated with an increased risk of allcause mortality [1, 2]. In studies able to stratify the cause of death, the increased
all-cause mortality has been related to cardiovascular and cancer mortality [see
e.g. 2]. Although obesity has long been recognized as an important cause of diabetes and cardiovascular disease, the relationship between obesity and cancer
has retained less attention than its cardiovascular effects. In a recent interview,
Prof. D. Hill, President of the UICC, said ‘Lack of public understanding of the link
between body weight and cancer probably parallels our attitudes to smoking and
cancer in the late 1950s’. However, the link between obesity and cancer is complex
since cancer is a heterogeneous group of diseases. The International Agency on
Cancer has determined that people who are overweight or obese are at increased
risk of developing adenocarcinoma of the esophagus, colon cancer, breast cancer
(in postmenopausal women), endometrial cancer and kidney cancer. Some epidemiological evidence has also indicated that cancers of the liver, gallbladder and
pancreas are also obesity-related whereas no associations are seen for example for
lung cancer [reviewed in 2]. In addition, obesity might influence different steps of
the disease and a careful examination should be given when considering the diagnosis (increase in cancer occurrence) or prognosis and mortality. For example, in
breast cancer, early studies have established that obese women have an increased
risk of developing postmenopausal, but not premenopausal, breast cancer. It has
been even demonstrated that a modest reduction in risk is present in women with
high BMI [reviewed in 2]. By contrast, studies of mortality and survival demonstrated that obesity is associated with reduced survival and an increased likelihood of recurrence. This poor prognosis seems to be independent of menopausal
status, smoking habits, tumor stage, and tumor hormone-binding characteristics
[for reviews, see 3, 4]. Multiple factors might contribute to the survival rates in
obese patients with cancer including a higher likelihood of comorbid conditions
and other ‘non-biological’ effects (e.g. delayed diagnosis or underdosing of chemotherapy). However, emerging evidence suggests that host factors might contribute to the occurrence in obese women of tumors exhibiting an aggressive
biology defined by advanced stage and high grade [5–8]. The molecular mechanisms underlying these effects remain poorly understood but increasing interest
has emerged towards adipokines, a term that defined the multiple secretory products of adipocytes. In fact, adipocytes, initially considered as energy storage cells,
have clearly emerged as endocrine cells in the last 10 years [9]. Through their ability to secrete hormones, growth factors, chemokines or pro-inflammatory molecules, adipocytes are therefore excellent candidates to play a crucial role in tumor
behavior through heterotypic signaling processes. The crosstalk between adipose
and epithelial tumor components might be positively affected in obesity where the
normal balance of these adipose tissue secretory proteins is perturbed [10, 11].
46
EDV019045.indd 46
Dirat · Bochet · Escourrou · Valet · Muller
2/17/2010 11:18:00 PM
Therefore, the purpose of this review is to emphasize the role that mammary adipose tissue might play in locally affecting breast cancer cell behavior. Adipose tissue constitutes an active endocrine organ that can have far-reaching effects on the
physiology of other tissues. To understand how obesity influences breast cancer
prognosis by increasing circulating plasma levels of estrogen, insulin, insulin-like
growth factors or other hormonal factors, the reader is referred to recent reviews
on that topic [see 2, 12].
Adipose Tissue Is an Active Component of the Tumor Stroma
Emerging evidence in the literature recognizes tumor progression as the product
of an evolving crosstalk between tumor cells and its surrounding supportive tissue, the tumor stroma [13]. This framework includes a specific type of extracellular matrix – the tumor matrix – as well as cellular components such as fibroblasts,
immune and inflammatory cells, and blood vessels. Based on the pioneering work
of Jude Folkman [14], it is now widely recognized that tumors must induce angiogenesis to grow as well as to metastasize to distant organ sites and accordingly
targeting the tumor vasculature has become an attractive possibility as a form of
anticancer therapy. Recent cumulative evidence demonstrates that in addition to
endothelial cells, other components of the stroma also act as key players in tumor
progression and invasion. Cancer-associated fibroblasts and tumor-associated
macrophages promote tumor progression by secreting growth factors, chemokines
and pro-migratory extracellular matrix components [13, 15]. Is there a role for adipocytes in this ‘tissue-integrated’ view of tumor progression? Compared to other
components of the stroma, adipocytes received relatively little attention despite the
fact that they correspond to one of the most prominent cell types in breast tumors
(fig. 1). In addition, an effect of tumor-surrounding adipocytes would not have
been entirely surprising when one considers the intimate relationship that exists
between adipose and mammary tissues. The mammary gland develops in a bed
of white adipose tissue, and there are extensive mesenchymal-epithelial interactions in which the adipose mesenchyme ‘instructs’ aspects of mammary epithelial
development [16]. Finally, it is obvious that in numerous organs including breast,
early local tumor invasion results in immediate proximity of cancer cells to adipocytes (fig. 1). There is some evidence in the literature that adipocytes can affect
through paracrine mechanisms the behavior of breast tumor cells [for review, see
12]. For example in a three-dimensional collagen gel matrix co-culture technique,
it has been shown that mature adipocytes secrete a factor(s) which can promote
the growth of human breast cancer cell lines, as reflected in an enhanced uptake
of bromodeoxyuridine [17]. In an elegant in vivo study, the group of Scherer [18]
has shown that co-injection of the breast cancer cell line SUM59PT with murine
Tumor-Surrounding Adipocytes in Breast Cancer Progression
EDV019045.indd 47
47
2/17/2010 11:18:00 PM
Tumor center
Invasive front
Adipose tissue
Fig. 1. Mature adipocytes are present in breast tumor stroma. Histologic examination of a breast
tumor (HE, orig. magnif. ×200). Note that mature adipocytes are located adjacent to invading
cancer cells.
adipocytes (but not pre-adipocytes) in immunodeficient mice not only increase
the levels and rate of tumor progression but also promote development of metastases as well. They further demonstrate that this effect is partially controlled by
type VI collagen secreted by adipocytes that promotes GSK3β phosphorylation,
β-catenin stabilization and increased β-catenin activity in breast cancer cells [19].
Collagen VI is not the only candidate that has been demonstrated to be involved
in this process of adipokine’s driven tumor progression. Leptin has been shown
to promote in some, but not all, cell lines in an autocrine and paracrine manner
the proliferation and/or migration of breast cancer cells. Another adipose tissuederived protein, adiponectin, whose expression is reported to be inversely related
to body fat, has been shown to inhibit cell proliferation and enhance breast cancer
cell apoptosis, although again these effects appear to be restricted to specific models (for a detailed review of these two adipokines in breast cancer progression, see
Vona-Davis and Rose [12]). Elevated serum estrogen levels as well as enhanced
local production of estrogen have been considered primary mediators of how
increased body weight promotes breast cancer development in postmenopausal
women [2]. Related to tumor progression, the local estrogen production (through
aromatization of the C19 steroid androstenedione in adipocytes) might also favor
tumor growth through the interaction with the estrogen receptor of nearby tumor
48
EDV019045.indd 48
Dirat · Bochet · Escourrou · Valet · Muller
2/17/2010 11:18:00 PM
cells, a point that has been extensively reviewed in the literature [for review, see 20].
In obesity, the normal balance of these adipose tissue secretory proteins is affected
both positively (leptin) and negatively (adiponectin). According to the preclinical evidence demonstrating their ability to modulate breast cancer cell behavior,
they represent a good candidate to explain the poorer prognosis of breast cancer
in obese patients, although their local secretion in breast tumors remains poorly
characterized [21]. However, all these studies through their use of ‘naive’ adipocyte-conditioned medium or the use of recombinant proteins (e.g. leptin or adiponectin) precludes that the mature adipocytes remain relatively inert in response
to the nearby tumor cells. It has been demonstrated that cancer cells usually go
about generating a supportive microenvironment by modifying the phenotype
of surrounding normal cells. For example, it has been demonstrated that cancer
cells modify the phenotype of fibroblasts that acquire traits of wounded fibroblasts
(including the expression of a smooth cell actin) [22], that are therefore named
carcinoma-associated fibroblasts, supporting the idea that cancer is a ‘wound
that never heals’ [13]. In accordance with this concept of a constant bidirectional
crosstalk between cancer and stroma cells, we therefore propose that tumor-surrounding adipocytes also exhibit profound phenotypic changes. A first argument
in favor of this hypothesis came from the laboratory of Marie-Christine Rio [23]
showing that in vivo invasive cancer cells induce in adjacent adipocytes the expression of stromelysin-3 (also named metalloprotease 11, MMP-11), a potent inhibitor of adipocyte differentiation. We recently set up in the laboratory an original
co-culture model between breast tumor cells and adipocytes. Our results show
that tumor cells promote extensive phenotypic changes in adipocytes leading to
an ‘activated’ phenotype, that in turns promote the occurrence of metastatic traits
in cancer cells [Dirat et al., in preparation]. Therefore, these preliminary results
demonstrate that cancer cells might force adipocytes to express a new subset of
molecules that are not expressed by adipocytes in normal conditions, and that
like cancer-associated fibroblasts, cancer-associated adipocytes (CAA) are present
within a tumor with specific features that remain to be extensively characterized.
A detailed proteomic analysis of the proteins secreted in breast adipose tissue collected from tumorectomy of estrogen receptor-negative, high-grade tumors present in premenopausal women showed that numerous hormones, cytokines and
growth factors are present within this tissue [24]. Comparison with adipose tissue
of normal breast will clearly offer the opportunity to characterize the molecular
circuitry between adipocytes and epithelial cells. In addition, this crosstalk might
also affect less differentiated cells as well as mature adipocytes. For example, it
has been demonstrated that conditioned media from breast cancer cells inhibited the differentiation of pre-adipocytes into mature adipocytes in favor of the
accumulation of pre-adipocyte cells into the cancer tissue [25]. Characterization
of the molecular circuitry between CAA and the epithelial component might help
Tumor-Surrounding Adipocytes in Breast Cancer Progression
EDV019045.indd 49
49
2/17/2010 11:18:01 PM
CXCL1 mRNA expression
(arbitrary units)
150
100
50
0
VAT
SAT
MAT
Fig. 2. Chemokine CXCL-1 is not expressed in mammary adipose tissue. Expression of CXCL-1
was measured by qPCR on subcutaneous adipose tissue (SAT). Visceral adipose tissue (VAT) was
obtained from healthy donors (5 and 9 respectively) with BMI ≤25. Mammary adipose tissue
(MAT) was obtained from reduction mammoplasty performed in 12 healthy women exhibiting
normal (≤25) BMI. Results are expressed as mean ± SD (in arbitrary units).
to identify attractive targets in cancer therapy since drugs aimed at stromal adipocyte signals and effector functions may prove complementary to conventional
treatments targeting the overt cancer cells in breast tumors.
Consequences for the Poor Prognosis Observed for Breast Cancer in Obese
Patients: Some Answers, Many Questions
Although not demonstrated experimentally, one might reasonably speculate that
the positive contribution of these CAA into tumor progression might be amplified
in obese women, therefore explaining in part the poor prognosis observed in this
subset of patients. Accumulating evidence in recent years has demonstrated that
obesity is associated with a low-grade inflammation of white adipose tissue which
can subsequently lead to insulin resistance, impaired glucose tolerance and even
diabetes [9]. The increased production and secretion of a wide range of inflammatory molecules, including TNF-α and interleukin-6, by adipocytes (but also by
infiltrating macrophages which may be a major source of locally produced proinflammatory cytokines) seen in white adipose tissue from obese patients might
have a profound effect on tumor progression, especially if this inflammatory
response is amplified in the cancer tissue [2]. Concerning adipose breast tissue,
characterization of its pattern of secretion is clearly needed in both lean and obese
patients since it is poorly defined as compared to other fat cell depots. Preliminary
experiments performed in our laboratory in fact suggest that striking differences
might be observed. For example, as seen in figure 2, whereas the proangiogenic
chemokine CXCL-1 is expressed in deep and subcutaneous adipose tissue, its
50
EDV019045.indd 50
Dirat · Bochet · Escourrou · Valet · Muller
2/17/2010 11:18:01 PM
expression is absent from mammary adipose tissue, clearly demonstrating that
specific studies should be performed. If, as we believe, the tumor characteristics
are modified during the early steps of tumor progression (e.g. early acquisitions
of metastatic traits) in a context of obesity, weight loss after breast cancer diagnosis might have a limited impact on prognosis, this latter point remaining largely
debated in the literature [26]. Obesity also affects the prognosis of prostate tumors
with the occurrence of more aggressive disease [2]. The expected striking increase
in the incidence of these aggressive cancers in the near future related to obesity
turns the knowledge of this field of great impact as it is needed for the development of strategies to prevent and treat this disease.
Acknowledgements
Studies performed in our laboratories were supported by the French National Cancer Institute
(INCA PL 2006–035 to G.E., P.V. and C.M.), the ‘Ligue Régionale contre le Cancer’ (Comité du
Lot et Haute-Garonne to C.M.) and the University of Toulouse (AO CS 2009 to C.M.).
References
1 Yach D, Stuckler D, Brownell KD: Epidemiologic
and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes. Nat Med 2006;12: 62.
2 Calle EE, Kaaks R: Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed
mechanisms. Nat Rev Cancer 2004;4:579.
3 Carmichael AR: Obesity and prognosis of breast
cancer. Obes Rev 2006;7:333.
4 Stephenson GD, Rose DP: Breast cancer and obesity: an update. Nutr Cancer 2003;45:1.
5 Feigelson HS, Patel AV, Teras LR, Gansler T, Thun
MJ, Calle EE: Adult weight gain and histopathologic characteristics of breast cancer among postmenopausal women. Cancer 2006;107:12.
6 Berclaz G, Li S, Price KN, Coates AS, CastiglioneGertsch M, Rudenstam, CM, Holmberg SB,
Lindtner J, Erien D, Collins J, Snyder R, Thurlimann B, Fey, MF, Mendiola C, Werner ID, Simoncini E, Crivellari D, Gelber D, Goldhirsch A:
Body mass index as a prognostic feature in operable breast cancer: the International Breast Cancer Study Group experience. Ann Oncol 2004;15:
875.
7 Daniell HW, Tam E, Filice A: Larger axillary
metastases in obese women and smokers with
breast cancer – an influence by host factors on
early tumor behavior. Breast Cancer Res Treat
1993;25:193.
8 Daling JR, Malone KE, Doody DR, Johnson LG,
Gralow JR, Porter PL: Relation of body mass
index to tumor markers and survival among
young women with invasive ductal breast carcinoma. Cancer 2001;92:720.
9 Rajala MW, Scherer PE: The adipocyte – at the
crossroads of energy homeostasis, inflammation,
and atherosclerosis. Endocrinology 2003;144:
3765.
10 Chavey C, Boucher J, Monthouel-Kartmann MN,
Sage EH, Castan-Laurell I, Valet P, Tartare-Deckert S, Van Obberghen E: Regulation of secreted
protein acidic and rich in cysteine during adipose
conversion and adipose tissue hyperplasia. Obesity (Silver Spring) 2006;14:1890.
11 Boucher J, Castan-Laurell I, Daviaud D, Guigne
C, Buleon M, Carpene C, Saulnier-Blache JS,
Valet P: Adipokine expression profile in adipocytes of different mouse models of obesity. Horm
Metab Res 2005;37:761.
12 Vona-Davis L, Rose DP: Adipokines as endocrine,
paracrine, and autocrine factors in breast cancer
risk and progression. Endocr Relat Cancer 2007;
14:189.
13 Mueller MM, Fusenig NE: Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat
Rev Cancer 2004;4:839.
Tumor-Surrounding Adipocytes in Breast Cancer Progression
EDV019045.indd 51
51
2/17/2010 11:18:01 PM
14 Naumov GN, Akslen LA, Folkman J: Role of
angiogenesis in human tumor dormancy: animal
models of the angiogenic switch. Cell Cycle 2006;
5:1779.
15 Bissell MJ, Labarge MA: Context, tissue plasticity,
and cancer: are tumor stem cells also regulated by
the microenvironment? Cancer Cell 2005;7:17.
16 Wiseman BS, Werb Z: Stromal effects on mammary gland development and breast cancer. Science 2002;296:1046.
17 Manabe Y, Toda S, Miyazaki K, Sugihara H:
Mature adipocytes, but not preadipocytes, promote the growth of breast carcinoma cells in collagen gel matrix culture through cancer-stromal
cell interactions. J Pathol 2003;201:221.
18 Iyengar P, Combs TP, Shah SJ, Gouon-Evans V,
Pollard JW, Albanese C, Flanagan L, Tenniswood
MP, Guha C, Lisanti MP, Pestell RG, Scherer PE:
Adipocyte-secreted factors synergistically promote mammary tumorigenesis through induction
of anti-apoptotic transcriptional programs and
proto-oncogene stabilization. Oncogene 2003;22:
6408.
19 Iyengar P, Espina V, Williams TW, Lin Y, Berry D,
Jelicks LA, Lee H, Temple K, Graves R, Pollard J,
Chopra N, Russell RG, Sasisekharan R, Trock BJ,
Lippman M, Calvert VS, Petricoin EF 3rd, Liotta
L, Dadachova E, Pestell RG, Lisanti, MP, Bonaldo
P, Scherer PE: Adipocyte-derived collagen VI
affects early mammary tumor progression in vivo,
demonstrating a critical interaction in the tumor/
stroma microenvironment. J Clin Invest 2005;115:
1163.
20 Cleary MP, Grossmann ME: Minireview: Obesity
and breast cancer: the estrogen connection. Endocrinology 2009;150:2537.
21 Hede K: Fat may fuel breast cancer growth. J Natl
Cancer Inst 2008;100:298.
22 Haviv I, Polyak K, Qiu W, Hu M, Campbell I: Origin of carcinoma-associated fibroblasts. Cell Cycle
2008;8:589.
23 Andarawewa KL, Motrescu ER, Chenard MP,
Gansmuller A, Stoll I, Tomasetto, C, Rio MC:
Stromelysin-3 is a potent negative regulator of
adipogenesis participating to cancer cell-adipocyte interaction/crosstalk at the tumor invasive
front. Cancer Res 2005;65:10862.
24 Celis JE, Moreira JM, Cabezon T, Gromov P, Friis
E, Rank F, Gromova I: Identification of extracellular and intracellular signaling components of
the mammary adipose tissue and its interstitial
fluid in high-risk breast cancer patients: toward
dissecting the molecular circuitry of epithelialadipocyte stromal cell interactions. Mol Cell Proteomics 2005;4:492.
25 Meng L, Zhou J, Sasano H, Suzuki T, Zeitoun KM,
Bulun SE: Tumor necrosis factor-α and interleukin-11 secreted by malignant breast epithelial
cells inhibit adipocyte differentiation by selectively down-regulating CCAAT/enhancer binding protein-α and peroxisome proliferator-activated
receptor-γ: mechanism of desmoplastic reaction.
Cancer Res 2001;61:2250.
26 Griggs JJ, Sabel MS: Obesity and cancer treatment: weighing the evidence. J Clin Oncol 2008;
26, 4060.
Prof. Catherine Muller
IPBS CNRS UMR 5089, Université de Toulouse
205, route de Narbonne, FR–31077 Toulouse Cedex (France)
Tel. +33 5161 17 59 32, Fax +33 561 17 59 33
E-Mail [email protected]
52
EDV019045.indd 52
Dirat · Bochet · Escourrou · Valet · Muller
2/17/2010 11:18:01 PM
RESULTATS
65
66
1. Les adipocytes associés au cancer (CAAs) participent à la progression
tumorale.
Au sein du stroma, le dialogue paracrine que les cellules tumorales établissent avec les fibroblastes
ou avec les macrophages a été bien caractérisé et de nombreux travaux ont montré qu’il était associé
à des modifications drastiques des cellules stromales (morphologiquement et fonctionnellement),
ainsi qu’à une augmentation de la progression tumorale.
Parmi les cellules du microenvironnement tumoral, les adipocytes ont été très peu considérés. Des
adipokines ont pourtant été impliquées dans la progression tumorale, grâce à l’utilisation de
protéines recombinantes ou de milieu conditionné d’adipocytes (Schaffler et al., 2007) (Park et al.,
2011). Cependant, le dialogue entre les adipocytes et les cellules tumorales n’a été mis en évidence
que dans une seule étude publiée par le groupe du Pr. Marie-Christine Rio (Andarawewa et al.,
2005), centrée sur le rôle de la MMP-11. Ce groupe a montré une augmentation de la MMP-11 dans
les adipocytes péri-tumoraux.
A partir de ces travaux, le Pr Catherine Muller et le Pr Philippe Valet ont combiné leur expertise en
cancérologie et en secrétions adipocytaires afin d’élaborer un projet commun concernant le rôle des
adipocytes dans la progression tumorale. Lorsque je suis arrivée au laboratoire en 2008, j’ai pu
contribuer à cette étude, débutée par Béatrice Dirat, dont le but était de caractériser l’interaction
paracrine entre les adipocytes et les cellules tumorales mammaires, d’une part en déterminant
l’influence des adipocytes péri-tumoraux sur la progression tumorale, et d’autre part en
caractérisant leur phénotype.
Pour cela nous avons utilisé un système de co-culture en 2D, dans lequel les adipocytes et les
cellules cancéreuses sont séparés par un insert permettant la diffusion des facteurs solubles. Nos
résultats indiquent que les cellules tumorales co-cultivées avec des adipocytes présentent des
capacités d'invasion accrues in vitro et in vivo (métastases obtenues après injection des cellules
cancéreuses préalablement co-cultivées par voie veineuse chez la souris). De plus, les adipocytes
cultivés en présence de cellules cancéreuses présentent de profondes modifications associant une
délipidation et une diminution des marqueurs adipocytaires. Ces adipocytes ont un phénotype
« activé » marqué par une surexpression de protéases dont la MMP-11 et de cytokines proinflammatoires (IL-6, IL-1β).
Ainsi, nous avons mis en évidence l’existence d’un dialogue bidirectionnel entre les cellules
tumorales et les adipocytes. Ces derniers présentent un phénotype activé (nous les avons
appelé Cancer- Associated Adipocytes ou CAAs) favorisant la progression tumorale. Ce travail
a fait l’objet d’une publication dans le journal Cancer Research.
67
68
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Cancer-Associated Adipocytes Exhibit an Activated
Phenotype and Contribute to Breast Cancer Invasion
Béatrice Dirat, Ludivine Bochet, Marta Dabek, et al.
Cancer Res 2011;71:2455-2465. Published online March 31, 2011.
Updated Version
Supplementary
Material
Cited Articles
E-mail alerts
Reprints and
Subscriptions
Permissions
Access the most recent version of this article at:
doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Access the most recent supplemental material at:
http://cancerres.aacrjournals.org/content/suppl/2011/03/25/71.7.2455.DC1.html
This article cites 37 articles, 8 of which you can access for free at:
http://cancerres.aacrjournals.org/content/71/7/2455.full.html#ref-list-1
Sign up to receive free email-alerts related to this article or journal.
To order reprints of this article or to subscribe to the journal, contact the AACR
Publications Department at [email protected].
To request permission to re-use all or part of this article, contact the AACR Publications
Department at [email protected].
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Cancer
Research
Microenvironment and Immunology
Cancer-Associated Adipocytes Exhibit an Activated
Phenotype and Contribute to Breast Cancer Invasion
atrice Dirat1,2,3, Ludivine Bochet1,2,3, Marta Dabek1,2, Danie
le Daviaud1,3, Ste
phanie Dauvillier1,2,
Be
Bilal Majed6, Yuan Yuan Wang1,2,3, Aline Meulle1,2,3, Bernard Salles1,2,
Sophie Le Gonidec1,3, Ignacio Garrido4, Ghislaine Escourrou5, Philippe Valet1,3, and
Catherine Muller1,2
Abstract
Early local tumor invasion in breast cancer results in a likely encounter between cancer cells and mature
adipocytes, but the role of these fat cells in tumor progression remains unclear. We show that murine and human
tumor cells cocultivated with mature adipocytes exhibit increased invasive capacities in vitro and in vivo, using
an original two-dimensional coculture system. Likewise, adipocytes cultivated with cancer cells also exhibit an
altered phenotype in terms of delipidation and decreased adipocyte markers associated with the occurrence of
an activated state characterized by overexpression of proteases, including matrix metalloproteinase-11, and
proinflammatory cytokines [interleukin (IL)-6, IL-1b]. In the case of IL-6, we show that it plays a key role in the
acquired proinvasive effect by tumor cells. Equally important, we confirm the presence of these modified
adipocytes in human breast tumors by immunohistochemistry and quantitative PCR. Interestingly, the tumors
of larger size and/or with lymph nodes involvement exhibit the higher levels of IL-6 in tumor surrounding
adipocytes. Collectively, all our data provide in vitro and in vivo evidence that (i) invasive cancer cells
dramatically impact surrounding adipocytes; (ii) peritumoral adipocytes exhibit a modified phenotype and
specific biological features sufficient to be named cancer-associated adipocytes (CAA); and (iii) CAAs modify the
cancer cell characteristics/phenotype leading to a more aggressive behavior. Our results strongly support the
innovative concept that adipocytes participate in a highly complex vicious cycle orchestrated by cancer cells to
promote tumor progression that might be amplified in obese patients. Cancer Res; 71(7); 2455–65. 2011 AACR.
Introduction
Cells that compose the tumor stroma are associated, if not
obligate, partners in tumor progression (1–3). In breast cancer, stromal cells include resident adipocytes and fibroblasts, a
wide range of recruited hematopoietic cells, and newly formed
blood vessels with their associated cells (3). Dynamic and
reciprocal communication between epithelial and stromal
compartments occurs during breast cancer progression
de Toulouse; 2CNRS (Centre National de
Authors' Affiliations: 1Universite
la Recherche Scientifique), Institut de Pharmacologie et de Biologie
et de la Recherche me
dicale,
Structurale; 3Institut National de la Sante
partement de Chirurgie Oncologique, Institut ClauINSERM U1048; 4De
5
dius Regaud; and Service d’Anatomo-Pathologie, Hôpital de Rangueil,
partement de Biostatistiques, Institut Curie,
Toulouse, France; and 6De
d'Epide
miologie et de Recherche Clinique, Hôpital
Paris, France et Unite
d'Arras, Arras, France
Note: Supplementary data for this article are available at Cancer Research
Online (http://cancerres.aacrjournals.org/).
Corresponding Author: Catherine Muller, Institut de Pharmacologie et de
Biologie Structurale, 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex,
Toulouse, France. Phone: 33-561-17-59-32; Fax: 33-561-17-59-94;
E-mail: [email protected]
doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
2011 American Association for Cancer Research.
(1, 2). Cancer cells usually go about generating a supportive
microenvironment by activating the wound-healing response
of the host (4). Conversely, the stromal cells, such as cancerassociated fibroblasts or tumor-associated macrophages, promote tumor progression by secreting growth factors, chemokines, and promigratory extracellular matrix components (2).
To date, most of the studies focused on cancer cell–mesenchymal cell interactions have emphasized the contribution of
fibroblasts, endothelial, and inflammatory cells (1). Little
attention has been given to the mature adipocytes despite
the fact that in breast cancers, early local tumor invasion
results in immediate proximity of cancer cells to adipocytes
(3). Until recently, adipocytes were mainly considered as an
energy storage depot, but there are now clear evidences
pointing adipocytes as endocrine cells producing hormones,
growth factors, cytokines, and other molecules named adipokines (5). Therefore, mature adipocytes represent excellent
candidates to influence tumor behavior through heterotypic
signaling processes.
Adipokines, such as leptin, adiponectin (APN), hepatocyte
growth factor, or collagen VI, stimulate the growth and
survival of breast tumor cells even in estrogen-negative cells
(6, 7). Moreover, it has been shown that metalloproteinase
(MMP)-11/stromelysin-3 is induced in adipose tissue by cancer cells as they invade their surrounding environment (8).
www.aacrjournals.org
2455
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Dirat et al.
Obesity, wherein the normal balance of adipose tissue secretory proteins is disturbed, has been recently identified as a
negative prognosis factor for breast cancer (9, 10). This poor
prognosis seems to be independent of menopausal status,
tumor stage, and tumor hormone–binding characteristics (for
review, see refs. 11–13). Several studies pointed out that obese
women exhibit at diagnosis an increase in lymph nodes
involvement and a higher propensity to distant metastasis
(10, 11, 14–17). Furthermore, obesity is also associated with
the occurrence of tumors of high grade with increased local
and distant invasion in prostate cancer (18). Taken together,
these compelling observations suggest that excess adiposity
may favor tumor invasiveness by yet uncharacterized mechanism(s). We show here that tumor-surrounding adipocytes
exhibit profound phenotypic changes in vitro and in human
tumors, and these modified adipocytes promote tumor cell
invasion and metastasis.
Materials and Methods
Cell culture
The murine 3T3-F442A preadipocyte cell line was differentiated as described previously (19). To estimate the adipocyte phenotype, triglyceride (TG) content was quantified using
a colorimetric kit (Wako Chemicals), and red oil staining was
carried out as previously described (20). The human breast
cancer cell line ZR 75.1 (provided by Prof. K. Bystricky,
Laboratoire de Biologie Moleculaire Eucaryote, Toulouse,
France) and the murine 67NR and 4T1 breast cancer cell lines
(ref. 21; provided by Dr. S. Vagner, INSERM U563, Toulouse,
France) were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium
supplemented with 10% (ZR 75.1 and 67NR) and 5% (4T1) fetal
calf serum (FCS). The human breast cancer cell line
SUM159PT (provided by Dr. J Piette, IGMM, Montpellier,
France) was grown in Ham F12 (50:50) medium complemented with 5% FCS, 1 mg/mL hydrocortisone (Sigma), and 0.2 UI/
mL insulin. All the cell lines were used within 2 months after
resuscitation of frozen aliquots. Cell lines were authenticated
on the basis of viability, recovery, growth, and morphology.
For ZR 75.1 and SUM159PT cell lines, the expression status of
estrogen receptor (ER) a, E-cadherin, N-cadherin, and vimentin was confirmed by immunoblotting before they were used
in the experiments (22). For all cell lines, their invasive
behavior was confirmed using Boyden chamber assays before
they were used in the experiments. Cell lines 67NR and 4T1
were also tested for their ability to form (4T1) or not (67NR)
metastatic tumors when injected in syngenic BALB/c mice
(21).
Human samples
Breast adipose tissue samples were collected from
reduction mammoplasty (RM) or tumorectomy (TU),
according to the guidelines of the Ethical Committee of
Toulouse-Rangueil. All subjects gave their informed consent to participate in the study, and investigations were
conducted in accordance with the Declaration of Helsinki
as revised in 2000. In cases of TU, the fat tissue samples
obtained were immediately close to the tumor mass and
2456
were devoid of fibrosis, as assessed macroscopically (data
not shown). Adipose tissue pieces were immediately used
for collagenase digestion as previously described (23) and
centrifuged (20 minutes, room temperature, 1,000 rpm) to
separate adipocytes from the stroma vascular fraction
(pellet, SVF).
Coculture and invasion assays
Tumor cells and adipocytes were cocultured using a Transwell culture system (0.4-mm pore size; Millipore). A total of 5 104 (67NR), 1.5 105 (SUM159PT, 4T1), or 3 105 (ZR 75.1)
cells were seeded in the top chamber of the Transwell system
in the culture medium of adipocytes and cocultivated with or
without mature adipocytes in the bottom chamber for the
indicated times. Adipocytes or tumor cells cultivated alone in
similar conditions served as controls. To evaluate the effect of
adipocyte-conditioned medium (Ad-CM) on tumor cell invasion, mature adipocytes were cultivated overnight with
serum-free medium containing 1% of delipidated bovine
serum albumin (Sigma) and medium was collected. CM
was also collected from adipocytes previously cocultivated
during 3 days with tumor cells [cancer-associated adipocytes
conditioned medium (CAA-CM)]. After 3 days of coculture in
the presence of mature adipocytes, Ad-CM, or CAA-CM (complemented with 10% FCS), tumor cells were used to conduct
Matrigel invasion assays as previously described (24). A total
of 35 to 40 fields per filter were counted using an optical
microscope. Invasion assays were also conducted with tumor
cells previously cultivated for 3 days with recombinant human
IL-6 (PeproTech).
Western blot analysis
Whole cell extracts and immunoblots were prepared as
previously described (25). All the antibodies used in our study
are presented in Supplementary Information.
Tail vein metastasis assays
A total of 1 106 4T1 cells, previously cocultivated either
with or without mature adipocytes for 4 days, were injected
intravenously in BALB/c mice (6 animals per condition). Mice
were sacrificed after 14 days, and lungs were taken for
analyses. Nodules were scored from 1 to 5 according to their
likelihood to represent metastasis to lung (0, normal lung
tissue; 1, tissue with 1–5 nodules; 2, 6–10 nodules; 3, 11–20
nodules; 4, 21–30 nodules; and 5, >31 nodules). Lungs were
then fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin.
Sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E) and
nodules were observed. The mean number of nodules per lung
area and the mean nodule area as a function of lung area (that
defined the nodule area index) were measured by ImageJ
software program. The local Institutional Animal Care and
Use Committee approved the experimental protocols
described in the study.
Immunofluorescence, immunohistochemistry, and
determination of adipokines secretion
Immunofluorescence and immunohistochemistry were carried out as previously described (8, 24). Concentration of
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
Cancer Research
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Key Role of Mature Adipocytes in Breast Cancer Progression
secreted factors in supernatants was determined using the
xMAP Technology (Luminex), with a Milliplex kit (Millipore).
RNA extraction and quantitative PCR
Gene expression was analyzed using real-time PCR as
described previously (23). The sequences of the primers are
presented in Supplementary Information.
Statistical methods
Quantitative expression of biological markers measured by
quantitative PCR (qPCR) in isolated human adipocytes was
assessed using estimations of means and SDs. Hence, a normal
distribution of these measures was assumed. However, the
size of subpopulations was limited in most cases. Thus, we
tested differences about the expression of biological markers
between subpopulations of interest, using nonparametric
tests (i.e., Wilcoxon's nonparametric rank test). Quartiles were
also computed; box plots permitted to appreciate the presence
of outliers and to illustrate differences in the expression of
biological markers. The threshold of statistical significance
was fixed at alpha risk at 5%. SPlus statistical software was
used for the data analysis (26). For the in vitro experiments, the
statistical significance of differences between the means (at
least 3 independent experiments) was evaluated using
Student's t test, done using Prism (GraphPad Inc.). The values
of *P 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 were deemed as
significant whereas "NS" stands for not significant.
Results and Discussion
Tumor cells cocultivated with mature adipocytes
exhibit an enhanced invasive phenotype
Human cancer cells with low (ZR 75.1) or high (SUM159PT)
invasive capacities (27) were grown for 3 days on Transwells,
allowing the diffusion of soluble factors, in the presence or
absence of murine mature adipocytes (28). After 3 days, tumor
cells were trypsinized and Matrigel invasion assays were
conducted in a medium containing either 0% or 10% FCS.
As shown in Figure 1A, the invasive capacity of ZR 75.1 tumor
cells in 10% FCS containing medium was increased by 3-fold in
cells previously cocultivated for 3 days with adipocytes as
compared with tumor cells grown alone (P < 0.01). No additional increase in the invasive capacity of ZR 75.1 was
observed when the time of coculture with adipocytes was
increased up to 5 days (data not shown). This effect was not
observed when tumor cells were cocultivated with preadipocytes (Supplementary Fig. S1A). Similar results were obtained
with the SUM159PT cell line, although to a lesser extent
(Fig. 1A, P < 0.05). Experiments were also carried out with
the mouse mammary cell line 4T1 and its nonmetastatic
sibling cell line 67NR (21). Coculture with adipocytes increases
both 67NR and 4T1 invasive capacities by 2-fold (Fig. 1B, P <
0.05 and 0.01, respectively). Therefore, mature adipocytes are
able to stimulate the invasive capacities of murine and human
breast cancer cell lines that are either positive (ZR 75.1) or
negative (SUM159PT, 67NR, 4T1) for the ER. In addition, the
proinvasive effect was independent from the tumor growth–
promoting effect because coculture with adipocytes has no
www.aacrjournals.org
effect on ZR 75.1 or murine tumor cell lines proliferation in
contrast to SUM159PT cells (Supplementary Fig. S1B). When
tumor cells were grown in the presence of CM obtained from
adipocytes, which have never been cocultivated with tumor
cells (Ad-CM), invasive capacities were not significantly
increased for any of cell lines (Fig. 1C). When CM was prepared
from adipocytes previously cocultivated with tumor cells
(CAA-CM), a significant stimulation of tumor invasive capacities was observed in all the tested models as compared with
cells grown in control medium (P < 0.05 for the 67NR cells, P <
0.01 for the ZR 75.1, SUM159PT, and 4T1 cells). These results
highlight that a cross-talk between the 2 cell populations is
necessary to obtain this effect (Fig. 1C).
Noncocultivated ZR 75.1 cells displayed a characteristic
epithelial morphology and form compacted colonies. Yet,
when these cells were cocultivated with adipocytes from 3
to 5 days, morphologic changes became apparent. Cells
formed less compacted colonies and exhibited a more scattered aspect. In addition, these cells displayed a downregulation of membrane E-cadherin expression, in association with
b-catenin redistribution, resulting into a disorganized state in
the cytoplasm (Fig. 2A). Decreased E-cadherin expression was
observed both at mRNA (Fig. 2B) and protein levels (Fig. 2C)
without an increased expression of mesenchymal markers
(Fig. 2B and C), suggesting the occurrence of an incomplete
epithelial-mesenchymal transition (EMT). For the SUM159PT
cell line, which has already undergone a complete EMT,
morphologic changes were also observed along with the
reorganization and polarization of vimentin (Fig. 2A) without
a change in its expression level (Fig. 2C).
Our coculture system shows that adipocytes stimulate the
invasiveness of tumor cells in vitro. To test the hypothesis that
"priming" tumor cells with adipocytes regulate tumor cell
distal organ seeding and growth, we conducted tail vein
metastasis assays, using the 4T1 cell line. 4T1 tumor cells
were cultured in vitro for 4 days in the presence or absence of
adipocytes, harvested, and injected intravenously into BALB/c
mice. As shown in Figure 3A, the number of lung metastases
was enhanced in mice injected with 4T1 cells previously
cocultivated with adipocytes as compared with mice injected
with 4T1 grown alone (P < 0.05). Histologic analysis (Fig. 3B)
confirmed that both the number and size of the nodules were
significantly increased in mice injected with adipocytes-cocultivated 4T1 compared with 4T1 cells grown alone (Fig. 3C and
D, P < 0.05 for the 2 parameters). Therefore, our results clearly
show that adipocytes promote the invasive phenotype of
breast tumor cells both in vitro and in vivo.
Cocultivated adipocytes exhibit extensive phenotypic
changes
Adipocytes have been shown to promote tumor survival
and growth in vitro and in vivo (6, 29), but their contribution
to tumor cell invasion is an emerging concept. Because our
results showed that a cross-talk between the 2 cell populations is necessary to observe the proinvasive effect (Fig. 1C),
we next examined the phenotype of cocultivated adipocytes.
As shown in Figure 4A (left), mature adipocytes cocultivated
with ZR 75.1 tumor cells exhibited a dramatic reduction in
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
2457
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Dirat et al.
Figure 1. Coculture of breast
tumor cells with mature
adipocytes stimulates their
invasive capacities. A, ZR 75.1
or SUM159PT cells were
cocultivated in the presence (C)
or absence (NC) of mature
adipocytes. After 3 days, tumor
cells were trypsinized and used
for Matrigel invasion assay in a
medium containing either 0%
(white bars) or 10% FCS (black
bars). B, similar experiments were
done with the 67NR and 4T1
murine cancer cells. A and B,
representative images of Matrigel
invasion assay conducted in a
medium containing 10% FCS are
shown below each graph. C,
indicated cells were cultivated
either in normal medium (control),
in CM obtained from adipocytes
(Ad-CM), or in CM obtained from
adipocytes previously grown in
the presence of tumor cells
(CAA-CM). After 3 days, tumor
cells were trypsinized and used
for Matrigel invasion assays in
a medium containing either 0%
(white bars) or 10% FCS (black
bars).
the number and size of lipid droplets that correlated with a
significant decrease in lipid accumulation (Fig. 4A, right, P <
0.05). These adipocytes lose several terminal differentiation
markers exemplified by the strong decrease in HSL (hormone-sensitive lipase), APN, resistin, and aP2 mRNA (ref. 5;
2458
Fig. 4B, P < 0.05 for all the markers), this loss was also
confirmed at protein levels for APN and resistin (Fig. 4C, P <
0.05). In cocultivated adipocytes, the level of C/EBPa was
dramatically reduced (P < 0.001) whereas that of PPARg was
not significantly decreased (Fig. 4B). As previously stated,
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
Cancer Research
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Key Role of Mature Adipocytes in Breast Cancer Progression
Figure 2. Cancer cells exhibit morphologic changes and incomplete EMT on coculture with adipocytes. A, ZR 75.1 or SUM159PT were grown on coverslips in
inserts, the lower wells cocultivated in the presence (C) or absence (NC) of mature adipocytes. After 3 or 5 days, cells were fixed and stained with the
indicated antibodies. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bars, 40 mmol/L. B, relative mRNA expression of N-cadherin and E-cadherin in indicated tumor
cell lines cocultivated in the presence (C) or absence (NC) of murine adipocytes for 5 days evaluated by qPCR. C, analysis of protein expression of the
indicated markers done by Western blots with extracts obtained from tumor cells cocultivated in the presence (C) or absence (NC) of adipocytes (5 days).
MMP-11/stromelysin-3 is induced in vivo in adipose tissue
by cancer cells as they invade their surrounding environment (8). Similarly, an upregulation for this protease was
noted in the cocultivated adipocytes, highlighting the in vivo
relevance of this coculture model (Fig. 4B, P < 0.001). In
contrast, the levels of MMP-9 (Fig. 4B) and MMP-2 (not
shown) remain unchanged whereas a significant increase
(10-fold) of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)
expression was found (Fig. 4B, P < 0.01). In cocultivated
adipocytes, a 5-fold increase in levels of IL-6, IL-1b, and TNFa was shown at mRNA levels (Fig. 4B, P < 0.001 for all
cytokines). At protein levels, however, only IL-6 and IL-1b
were found to be significantly higher in the supernatant of
cocultivated cells (Fig. 4C, P < 0.05 for both cytokines)
whereas the levels of TNF-a remained undetectable in both
conditions (data not shown). Of note, these extensive adipocyte phenotypic changes were obtained with other tumor
cells lines (Supplementary Fig. S2). Furthermore, these
results were confirmed with mammary adipocytes derived
www.aacrjournals.org
from ex vivo differentiation of progenitors purified from
mammary adipose tissue of healthy donors undergoing
RM (6 independent donors; Supplementary Fig. S3). Therefore, we extensively described tumor-induced changes in
adipocytes that are reproducibly displayed by both human
and mouse cocultivated adipocytes. Collectively, our observations clearly show that cocultivated adipocytes generally
exhibit a loss of lipid content, a decrease in late adipose
markers, and overexpression of inflammatory cytokines and
proteases. We named these cells "cancer associated adipocytes" (11).
CAAs are found in human tumors
We next investigate whether these cells are present in
primary human tumors. To address this critical issue, we first
conducted a histologic analysis of human breast tumors. As
exemplified in Figure 5A, we consistently observed at the
invasive front of human breast tumors the presence of adipocytes of smaller sizes with a dilated interstitial space, which
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
2459
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Dirat et al.
Figure 3. Coculture with adipocytes stimulates the metastatic potential of
4T1 cells in vivo. A, left, representative lungs harvested at necropsy after
tail vein injection of 4T1 cocultivated in the presence (C) or absence (NC) of
adipocytes during 4 days prior to injection. Right, metastatic score as
determined by macroscopic examination. B, left, H&E stained transverse
sections of host lungs from mice injected with 4T1 cells previously
cocultivated in the presence (C) or absence (NC) of adipocytes during
4 days (original magnification 40). Examples of invading lesions are
shown by arrows. Right, magnified views of invading lesions. C and D,
metastasis number obtained from mice injected with 4T1 cells, previously
cocultivated in the presence (C) or absence (NC) of adipocytes during
4 days, is expressed either as the average number of metastasis sites per
lung area (C) or as nodule area index (D) representing the average
metastasis area normalized by total lung area.
might be related to extensive extracellular matrix occurring in
tumor-surrounding adipocytes such as collagen VI overexpression (6). Further characterization of these CAAs was done
by immunohistochemistry. As shown in Figure 5B (i and ii), we
observed a decreased expression of the adipocyte marker APN
in CAAs as compared with normal mammary adipose tissue.
Although MMP-11 and IL-6 were not detected in mature
adipocytes of RM (Fig. 5B, iii and v, respectively), these
proteins were expressed within the rim of cytoplasm of the
2460
adipocytes located proximally to the invasive cancer cells
(Fig. 5B, iv and vi, respectively). To further assess the expression of these markers by a quantitative approach, adipocytes
were isolated from fat samples associated with TU or RM (23).
A series of 28 samples, with 14 samples in each group
(Supplementary Tables S1 and S2 for the clinical characteristics of the patients), was used comparable with respect to
age (mean: 51.8 7.3 vs. 60 13) and BMI (26.2 2.8 vs. 25.2
2.3). Adipocytes isolated from tumor samples overexpressed
MMP-11 (P ¼ 0.001), PAI-1 (P < 0.01), and IL-6 (P < 0.001), as
compared with adipocytes purified from normal mammary
gland, whereas the mRNA levels of IL-1b and TNF-a were not
statistically different (Fig. 5C). The adipose tissue also contains stromal cells (present in the SVF), such as fibroblasts,
endothelial cells, and adipocyte precursors. The levels of
expression of MMP-11, PAI-1, IL-6, IL-1b, and TNF-a remained
unchanged between normal and tumor-surrounding adipose
SVF, highlighting that the observed increase in proinflammatory molecules and proteases is an adipocyte-dedicated event
(Fig. 5C). Furthermore, when the expression levels of IL-6 in
adipocytes were analyzed as a function of tumor characteristics, we found that higher levels of this cytokine were
associated with the tumors of larger size and with lymph
nodes involvement (Fig. 5D). This correlation was not found
either for PAI-1 or for MMP-11 (Supplementary Fig. S4). Taken
together, these results show that CAAs are found in human
tumors.
Our data strongly support the concept that an intimate
cross-talk is established between cancer cells and mature
adipocytes at the invasive front of the tumor. Invading tumor
cells are able to modify adipocytes phenotype, which, in turn,
stimulate cancer cells aggressive behavior (30). The mechanism(s) responsible for the transition from mature adipocytes
to CAAs remain(s) unclear. Modification resembling to CAAs
is also observed in adipose tissue of tumor-bearing mice far
from the tumor site. In cachexia, adipocytes also exhibit
morphologic modification, decreased in adipogenic transcription factors such as C/EBPa and late differentiation markers
such as leptin (31). However, during cancer cachexia, adipocytes exhibit a decrease in resistin expression and upregulation of lipolytic enzymes such as HSL or ATGL (adipose
triglyceride lipase) (31), events not found in CAAs (Fig. 4
and Supplementary Fig. S5), alluding to their unique phentotype. Several molecules expressed by tumor cells have been
described as strong suppressors of adipogenesis such as IL-1b,
TNF-a, or even IL-6 (32), representing one mechanism by
which tumor cells might directly influence adipocyte behavior.
An alternative mechanism might be adipocytes themselves as
the source of autocrine signals that induce the CAAs phenotype. In favor of the latter hypothesis, we showed that tumor
CM was not able to reproduce CAAs phenotype, suggesting
that either adipocyte factors or inducible factors in tumor cells
are necessary to observe this effect (Supplementary Fig. S6).
Adipocyte IL-6 plays a key role in mediating adipocytedependent invasive activity of tumor cells
Our results show that IL-6 is overexpressed in tumorsurrounding adipocytes both in vitro and in vivo. We showed
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
Cancer Research
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Key Role of Mature Adipocytes in Breast Cancer Progression
Figure 4. Adipocytes cocultivated
with breast tumor cells undergo
extensive phenotypic changes. A,
left, mature murine adipocytes
cocultivated in the presence (C) or
absence (NC) of ZR 75.1 tumor
cells were stained with red oil.
Right, the TG content was dosed
in adipocytes. B, adipocytes were
cocultivated in the presence (C) or
absence (NC) of ZR 75.1 tumor
cells. After 3 days, mRNAs were
extracted and expression of the
indicated genes was analyzed by
qPCR. C, dosage of the indicated
murine secreted factors in the
supernatants of adipocytes grown
alone (NC) or in the presence of
breast tumor cells (C).
that IL-6 (at 10 ng/mL, a dose equivalent to the levels
secreted by CAAs, Fig. 4C) significantly increased the invasive capacities in ZR 75.1 and 67NR cells (Fig. 6A, P < 0.01 for
the 2 cell lines). As compared with untreated cells, the
epithelial-like ZR 75.1 cells exposed to IL-6 form less compacted colonies and exhibit a more scattered aspect
(Fig. 6B). A downregulation of membrane E-cadherin expres-
www.aacrjournals.org
sion resulting into a disorganized state in the cytoplasm, in
association with b-catenin redistribution (Fig. 6B), was
observed in treated cells in accordance with the literature
(33–35). Strikingly, when ZR 75.1 cells were cocultivated with
adipocytes in the presence of murine IL-6 blocking antibody,
the adipocyte proinvasive effect was significantly decreased
(Fig. 6C, P < 0.01). mIL-6 blocking antibody specifically
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
2461
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Dirat et al.
Figure 5. CAAs from human
breast tumor exhibit extensive
phenotypic changes in
accordance with the in vitro
coculture assays. A, top,
histologic examination of an
invasive breast tumor after H&E
staining (original magnification 200). Ad, adipose tissue; IF,
invasive front; C, tumor center.
Bottom, histologic magnification
of the invasive front of the tumor.
Note that the number and the size
of adipocytes were reduced
(adipocytes of smaller size are
indicated by arrows). B, the
expression of APN (i and ii), MMP11 (iii and iv), and IL-6 (v and vi)
was visualized (in brown) in
adipocytes (lipids in white,
nucleus in blue) located adjacent
to invading cancer cells (right) as
compared with normal adipose
tissue (left). Arrows indicate the
expression of proteins of interest
within the rim of cytoplasm of
adipocytes. C, top, the expression
of the indicated genes was
analyzed by qPCR in mature
adipocytes obtained from RM or
TU (14 independent samples per
group). Bottom, similar
experiments were done with the
SVF of the samples. D, the
expression of IL-6 was measured
as a function of tumor
characteristics. G, grade; IDC,
invasive ductal carcinoma; ILC,
invasive lobular carcinoma; N,
lymph node involvement.
inhibits the proinvasive effect of CAA-CM in both 67NR and
4T1 models and had no effect on the invasive capacities of
cells grown in control medium (Fig. 6D, P < 0.01 and P < 0.05,
respectively). Altogether, these results indicate that IL-6
plays a key role in the CAAs proinvasive effects.
In breast cancer patients, the extent of the increase in
serum IL-6 correlates with poor disease outcome and reduced
prognosis (36). Recent evidence shows that fibroblast-derived
IL-6 supports breast tumor growth and metastasis (37). Our
results show that the stromal IL-6 is also produced by mature
adipocytes surrounding the tumors. The absence of IL-6
overexpression in the SVF of human adipose tissue isolated
2462
from breast tumor biopsies (Fig. 5C) apparently contradicts a
recent study conducted ex vivo, and not in vivo, using human
adipose tissue–derived stromal cells cocultivated with tumor
cells (38). Our results obtained in human tumors suggest that
within the cellular complexity of the adipose tissue, the crosstalk with tumor cells is rather established with mature, than
with precursors, adipose cells (Fig. 5C and D). In addition,
because mature adipocytes are the most abundant cells in the
breast tumor stroma (3), their cumulative secretion of IL-6
could therefore have profound impact on tumor progression.
Finally, this work paves the way for future clinical and
cellular studies aimed at determining the impact of this
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
Cancer Research
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Key Role of Mature Adipocytes in Breast Cancer Progression
Figure 6. IL-6 is involved in the
adipocyte-driven proinvasive
effect. A, ZR 75.1 and 67NR cells
were cultivated either alone (NT) or
in the presence of IL-6, and after 3
days, they were harvested to
conduct Matrigel assays in a
medium containing either 0 or
10% serum. B, similarly treated ZR
75.1 cells were fixed and stained
with the indicated antibodies.
Nuclei were labeled with TO-PRO3; scale bars, 40 mmol/L. C, ZR
75.1 were cocultivated for 3 days
in the presence (C) or absence
(NC) of murine adipocytes. As
indicated, blocking antibody
directed against murine IL-6
(aIL-6) or control antibody (IgG)
was added in the culture medium.
Tumor cells were then harvested
to conduct Matrigel invasion
assays in a medium containing
10% FCS. D, 67NR and 4T1 cells
were cultivated in normal medium
(control), normal medium
containing control
immunoglobulin (control þ IgG), or
blocking antibody directed
against murine IL-6 (control þ
aIL-6) conditioned medium
obtained from adipocytes
previously grown in the presence
of tumor cells (CAA-CM), CAA-CM
containing control (CAA-CM þ
IgG), or IL-6 blocking antibody
(CAA-CM þ aIL-6). After 3 days,
tumor cells were harvested to
conduct Matrigel invasion assay in
a medium containing either 0% or
10% FCS.
cross-talk in obesity conditions. Indeed, our results suggest
that the cross-talk between the CAAs and tumor components might be amplified in obesity in which the normal
balance of adipose tissue secretory proteins is disturbed.
www.aacrjournals.org
Obesity is related to a condition of low chronic inflammation
characterized by the abnormal production of inflammatory
cytokines involved in insulin resistance (5). Obesity and the
now-defined profile of CAAs share inflammation as common
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
2463
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Dirat et al.
traits, including overexpression of IL-6 with the noticeable
absence of overexpression of TNF-a in CAAs (Fig. 5). Interestingly, the association of high levels of IL-6 in CAAs with
high tumor size and enhanced local invasion reflects those
traits present in obese patients (10, 16, 17). Therefore, CAAs
within a context of obesity should be more prone to amplify
the negative cross-talk with tumor cells that we have identified and characterized in this study. This is a hypothesis
that remains to be shown in both murine and human
models. Such studies will provide unique opportunities to
set up specific strategies for the treatment of the subsets of
patients exhibiting aggressive diseases.
Disclosure of Potential Conflicts of Interest
No potential conflicts of interest were disclosed.
Acknowledgments
The authors thank Sandrine Imbert for her excellent technical assistance,
Sandra Gres for qPCR primer design, the Anexplo-Phenotypage platform,
IFR150, in Toulouse for Luminex analysis, and all our colleagues from I2MR
and IPBS for critical reading of the manuscript.
Grant Support
The "Canceropole Grand Sud-Ouest", INCA (P. Valet, C. Muller, and
G. Escourrou), the "Ligue Nationale Contre le Cancer (Comite "Midi-Pyrenees,
Gers et du Lot" to C. Muller), and the radioprotection Committee of EDF
(C. Muller) supported this work.
The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment
of page charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in
accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
Received September 10, 2010; revised January 13, 2011; accepted January 20,
2011; published online April 1, 2011.
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
2464
Mueller MM, Fusenig NE. Friends or foes—bipolar effects of the
tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer 2004;4:839–49.
Joyce JA, Pollard JW. Microenvironmental regulation of metastasis.
Nat Rev Cancer 2009;9:239–52.
Wiseman BS, Werb Z. Stromal effects on mammary gland development and breast cancer. Science 2002;296:1046–9.
Schafer M, Werner S. Cancer as an overhealing wound: an old
hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:628–38.
Rajala MW, Scherer PE. Minireview: The adipocyte—at the crossroads of energy homeostasis, inflammation, and atherosclerosis.
Endocrinology 2003;144:3765–73.
Iyengar P, Espina V, Williams TW, Lin Y, Berry D, Jelicks LA, et al.
Adipocyte-derived collagen VI affects early mammary tumor
progression in vivo, demonstrating a critical interaction in the
tumor/stroma microenvironment. J Clin Invest 2005;115:1163–
76.
Vona-Davis L, Rose DP. Adipokines as endocrine, paracrine, and
autocrine factors in breast cancer risk and progression. Endocr Relat
Cancer 2007;14:189–206.
Andarawewa KL, Motrescu ER, Chenard MP, Gansmuller A, Stoll I,
Tomasetto C, et al. Stromelysin-3 is a potent negative regulator of
adipogenesis participating to cancer cell-adipocyte interaction/
crosstalk at the tumor invasive front. Cancer Res 2005;65:10862–
71.
Calle EE, Kaaks R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological
evidence and proposed mechanisms. Nat Rev Cancer 2004;4:579–
91.
Majed B, Moreau T, Senouci K, Salmon RJ, Fourquet A, Asselain B. Is
obesity an independent prognosis factor in woman breast cancer?Breast Cancer Res Treat 2008;111:329–42.
Dirat B, Bochet L, Escourrou G, Valet P, Muller C. Unraveling the
obesity and breast cancer links: a role for cancer-associated
adipocytes? Endocr Dev 2010;19:45–52.
Carmichael AR. Obesity and prognosis of breast cancer. Obes Rev
2006;7:333–40.
Stephenson GD, Rose DP. Breast cancer and obesity: an update. Nutr
Cancer 2003;45:1–16.
Feigelson HS, Patel AV, Teras LR, Gansler T, Thun MJ, Calle EE. Adult
weight gain and histopathologic characteristics of breast cancer
among postmenopausal women. Cancer 2006;107:12–21.
Maehle BO, Tretli S, Skjaerven R, Thorsen T. Premorbid body weight
and its relations to primary tumour diameter in breast cancer patients;
its dependence on estrogen and progesteron receptor status. Breast
Cancer Res Treat 2001;68:159–69.
Berclaz G, Li S, Price KN, Coates AS, Castiglione-Gertsch M, Rudenstam CM, et al. Body mass index as a prognostic feature in operable
breast cancer: the International Breast Cancer Study Group experience. Ann Oncol 2004;15:875–84.
17. Daniell HW, Tam E, Filice A. Larger axillary metastases in obese
women and smokers with breast cancer—an influence by host
factors on early tumor behavior. Breast Cancer Res Treat 1993;
25:193–201.
18. Buschemeyer WC III, Freedland SJ. Obesity and prostate cancer:
epidemiology and clinical implications. Eur Urol 2007;52:331–43.
19. Meulle A, Salles B, Daviaud D, Valet P, Muller C. Positive regulation
of DNA double strand break repair activity during differentiation of
long life span cells: the example of adipogenesis. PLoS One 2008;3:
e3345.
20. Masson O, Chavey C, Dray C, Meulle A, Daviaud D, Quilliot D, et al.
LRP1 receptor controls adipogenesis and is up-regulated in human
and mouse obese adipose tissue. PLoS One 2009;4:e7422.
21. Aslakson CJ, Miller FR. Selective events in the metastatic process
defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations
of a mouse mammary tumor. Cancer Res 1992;52:1399–405.
22. Neve RM, Chin K, Fridlyand J, Yeh J, Baehner FL, Fevr T, et al. A
collection of breast cancer cell lines for the study of functionally
distinct cancer subtypes. Cancer Cell 2006;10:515–27.
23. Daviaud D, Boucher J, Gesta S, Dray C, Guigne C, Quilliot D, et al.
TNFalpha up-regulates apelin expression in human and mouse adipose tissue. FASEB J 2006;20:1528–30.
24. Monferran S, Paupert J, Dauvillier S, Salles B, Muller C. The membrane form of the DNA repair protein Ku interacts at the cell surface
with metalloproteinase 9. EMBO J 2004;23:3758–68.
25. Muller C, Monferran S, Gamp AC, Calsou P, Salles B. Inhibition of Ku
heterodimer DNA end binding activity during granulocytic differentiation of human promyelocytic cell lines. Oncogene 2001;20:4373–82.
26. Venables WN, Ripley BD. Modern Applied Statistics with S. 4th ed.
New York: Springer; 2002. p. xi, 495
27. Sommers CL, Byers SW, Thompson EW, Torri JA, Gelmann EP.
Differentiation state and invasiveness of human breast cancer cell
lines. Breast Cancer Res Treat 1994;31:325–35.
28. Green H, Kehinde O. Spontaneous heritable changes leading to
increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell 1976;7:105–13.
29. Elliott BE, Tam SP, Dexter D, Chen ZQ. Capacity of adipose tissue to
promote growth and metastasis of a murine mammary carcinoma:
effect of estrogen and progesterone. Int J Cancer 1992;51:416–24.
30. Motrescu ER, Rio MC. Cancer cells, adipocytes and matrix metalloproteinase 11: a vicious tumor progression cycle. Biol Chem
2008;389:1037–41.
31. Bing C, Trayhurn P. Regulation of adipose tissue metabolism in
cancer cachexia. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2008;11:201–7.
32. Harp JB. New insights into inhibitors of adipogenesis. Curr Opin
Lipidol 2004;15:303–7.
33. Sullivan NJ, Sasser AK, Axel AE, Vesuna F, Raman V, Ramirez N, et al.
Interleukin-6 induces an epithelial-mesenchymal transition phenotype
in human breast cancer cells. Oncogene 2009;28:2940–7.
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
Cancer Research
DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3323
Key Role of Mature Adipocytes in Breast Cancer Progression
34. Arihiro K, Oda H, Kaneko M, Inai K. Cytokines facilitate chemotactic
motility of breast carcinoma cells. Breast Cancer 2000;7:221–30.
35. Sansone P, Storci G, Tavolari S, Guarnieri T, Giovannini C, Taffurelli M,
et al. IL-6 triggers malignant features in mammospheres from human
ductal breast carcinoma and normal mammary gland. J Clin Invest
2007;117:3988–4002.
36. Knupfer H, Preiss R. Significance of interleukin-6 (IL-6) in breast
cancer [review]. Breast Cancer Res Treat 2007;102:129–35.
www.aacrjournals.org
37. Studebaker AW, Storci G, Werbeck JL, Sansone P, Sasser AK,
Tavolari S, et al. Fibroblasts isolated from common sites of breast
cancer metastasis enhance cancer cell growth rates and invasiveness in an interleukin-6-dependent manner. Cancer Res 2008;68:
9087–95.
38. Walter M, Liang S, Ghosh S, Hornsby PJ, Li R. Interleukin 6 secreted
from adipose stromal cells promotes migration and invasion of breast
cancer cells. Oncogene 2009;28:2745–55.
Cancer Res; 71(7) April 1, 2011
Downloaded from cancerres.aacrjournals.org on September 5, 2011
Copyright © 2011 American Association for Cancer Research
2465
Supplementary information
Antibodies. The rabbit polyclonal anti-vimentin, and anti-α tubulin (clone DM1A) mAbs were obtained from
Neomarkers. The rabbit polyclonal antibody directed against Hormone-Sensitive Lipase (HSL) is a kind gift of
Dr D. Langin (INSERM U858). The anti-β-catenin mAb (clone 14/beta-catenin) was from BD Biosciences. The
Anti-E-cadherin mAb (clone HECD-1) was from Calbiochem. The mAb directed against N-Cadherin (3B9) was
from Invitrogen as well as rhodamine-phalloidin used to detect polymerized actin. Anti-MMP-11 antibody (MAb
5ST-4A9) is a king gift of Dr MC Rio (IGBMC, Strasbourg, France). The mAb directed against human
adiponectin (HADI 773) was from Alexis biochemicals, and the goat antibody directed against human IL-6 used
in immunohistochemistry was from R&D. Neutralizing goat antibody directed against murine IL-6 was from
R&D and the IgG from goat serum used as a control was from Sigma. Secondary antibodies (for
immunofluorescence) were Goat anti-mouse or goat anti-rabbit IgG F(ab’)2 fragment AlexaFluor-488 conjugated
( obtained from Invitrogen). TO-PRO-3 was used as a final 1µM concentration and was from obtained from
Invitrogen.
Cell proliferation assay. Tumor cells (5 X 104 cells for SUM159PT or 67NR, 1.5 x 105 cells for 4T1 or 3 x 105
cells for ZR75.1 cells) were seeded in the upper chamber of the Transwell system in the culture medium of
adipocytes and were cocultivated or not with adipocytes for 3 days. After 3 days, tumor cells were trypsinized
and counted using a Mallassez counting chamber.
Immunofluorescence and confocal microscopy.
Cells seeded on glass coverslips were fixed with 3.7% paraformaldehyde (PFA) solution for 20 min at room
temperature. PFA was quenched with 50 mM NH4Cl and cells were permeabilized with PBS-0.2% TritonX-100
for 5 min. After blocking with PBS containing 10% FCS for 60 min, cells were incubated with primary antibody
in PBS-2% FCS for 2h. Cells were then washed three times with PBS-2% FCS and incubated with secondary
antibody and TO-PRO-3 for 30 min. Actin filaments were stained with rhodamin-phalloidin for 30 min. After
three washes with PBS, cells were mounted in Vectashield medium (Abcys). Fluorescence images were acquired
with a confocal laser microscopy system (Leica SP2). The image resolution was 512 x 512 pixels and scan rate
was 400 Hz. For each sample, over 100 cells were examined in at least three independent experiments.
RNA extraction and quantitative RT-PCR (qPCR). Total RNAs were extracted using the RNeasy mini kit
(Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Gene expression was analyzed using real time PCR as described previously
(Daviaud et al., 2006) . Total RNAs (1 µg) were reverse-transcribed for 60 min at 37 °C using Superscript II
reverse transcriptase (Invitrogen, Auckland, NZ) in the presence of a random hexamer. A minus reverse
transcriptase reaction was performed in parallel to ensure the absence of genomic DNA contamination. Real time
PCR was performed starting with 25 ng of cDNA and the indicated concentrations of both sense and antisense
primers (presented in Table S3) in a final volume of 25 µl using the SYBR Green TaqMan Universal PCR
master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fluorescence was monitored and analyzed in a GeneAmp
7300 detection system instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA). Analysis of 18S ribosomal RNA was
performed in parallel using the ribosomal RNA control TaqMan assay kit (Applied Biosystem), or HPRT RNA
1
(100 nM) or GAPDH RNA (100nM) to normalize gene expression, using geNorm Software. Analysis of hMMP11, hE-cadherin and hN-Cadherin gene expression was performed using a TaqMan assay kit (Applied
Biosystem). Analysis of oligonucleotide primers were designed using the Primer Express software (PerkinElmer
Life Sciences) as previously described (Daviaud et al., 2006).
Coculture, migration and invasion assays. For coculture with preadipocytes, 3x105 ZR 75.1 cells were seeded
in the upper chamber of the Transwell system (0.4µM pore size, Millipore) in the culture medium of
preadipocytes and were cocultivated or not for 3 days with preadipocytes (initially seeded at 6x104 cells/wells).
After three days, breast cancer cells were trypsinized and used for invasion assays (Monferran et al., 2004). In
certain experiments, ZR 75.1 cells were cocultivated with mammary adipocytes obtained from the ex vivo
differentiation of adipose progenitors present in the SVF fraction of normal mammary adipose tissue (see
below). To evaluate the effect of tumor-conditioned medium on adipocyte phenotype (SUM159PT-cm),
exponentially growing SUM159PT cells were incubated overnight in serum-free media in the presence of 0.5%
delipidated BSA. The culture medium was collected and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. After 3 days in
culture alone, in the presence of SUM159PT cells or SUM159PT-cm (complemented with 10 % serum), mRNA
were extracted from adipocytes to perform qPCR experiments.
Obtention of mammary adipocytes. Breast adipose tissue samples were collected from reduction
mammoplasty according to the guidelines of the Ethical Committee of Toulouse-Rangueil. All subjects gave
their informed consent to participate to the study, and investigations were performed in accordance with the
declaration of Helsinki as revised in 2000. Adipose tissue pieces were immediately used for collagenase
digestion as previously described (Daviaud et al., 2006) and centrifuged to separate adipocytes from the stromavascular fraction (pellet, SVF). The SVF fraction issued from mammoplasty reduction adipose tissue samples
was used for ex vivo differentiation as previously described (Bour et al., 2007). After 10 to 14 days of culture in
lipogenic medium, mammary adipocytes were used for coculture with tumor cells in the experimental conditions
described for murine adipocytes in the Material and Methods Section of the manuscript.
References
Bour, G., Lalevee, S., and Rochette-Egly, C. (2007). Protein kinases and the proteasome join in the
combinatorial control of transcription by nuclear retinoic acid receptors. Trends Cell Biol 17, 302-309.
Daviaud, D., Boucher, J., Gesta, S., Dray, C., Guigne, C., Quilliot, D., Ayav, A., Ziegler, O., Carpene, C.,
Saulnier-Blache, J. S., et al. (2006). TNFalpha up-regulates apelin expression in human and mouse adipose
tissue. Faseb J 20, 1528-1530.
Monferran, S., Paupert, J., Dauvillier, S., Salles, B., and Muller, C. (2004). The membrane form of the DNA
repair protein Ku interacts at the cell surface with metalloproteinase 9. EMBO J 23, 3758-3768.
2
B
mber of cells (x104)
Num
A
20
***
60
50
40
30
20
10
0
SUM159PT
ZR 75.1
0% FCS
10% FCS
15
NC
C
10
5
250
0
NC
C
Number of c
cells (x104)
Number o
of cells per field
70
200
150
100
50
0
4T1
67NR
Figure S1. (A) Adipocytes but not preadipocytes promote ZR 75.1 invasive capacities. ZR 75.1 were cocultivated (C) or not (NC)
with murine pre-adipocytes on a Transwell for 3 days. Tumor cells were then trypsinized and used to perform Matrigel invasion assays
towards medium containing either 0 or 10% FCS. (B) Effect of mature adipocytes on tumor cell proliferation. 3 x 105 ZR 75.1, 1.5 x
105 4T1 and 5 x 104 67NR and SUM159PT cells were grown for three days on Transwells in the presence or not of mature adipocytes
obtained from the in vitro differentiation of the murine pre-adipocyte
pre adipocyte cell line,
line 3T3-F442A.
3T3 F442A After three days,
days cells were counted.
counted Mean of
five independent experiments ± SD, *** statistically significant by Student’s t-test, p<0.001.
Dirat et al, SuppS1
0.75
0.50
0.25
*
*
***
0.00
HSL
APN
resistin
**
mRN
NA relative expression
mRN
NA relative expression
1.00
1.00
0.75
0.50
***
0.25
**
0.00
aP2
PPARγ
C/EBPα
1 00
1.00
0.75
0.50
*
*
*
0.25
0.00
IL-6
IL-1β
TNF-α
mRNA
A relative expression
mRNA
A relative expression
NC
C
15
1.5
*
*
1.0
0.5
0.0
MMP-11
PAI-1
MMP-9
Figure S2. The occurrence of the CAAs phenotype is reproducibly observed in the presence of SUM159PT cells. Mature
adipocytes were cocultivated or not in the presence of SUM159PT breast cancer cells for three days. mRNAs were extracted from
adipocytes and the expression of the indicated genes analysed by qPCR. Means of at least three independent experiments ± SD, *
statistically significant by Student's t-test, p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
Dirat et al, SuppS2
B
Number oof cells per field
A
NC
NC
20
***
15
NC
C
10
5
0
0%
C
0.5
***
HSL
***
***
APN
Resistin
aP2
Sample n°1
***
1.5
1.0
0.5
***
0.0
PPARγ
5
4
*
3
*
2
*
C
C/EBPα
Samp
ple n°2
1.0
mRNA relative expressiion
m
(fold)
NC
2.0
1.5
0.0
βcatenin
Phase contrast
mRNA relative ex
xpression
(fold)
mRNA relative expression
(fold
d)
Red oil
C
10%
NC
C
1
0
IL-6
IL-1β
TNF-α
Figure S3. Similar crosstalk between tumor cells and adipocytes is observed with human mammary adipocytes. (A) Upper panel: human mammary
adipocytes issued from the ex vivo differentiation of the SVF fraction of adipose tissue obtained from reduction mammoplasty were cocultivated (C) or not
(NC) for 3 days in the presence of ZR 75.1 tumor cells. Shown a representative experiment of Red oil staining and phase contrast. Lower panel: after 3
days, mRNAs were extracted from adipocytes grown alone (white bars) or in the presence of ZR 75.1 tumor cells (black bars) and the levels of expression of
the indicated genes evaluated by qPCR.
qPCR Data represent the results obtained from 6 independent donors ± SD,
SD * statistically significant by Student
Student'ss tt-test
test,
p<0.05, *** p<0.001; (B) Upper panel: ZR 75.1 tumor cells were grown or not with mature human adipocytes obtained from 6 independent donors. After 3
days, cells were taken to perform Matrigel invasion assays toward a medium containing either 0 or 10% FCS, *** statistically significant by Student's t-test,
p<0.001; Lower panel: tumor cells cocultivated or not with adipocytes were fixed and stained for β-catenin expression. Shown the results of representative
experiments obtained with adipocytes issued from 2 independent donors.
Dirat et al, SuppS3
A
mRNA rrelative expression
0.9 1.0
0 1.1 1.2 1.3 1..4
PAI-1
0.8
P=0.05
ER-
ER+
IDC
ILC
GII
GIII
N-
N+
<3cm
>3cm
MMP-11
2.0 2.5
1.0 1.5
0.5
0.0
0
mRNA relative e
expression
3.0
B
ER-
ER+
IDC
ILC
GII
GIII
N-
N+
<3cm
>3cm
Figure S4. Expression of PAI-1 and MMP-11 in tumor-associated adipocytes as a function of tumor characteristics. Expression
of PAI-1 or MMP-11 genes was measured from tumor-associated adipocytes in 14 independent samples. Expression was analyzed as a
g receptor),
p ), IDC ((invasive ductal carcinoma),
), ILC ((invasive lobular carcinoma),
), N ((lymph
y p
function of tumor characteristics ; ER ((estrogen
nodes involvement).
Dirat et al, SuppS4
A
HSL
ATGL
0.6
HSL mRNA relative
expression
ATGL mRNA relative
expression
1.5
1.0
0.5
**
***
00
0.0
3 days
0.4
NC
C
0.2
*
00
0.0
5 days
3 days
**
5 days
C
B
D3
NC C
D5
NC
HSL
C
NC
C
HSL
Tubulin
Figure S5. The occurrence of the CAAs phenotype is associated with a profound down regulation of lipolytic enzymes in
mature adipocytes. (A) Mature adipocytes were cocultivated (black bars) or not (white bars) in the presence of SUM159PT breast
cancer cells. At the indicated times, mRNAs were extracted from adipocytes and the expression of Adipocyte TriGlyceride Lipase
(ATGL) or Hormono-Sensitive Lipase (HSL) analysed by qPCR, means of three independent experiments ± SD, *statistically significant
by Student's t-test, p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001; (B) Proteins were extracted from adipocytes cocultivated (C) or not (NC) in the
presence of tumor cells and the expression of HSL was measured by Western blot, tubulin being used as a loading control ; (C) these
results were confirmed using immunofluorescence approach (five days of coculture).
Dirat et al, SuppS5
C/EBPα
α mRNA relative expression
C/EBPα
aP2 m
mRNA relative expresssion
aP2
100
75
**
50
25
0
C
SUM159PT-cm
Adiponectin mRNA relative exprression
NC
120
80
40
***
0
nc
140
c
SUM159PT-cm
Adiponectin
70
**
0
nc
c
SUM159PT-cm
Figure S6.
S6 The occurrence of the CAAs phenotype is not reproduced by conditioned medium obtained from tumor cells.
cells
Adipocytes were cocultivated (C, black bars) or not (NC, white bars) in the presence of SUM159PT cells. In parallel, adipocytes were
cultivated in the presence of tumor cells conditioned medium complemented with 10% serum (SUM159PT-cm, grey bars). After three
days, mRNAs were extracted from adipocytes and the expression of indicated genes analysed by qPCR, means of three independent
experiments ± SD,** statistically significant by Student's t-test, p<0.01, *** p<0.001.
Dirat et al, SuppS6
Variables
Age in years
[35-50[
50
Body Mass Index in kg/m
[18-25[
[25-30[
30
Controls (n=14)
n (%)
Cases (n=14)
n (%)
6 (42,8)
8 (57,2)
3 (21,4)
11 (78,6)
5 (35,7)
7 (50)
4 (28,6)
9 (64,3)
2 (14,3)
1 (7,1)
2
Supplementary Table 1. Age and anthropometric characteristics of control
and cases series.
Variables
Sub-groups
Tumor histology
Lobular
Canalar
I
II
3 (21,4)
11 (78,6)
0 (0)
9 (64,3)
III
Pre-menopausal
Post-menopausal
5 (35,7)
3 (21,4)
11 (78,6)
Breast cancer stage
Menopausal status
Cases (n=14)
n (%)
]0-2]
]2-5]
>5
nc
Clinical node involvement
N0
N1
N2
Tumor estrogen receptors status ER (-)
ER (+)
Tumor HER2 status
HER2 (-)
3 (21,4)
7 (50)
2 (14,3)
2 (14,3)
3 (21,4)
5 (35,7)
6 (42,9)
4 (28,6)
10 (71,4)
11 (78,6)
HER2 (+)
3 (21,4)
Tumor diameter in cm
Supplementary Table 2. Clinical characteristics of the breast cancer patients.
Name
Adiponectin (APN)
Forward
TGGAATGACAGGAGCTGAAGG
Reverse
TATAAGCGGCTTCTCCAGGCT
Concentrations (nM)
900
aP2
TTCGATGAAATCACCGCAGA
GGTCGACTTTCCATCCCACTT
900
ATGL
CAGCACATTTATCCCGGTGTAC
AAATGCCGCCATCCACATAG
100
C/EBP-α
CAAGAACAGCAACGAGTACCG
GTCACTGGTCAACTCCAGCAC
100
FGF-β
GCGACCCACACGTCAAACTA
TGGCACACACTCCCTTGATAGA
100
HGF
TCGTGGCAATGGGAAAAATT
GGAACATGTAAGTCCAGACCTTGTT
100
HSL
GGCTTACTGGGCACAGATACCT
CTGAAGGCTCTGAGTTGCTCAA
900
IL-1β
ACCATGGCACATTCTGTTCAAA
GCCCATCAGAGGCAAGGA
300
IL-6
GCCCACCAAGAACGATAGTCA
CAAGAAGGCAACTGGATGGAA
300
leptin
GGGCTTCACCCCATTCTGA
TGGCTATCTGCAGCACATTTTG
900
MMP-9
TGAGTCCGGCAGACAATCCT
CGCCCTGGATCTCAGCAATA
300
MMP-11
GCCCTCATGTCCCCTTTCTAC
CCTTCGGTCATCTGGGCTAA
900
PAI-1
TCTCCAATTACTGGGTGAGTCAGA
GCAGCCGGAAATGACACAT
900
PPARγ
CTGTCAGAAACGGCTGTGTCA
TCCGGGCGAAACATTCA
300
TNF-α
TGGGACAGTGACCTGGACTGT
TTCGGAAAGCCCATTTGAGT
100
Resistin
TCGTGGGACATTCGTGAAGA
GGGCTGCTGTCCAGTCTATCC
300
Supplementary Table 3A. Sequences and concentrations of the primers used to detect murine genes expression using qPCR.
Name
Adiponectin(APN)
Forward
GCAGAGATGGCACCCCTG
Reverse
GGTTTCACCGATGTCTCCCTTA
Concentrations (nM)
300
aP2
GCATGGCCAAACCTAACATGA
CCTGGCCCAGTATGAAGGAAA
300
C/EBP-α
ACCCTCAGCCTTGTTTGTACTGTAT
GGACTGATCGTGCTTCGTGTT
300
C/EBP-β
AACATCGCCGTGCGCAAGAG
GCTTGAACAAGTTCCGCAGG
300
HSL
GTGCAAAGACGGAGGACCACTCCA
GACGTCTCGGAGTTTCCCCTCAG
900
IL-1β
TCAGCCAATCTTCATTGCTCAA
TGGCGAGCTCAGGTACTTCTG
300
IL-6
AGGGCTCTTCGGCAAATGTA
GAAGGAATGCCCATTAACAACAA
100
leptin
CCTTCCAGAAACGTGATCCAA
GGCCAGCACGTGAAGAAGAT
900
MMP-9
CCCTGGAGACCTGAGAACCA
CCACCCGAGTGTAACCATAGC
900
PAI-1
ACCGATTCGACCAGTTATTTGAC
TCTTGTTCTCTGCTGCCTTCAG
300
PPARγ
GAACCACCGCACGATGTTG
AAGTCGAACACGCTGCTGAA
900
TNF-α
CCGAGTCTGGGCAGGTCTAC
TGGGAAGGTTGGATGTTCGT
300
Supplementary Table 3B. Sequences and concentrations of the primers used to detect human genes expression using qPCR.
2. Les CAAs participent à la radiorésistance des cellules tumorales
mammaires.
En plus d’un rôle dans la croissance tumorale et dans la dissémination métastasique, le
microenvironnement participe à la réponse des cellules cancéreuses aux traitements anti-tumoraux,
et notamment à la réponse à la radiothérapie.
Effets cellulaires des radiations ionisantes (RI) :
Les cellules exposées aux RI présentent de nombreux dommages de l’ADN (oxydations de bases,
de sucres, cassures simple et double brins). Ces lésions de l’ADN sont la conséquence soit de
« l’effet direct » des radiations déposant leur énergie sur l’ADN, soit d’un effet indirect de radiolyse
de l’eau conduisant à la formation d’espèces radicalaires. Parmi ces lésions, les dommages les plus
cytotoxiques sont les cassures double brin, et la capacité des cellules à réparer ces cassures est un
déterminant majeur de la radiosensibilité cellulaire (Averbeck, 2000). La signalisation des lésions
de l’ADN va conduire à l’arrêt du cycle cellulaire grâce à l’activation de points de contrôle du cycle
cellulaire (ou « checkpoints »). Ces mécanismes régulateurs inhibent la progression du cycle
cellulaire à la transition G1/S et/ou G2/M ainsi que la progression en phase S (Ishikawa et al.,
2006). L’arrêt du cycle cellulaire permet la mise en place des mécanismes de réparation de l’ADN
et prévient les anomalies de réplication ou la survenue d’aberrations chromosomiques pendant la
mitose. Si la cellule a accumulé une trop grande quantité de dommages, les RI peuvent induire une
mort rapide par apoptose ou par nécrose (Roos and Kaina, 2006). Toutefois, dans les cellules
épithéliales, la mort la plus souvent observée est une mort différée appelée mort post-mitotique
(Ross, 1999). Cette mort est définie par l’incapacité des cellules à accomplir une mitose complète
en raison de la persistance de lésions de l’ADN ou d’aberrations chromosomiques accumulées au
cours des mitoses précédentes. Après plusieurs cycles cellulaires, ces cellules deviennent géantes et
possèdent de nombreux micronoyaux. Sur le plan moléculaire, les mécanismes régulant ce type de
mort restent mal caractérisés mais semblent faire intervenir des protéines impliquées dans le point
de contrôle G2/M (comme Chk1 et Chk2) ou dans le point de contrôle intra-M (comme la
survivine) (Castedo et al., 2004). Toutefois, la mort cellulaire induite par les RI n’est pas
strictement dépendante de la quantité de dommages de l’ADN. Ainsi les cellules tumorales peuvent
résister à l’effet cytotoxique des RI en augmentant leur activité de réparation de l’ADN ou en
inhibant les processus de mort cellulaire (Muller et al., 1998). En effet, la mort radio-induite peut
être régulée par de multiples voies de signalisation intracellulaire, elles-mêmes contrôlées par des
oncogènes, l'activité de certaines protéines kinases ou des signaux environnementaux (Xia and
69
Powell, 2002). Par exemple, la voie NF-ĸB, qui favorise la survie et la prolifération cellulaire a été
impliquée dans la résistance à la radiothérapie (Ahmed and Li, 2008).
Influence du microenvironnement sur la réponse aux RI :
Les différents mécanismes de résistance ont pour la plupart été caractérisés ex vivo sur des cellules
tumorales en culture et ne tiennent donc pas compte du microenvironnement tumoral. Cependant,
des travaux originaux ont impliqué le stroma tumoral dans la réponse à la radiothérapie. En effet,
l’équipe des Drs Fucks & Kolesnick a montré que le statut apoptotique des cellules endothéliales
conditionne la réponse des cellules normales et tumorales à la radiothérapie, en utilisant un modèle
de souris dont les cellules endothéliales sont incapables de déclencher l’apoptose. Dans ce modèle,
les tumeurs deviennent radiorésistantes à cause de l’absence de dommages microvasculaires à
proximité des cellules tumorales (Garcia-Barros et al., 2003). De plus, la déplétion en macrophages
infiltrant la tumeur augmente la radiosensibilité (Meng et al., 2010). Ces effets résulteraient de
secrétions paracrines des cellules stromales qui influenceraient la mort des cellules cancéreuses en
réponses aux traitements. Ainsi, une étude a montré que deux cytokines, l’erythropoïétine (EPO) et
l’IL-3 inhibent l’apoptose de cellules leucémiques induite par un inhibiteur de topoisomérase II. En
effet, l’activation des voies de signalisation PI3K/Akt/GSK-3 induit un arrêt du cycle cellulaire en
phase G2/M dépendant de la protéine Chk1, ce qui favorise la réparation des lésions de l’ADN (Jin
et al., 2005).
Les sécrétions paracrines en réponse aux RI influencent non seulement la réponse des cellules
tumorales mais aussi la carcinogenèse. En effet, l’équipe du Pr. MH Barcellos-Hoff a travaillé sur
des cellules transformées non tumorales pour montrer que, lorsqu’elles sont implantées dans un
stroma murin irradié, ces cellules donnent naissance à des tumeurs (Barcellos-Hoff and Ravani,
2000). Cet effet serait dû à la sécrétion de TGFβ par les cellules stromales en réponse aux RI, cette
cytokine étant capable de réguler le cycle cellulaire et l’apoptose des cellules cancéreuses
mammaires (Barcellos-Hoff, 2005).
Dans notre précédente étude, nous avons décrit les adipocytes comme des acteurs majeurs du
microenvironnement tumoral mammaire, favorisant la dissémination métastasique des cellules
cancéreuses. Grâce à la sécrétion de nombreuses adipokines, ces cellules pourraient également
moduler la réponse aux traitements anti-tumoraux. Ainsi, une étude a montré que les secrétions
adipocytaires favorisent l’activation de signaux de survie dans des cellules leucémiques traitées par
un inhibiteur de la polymérisation des microtubules (Behan et al., 2009). Etant donné le rôle très
important de la radiothérapie dans la prise en charge du traitement du cancer du sein, il nous est
apparu essentiel d’étudier l’influence des CAAs dans la réponse aux RI des cellules tumorales. Le
70
but de ce deuxième travail a donc été d’évaluer l’effet des CAAs dans la réponse aux RI de
cellules tumorales mammaires.
J’ai ainsi mis en évidence que les CAAs confèrent une radiorésistance aux cellules tumorales et
favorisent la phosphorylation de la protéine Chk1. Cet effet serait dû, au moins en partie, à la
présence d’IL-6 secrétée par les cellules tumorales en réponse aux CAAs.
Ces travaux montrent pour la première fois un rôle des adipocytes péri-tumoraux dans la
réponse des tumeurs à l’exposition aux RI et ont été publiés dans le journal Biochemical and
Biophysical Research Communications (BBRC).
71
72
Biochemical and Biophysical Research Communications 411 (2011) 102–106
Contents lists available at ScienceDirect
Biochemical and Biophysical Research Communications
journal homepage: www.elsevier.com/locate/ybbrc
Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance
Ludivine Bochet a,b,c, Aline Meulle a,b,c, Sandrine Imbert b, Bernard Salles a,b, Philippe Valet a,c,
Catherine Muller a,b,⇑
a
Université de Toulouse, UPS, F-31077 Toulouse Cedex, France
CNRS, IPBS (Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale), 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077 Toulouse Cedex, France
c
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM U1048, 1 Avenue du Pr Jean Poulhès, BP 84225, F-31432 Toulouse Cedex, France
b
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 10 June 2011
Available online 25 June 2011
Keywords:
Adipocytes
Ionizing radiation
Breast cancer
Radioresistance
Interleukin 6
a b s t r a c t
Mature adipocytes are excellent candidates to influence tumor behavior through heterotypic signaling
processes since these cells produce hormones, growth factors, cytokines and other molecules, a heterogeneous group of molecules named adipokines. Using a 2D coculture system, we demonstrate that breast
tumor cells previously co-cultivated with mature adipocytes exhibit radioresistance and an earlier and
higher increase in the effector kinase Chk1, a phenotype that was associated with decreased cell death
as compared to tumor cells grown alone. Interestingly, the adipocytes-induced tumor changes taking
place during the coculture time preceding the exposure to IR were sufficient to confer the radioresistant
effect. Notorious among the changes brought by adipocytes was the significant increase of IL-6 expression in tumor cells, whose activity may well account for the observed tumor cell protection from IR toxicity. Indeed, our data confirmed the protective role of this cytokine as tumor cells incubated after
irradiation with recombinant IL-6 exhibit an increased in Chk1 phosphorylation and a radioresistant phenotype, thus far recapitulating the effects observed in the presence of adipocytes. Our current study sheds
light on a new role of tumor-surrounding adipocytes in fostering a radioresistant phenotype in breast
tumors, a finding that might have important clinical implications in obese patients that frequently exhibit
aggressive diseases.
Ó 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
1. Introduction
Radiation therapy (RT) remains an integral component of the
current available therapeutic strategies in the treatment of malignant disease. The use of therapeutic doses of ionizing radiation (IR)
as a primary sole treatment modality, or in combination with
surgery and chemotherapy, results in high rates of loco-regional
control in a majority of cancer patients. However, a significant
number of patients will experience relapse (for review see [1]) suggesting a possible radioresistant phenotype of tumor cells, and the
functional mechanisms behind the radioresistance need to be
understanding. IR induces a range of cellular lesions in genomic
DNA, thought to be the most important subcellular target molecule. DNA breaks initiates a DNA damage response that coordinates
cell-cycle transitions, DNA repair and cell death [2]. The protein
kinases Ataxia telangiectasia mutated (ATM) and ATR (ATM and
Rad3 related), as well as their downstream substrates Chk1 and
Chk2 are central players in determining cellular responses to
DNA damage [2]. Although a majority of these lesions are repaired,
some unrepaired breaks may be generated and lead to
⇑ Corresponding author at: IPBS, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077
Toulouse Cedex, France. Fax: +33 561 17 59 94.
E-mail address: [email protected] (C. Muller).
0006-291X/$ - see front matter Ó 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bbrc.2011.06.101
chromosomal aberrations and post-mitotic cell death. This mode
of cell death is considered to be the major mechanism by which
the majority of solid tumors respond to clinical RT [3].
Cancer is a tissue-based disease in which malignant cells
interact dynamically with multiple normal cell types such as fibroblasts, adipocytes, infiltrating immune cells and endothelial cells
within the context of extra-cellular matrix [4]. Of all cell types
present in the microenvironment, adipocytes are probably the least
well studied despite the fact that they correspond to one of the
most prominent cell type in tissues such as breast [5]. Until
recently, adipocytes were mainly considered as an energy storage
depot, but there is now clear evidences pointing to the fat tissue
as an endocrine organ that produces an heterogeneous group of
molecules called adipokines (i.e. hormones, growth factors, cytokines) [6] prone to affect tumor behavior (for review see [7]). We
have recently demonstrated that adipocytes participate in a highly
complex vicious cycle orchestrated by cancer cells to promote
tumor invasion [8]. Invasive cancer cells dramatically impact
surrounding adipocytes that exhibit a modified phenotype and
specific biological features (delipidation, overexpression of inflammatory cytokines) sufficient to be named ‘‘Cancer-Associated
Adipocytes (CAAs)’’ [8]. Several studies have demonstrated that
the stroma (including endothelial cells, fibroblasts or macrophages) could cooperate to modulate the response of tumors cells
L. Bochet et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 411 (2011) 102–106
103
to radiation exposure [9–13]. These findings led us to analyze the
effect of the adipocyte and tumor cells crosstalk on breast cancer
cell response to IR. This issue is of major clinical importance since
adiposity is associated with reduced likelihood of survival and
increased likelihood of recurrence regardless of the menopausal
status even in women with breast cancer that is negative for estrogen receptor (for review see [7]).
described previously [16]. The primers to detect IL-6 mRNA were
sense primer: 50 -AGGGCTCTTCGGCAAATGTA-30 , antisense primer:
50 -GAAGGAATGCCCATTAACAACAA-30 Fluorescence was monitored
and analyzed in a GeneAmp 7300 detection system instrument
(Applied Biosystems). Analysis of 18S ribosomal RNA was performed in parallel using the ribosomal RNA control TaqMan assay
kit (Applied Biosystems).
2. Materials and methods
2.5. Cell extracts and Western blot
2.1. Cell lines and cell culture
Whole cell extracts and Western blot experiments were
performed as previously described [17]. The following antibodies
were used: b tubulin (clone DM1A) obtained from Neomarkers;
pChk1 (Ser345), pChk2 (Thr68), pSTAT-3 (Tyr 705) and Chk1
(2G1D5) obtained from Cell Signaling Technology.
The murine 3T3F442A pre-adipocyte cell line was cultured in
DMEM medium supplemented with 10% of fetal calf serum (FCS).
The differentiation was induced by incubating confluent cells in
differentiation medium (DMEM supplemented with 10% FCS plus
50 nM insulin) for up to 14 days as described previously [14].
The term ‘‘mature adipocytes’’ represents cells that have been differentiated for 10–14 days. The human mammary carcinoma cell
line SUM159PT (provided by Dr. J. Piette, IGMM, Montpellier,
France) was grown in Ham F12 medium complemented with 5%
FCS, 1 mg/ml hydrocortisone (Sigma) and 0.2 UI/ml insulin. All cell
lines were incubated at 37 °C with 5% CO2 in the air. All culture
media (Life Tech) were supplemented with antibiotics.
2.2. Radiation treatment and cell survival determination
About 5 104 SUM159PT cells were seeded in the upper chamber of a Transwell culture system (0.4 lm pore size, Millipore) in
the culture medium of adipocytes with or without mature adipocytes in the lower chamber during 3 days. After this period, cocultures were irradiated at the indicated doses using a 130 kV X-ray
machine (Faxitron RX-650), with a dose rate of 0478 Gy/min and
further incubated during 48 h in the presence or not of adipocytes.
Cell survival after irradiation was determined by clonogenic assay.
Tumor cells were trypsinized and plated at low density (500 cells/
60 mm2 dishes, three dishes per conditions) in complete medium
and incubated for 10 days. Colonies were stained with crystal
violet and counted under a microscope, with 50 cells as the
minimum number to define a surviving colony. In certain conditions, SUM159PT cells were post-incubated after irradiation in
the presence of IL-6 (30 ng/ml) (obtained from Peprotech).
2.3. DAPI staining and post-mitotic cell death detection
About 5 104 SUM159PT cells were plated on coverslips in the
upper chamber of the Transwell culture system and co-cultivated
or not with mature adipocytes. Three days after, cells were exposed
to 5 Gy followed by 96 h of incubation. Cells were then washed in
PBS and fixed with paraformaldehyde (3.7%) for 15 min at room
temperature. Coverslips were rinsed three times with PBS and
permeabilized 5 min with 0.1% Triton X-100. Cells were then incubated 15 min at 37 °C with 10 lg/ml of DAPI (4,6-diamidino-2phenylindole). Nuclei staining were visualized using a laser
scanning spectral confocal microscope (Leica SP2). Post-mitotic
dying cells showed abnormal mitosis with the formation of large
cells with multiple micronuclei [15]. Percentage of giant multinucleated cells was determined dividing the number of multinucleated cells by the number of total cells counted for each condition
(at least 100 cells were counted for each condition).
2.4. RNA extraction and quantitative RT-PCR (qPCR)
Total RNAs were extracted using the RNeasy mini kit (Qiagen
GmbH). Gene expression was analyzed using real time PCR as
3. Results
3.1. Coculture with adipocytes increases tumor cell survival and
enhances Chk1 activation after IR exposure
To characterize the possible effects of adipocytes on IR-induced
cytotoxicity of tumor cells, we used the in vitro coculture system
previously described [8]. Human cancer cells SUM159PT were
grown for 3 days on inserts, allowing the diffusion of soluble
factors, in the presence or not of mature adipocytes obtained from
the in vitro differentiation of the murine preadipocyte cell line
3T3F442A [18]. After this incubation period, cells were irradiated
and further incubated for 48 h. The survival fractions after IR exposure of SUM159PT cells previously co-cultivated or not with mature adipocytes were determined by clonogenic assays. As shown
in Fig. 1, coculture with adipocytes significantly decreased IR-cytotoxicity in tumor cells (survival fraction at 2 Gy, SF2 = 0.312 when
tumor cells were not co-cultivated, SF2 = 0.57 when cells were cocultivated with mature adipocytes, p < 0.001). We next examined
the phosphorylation pattern of the two effector kinases Chk1 and
Chk2 in these cells. As shown in Fig. 2A, a higher and earlier (see
after 8 h) increase in Chk1 phosphorylation was observed in irradiated SUM159PT cells that have been previously cocultivated with
adipocytes as compared to tumor cells grown alone. Note that
the level of expression of Chk1 remains constant between the
two different culture conditions and was not affected by irradiation. By contrast, the level of Chk2 phosphorylation after IR
exposure was not affected by the coculture. Given that irradiation-induced DNA double-strand breaks leads to chromosomal
rearrangements, mitotic catastrophe, and ultimately to mitotic cell
Fig. 1. Coculture with adipocytes improves SUM159PT survival after irradiation.
Survival curves of irradiated SUM159PT cells cocultivated or not in the presence of
mature adipocytes. After 3 days of co-cultivated (coc) or not (nc), tumor cells alone
or tumor cells with adipocytes were irradiated with 0, 2, 5 and 10 Gy and
clonogenic assay was performed 48 h later. Data represent the mean of three
independent experiments ± SD, statistically significant by two-way ANOVA,
p < 0.0001.
104
L. Bochet et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 411 (2011) 102–106
Fig. 3. Coculture with adipocytes induces tumor changes that confer intrinsic
tumor cells radioresistance. Upper panel: experimental design: SUM159PT tumor
cells were co-cultivated or not (nc) with mature adipocytes and irradiated or not
with 5 Gy. Then, co-cultivated cells are either further incubated with adipocytes
(coc), or cultivated alone (coc sep). Forty-eight hours after irradiation, clonogenic
assays were performed on tumor cells. Lower panel: histogram representing the
survival fraction from the clonogenic assays analysis. Data represent the mean of at
least three different experiments ± SD, statistically significant by Student’s t-test,
⁄⁄⁄
p < 0.001.
Fig. 2. Coculture with adipocytes enhances Chk1 activation after irradiation. (A)
Western blot analysis of Chk1 and Chk2 phosphorylation. SUM159PT tumor cells
were co-cultivated (coc) or not (nc) for 3 days and irradiated or not with 5 Gy. Eight
and 24 h after irradiation, cells were lysed and subjected to Western blot analysis
with the indicated antibodies. All blots shown are representative of three
independent experiments. (B) Multinucleated analysis of SUM159PT cells cocultivated or not before exposure to IR. Cells were grown during 3 days with (coc) or
without (nc) adipocytes then exposed or not to 5 Gy irradiation and stained with
DAPI 96 h after IR exposure. Upper panel: representative images of nuclei in each
condition. Arrows indicate giant multinucleated cells. Scale bar 10 lm. Lower
panel: histogram representing the percentage of multinucleated cells after irradiation of SUM159PT cells cocultivated (coc) or not (nc) with adipocytes prior to
irradiation. Each bar represents more than 100 nuclei counted. Data represent the
mean of at least three different experiments ± SD, statistically significant by
Student’s t-test, ⁄⁄p < 0.01.
death, the appearance of giant multinucleated cells can be
measured as a way to quantify cells undergoing mitotic cell death
due to irradiation [15]. We therefore quantified the occurrence of
giant multinucleated cells 96 h after exposure to 5 Gy irradiation.
Indeed, as shown in Fig. 2B, there was an approximately 2-fold
decrease in the percentage of occurring giant multinucleated cells
(p < 0.01) in adipocytes-co-cultivated cells as compared to tumor
cells grown alone. Taken together, these compelling results show
that adipocytes protect tumor cells from IR toxicity by preventing
mitotic cell death through the induction of molecular factors
important for the regulation of this pathway such as Chk1, as
previously described [19,20].
3.2. The putative role of IL-6, secreted by tumor cells, in radioresistance
Having described the effects of adipocytes on IR-induced
cytotoxicity of tumor cell, we wanted to further understand the
establishment of tumor cell radioresistance using our in vitro
coculture system. We first investigated whether the presence of
adipocytes within the first 48 h following exposure to IR was
necessary to observe the radioprotective effect. Accordingly, previously co-cultivated tumor cells were irradiated and post-incubated
for 48 h in the presence or not of adipocytes. Tumor cells grown
alone in inserts during the entire time of the experiment were used
as a negative control. The experimental design of these experiments is recapitulated in Fig. 3 (upper panel). As shown in Fig. 3
(lower panel), we found that while co-cultivated tumor cells were
protected from IR-induced cell death, this effect was independent
of the presence of adipocytes in the post-treatment period. These
results demonstrate that the radioprotective effect is conferred
by the changes induced in tumor cells by the coculture period prior
to irradiation. According to the emerging role of inflammatory
cytokines in the response of tumors to RT [21], we performed an
extensive search for cytokines expressed by tumor cells after
3 days of coculture with adipocytes using qPCR analysis. Among
the cytokines examined, we observed an exclusive 3-fold increase
in IL-6 mRNA expression (Fig 4A, left panel p < 0.01), whereas that
of IL-1b or TNFa was not significantly affected (data not shown).
ELISA experiment revealed that IL-6 secretion was undetectable
when tumor cells were not co-cultivated, whereas the level of
IL-6 secreted reached 2.5 ± 0.05 ng/ml (mean of three independent
experiments) when tumor cells were co-cultivated with mature
adipocytes for 3 days. Furthermore, the incubation of SUM159PT
cells with IL-6 after irradiation led to an enhanced Chk1, but not
Chk2, phosphorylation similar to that of signal transducer and activator of transcription (STAT)-3, reflecting IL-6-specific activity
(Fig. 4A, right panel). We then decided to test the direct effects of
this important cytokine in conferring radioresistance to tumor cells
in our model. As a matter of fact, when irradiated SUM159PT cells
where post-incubated with IL-6 at 2.5 ng/ml and 30 ng/ml, a dosedependant increase in the surviving fraction was observed as com-
L. Bochet et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 411 (2011) 102–106
105
Fig. 4. Overexpression of IL-6 in co-cultivated tumor cells as a candidate to explain the occurrence of a radioresistant phenotype. (A) Left panel: relative mRNA expression of
IL-6 in SUM159PT cells co-cultivated (coc) or not (nc) for 3 days with mature adipocyte evaluated by qPCR. Data represent the mean of at least three different
experiments ± SD, statistically significant by Student’s t-test, ⁄⁄p < 0.01. Right panel: Western blot analysis of Chk1, Chk2 and STAT-3 phosphorylation. SUM159PT tumor cells
were irradiated or not with 5 Gy and further incubated in the presence or not of IL-6. Eight and 24 h after irradiation cells were lysed and subjected to Western blot analysis
with the indicated antibodies. STAT-3 phosphorylation is used as a marker of IL-6 activity. All blots shown are representative of three independent experiments. (B)
Histogram representing the survival fraction of SUM159PT cells irradiated with 5 Gy followed by a post-incubation period of 48 h in the presence (IL-6) or not (nt) of IL-6
measured by clonogenic assay. Data represent the mean of at least three different experiments ± SD, statistically significant by Student’s t-test, ⁄⁄⁄p < 0.001.
pared to untreated cells (Fig. 4B, p < 0.01 at 2.5 ng/ml, p < 0.001 at
30 ng/ml). Altogether, these results suggest that IL-6 expression in
tumor cells, induced by the cross-talk with adipocytes, might play
a role in their acquisition of radioresistance.
4. Discussion
Several studies have demonstrated that the stroma (including
endothelial cells, fibroblasts or macrophages) could cooperate to
modulate the response of tumors cells to radiation exposure [9–
13]. In this context, little attention has been given to the mature
adipocytes, although it is obvious that they represent the most
prominent cell type in breast tumor stroma. In the first part of
our study we demonstrated that breast cancer cells co-cultivated
with mature adipocytes exhibit both a decreased in IR sensitivity
and post-mitotic cell death (see Figs. 1 and 2B), highlighting the
role of adipocytes in fostering breast tumor cell radioresistance.
Interestingly, adipocytes-induced tumor changes during the coculture time that precedes exposure to IR were the key determinant of
the observed effect (see Fig. 3). These results suggest that tumorsurrounding adipocytes are able to induce inherent resistance in
tumor cells rather that contributing to transient induction of protective pathways following radiation exposure, in opposition to
stromal fibroblasts that confer radioresistance to breast tumor cells
through the release of soluble factors [10]. This effect of adipocytes
might not be limited to IR amongst the strategies used to treat cancer. In fact, it has been recently demonstrated that adipocytes prevented chemotherapy-induced apoptosis in leukemia, and this was
associated with the increased expression of two prosurvival signals
Bcl-2 and Pim-2 in leukemia-co-cultivated cells [22]. Among the
cytokines secreted by tumor cells, we identified IL-6 as a good can-
didate to confer, in an autocrine fashion, a radioresistant phenotype to tumor cells. First, IL-6 was overexpressed in co-cultivated
cells as compared to cells grown alone (Fig. 4A). Secondly, the
post-incubation of irradiated tumor cells with recombinant IL-6
was able to reproduce the radioprotective effect, in a dose dependent manner (Fig. 4B). There is accumulating evidence in the literature that inflammatory signaling pathways modulate the
response of tumors to RT [21]. In contrast to other cytokines, few
studies have involved IL-6 in radioresistance [23,13,24–27]. IL-6
activates several intracellular signaling pathways. Binding of IL-6
to its receptor activates the Janus family of kinases (JAK1, JAK2,
and TYK2) and these kinases phosphorylate STAT-3, promoting
its nuclear transfer and transcriptional function [28]. Interestingly,
STAT-3 activation, by its ability to promote the expression in prosurvival genes such as survivin and bcl-X, has also been involved in
radioresistance [29]. Our current study suggests that the increase
in Chk1 phosphorylation might be involved in the observed radioresistant phenotype (see Figs. 2A and 4A). Previous studies linked
Chk1 activity and cell survival after IR exposure. Its depletion triggers an important radiosensitive effect mainly due to aberrant
mitosis [19,20] whereas increased levels of phosphorylated Chk1
are associated to both chemo-and radioresistance [30,31]. Interestingly, a recent paper by Jin and colleagues demonstrated that in
cells treated with cytokines (e.g. IL-3 or EPO), the increase in
Chk1 phosphorylation, triggered by the activation of the Akt/
GSK3 pathway, contributed to the occurrence of a chemoresistant
phenotype [31]. In our model, additional experiments are needed
to decipher the signaling pathways involved, since IL-6 is also able
to activate the phosphoinositol 3 kinase (PI3K)–protein kinase B
(PkB/Akt) pathway, as JAK can phosphorylate PI3K [32]. In conclusion, our work demonstrates for the first time, a role for tumor-surrounding adipocytes in fostering radioresistance in tumor cells.
106
L. Bochet et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 411 (2011) 102–106
This work paves the way for future cellular studies aimed at determining the molecular mechanism involved and the impact of this
new crosstalk in obesity conditions. Such studies will provide unique opportunities to set-up specific strategies for the treatment
of the subsets of patients exhibiting aggressive diseases.
Acknowledgments
The authors would like to thank Dr. Geanncarlo Lugo for critical
reading of the manuscript. The ‘‘Canceropole Grand Sud-Ouest’’ (to
B.S., C.M.), La Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labélisée to
BS), INCA (to P.V., C.M.), The ‘‘Ligue Nationale Contre le Cancer
(Comité ‘‘Midi-Pyrénées, Gers et du Lot’’ to C.M.) and the radioprotection Committee of EDF (to C.M.) supported this work.
References
[1] B.G. Haffty, P.M. Glazer, Molecular markers in clinical radiation oncology,
Oncogene 22 (2003) 5915–5925.
[2] S. Ashwell, J.W. Janetka, S. Zabludoff, Keeping checkpoint kinases in line: new
selective inhibitors in clinical trials, Expert Opin. Investig. Drugs 17 (2008)
1331–1340.
[3] G.M. Ross, Induction of cell death by radiotherapy, Endocr. Relat. Cancer 6
(1999) 41–44.
[4] M.M. Mueller, N.E. Fusenig, Friends or foes – bipolar effects of the tumour
stroma in cancer, Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 839–849.
[5] B.S. Wiseman, Z. Werb, Stromal effects on mammary gland development and
breast cancer, Science 296 (2002) 1046–1049.
[6] M.W. Rajala, P.E. Scherer, Minireview: the adipocyte – at the crossroads of
energy homeostasis, inflammation, and atherosclerosis, Endocrinology 144
(2003) 3765–3773.
[7] B. Dirat, L. Bochet, G. Escourrou, P. Valet, C. Muller, Unraveling the obesity and
breast cancer links: a role for cancer-associated adipocytes?, Endocr Dev. 19
(2010) 45–52.
[8] B. Dirat, L. Bochet, M. Dabek, D. Daviaud, S. Dauvillier, B. Majed, Y.Y. Wang, A.
Meulle, B. Salles, S. Le Gonidec, I. Garrido, G. Escourrou, P. Valet, C. Muller,
Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to
breast cancer invasion, Cancer Res. 71 (2011) 2455–2465.
[9] M.H. Barcellos-Hoff, S.A. Ravani, Irradiated mammary gland stroma promotes
the expression of tumorigenic potential by unirradiated epithelial cells, Cancer
Res. 60 (2000) 1254–1260.
[10] K.K. Tsai, J. Stuart, Y.Y. Chuang, J.B. Little, Z.M. Yuan, Low-dose radiationinduced senescent stromal fibroblasts render nearby breast cancer cells
radioresistant, Radiat. Res. 172 (2009) 306–313.
[11] M. Garcia-Barros, F. Paris, C. Cordon-Cardo, D. Lyden, S. Rafii, A. HaimovitzFriedman, Z. Fuks, R. Kolesnick, Tumor response to radiotherapy regulated by
endothelial cell apoptosis, Science 300 (2003) 1155–1159.
[12] F. Paris, Z. Fuks, A. Kang, P. Capodieci, G. Juan, D. Ehleiter, A. HaimovitzFriedman, C. Cordon-Cardo, R. Kolesnick, Endothelial apoptosis as the primary
lesion initiating intestinal radiation damage in mice, Science 293 (2001) 293–
297.
[13] Y. Meng, M.A. Beckett, H. Liang, H.J. Mauceri, N. van Rooijen, K.S. Cohen, R.R.
Weichselbaum, Blockade of tumor necrosis factor alpha signaling in tumorassociated macrophages as a radiosensitizing strategy, Cancer Res. 70 (2010)
1534–1543.
[14] A. Meulle, B. Salles, D. Daviaud, P. Valet, C. Muller, Positive regulation of DNA
double strand break repair activity during differentiation of long life span
cells: the example of adipogenesis, PLoS ONE 3 (2008) e3345.
[15] M. Castedo, J.L. Perfettini, T. Roumier, K. Andreau, R. Medema, G. Kroemer, Cell
death by mitotic catastrophe: a molecular definition, Oncogene 23 (2004)
2825–2837.
[16] D. Daviaud, J. Boucher, S. Gesta, C. Dray, C. Guigne, D. Quilliot, A. Ayav, O.
Ziegler, C. Carpene, J.S. Saulnier-Blache, P. Valet, I. Castan-Laurell, TNFalpha
up-regulates apelin expression in human and mouse adipose tissue, FASEB J.
20 (2006) 1528–1530.
[17] F. Bouquet, C. Muller, B. Salles, The loss of gammaH2AX signal is a marker of
DNA double strand breaks repair only at low levels of DNA damage, Cell Cycle
5 (2006) 1116–1122.
[18] H. Green, O. Kehinde, Spontaneous heritable changes leading to increased
adipose conversion in 3T3 cells, Cell 7 (1976) 105–113.
[19] Y. Tao, C. Leteur, C. Yang, P. Zhang, M. Castedo, A. Pierre, R.M. Golsteyn, J.
Bourhis, G. Kroemer, E. Deutsch, Radiosensitization by Chir-124, a selective
CHK1 inhibitor: effects of p53 and cell cycle checkpoints, Cell Cycle 8 (2009)
1196–1205.
[20] H. Niida, Y. Katsuno, B. Banerjee, M.P. Hande, M. Nakanishi, Specific role of
Chk1 phosphorylations in cell survival and checkpoint activation, Mol. Cell.
Biol. 27 (2007) 2572–2581.
[21] A. Deorukhkar, S. Krishnan, Targeting inflammatory pathways for tumor
radiosensitization, Biochem. Pharmacol. 80 (2010) 1904–1914.
[22] J.W. Behan, J.P. Yun, M.P. Proektor, E.A. Ehsanipour, A. Arutyunyan, A.S. Moses,
V.I. Avramis, S.G. Louie, A. Butturini, N. Heisterkamp, S.D. Mittelman,
Adipocytes impair leukemia treatment in mice, Cancer Res. 69 (2009) 7867–
7874.
[23] P.G. Braunschweiger, V. Basrur, O. Santos, A. Adessa, P. Houdek, A.M. Markoe,
Radioresistance in murine solid tumors induced by interleukin-1, Radiat. Res.
145 (1996) 150–156.
[24] R.F. Hwang, T. Moore, T. Arumugam, V. Ramachandran, K.D. Amos, A. Rivera, B.
Ji, D.B. Evans, C.D. Logsdon, Cancer-associated stromal fibroblasts promote
pancreatic tumor progression, Cancer Res. 68 (2008) 918–926.
[25] R. Neta, R. Perlstein, S.N. Vogel, G.D. Ledney, J. Abrams, Role of interleukin 6
(IL-6) in protection from lethal irradiation and in endocrine responses to IL-1
and tumor necrosis factor, J. Exp. Med. 175 (1992) 689–694.
[26] J.J. Dubost, C. Rolhion, A. Tchirkov, S. Bertrand, J. Chassagne, A. Dosgilbert, P.
Verrelle, Interleukin-6-producing cells in a human glioblastoma cell line are
not affected by ionizing radiation, J. Neurooncol. 56 (2002) 29–34.
[27] E.V. Efimova, H. Liang, S.P. Pitroda, E. Labay, T.E. Darga, V. Levina, A. Lokshin, B.
Roizman, R.R. Weichselbaum, N.N. Khodarev, Radioresistance of Stat1 overexpressing tumour cells is associated with suppressed apoptotic response to
cytotoxic agents and increased IL6–IL8 signalling, Int. J. Radiat. Biol. 85 (2009)
421–431.
[28] P.J. Murray, The JAK-STAT signaling pathway: input and output integration, J.
Immunol. 178 (2007) 2623–2629.
[29] B.B. Aggarwal, A.B. Kunnumakkara, K.B. Harikumar, S.R. Gupta, S.T. Tharakan,
C. Koca, S. Dey, B. Sung, Signal transducer and activator of transcription-3,
inflammation, and cancer: how intimate is the relationship?, Ann N. Y. Acad.
Sci. 1171 (2009) 59–76.
[30] B. Hu, X.Y. Zhou, X. Wang, Z.C. Zeng, G. Iliakis, Y. Wang, The radioresistance to
killing of A1-5 cells derives from activation of the Chk1 pathway, J. Biol. Chem.
276 (2001) 17693–17698.
[31] Z.H. Jin, T. Kurosu, M. Yamaguchi, A. Arai, O. Miura, Hematopoietic cytokines
enhance Chk1-dependent G2/M checkpoint activation by etoposide through
the Akt/GSK3 pathway to inhibit apoptosis, Oncogene 24 (2005) 1973–1981.
[32] J. Zhang, Y. Choi, B. Mavromatis, A. Lichtenstein, W. Li, Preferential killing of
PTEN-null myelomas by PI3K inhibitors through Akt pathway, Oncogene 22
(2003) 6289–6295.
3. Un nouveau phénotype adipocytaire : les Fibroblastes dérivés des
adipocytes ou ADFs.
Au sein du tissu tumoral, plus on se rapproche du centre de la tumeur, plus le ratio
fibroblastes/adipocytes est élevé. Dans la tumeur, les adipocytes disparaissent au profit de
nombreux fibroblastes qui secrètent des protéines pro-fibrotiques à l’origine de la réaction
desmoplastique (RD). L’hypothèse avancée par notre laboratoire est une « réorientation » des
adipocytes en cellules fibroblastiques au sein de la tumeur.
Plusieurs arguments nous ont conduit à émettre cette hypothèse :
l’origine des fibroblastes de la RD n’est toujours pas démontrée, probablement parce que ces
-
cellules n’ont pas une mais plusieurs origines,
-
nos travaux précédents ont mis en évidence de profondes modifications des adipocytes péri-
tumoraux, appelés des CAAs. Si la présence des cellules tumorales est prolongée, ne pourrait-on
pas imaginer des modifications encore plus importantes des CAAs ?
-
certaines sécrétions tumorales sont à l’origine d’une dédifférenciation des adipocytes qui
perdent leurs gouttelettes lipidiques ainsi que l’expression des marqueurs adipocytaires, et
adoptent une morphologie fibroblastique (Gustafson and Smith, 2010).
Mon dernier axe de recherche a donc consisté à valider notre hypothèse. J’ai ainsi démontré in vitro
et in vivo que les adipocytes sont capables de se « réorienter » en cellules fibroblastiques sous
l’effet des secrétions tumorales. J’ai ensuite entrepris de caractériser le phénotype de ces nouvelles
cellules que nous avons appelées des ADFs pour Adipocyte-Derived Fibroblast. Enfin, dans le but
de déterminer l’effet des ADFs sur les propriétés des cellules cancéreuses, j’ai utilisé deux tests
d’invasion : en 2D et en 3D. L’analyse des résultats a montré une invasion accrue des cellules
tumorales en présence d’ADFs.
Nos résultats indiquent, pour la première fois, que les adipocytes sont capables de se
réorienter en cellules fibroblastiques en présence de cellules tumorales. Ils contribuent ainsi à
la réaction desmoplastique et favorisent la progression tumorale. Ce travail a fait l’objet d’une
publication en préparation.
73
74
Adipocyte-Derived Fibroblasts (ADFs), a new stromal cell population, promote tumor
progression and contribute to desmoplastic reaction in breast cancer.
Bochet Ludivine
Béatrice
1,3
1,2,3
, Lehuédé Camille
, Dabek Marta
1,2
1,2
, Dray Cédric
, Dauvillier Stéphanie
1,3
, Guiet Romain
1,2
1,2
, Wang Yuan Yuan
1,2,3
, Maridonneau-Parini Isabelle
, Dirat
1,2
, Le
Gonidec Sophie 1,3, Escourrou Ghislaine 4, Valet Philippe 1,3 and Muller Catherine 1,2
1
Université de Toulouse, UPS, F-31077 Toulouse, France
2
3
CNRS ; Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale F-31077 Toulouse, France
Institut National de la Santé et de la Recherche médicale, INSERM U1048, F-31432 Toulouse,
France
4
Service d’Anatomo-Pathologie, Hôpital de Rangueil, 31403 Toulouse, France.
Financial support: The “Canceropole Grand Sud-Ouest”, INCA (to PV, CM and GE), The “Ligue
Nationale Contre le Cancer (Comité “Midi-Pyrénées, Gers et du Lot” to CM), The “Fondation de
France” (to PV and CM) supported this work.
Corresponding author: Pr Catherine Muller, IPBS, 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex –
Tel: 33-561-17-59-32; Fax: 33-561-17-59-94; e-mail: [email protected]
1
Abstract
One of the features of many carcinomas, particularly breast, is the presence of a dense collagenous
stroma, the so-called desmoplastic response, comprising fibroblast-like cells which play a crucial role
in tumor progression. Peritumoral fibroblasts are composed of several subpopulations that are
morphologically undistinguishable and their origins remain debated. Our results demonstrate that a
part of these fibroblasts could arise from the “reorientation” of mature adipocytes, highly represented
in breast tumor microenvironment. Using a 2D coculture system, we demonstrate that murine and
human adipocytes cocultivated with breast cancer cells lose their lipid content as well as their
adipocyte differentiation markers while they acquired activated fibroblast features including enhanced
secretion of ECM proteins, increased migratory and invasive abilities and overexpression of FSP1, but
not SMA, protein. This population of FSP1+ fibroblasts was named Adipocyte-Derived Fibroblast
(ADF). We reproduce the reorientation of adipocytes into ADFs during tumor development using an
original murine model and confirm their presence in human tumors. Moreover, our results show that
the ADF phenotype depends on the reactivation of the Wnt/β-catenin pathway. Finally, tumor cells
cultivated with ADF display increased invasion abilities in 2D and 3D models. We propose that breast
tumor cells are able to force at the invasive front mature adipocytes into ADFs. This FSP1+ cell
population is then able to reach the center of the tumor to participate to the desmoplastic reaction and
to play an invasion –promoting role.
2
Introduction
Accumulating evidences indicate that tumor progression is tightly supported by tumor-stroma
interactions (1) (2). The tumor microenvironment is composed by several cell populations such as
fibroblasts, immune cells, adipocytes or endothelial cells. Malignant tumors not merely grow into a
preexisting stroma but they actively form a tumor-reactive stroma, involving cytokine secretingactivated cells, inflammation and fibrosis. Accordingly, tumors have been described as “wounds that
never heals” and they surround themselves with a permissive microenvironment for malignant growth
(3). Among these activated cells, Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) play a major role in the
growth of epithelial solid tumors. For example, Orimo et al. have recently used a co-implantation
tumor xenograft model to demonstrate that CAFs isolated from human breast carcinomas promote the
growth of breast carcinoma cells significantly more than do normal mammary fibroblasts derived from
the same patients (4). Other studies have implicated CAF in angiogenesis and metastatic process,
through the release of growth factors and chemokines and their participation to extracellular matrix
remodeling (5). Despite the well-documented role of CAF in tumor progression, there still exists a
significant ambiguity with respect to the identification of fibroblasts in the cancer tissue (6). CAFs
were first identified upon morphological criteria and αSMA (Smooth Muscle Actin α) expression, like
wound healing myofibroblasts. However, some reports have demonstrated that this marker is not
ubiquitous: a significant number of CAFs expressing FSP1 (Fibroblast Specific Protein-1) but not
αSMA (6). This large heterogeneity in marker expression for CAFs may be explained by their diverse
origin. Indeed, CAFs are variously reported to stem from resident local fibroblast, bone marrow
derived progenitor cells or trans-differentiating epithelial/endothelial cells through epigenetic
transitions (7).
In breast cancer, early local tumor invasion induce an immediate proximity of cancer cells to
adipocytes and we have recently demonstrated that invasive cancer cells dramatically impact
surrounding adipocytes (8). In fact, tumor-surrounding adipocytes exhibit in vitro and in vivo a
modified phenotype marked by a decrease in lipid content, decreased adipocyte markers expression
associated with the occurrence of an activated state characterized by overexpression of proteases,
including matrix metalloproteinase-11, and proinflammatory cytokines (8). We named these cells,
present in vivo at the tumor invasive front and that retained an adipocyte-like morphology, CancerAssociated Adipocytes (CAAs) (8) (9). As the origin of CAFs is not entirely elucidated, our
hypothesis is that during tumor evolution, peritumoral adipocytes undergo reorientation into
fibroblaste-like cells and may account for a part of the CAFs population. Independently of a tumor
context, some recent studies have shown that mature adipocytes are able to “dedifferentiate” towards
fibroblast-like cells (10) (11) (12). Although little data exist on mechanisms that could be potentially
involved in this effect, the role of soluble factors such as TNF , Wnt3a (10) or specific mitochondrial
uncoupling (11) has been described. Recombinant MMP-11 is also able to revert mature adipocyte
phenotype (13).
3
In the present study, we demonstrate for the first time, using in vitro and in vivo approaches, that
tumor cells are able to force mature adipocytes towards fibroblast-like cells. We also extensively
describe the original phenotype of these new stromal cells, named ADF for Adipocyte-Derived
Fibroblasts, expressing some CAF markers, like FSP1, and displaying invasive and migratory
capacities. Finally, using 2D and 3D collagen matrix models, we underline the abilities of ADF to
promote breast cancer cells spreading. Altogether, our data strongly suggest that ADFs are potential
key players in breast cancer progression.
Results and Discussion
Breast tumor cells are able to “dedifferentiate” mature adipocyte into fibroblast-like cells. To
explore whether mature adipocytes could be reorientated into fibroblast-like cells by tumor secretions,
we took advantage of the coculture model recently set-up in our laboratory (8). As shown in fig.1A,
mature adipocytes cocultivated for up to 8 days in the presence of the breast cancer cells SUM159PT
progressively exhibit a marked decrease in the number and size of lipid droplets (see bodipy labeling,
upper panel). After 5 days of coculture, cells progressively switch their round morphology and acquire
a fibroblastic and elongated shape that was predominant after 8 days (see phase contrast, middle
panel). These fibroblast-like cells still contained little lipid droplets as compared to pre-adipocytes
used as a control (fig. 1A, upper panel). Interestingly, when cocultivated in presence of tumor cells,
the expression of Pref-1, a protein highly expressed in preadipocytes (perinuclear and dotted staining)
and absent in mature adipocyte (14), progressively increase in cocultivated adipocytes (strong
cytoplasm staining). The accumulation of fibroblast-like cells was not associated with an increase of
preadipocyte proliferation (fig. S1A). Moreover, cocultivated adipocytes neither die nor proliferate,
suggesting that they are certainly reoriented into fibroblast-like cells (see fig. S1B). Analysis of genes
and protein expression revealed that cocultivated adipocytes progressively lose terminal differentiation
markers as exemplified by the strong decrease in adiponectin (APN) and HSL (Hormono-sensitive
lipase) expression (fig. 1B, 1C). A major decrease of resistin and leptin secretion is also observed
during coculture (see fig. 1D). Finally, the expression of two key transcription factor CEBPα and
PPARγ progressively declined in cocultivated cells (see fig. 1B and 1C). Similar results were obtained
by cocultivating adipocytes with the human breast cancer cell lines ZR 75.1 and HMT3522-T4.2 and
with the mouse mammary cell line 4T1 (fig. S1C). We also evaluated the effect of coculture on insulin
sensitivity of adipocytes. First, we found that cocultivated adipocytes exhibit a progressive decrease in
Glut-4 expression associated with a concomitant increase in Glut-1 expression (fig. 1E, 1F). After 3
days of coculture, a significant decrease in insulin-stimulated glucose transport is observed only for
low doses of insulin whereas after 8 days of coculture the insulin-stimulated glucose transport was
inhibited whatever low or high doses of insulin are used (fig. 1G). Taken together, we extensively
described long terms tumor-induced changes in adipocytes: lipid droplets loss, disappearance of
4
typical adipocyte-associated markers, occurrence of an insulin-resistant fibroblast-like cell population
expressing markers of undifferentiated phenotype. We named these cells “Adipose-Derived
Fibroblasts” (ADFs).
ADFs are found in vivo. We next investigate whether these cells might be observed in vivo. To
address this critical issue, we used a model originally developed by Green and Kehinde (15). In this
model, GFP-tagged 3T3-F442A preadipocytes are implanted subcutaneously into athymic Balb/c nude
mice, where they develop into typical fat pads after 5 weeks. The murine breast cancer cells 4T1 were
then injected into these fat pads and we performed immunohistochemical staining for GFP in fat pads
removed 10 days after injection of tumor cells (see fig. 2A for the experimental protocol). The fat pads
derived from 3T3-F442A preadipocytes exhibited histological features of adipose tissue and
adipocytes express a substantial staining for GFP, particularly in the nuclei but also in the cytoplasm,
whereas tumor cell did not (fig. 2B, upper panel). When tumor cells have been injected within the fat
pads, adipose tissue is composed of adipocytes of small size containing many small lipid droplets
associated to many elongated small cells that had lost most of their lipids with GFP-positive nuclei (as
indicated with arrows). Within the tumor, GFP-positive fibroblast-like cells appears to spread and to
interdigitate with tumor cells (fig. 2B, asterisk). Staining of the tissue sections with Masson’s
trichrome revealed an increase of collagen fibrils in the tumor grown within the fat pad whereas few
collagen fibrils were seen in tumor grown alone. In human beings, we found ADFs as fibroblast-like
cells exhibiting small lipid droplets (arrows, fig. 2C) at the invasive front of breast tumors. ADFs were
not present in the adipose tissue far from the tumor where adipocytes are much larger. Taken together,
these results show that breast tumor cells are able to “dedifferentiate” in vivo mature adipocytes
leading to marked increase in matrix proteins and increased numbers of morphologically identified
“stromal fibroblasts”. Our results show that fibroblasts derived from adipocytes are associated with the
tumor microenvironment and are a potential source of CAFs.
ADFs overexpress FSP1, but not αSMA, and exhibit a profibrotic phenotype. We then
investigated the expression in ADFs of major markers previously used to identify CAFs such as
αSMA, FAP (Fibroblast-Activated Protein) and FSP1 (6). As shown in fig. 3A, adipocytes
cocultivated with tumor cells gradually acquired FSP1 expression, in opposition to αSMA or FAP that
remain unchanged. Absence of positive regulation of αSMA expression during coculture was also
confirmed at mRNA levels using qPCR (fig. 3B). Progressive decrease in caveolin expression was
also observed during conversion of mature adipocytes into ADFs (see fig. 3C). Enhanced secretion of
ECM proteins such as type I collagen and fibronectin was also observed during adipocyte conversion
into ADFs (fig. 3D). Taken together, our results demonstrate that mature adipocytes can be reoriented
into FSP1-expressing fibroblastic cell population that could provide a dense fibrotic network for tumor
cells. These results were confirmed with mammary adipocytes derived from ex vivo differentiation of
5
progenitors purified from mammary adipose tissue of healthy donors undergoing reduction
mammoplasty. Using 6 independent donors, we showed that mammary adipocytes cocultivated with
tumor cells exhibit (i) a strong decrease in the terminal differentiation markers and the loss of lipid
droplets (ii) an actin reorganization and (iii) an increase in FSP1 expression associated with an
enhanced secretion of fibronectin, whereas the levels of αSMA and FAP remain unchanged (fig. S2).
Therefore, tumor cells can dramatically force mature 3T3-F442A adipocytes, like human adipocytes,
into fibroblast-like cells that exhibit an activated phenotype, which is associated to enhance secretion
of ECM proteins. However, this cell population does not express
SMA or FAP, two widely used
markers of CAFs, but FSP1. Interestingly, a unique FSP1 expressing cell population, whose origin
remains unknown, distinct from the
SMA+ CAFs has been described in tumor stroma from
experimentally generated tumors in mouse (6). Our data show that this cell population arises, at least
for a part, from ADFs.
The Wnt/β-catenin pathway is reactivated in ADFs. The activation of the canonical Wnt/β-catenin
pathway has been shown to induce a dedifferentiated state in mature adipocytes (10). First, using an
immunofluorescence approach, we demonstrate an increase in β-catenin expression during coculture,
associated with a redistribution from the cell membrane toward the cytoplasm (see fig. 4A). When this
pathway is activated, the β-catenin is hypo-phosphorylated and translocated into the nucleus where it
binds to the lymphoid-enhancer-binding factor/T-cell-specific transcription factor (LEF/TCF) to
activate expression of Wnt target genes (16). Accordingly, using an antibody specific for this hypophosphorylated form (dephosphorylated on Ser37 or Thr41) we show an increase of the active form of
β-catenin protein in ADFs (fig. 4A and 4B), mainly located in the nucleus. Accordingly, our results
indicate an increase of all the Wnt target genes analyzed, Dishevelled-1 (Dvl1), Wnt10b, Endothelin-1
(EDT1) and MMP7 (fig 4C). Taken together our results show the reactivation of the Wnt/β-catenin
pathway during coculture is likely to contribute to the occurrence of the ADFs. It has been recently
described for the first time that canonical Wnt activation by Wnt3a or TNF
induced a marked
dedifferentiation of both 3T3-L1 and human adipocytes (10). TNF was found to be absent from the
supernatant of all breast cancer cell lines cocultivated or not with adipocytes whereas we were able to
detect Wnt3a expression and secretion in ZR 75.1, T4-2 and SUM159PT cell lines (data not shown).
In accordance with our results, it has been described that most cancer cells lines overexpress soluble
Wnt ligands, including Wnt3a, suggesting that canonical Wnt/beta-catenin signaling is activated in
these cell lines by an autocrine mechanism (17). Within the tumor/adipocyte crosstalk, Wnt3a
represents therefore a good candidate at the origin of adipocyte reorientation that needs to be
investigated.
6
Increased spreading, migratory and invasive properties of ADFs. We then investigated the
functional properties of ADFs. As shown in fig. 5A, coculture was associated with a profound
reorganization of actin cytoskeleton, marked by the occurrence of stress fibers and the formation of
punctuate spots of vinculin at the ends of actin bundles. An increase in FAK (Focal Adhesion Kinase)
expression was also observed during coculture. Accordingly, cocultivated adipocytes, as they acquire
an ADF phenotype, progressively exhibit increase migratory (fig. 5B, left panel) and invasive (fig. 5B,
right panel) abilities. It has been previously described that cancer cells stimulate fibroblasts to
synthesize metalloproteases in a paracrine manner including mainly MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP9, MMP-11 and MMP-13 (18). As shown in fig. 5C, while MMP-2 and MMP-9 levels remain
unchanged or decrease in cocultivated adipocytes, we observe a progressive and important increase in
MMP-13 expression from 5 days of coculture (15-fold increase after 8 days, p< 0.01). Noteworthy that
MMP-1 and MMP-3 were not expressed in adipocytes cocultivated or not (data not shown) and that
MMP-11 was only transiently induced after 5 days of coculture (fig 5C). Taken together, these results
strongly suggest that the pro-invasive effect is an MMP-13 relative event. In accordance with our
results, it has been previously described that MMP-13 mRNA is expressed in a subpopulation of
myofibroblasts in invasive ductal breast carcinomas (19), but rarely in normal breast, benign breast
lesions and ductal carcinoma in situ (DCIS). Interestingly, the presence of microinvasion in DCIS is
associated with focal expression of MMP-13 mRNA in stromal fibroblasts (19) (20).
ADFs stimulate tumor cells invasive phenotype. We then investigated the effect of ADFs on tumor
cell behavior. Mature adipocytes were cocultivated with breast cancer cells for 5 days to obtain ADFs
(fig. 6A). New tumor cells were then grew alone, in the presence of mature adipocytes or in the
presence of ADFs during 3 days (fig. 6A). While ADF didn’t influence tumor cell proliferation (data
not shown), the invasive capacity of SUM159PT tumor cells toward 10 % FCS containing medium
was increased by 2.5 fold in cells previously cocultivated with ADFs as compared to tumor cells grow
alone (fig. 6B, p<0.05). Accordingly, morphological changes were also observed with vimentin
reorganization and polarization (fig. 6C) associated to actin changes. These effects were more
pronounced than with cells grew with mature adipocytes (fig. 6C). As 2D and 3D invasion model may
differ (21), we decided to confirm our result using a spheroid invasion model within a collagen matrix.
HcRed-SUM159PT cells were allowed to form a spheroid alone or mixed with GFP-3T3-F442A or
with GFP-ADF. Three weeks after, spheroids were disposed into a collagen matrix and invasion was
monitored each 24h, the maximal invasion being measured 72h after (fig. 6D). ADFs remained in the
center of the spheroids and in contrast to tumor cells that invaded the collagen matrix (fig. 6E).
According to the previous results, ADFs increased tumor cell invasion, while preadipocytes didn’t
(fig. 6E-F). The combined results indicate that, whatever the model used, ADFs strongly enhance
tumor cell invasion. According to the characterized phenotype of ADFs as FSP1 positive activated
fibroblasts, it is interesting to note that fibroblasts-produced FSP1 promotes tumor metastasis and that
7
mammary carcinoma cells injected into FSP1-/- cells showed significant delay in tumor uptake and
decreased tumor incidence (22). Co-injection of carcinoma cells with FSP1+/+ mouse embryonic
fibroblasts partially restores the kinetics of tumor development and the ability to form metastases,
underlying the role of this specific subset of stromal population in invasion processes (22).
We have previously demonstrated that invasive cancer cells dramatically impact surrounding
adipocytes and that adipocytes present at the tumor invasive front exhibit decrease in size and lipid
content and specific biological features, cells that we named CAAs (8). Our current work underlines
the extraordinary plasticity of adipocytes and shows for the first time in vitro and in vivo that tumor
secretion can force mature adipocytes into a FSP1 fibroblast cell population, that we named ADFs. In
vitro, the transition from CAAs to ADFs is time dependent (fig. 1 and 3) and the two cell populations
appear to coexist in vivo (fig. 2). Once modified at the tumor invasive front, where the crosstalk
between breast tumor and adipocytes is established, our data suggest that the ADFs, that exhibit
increase migratory and invasive abilities (fig. 5), are able to join the center of the tumor to participate
to the desmoplastic reaction. This new stromal cell population is then able to stimulate the invasion of
tumor cells as shown using 2D and 3D models (see fig. 6). The proposed mechanism to explain the
occurrence and the role of ADFs in breast cancer is summarized in fig. 7. Obesity, where the normal
balance of adipose tissue secretory proteins is perturbed, has been recently identified as a negative
prognosis factor for breast cancer. This poor prognosis seems to be independent of menopausal status,
smoking habits, tumor stage, and tumor hormone binding characteristics. Several studies pointed out
that obese women exhibit higher propensity to local invasion and distant metastasis (23-28)).
Therefore, further studies should address whether these desmoplastic reaction and these FSP1+ CAFs
are overrepresented in obese patients in which they would provide an invasion-promoting population.
Materials and Methods.
Detailed methods appear in the SI Materials and Methods.
Cell Culture. The murine 3T3F442A pre-adipocyte cell line was cultured in DMEM medium
supplemented with 10% of fetal calf serum (FCS). The differentiation was induced by incubating
confluent cells in differentiation medium (DMEM supplemented with 10% FCS plus 50 nM insulin) as
described previously for up to 14 days (29). Unless indicated, the term “adipocytes” represent cells
that have been differentiated for 7 to 10 days. To estimate the adipocyte phenotype, triglyceride
content was quantified using a colorimetric kit (Wako Chemicals), and Oil red staining was performed
as previously described (13). The SUM159PT cell line (gift of Dr J. Piette, IGMM, Montpellier,
France) was grown in Ham F12 (50:50) medium complemented with 5% FCS, 1µg/ml hydrocortisone
(Sigma, Saint-Quentin les Ulysses, France) and 0.2 UI /mL insulin. More cell lines used in this study
are described in SI Materials and Methods.
8
Coculture. Coculture between tumor cells and adipocytes were performed using a Transwell culture
system (0.4 µM pore size, Millipore). 5 x 104 (SUM159PT, 4T1, HMT3522-T4-2) or 1.5 x 105 (ZR
75.1) cells were seeded in the upper chamber of the Transwell system in the culture medium of
adipocytes and cocultivated or not with mature adipocytes for the indicated times. Medium was daily
changed. Adipocytes cultivated alone in similar conditions served as controls. After at least 5 days of
coculture, reoriented adipocytes are named ADF.
GFP-Subcutaneous Fat Pad Formation and tumor injection. GFP-3T3-F442A preadipocytes were
grown to confluence, then trypsinized and centrifuged. Cell pellets were resuspended in 200 µl of PBS
and injected into each flank of athymic nude mice, as described in (15). Mice were housed in
polypropylene cages in a light- and temperature-controlled room (12 hours/12 hours cycles, 20 ± 2°C)
with free access to food (standard pellets, Harlan Teklad, Oxon) and water. The experimental
protocols described in the study were approved by the local Institutional Animal Care and Use
Committee. Fat pad formation was allowed to proceed for 5 weeks, after which fat pads were injected
with 4x104 4T1 tumor cells under anesthesia with inhaled isoflurane. Mice with fat pad alone or tumor
cells alone were used as controls. After 7 days, mice were euthanized and fat pad or tumors were
paraffin-embedded after 48 h of fixation in buffered formalin.
References.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Mueller MM & Fusenig NE (2004) Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in
cancer. Nature reviews. Cancer 4(11):839-849.
Wiseman BS & Werb Z (2002) Stromal effects on mammary gland development and breast
cancer. Science 296(5570):1046-1049.
Dvorak HF (1986) Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma
generation and wound healing. The New England journal of medicine 315(26):1650-1659.
Orimo A, et al. (2005) Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas
promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell
121(3):335-348.
Kalluri R & Zeisberg M (2006) Fibroblasts in cancer. Nature reviews. Cancer 6(5):392-401.
Sugimoto H, Mundel TM, Kieran MW, & Kalluri R (2006) Identification of fibroblast
heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer biology & therapy 5(12):1640-1646.
Allen M & Louise Jones J (2011) Jekyll and Hyde: the role of the microenvironment on the
progression of cancer. The Journal of pathology 223(2):162-176.
Dirat B, et al. (2011) Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and
contribute to breast cancer invasion. Cancer research 71(7):2455-2465.
Dirat B, Bochet L, Escourrou G, Valet P, & Muller C (2010) Unraveling the obesity and
breast cancer links: a role for cancer-associated adipocytes? Endocrine development 19:45-52.
Gustafson B & Smith U (2010) Activation of canonical wingless-type MMTV integration site
family (Wnt) signaling in mature adipocytes increases beta-catenin levels and leads to cell
dedifferentiation and insulin resistance. The Journal of biological chemistry 285(18):1403114041.
9
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
Tejerina S, et al. (2009) Mild mitochondrial uncoupling induces 3T3-L1 adipocyte dedifferentiation by a PPARgamma-independent mechanism, whereas TNFalpha-induced dedifferentiation is PPARgamma dependent. Journal of cell science 122(Pt 1):145-155.
Matsumoto T, et al. (2008) Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit
multilineage potential. Journal of cellular physiology 215(1):210-222.
Andarawewa KL, et al. (2005) Stromelysin-3 is a potent negative regulator of adipogenesis
participating to cancer cell-adipocyte interaction/crosstalk at the tumor invasive front. Cancer
research 65(23):10862-10871.
Wang Y, Hudak C, & Sul HS (2010) Role of preadipocyte factor 1 in adipocyte
differentiation. Clinical lipidology 5(1):109-115.
Green H & Kehinde O (1979) Formation of normally differentiated subcutaneous fat pads by
an established preadipose cell line. Journal of cellular physiology 101(1):169-171.
Christodoulides C, Lagathu C, Sethi JK, & Vidal-Puig A (2009) Adipogenesis and WNT
signalling. Trends in endocrinology and metabolism: TEM 20(1):16-24.
Benhaj K, Akcali KC, & Ozturk M (2006) Redundant expression of canonical Wnt ligands in
human breast cancer cell lines. Oncology reports 15(3):701-707.
Noel A, Jost M, & Maquoi E (2008) Matrix metalloproteinases at cancer tumor-host interface.
Seminars in cell & developmental biology 19(1):52-60.
Nielsen BS, et al. (2001) Collagenase-3 expression in breast myofibroblasts as a molecular
marker of transition of ductal carcinoma in situ lesions to invasive ductal carcinomas. Cancer
research 61(19):7091-7100.
Nielsen BS, Rank F, Illemann M, Lund LR, & Dano K (2007) Stromal cells associated with
early invasive foci in human mammary ductal carcinoma in situ coexpress urokinase and
urokinase receptor. International journal of cancer. Journal international du cancer
120(10):2086-2095.
Van Goethem E, Poincloux R, Gauffre F, Maridonneau-Parini I, & Le Cabec V (2010) Matrix
architecture dictates three-dimensional migration modes of human macrophages: differential
involvement of proteases and podosome-like structures. J Immunol 184(2):1049-1061.
Grum-Schwensen B, et al. (2005) Suppression of tumor development and metastasis
formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer research 65(9):3772-3780.
Dirat B, Bochet L, Escourrou G, Valet P, & Muller C (Unraveling the Obesity and Breast
Cancer Links: A Role for Cancer-Associated Adipocytes? Endocr Dev 19:45-52.
Majed B, et al. (2008) Is obesity an independent prognosis factor in woman breast cancer?
Breast Cancer Res Treat 111(2):329-342.
Feigelson HS, et al. (2006) Adult weight gain and histopathologic characteristics of breast
cancer among postmenopausal women. Cancer 107(1):12-21.
Maehle BO, Tretli S, Skjaerven R, & Thorsen T (2001) Premorbid body weight and its
relations to primary tumour diameter in breast cancer patients; its dependence on estrogen and
progesteron receptor status. Breast Cancer Res Treat 68(2):159-169.
Berclaz G, et al. (2004) Body mass index as a prognostic feature in operable breast cancer: the
International Breast Cancer Study Group experience. Ann Oncol 15(6):875-884.
Daniell HW, Tam E, & Filice A (1993) Larger axillary metastases in obese women and
smokers with breast cancer--an influence by host factors on early tumor behavior. Breast
Cancer Res Treat 25(3):193-201.
Meulle A, Salles B, Daviaud D, Valet P, & Muller C (2008) Positive regulation of DNA
double strand break repair activity during differentiation of long life span cells: the example of
adipogenesis. PloS one 3(10):e3345.
10
Supplementary information
Cell Culture. The breast cancer cell line ZR 75.1 (gift of Pr K. Bystricky, LBME, Toulouse, France) and the
murine 4T1 cell lines (gift of Dr S. Vagner, INSERM U563, Toulouse, France) were cultured in DMEM medium
supplemented with 10% (ZR 75.1) and 5% (4T1) FCS. HMT-3522-T4-2 mammary epithelial cells (Gift of Dr E.
Liaudet-coopman, IRCM, Montpellier, France) were cultured in H14 medium (9105051 Weaver, 1997)
consisting in DMEM/F12 with 250 ng/ml insulin, 10 mg/ml transferrin, 2.6 ng/ml sodium selenite, 10-10 M
estradiol and 1.4x10-6 M hydrocortisone.
Human samples. Breast adipose tissue samples were collected from reduction mammoplasty or tumorectomy
according to the guidelines of the Ethical Committee of Toulouse-Rangueil. All subjects gave their informed
consent to participate to the study, and investigations were performed in accordance with the declaration of
Helsinki as revised in 2000. In cases of tumorectomy, the fat tissues samples obtained were close to the tumor
mass. In cases of mammoplasty, adipose tissue pieces were used for collagenase digestion as previously
described {Daviaud, 2006 #3} and centrifuged to separate adipocytes from the stroma-vascular fraction (pellet,
SVF) (20 min, RT, 1000 rpm). The SVF fraction was used for ex vivo differentiation as previously described
{Bour, 2007 #4}. Briefly, the stromal vascular pellets were incubated overnight with DMEM/Ham F12 medium
supplemented with 10% FCS. Then, the medium was replaced by an adipogenic induction medium
(DMEM/Ham's F12 (1:1) medium supplemented with 1µg/ml ciglitazone, 10 mg/ml transferrin, 33 mM biotin,
66 mM insulin, 1 nM triiodothyronine, and 17 mM pantothenate). Cells were cultivated in this condition during
3 days before the ciglitazone was removed. Cells are differentiated after 10 days of culture.
Migration and invasion assays (2D). For adipocytes: After 3 or 8 days of coculture in the presence of
SUM159PT cells, adipocytes were trypsinized and used to perform migration assay or Matrigel invasion assays
as previously described {Monferran, 2004 #5}. Cells were allowed to migrate for 24 h in transwell chambers (8
µm pore size, Greiner Bio one) towards a medium containing either 0 or 10% serum.
After this time, non-invading cells were removed from inner wells using a cotton swab and invading cells
adherent to the bottom of the filter were fixed with methanol and stained with toluidine blue. The invading cells
were dissolved in lysing solution containing 5% 2-mercaptoethanol, 20% SDS and 10% glycerol. The optical
density was then read at 570 nm using a MicroQaunt plate reader.
For tumor cells: Tumor cells were cocultivated or not with ADF or with mature adipocytes during 3 days and
used to perform Matrigel invasion assay. Cells were allowed to migrate for 4 h in transwell chambers (8 µm pore
size, Greiner Bio one) towards a medium containing either 0 or 10% serum.
Then, cells on the bottom surface of the filter were counted, after staining, under a Nikon inverted microscope in
three randomized fields of 505 mm2.
Retroviral vector and in vitro transduction. pWPXLD® is a lentiviral vector (LV) encoding the enhanced
green fluorescent protein (EGFP) under the control of the EF1-alpha promoter provided by Trono lab (Lausanne,
S). pWPHcRed encoding a far-red fluorescent protein, was derived from pWPXLD® by replacing eGFP cDNA
(BamH1-EcoR1) by HcRed cDNA (from pHcRed1, Clontech). 293T cells were kindly provided by Genethon
(France). Generation of 293T-pWPXLD or 293T- pWPHcRed and preparation of high titer LV pseudotyped with
VSV-G protein have been described previously (Delenda C. Lentiviral vectors: optimization of packaging,
transduction and gene expression. J Gene Med 2004; 6 Suppl 1: S125-38.). 50x103 cells (3T3-F442A or
SUM159PT ) were plated on 35 mm dishes 24 h prior to transduction with viral vectors at a MOI of 10:1. After
transduction (48 h) cells were either passed or harvested for FACS analysis on a Becton Dickinson FACScan to
determine transfection efficiency. Several independent stably-transfected cell lines showing constant EGFP or
HcRed expression levels as determined by FACS analysis were obtained after cloning by limiting dilution
without applying selective pressure. One of these cell lines (subsequently defined as GFP-3T3-F442A or HcRedSUM159PT) was used for the experiments reported here.
RNA extraction and quantitative RT-PCR (qPCR). Total RNAs were extracted using the RNeasy mini kit
(Qiagen). Gene expression was analyzed using real time PCR as described previously {Daviaud, 2006 #3}. Total
RNAs (1 µg) were reverse-transcribed for 60 min at 37°C using Superscript II reverse transcriptase (Life
technologies) in the presence of a random hexamer. A minus reverse transcriptase reaction was performed in
parallel to ensure the absence of genomic DNA contamination. Real time PCR was performed starting with 25
ng of cDNA and the indicated concentrations of both sense and antisense primers (presented in the Table S1 and
S2) in a final volume of 25 μl using the SYBR Green TaqMan Universal PCR master mix (Applied Biosystems).
Fluorescence was monitored and analyzed in a GeneAmp 7300 detection system instrument (Applied
Biosystems). Analysis of 18S ribosomal RNA was performed in parallel using the ribosomal RNA control
TaqMan assay kit (Applied Biosystem) to normalize for gene expression. Oligonucleotide primers were designed
using the Primer Express software (PerkinElmer Life Sciences) as previously described {Daviaud, 2006 #3}.
Antibodies and probes. The rabbit polyclonal anti-vimentin, anti-adiponectin and anti-α tubulin (clone DM1A)
mAbs were obtained from Thermoscientific. The rabbit polyclonal antibody directed against Hormone-Sensitive
Lipase (HSL) is a kind gift of Dr D. Langin (INSERM U858). The anti-β-catenin mAb (clone 14/beta-catenin)
and anti-FAK mAb were from BD Biosciences. The bodipy lipid probe was from Invitrogen as well as
rhodamine-phalloidin used to detect polymerized actin. The rabbit polyclonal anti-PPARγ, the anti-active-βcatenin mAb were provided from Millipore. The rabbit polyclonal anti-C/EBPalpaha and anti-caveolin-1 were
obtained from Santacruz. The mAb directed against Glut4 was from Cell Signaling. The rabbit polyclonal antiGlut1 was obtained from SpringBioscience. The rabbit polyclonal anti-Wnt3a, anti-Pref1, anti-FAP, anti-FSP1
and the rabbit monoclonal (E184) anti-αSMA were obtained from Abcam. The anti-vinculin mAb (hVIN-1) was
from Sigma-aldrich. The mAb directed against Fibronectin (FBN11) was from Fischer Scientific. The rabbit
polyclonal anti-Collagen 1 was from Chemicon. The goat antibody directed against GFP used in
immunohistochemistry was from Roche. Secondary antibodies (for immunofluorescence) were Goat anti-mouse
or goat anti-rabbit IgG F(ab’)2 fragment AlexaFluor-488 conjugated ( obtained from Invitrogen). TO-PRO-3 was
used as a final 1µM concentration and was from obtained from Invitrogen.
Western blot analysis. Whole cell extracts and immunoblots were prepared as previously described {Muller,
2001 #8}. All the antibodies used in this study are presented in “Antibodies and probes” section.
Immunofluorescence, immunohistochemistry and determination of adipokines secretion. Adipocytes and
SUM159PT grown on coverslips, cocultivated or not, 3, 5 or 8 days after, cells were fixed in 3.7%
paraformaldehyde for 20 min at room temperature (RT). After blocking with 10% FCS and 2% BSA in PBS for
1 hour, cells were incubated 2 hours at RT with the corresponding antibody, described in “Antibodies and
probes” section. Actin filaments were stained with rhodamin-phalloidin for 30 min. Cells were then washed three
times with PBS-2% FCS and incubated with secondary antibody and TO-PRO-3 for 30 min. After three washes
with PBS, cells were mounted in Vectashield medium (Abcys). Fluorescence images were acquired with a
confocal laser microscopy system (Leica SP2). The image resolution was 512 x 512 pixels and scan rate was 400
Hz. For each sample, over 100 cells were examined in at least three independent experiments.
Immunohistochemistry was performed as previously described {Andarawewa, 2005 #2}. Adjacent sections were
stained with Haematoxylin & Eosin or Masson's trichrome, to visualize collagen fibers. Images were captured on
a Leica DMRA2. Concentration of secreted factors in supernatants was determined using the Xmap Technology
(Luminex), with a Milliplex Kit (Millipore).
Insulin-resistance experiments. Differentiated adipocytes were cocultivated or not during 3 and 8 days with
SUM159PT cells. Then, adipocytes were starved of serum 2 hours and were preincubated for 30min at 37°C in
0.5ml of Krebs–Ringer buffer (120mM NaCl, 6mM KCl, 1mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 1mM NaH2PO4 and
1mM Na2HPO4) supplemented with 12.5mM Hepes, 3.5% (w/v) BSA and 2mM pyruvate (pH7.4), and gassed
with O2/CO2 (19:1). After this period, fresh buffer containing various concentrations of insulin (50nM to 100nM)
were incubated with the cells for 45min. A glucose transport assay was then started by addition of 100µl of a 2deoxyglucose isotopic dilution (containing 0.2µCi of 2-deoxy[3H]glucose) at a final concentration of 140µM.
The assay was carried out for 10min, after which the radioactive solution was aspirated and cells were rinsed
with ice-cold PBS containing 10mM glucose. Cells were rinsed several times with PBS, treated with 0.5ml of
0.05M NaOH and counted for radioactivity. Non-specific glucose uptake was determined by addition of 40µM
cytochalasin B prior to 2-deoxyglucose administration.
Spheroids formation and invasion in a 3D collagen matrix. The hanging-drop method has been adapted to
produce spheroids of similar diameter {Del Duca, 2004 #9}. Drops (20 μl) containing 1000 tumor cells alone or
mixed with 1000 ADFs or preadipocytes were suspended on the lid of agar coated 24-well dishes containing 500
μl of culture media. After the 7 days required for cell aggregation, the spheroids were transferred to the bottom
of the well containing 500 μl of culture medium. Multicellular spheroids were then allowed to grow for 7 days
and the spheroids used in the invasion experiments have an average diameter around 500 μm.
The spheroid invasion was performed as previously described {De Wever, 2004 #10}. Briefly, Nutragen (2 and
4 mg/ml final concentrations) was added to a mixture of 10% (v/v) MEM eagle 103 (MEM; Invitrogen,
Carlsbad, CA), deionized water, and 4–6% (v/v) of 7.5% sodium bicarbonate buffer (pH 9) (Invitrogen) {Van
Goethem, 2010 #20}. Twenty µl of this solution is poured in wells of a 96 wells-plate, the spheroid cells were
suspended in the remaining collagen type I solution and then transferred into the wells. After collagen gelation,
500 µl of culture medium was carefully added. In this experiment, we used far-red fluorescent SUM159PT
(HcRed-SUM159PT), GFP-preadipocytes and GFP-ADF. We scored invasion every day by imaging spheroids,
up to 72 h. Invasion was scored by two independent observers.
Statistical analysis. The statistical significance of differences between the means (at least three independent
experiments) was evaluated using Student's t test, performed using Prism (GraphPad Inc.). p values below 0.05
(*), <0.01 (**) and <0.001 (***) were deemed as significant while “NS” stands for not significant.
Name
Adipsin
Forward
GCCTGATGTCCTGCATCAACT
Reverse
GCGCAGATTGCAGGTTGTC
Concentrations (nM)
300
Adiponectin (APN)
TGGAATGACAGGAGCTGAAGG
TATAAGCGGCTTCTCCAGGCT
900
Ap2
TTCGATGAAATCACCGCAGA
GGTCGACTTTCCATCCCACTT
900
HSL
GGCTTACTGGGCACAGATACCT
CTGAAGGCTCTGAGTTGCTCAA
900
C/EBPα
CAAGAACAGCAACGAGTACCG
GTCACTGGTCAACTCCAGCAC
100
PPARγ
CCGAAGAACCATCCGATTGA
TTTGTGGATCCGGCAGTTAAG
900
Glut4
CCGGATTCCATCCCACAAG
CATGCCACCCACAGAGAAGA
300
Glut1
GGTGTGCAGCAGCCTGTGT
CACAGTGAAGGCCGTGTTGA
300
αSMA
GGAGAAGCCCAGCCAGTCGC
AGCCGGCCTTACAGAGCCCA
900
Dvl-1
CCTTCCATCCAAATGTTGC
GTGACTGACCATAGACTCTGTGC
100
Wnt10b
ATGCGGATCCACAACAACAG
TGACGTTCCATGGCATTTG
300
Endothelin-1 (EDT-1)
CCTG-GACATCATCTGGGTC
TGTGGCCTTATTGGGAAG
900
MMP7
CACTCACTGGGTCCTCCATT
GAAGAGGGAAACAGGTGCAG
900
MMP13
GATGATGAAACCTGGACAAGTAGTTC
GAACTCATGCGCAGCAACA
900
MMP2
CATCTCAGCCCGCCTAGTG
AGGAAGTGACTGGGCATGATCT
300
MMP9
TGAGTCCGGCAGACAATCCT
CGCCCTGGATCTCAGCAATA
3000
MMP11
GCCCTCATGTCCCCTTTCTAC
CCTTCGGTCATCTGGGCTAA
900
Table S1. Sequences and concentrations of the primers used to detect murine genes expression using qPCR.
Name
aP2
Forward
GCATGGCCAAACCTAACATGA
Reverse
CCTGGCCCAGTATGAAGGAAA
Concentrations (nM)
300
C/EBP-α
ACCCTCAGCCTTGTTTGTACTGTAT
GGACTGATCGTGCTTCGTGTT
300
HSL
PPARγ
GTGCAAAGACGGAGGACCACTCCA GACGTCTCGGAGTTTCCCCTCAG
GAACCACCGCACGATGTTG
AAGTCGAACACGCTGCTGAA
Table S2. Sequences and concentrations of the primers used to detect human genes expression using qPCR.
900
900
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
75
76
Au cours de mon doctorat, je me suis intéressée au rôle des adipocytes présents dans le
microenvironnement des tumeurs mammaires. Lorsque je suis arrivée au laboratoire, Béatrice Dirat
venait de démontrer l’existence d’un dialogue réciproque entre les cellules tumorales mammaires et
les adipocytes. Mes premiers travaux ont donc consisté à l’analyse de cette interaction afin de
décrire son effet sur les deux types cellulaires. Ce travail a permis de mettre en évidence un
nouveau phénotype adipocytaire, que nous avons appelé CAA. Dans un deuxième temps, j’ai pu
établir que les CAAs, en plus d’influencer l’invasion des cellules tumorales, modulent également la
radiosensibilité des cellules tumorales. Enfin, j’ai montré qu’un contact paracrine prolongé entre les
adipocytes et les cellules tumorales mammaires induit des modifications encore plus importantes
des CAAs, qui acquièrent une forme fibroblastique et sont appelés des ADFs. J’ai alors étudié (i) le
phénotype des ADFs en le comparant au phénotype des fibroblastes péri-tumoraux retrouvés dans
les tumeurs, (ii) l’effet pro-invasif des ADFs sur les cellules cancéreuses. Dans l’ensemble, ces
résultats indiquent clairement que le dialogue entre les adipocytes et les cellules tumorales est à
l’origine de profondes altérations des deux populations, ce qui contribue à la progression tumorale.
Les adipocytes péri-tumoraux influencent la progression tumorale.
Au cours de ce travail, j’ai pu montrer que les adipocytes péri-tumoraux peuvent moduler plusieurs
étapes de la progression tumorale mammaire : prolifération, migration, invasion et réponse aux
thérapies anti-cancéreuses. De plus, certains arguments suggèrent qu’ils pourraient également
moduler l’angiogenèse.
In vitro, nos résultats indiquent que les adipocytes sont susceptibles de favoriser la prolifération
tumorale. En revanche, cet effet dépend de la lignée tumorale utilisée. Ainsi, les adipocytes
influencent la prolifération des lignées SUM159PT (Dirat et al., 2011) et MDA-MB-231 (résultats
non montrés), mais pas celle des autres lignées mammaires humaines ou murines disponibles au
laboratoire, qu’elles possèdent ou non le récepteur aux estrogènes. Ils secrètent cependant de
nombreux facteurs de croissance et possèdent une activité aromatase importante susceptible de
fournir des estrogènes aux tumeurs qui possèdent leur récepteur. Ainsi, certaines études ont mis en
évidence un effet mitogénique du tissu adipeux sur la tumeur, notamment dans un contexte
d’obésité (White et al., 2010) (Grisouard et al., 2011) (Kaneko et al., 2010). En effet, les patientes
atteintes d’obésité ont souvent des tumeurs mammaires de taille plus importante que les patientes
non obèses (Cui et al., 2002) (Maehle et al., 2001) (Daling et al., 2001). Cet effet a été attribué aux
adipokines, à l’activité aromatase des adipocytes, ou encore à l’hyper-insulinémie résultant de
l’hypertrophie des adipocytes. Le fait que nous ne retrouvions pas obligatoirement un effet proprolifératif des adipocytes pourrait s’expliquer d’une part, parce que le milieu de culture ne contient
77
pas d’androgènes susceptibles d’être convertis en estrogènes par l’aromatase (différence in vitro/in
vivo) ; d’autre part, par le fait que nos lignées cellulaires prolifèrent de façon excessive, du fait de
leur transformation, masquant un possible effet des adipokines ; enfin, cet effet pourrait dépendre
du type de tumeur considéré.
A la différence de l’effet sur la prolifération, nos résultats indiquent que les adipocytes
influencent clairement et systématiquement l’invasion des cellules tumorales in vitro et in vivo.
In vivo, des cellules tumorales ayant été co-cultivées avec des adipocytes différenciés et injectées
dans la queue des souris induisent la formation d’un plus grand nombre de métastases pulmonaires
que des cellules non co-cultivées (Tail vein assay). In vitro, des cellules tumorales co-cultivées soit
avec des adipocytes différenciés soit avec des ADFs deviennent invasives dans une chambre de
Boyden recouverte de matrigel. Enfin, lorsque les cellules cancéreuses sont associées à des ADFs
dans un sphéroïde mixte, elles présentent des capacités invasives accrues dans une matrice de
collagène.
Les mécanismes à l’origine de ces observations ne sont pas clairement élucidés. Dans un premier
temps, nous avons montré qu’un anticorps bloquant anti-IL-6 diminue l’augmentation de l’invasion
induite par les adipocytes. Ceci suggère que l’effet observé est attribuable, au moins en partie, à
l’IL-6 secrétée par les adipocytes péri-tumoraux. Cette cytokine est décrite pour favoriser la
prolifération des cellules tumorales, ainsi que l’invasion et la formation des métastases. En effet,
elle est capable d’induire la TEM des cellules cancéreuses, à travers l’activation du facteur de
transcription STAT-3 (Sasser et al., 2007) (Sullivan et al., 2009). Ceci est en accord avec nos
résultats puisque la co-culture avec des adipocytes induit une TEM des cellules tumorales (qui reste
toutefois incomplète), associée une diminution de l’expression de la protéine E-Cadhérine. La
leptine est également capable d’activer de nombreux facteurs de transcription dans les cellules
cancéreuses, dont STAT-3, et influence ainsi la dissémination métastatique (Park et al., 2011). Elle
pourrait donc également jouer un rôle dans l’effet pro-invasif des adipocytes.
Les adipokines pourraient également influencer l’invasion tumorale en modifiant les sécrétions des
cellules cancéreuses, notamment en induisant la libération de MMPs. En effet, de nombreuses
cytokines secrétées par les adipocytes, comme l’IL-1β, le TNFα ou encore l’IL-6 sont décrites
comme induisant l’expression et la sécrétion de MMPs (MMP-2,-9,-13) (Mano et al., 2009) (Mak et
al., 2009) (Wright and Friedland, 2004) (Mak et al., 2010). Nos résultats indiquent que les cellules
tumorales co-cultivées avec des adipocytes différenciés ou avec des ADFs expriment des quantités
plus importantes de MMP-13 que les cellules non co-cultivées (résultats non publiés obtenus dans
notre laboratoire). Cette protéine est une collagénase capable de cliver le collagène pour permettre
la progression cellulaire à travers la MEC. De manière intéressante, les CAAs et les ADFs
78
expriment aussi des MMPs (les CAAs expriment la MMP-11 et les ADFs expriment la MMP-11 et
la MMP-13). Ils pourraient ainsi contribuer au remodelage de la MEC nécessaire à l’invasion des
cellules cancéreuses.
Récemment, le métabolisme lipidique des tumeurs a été impliqué dans de nombreux processus, dont
l’invasion tumorale. Ainsi, nous suggérons que la délipidation des adipocytes libèrerait dans
l’environnement les lipides sous forme d’acides gras, qui seraient captés par les cellules tumorales
et leur permettraient d’acquérir des capacités invasives (Dirat Béatrice, Wang YuanYuan, résultats
non publiés). De nombreuses études se sont intéressées au métabolisme des cellules cancéreuses, en
se concentrant sur le métabolisme glucidique. Comme nous l’avons déjà évoqué, les cellules
tumorales privilégient la glycolyse suivie de la fermentation lactique plutôt que la phosphorylation
oxydative (effet Warburg), ce qui favorise la progression tumorale. Pourtant, le métabolisme des
lipides semble également être très important pour le développement de la tumeur et la dissémination
métastatique. En effet, les acides gras libres ont récemment été impliqués dans les processus de
migration et d’invasion. L’augmentation des acides gras dans les cellules tumorales diminue
l’adhésion cellulaire, modifie la morphologie de la membrane, facilite l’extravasation grâce à des
changements de la polarité cellulaire, active certaines voies de signalisation comme la voie de
l’acide phosphatidique, de l’acide lysophosphatidique et des prostaglandines E2 qui favorisent
l’invasion (Ren et al., 2006) (Nomura et al., 2010) (Le et al., 2009). Enfin, les acides gras peuvent
être utilisés dans le cycle de la β-oxydation afin de produire de l’énergie nécessaire à la progression
tumorale (Buzzai et al., 2005).
Certains arguments suggèrent que la présence permanente, en continu, des adipocytes n’est
pas nécessaire pour observer une augmentation de l’invasion des cellules tumorales :
-
Lors des expériences in vivo (Tail vein assay), les cellules tumorales préalablement co-
cultivées ont des capacités invasives augmentées, alors qu’elles ne sont plus en présence des
adipocytes.
-
En 3D, nous avons réalisé des sphéroïdes composés, soit de cellules tumorales seules
préalablement co-cultivées (résultats non montrés), soit d’ADFs et de cellules tumorales cocultivées. Nous n’avons observé aucune différence entre ces deux conditions, dans les deux cas
l’invasion étant augmentée par rapport à des cellules tumorales non co-cultivées. Ainsi, des cellules
ayant été mises en présence des adipocytes, avant l’expérience d’invasion, acquièrent et gardent des
propriétés invasives.
-
Au cours de ces expériences en 3D, nous avons utilisé des cellules fluorescentes afin de
pouvoir suivre leur localisation au sein du sphéroïde et de la matrice de collagène. Il s’avère que les
79
ADFs se regroupent au centre du sphéroïde et ne migrent pas avec les cellules tumorales qui
semblent se déplacer par elles-mêmes, sans le soutien des secrétions adipocytaires.
En réalité, dans ces expériences, ce sont les cellules filles qui sont amenées à envahir
l’environnement, après la prolifération des cellules parentales préalablement co-cultivées. La
présence des adipocytes induit donc l’acquisition de nouvelles propriétés d’invasion des cellules
tumorales transmises à la descendance. On pourrait alors envisager que les adipokines induisent des
modifications épigénétiques de certains gènes impliqués dans l’invasion tumorale (comme les gènes
codant pour certaines MMPs ou pour des protéines de surface comme les intégrines par exemple).
Mais peu de travaux ont étudié la régulation des modifications de la chromatine par des signaux
extracellulaires. L’équipe du Dr Mina Bissell a néanmoins établi un lien entre des signaux
provenant de la MEC et le taux d’acétylation des histones dans les cellules tumorales (Spencer et
al., 2007). Dans notre étude, il serait donc intéressant d’analyser l’activité des protéines impliquées
dans la régulation génique comme les Histones désacétylases ou acétylases, dans des cellules cocultivées ou non avec les adipocytes. On pourrait ensuite réaliser cette même étude chez l’Homme,
dans des tumeurs mammaires influencées profondément par les adipocytes (chez des patientes
obèses) en comparant les résultats à des tumeurs développées chez des patientes non obèses.
Les adipocytes peuvent également influencer la dissémination métastasique en modulant
l’angiogenèse tumorale. Comme nous l’avons vu dans l’introduction, de nombreuses adipokines
favorisent la vascularisation, comme les facteurs de croissance, la leptine ou encore l’adiponectine.
Il serait donc intéressant d’étudier la vascularisation de tumeurs de patients obèses, comparé à celle
observée chez des patients non obèses.
Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai pu montrer que les adipocytes différenciés protègent les
cellules tumorales de la mort cellulaire radio-induite. Ces résultats sont en accord avec les
données épidémiologiques qui indiquent qu’en cas d’obésité, il y a une augmentation du risque de
rechute et de la mortalité chez des patientes obèses traitées pour un cancer du sein par chirurgie et
radiothérapie (Carmichael, 2006).
Cet effet n’est pas directement dû à l’action protectrice des adipokines, mais plutôt aux sécrétions
tumorales induites par les adipokines. En effet, des cellules tumorales co-cultivées puis irradiées
restent radio-résistantes, même si elles sont séparées des adipocytes post-irradiation. Ainsi, les
adipocytes modifient le profil sécrétoire des cellules tumorales co-cultivées, qui secrètent alors de
l’IL-6 agissant de façon autocrine pour se protéger de la mort radio-induite. Cette cytokine, où
plutôt le réseau de cytokines pro-inflammatoires dans son ensemble (IL-6, TNFα, IL-1β) est décrit
80
pour activer de nombreuses voies de signalisation favorisant la survie en réponse aux RI (NFκB,
PI3K/Akt, STAT, etc.) (Deorukhkar and Krishnan, 2010). Par un mécanisme non élucidé pour
l’instant, nous avons montré que l’IL-6 induit une hyper-phosphorylation de la protéine Chk1,
impliquée dans l’arrêt du cycle cellulaire en cas de dommages de l’ADN, et ce dans les cellules
tumorales exposées aux RI. Ceci engendre un arrêt prolongé des cellules irradiées en phase G2/M
du cycle cellulaire (résultats non montrés). Ces résultats sont en accord avec ceux de Jin et al. qui
ont révélé qu’un traitement de cellules leucémiques par les cytokines EPO ou IL-3 activait la voie
de signalisation Akt/GSK-3 augmentant ainsi la phosphorylation de Chk1 et la durée de la phase
G2/M, conduisant à l’émergence d’un phénotype chimiorésistant (Jin et al., 2005). Sachant que
l’IL-6 est aussi capable d’activer ces voies, il serait intéressant d’analyser le profil d’expression ou
d’activation de protéines impliquées dans les cascades de signalisation Akt/GSK-3 dans notre
modèle de radiorésistance. Il faudrait également évaluer l’importance de l’hyper-activation de Chk1
dans la radiorésistance induite par la présence des adipocytes, en utilisant par exemple des
inhibiteurs de cette protéine (UCN-01) ou une approche d’ARNi. D’autres travaux ont révélé que
l’augmentation de l’activation de Chk1 permettait aux cellules de devenir chimiorésistantes et/ou
radiorésistantes (Tao et al., 2009) (Niida et al., 2007) (Jin et al., 2005). Ainsi, l’effet que nous avons
mis en évidence n’est pas forcément limité aux RI mais peut être étendu à d’autres stratégies anticancéreuses comme la chimiothérapie. Une étude a d’ailleurs mis en évidence que les sécrétions
adipocytaires protègent des cellules leucémiques de l’apoptose induite par la chimiothérapie,
notamment en induisant une augmentation de l’expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et
Pim-2 (Behan et al., 2009). Les protocoles les plus employés dans le traitement du cancer du sein
utilisent le 5-fluoro-uracile, le cyclophosphamide, la doxorubicine ou encore le taxol. L’efficacité
de toutes ces molécules, hormis celle du taxol, est augmentée in vitro dans des cellules ayant un
checkpoint défectueux, notamment dans le cas d’une protéine Chk1 non fonctionnelle (Ganzinelli et
al., 2008) (Parsels et al., 2004) (Goldstein et al., 2008) (Kawakami et al., 2011) (Agner et al., 2005).
Il serait donc intéressant de comparer les survies cellulaires en réponse à ces drogues de cellules
tumorales co-cultivées ou non avec des adipocytes.
Chez la souris, l’irradiation de tumeurs après une greffe hétérotopique dans le tissu adipeux nous
permettrait de confirmer in vivo les résultats que nous avons obtenus in vitro. L’effet radioprotecteur des adipocytes pourrait d’ailleurs s’avérer important car des résultats obtenus
précédemment dans le laboratoire par Aline Meulle ont démontré que les adipocytes étaient des
cellules extrêmement radiorésistantes (Meulle et al., 2008). Ainsi, le dialogue paracrine établi avec
les cellules tumorales pourrait donc perdurer même après l’irradiation, du fait de la survie des
adipocytes.
81
Les adipocytes sont profondément modifiés en présence des cellules tumorales.
Les résultats obtenus au cours du doctorat de Béatrice Dirat ainsi que les miens ont mis en évidence
d’intenses modifications des adipocytes péri-tumoraux in vitro et in vivo. En effet, dans un premier
temps, nous avons montré qu’après 3 jours de co-culture les adipocytes adoptent un phénotype de
CAA, caractérisé par une diminution du contenu lipidique et la sécrétion de molécules proinflammatoires. Ces cellules ont été retrouvées au front invasif des tumeurs mammaires humaines.
Dans un deuxième temps, j’ai prolongé la co-culture jusqu’à 5 puis 8 jours et défini le phénotype
d’ADF. Lors de la réorientation en ADFs, les cellules perdent complètement leur contenu lipidique
ainsi que l’expression des marqueurs adipocytaires, et acquièrent certaines propriétés communes
avec celles des CAFs. Des arguments suggèrent que les ADFs pourraient se trouver au sein des
tumeurs mammaires humaines.
Les mécanismes à l’origine de la réorientation des adipocytes différenciés en CAA puis en
ADF ne sont pas complètement élucidés. Nos résultats suggèrent un rôle de la voie Wnt/βcaténine dans cet effet, car cette voie est activée de façon précoce dans les adipocytes co-cultivés et
des travaux ont montré que cette activation induit la dédifférenciation des adipocytes (Gustafson
and Smith, 2006). A la recherche de la (ou des) molécules impliqué(es), nous nous sommes
intéressés au TNFα, cette cytokine étant décrite comme activant la voie Wnt/β-caténine (Gustafson
and Smith, 2006). Nos résultats sont en accord avec ceux obtenus par l’équipe citée précédemment
car l’ajout de TNFα dans le milieu de culture induit la dédifférenciation des adipocytes en cellule de
type fibroblastique (Camille Lehuédé, résultats non publiés). Mais les tests ELISA que nous avons
réalisé indiquent que le TNFα est indétectable dans le surnageant de cellules tumorales co-cultivées.
A l’inverse, la sécrétion d’IL-6 par les cellules tumorales augmente en co-culture. Cependant, dans
notre modèle, l’ajout d’IL-6 dans le milieu de culture ne reproduit pas les effets de la co-culture sur
les adipocytes différenciés (Camille Lehuédé, résultats non publiés). Enfin, nous avons pu montrer
que le facteur Wnt3a est secrété par les cellules tumorales. Sachant que cette protéine induit un
phénotype fibroblastique dans des adipocytes différenciés en activant la voie Wnt/β-caténine
(Gustafson and Smith, 2010), il est fort probable que Wnt3a soit un acteur principal de la
réorientation des adipocytes dans un contexte tumoral. Afin de vérifier l’implication de Wnt3a,
nous devons inhiber cette protéine dans le système de co-culture grâce à l’utilisation d’anticorps
bloquants ou utiliser des protéines Wnt3a recombinantes sur des adipocytes différenciés. Ces
résultats pourraient ensuite être confirmés in vivo dans le modèle de « fat pad » que nous avons mis
au point chez la souris immunodéprimée. Il serait intéressant d’injecter des cellules tumorales
préalablement transfectées avec des shRNA dirigés contre Wnt3a dans le « fat pad », et d’observer
si une disparition des CAAs et des ADFs s’effectue au sein du tissu tumoral. D’autres protéines
82
Wnt sont susceptibles d’avoir un rôle dans la réorientation, comme Wnt10b ou Wnt1 par exemple.
Il serait astucieux d’étudier leur profil d’expression dans des cellules tumorales co-cultivées ou non
avec des adipocytes.
D’autres arguments suggèrent que les activateurs de la voie Wnt/β-caténine sont secrétés par les
cellules tumorales et jouent un rôle majeur dans le dialogue paracrine. En effet, nous avons présenté
cette voie dans l’introduction comme étant active dans les pré-adipocytes et comme inhibant la
différenciation adipocytaire. Des résultats obtenus dans notre laboratoire (résultats non publiés)
ainsi que dans d’autres équipes ont montré que les cellules tumorales inhibent l’adipogenèse (Meng
et al., 2001). Les protéines MMP-11, IL-11 et TNFα ont été impliquées dans cet effet, mais nous ne
pouvons pas exclure la participation d’autres acteurs comme les protéines Wnts.
En dehors des ligands Wnt, cette voie peut être activée par d’autres signaux. En effet, nous avons
déjà vu que la protéine GSK-3β a un rôle important puisque lorsqu’elle est activée, elle phosphoryle
la β-caténine qui est alors dégradée par le protéasome. Les signaux modulant l’activation de GSK3β, qui peuvent alors influencer la voie Wnt/β-caténine, sont nombreux et peuvent être secrétés par
les cellules tumorales (interleukines, facteurs de croissance) (Rosas et al., 2005) (Coghlan et al.,
2000) (Papkoff and Aikawa, 1998). La voie du TGFβ, par exemple, est liée aux voies Akt/GSK-3β
et favorise la translocation de la β-caténine du cytoplasme vers le noyau, augmentant ainsi
l’accumulation intra-nucléaire de cette protéine (Wang et al., 2009) (Guo et al., 2008) (Shao et al.,
2011) (Satterwhite and Neufeld, 2004). Cette coopération entre les voies du TGFβ et Wnt/βcaténine est, de plus, liée à l’inhibition de la différenciation adipocytaire (Zhou et al., 2004). Ainsi,
l’hypothèse d’un rôle du TGFβ dans notre modèle n’est pas à exclure. Une étude récente a montré
que le TGFβ d’origine macrophagique était capable d’induire un phénotype activé dans les préadipocytes (sécrétion de molécules pro-fibrotiques, augmentation des capacités d’invasion, etc.)
(Keophiphath et al., 2009). Ce même phénotype est retrouvé lorsque les pré-adipocytes sont cocultivés avec les cellules tumorales dans notre modèle. De plus, des travaux récents ont impliqué le
TGFβ d’origine tumoral dans la trans-différenciation de cellules souches adipocytaires en CAFs
(Jotzu et al., 2011) ou de cellules étoilées du foie en myofibroblastes prolifératifs, migratoires et
capables d’augmenter la croissance de métastases hépatiques (Kang et al., 2011). Il conviendrait
donc de mesurer la sécrétion de TGFβ dans le surnageant des cellules tumorales et d’étudier
l’activation de la protéine GSK-3β dans les CAAs et dans les ADFs.
Récemment, de nouveaux activateurs de la voie Wnt/β-caténine ont été découverts : les protéines de
la famille R-Spondin (R-Spondin 1, 2, 3 et 4). Bien que le rôle de ces protéines comme agonistes de
la voie soit maintenant clairement établi, leur mécanisme d’action n’est pas complètement élucidé.
Il semblerait que les R-Spondin agissent en synergie avec Wnt3a pour activer la voie. Un des
mécanismes d’action proposé est qu’en l’absence de R-Spondin, l’antagoniste dickkopf-1 sature les
83
co-récepteurs LRP et freine l’activation de la voie. La protéine R-Spondin inhibe la liaison
dickkopf-1/LRP et le récepteur est libre pour accueillir les ligands Wnt (Kim et al., 2006) (Binnerts
et al., 2007). Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire indiquent que les cellules tumorales
expriment les R-Spondines 1 et 3, sachant que l’expression de la R-Spondine 3 est augmentée en
co-culture (Camille Lehuédé, résultats non publiés). Nous devons donc étudier leur sécrétion et,
grâce à des protéines recombinantes et/ou des ARNi dirigés contre les R-Spondines, déterminer si
elles ont un rôle dans la réorientation.
De façon intéressante, certains arguments suggèrent que l’effet observé dans les adipocytes est peutêtre non-spécifique des cellules tumorales. En effet, la co-culture de cellules endothéliales avec des
adipocytes induit une profonde modification des adipocytes, associée à une lipolyse (Choi et al.,
2011). De plus, comme nous l’avons déjà vu, les secrétions macrophagiques activent les préadipocytes (Keophiphath et al., 2009), qui adoptent un phénotype similaire aux pré-adipocytes cocultivés avec des cellules tumorales (résultats non publiés). Ainsi, parmi les signaux qui peuvent
être communs à toutes ces expériences, on retrouve les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les
ROS régulent aussi la voie Wnt/β-caténine à travers la modulation de GSK-3β et de Dvl-1
(Hoogeboom and Burgering, 2009). Enfin, des travaux récents ont impliqué les ROS dans des
processus de trans-différenciation puisqu’ils sont capables d’induire la transformation de
fibroblastes en myofibroblastes (Toullec et al., 2010) (Lisanti et al., 2011). Cependant, le rôle des
ROS dans l’adipogenèse reste controversé, certains travaux indiquent un effet pro-adipogénique,
alors que d’autres leur prêtent un rôle inhibiteur (Imhoff and Hansen, 2010) (Guo et al., 2006). Il
serait donc intéressant de quantifier les ROS dans notre modèle et de déterminer leur rôle dans le
dialogue paracrine, notamment en utilisant des agents anti-oxydants.
En conclusion, les secrétions tumorales sont à l’origine de la réorientation des adipocytes,
probablement à travers l’activation de la voie Wnt/β-caténine. Des travaux supplémentaires sont
nécessaires afin d’identifier les signaux à l’origine de ces effets. Il est important de souligner que
certains de ces signaux peuvent provenir de sécrétions autocrines. En effet, on pourrait envisager
que les adipocytes sont modifiés par les cellules tumorales et se mettent alors à secréter des
molécules à l’origine de la réorientation (comme Wnt3a par exemple).
84
Un nouveau phénotype adipocytaire : les ADFs.
Une grande partie de mon dernier axe de recherche a consisté à définir le phénotype des ADFs, en
termes de morphologie, de secrétions et de capacités fonctionnelles.
Les premières caractéristiques que nous avons observées sont la perte des marqueurs adipocytaires,
un allongement de la forme de la cellule et l’acquisition progressive d’une insulino-résistance. Ces
résultats suggèrent que les ADFs, au sein de la tumeur, ne sont pas capables de capter le glucose,
pouvant donc induire localement une hyperglycémie et une hyper-insulinémie. L’insuline est
capable d’agir directement sur les cellules tumorales pour activer leur prolifération. Comme nous
l’avons déjà évoqué dans la discussion de ce manuscrit, il serait intéressant d’évaluer l’effet in vivo
des ADFs sur la croissance de la tumeur, ainsi que de mesurer l’insulinémie dans le tissu tumoral.
L’augmentation du taux de glucose est également susceptible d’influencer le développement
tumoral. En effet, ce sucre est utilisé par la cellule cancéreuse qui, du fait de son métabolisme
particulier (effet Warburg), en catabolise des quantités très importantes. Le stroma tumoral pourrait,
de cette façon, participer au métabolisme de la tumeur en lui fournissant des métabolites. Cette
hypothèse est corrélée aux travaux de l’équipe du Pr Michael Lisanti, pour qui « le stroma nourrit la
tumeur ». Comme nous l’avons vu précédemment, leurs résultats suggèrent que les cellules
tumorales induisent un stress oxydatif responsable de la transformation des fibroblastes adjacents en
myofibroblastes (Martinez-Outschoorn et al., 2010a). Des mécanismes d’autophagie sont ensuite
activés dans ces cellules stromales, à l’origine de la perte des cavéoles et des mitochondries,
contraignant les CAFs à utiliser la glycolyse aérobie et à libérer des métabolites riches en énergie
comme le lactate (ce phénomène a été appelé « Effet Warburg Reverse ») (Martinez-Outschoorn et
al., 2010c). Ce métabolite est activement utilisé par les cellules cancéreuses pour fournir de
l’énergie à travers l’activation du cycle de l’acide citrique. La perte de la cavéoline-1 (protéine
majoritaire des cavéoles) dans les fibroblastes péri-tumoraux est donc un biomarqueur du stress
oxydatif et de l’autophagie du stroma (Martinez-Outschoorn et al., 2010b). De façon intéressante,
nous avons montré une perte de l’expression de la cavéoline-1 dans les ADFs. Nous pourrions
vérifier les hypothèses de l’équipe du Pr Michael Lisanti dans notre modèle en évaluant la libération
de lactate ou l’autophagie dans les ADFs et en contrôlant in vivo la perte de la cavéoline-1 dans les
ADFs. De plus la perte de cette protéine dans les fibroblastes péri-tumoraux est un indicateur
pronostique indépendant chez les patientes atteintes de cancer du sein, associée à des récidives
précoces de la maladie, aux métastases ganglionnaires et à une résistance à la chimiothérapie
(Witkiewicz et al., 2009).
85
In vivo, l’identification des ADFs a été un réel défi. Cette étape était cependant nécessaire afin de
valider l’hypothèse de la réorientation des adipocytes au sein des tumeurs. Nous avons montré in
vitro que ces cellules perdent l’expression de tous les marqueurs adipocytaires (Adipsine,
Adiponectine, Ap2, LHS, Glut4) mais la mise en évidence de marqueurs acquis au cours de la coculture a été plus difficile. Dans un premier temps, nous avons envisagé un modèle de xénogreffe
chez la souris basé sur l’injection de cellules tumorales mammaires dans un « fat pad » exogène
contenant des adipocytes injectés en sous-cutané 5 semaines avant, sous forme de pré-adipocytes
exprimant la protéine GFP. L’analyse des tumeurs nous a permis de mettre en évidence l’émergence
de fibroblastes-GFP infiltrant les cellules tumorales. Cette expérience valide l’existence d’ADFs
provenant de la réorientation d’adipocytes différenciés à partir de cellules 3T3 dans un modèle
murin. L’observation d’un grand nombre de cellules-GFP d’aspect fibroblastique, possédant des
petites gouttelettes lipidiques, témoigne probablement d’un stade intermédiaire entre les adipocytes
et les ADFs. De manière intéressante, nous avons retrouvé ces mêmes cellules peu lipidées au front
invasif des tumeurs humaines. Mais seule la découverte de marqueurs spécifiques des ADFs chez
l’homme nous permettrait d’affirmer l’existence de ces cellules in vivo avec certitude. Ainsi, nous
avons exploré les protéines habituellement exprimées par les CAFs, comme l’αSMA, FAP et FSP-1
(Xouri and Christian, 2010). D’après les expériences d’immunofluorescence, les ADFs acquièrent
progressivement l’expression de la protéine FSP-1, alors que celle des deux autres protéines
étudiées restent inchangée. Des expériences sont donc actuellement en cours au laboratoire afin
d’analyser l’expression de cette protéine dans les fibroblastes péri-tumoraux de tumeurs mammaires
humaines, ainsi que dans les cellules fibroblastiques peu lipidées. Comme nous l’avons vu dans
l’introduction de ce manuscrit, la protéine FSP-1 est impliquée dans la motilité cellulaire (ce qui
pourrait expliquer l’augmentation du potentiel migratoire des ADFs) ainsi que dans la progression
tumorale (Grum-Schwensen et al., 2005). Il serait donc intéressant d’injecter à des souris des
cellules tumorales avec des ADFs n’exprimant pas la protéine FSP-1 (Approche shRNA), comparé
à une injection de cellules tumorales seules ou avec des ADFs normaux. Cette expérience
permettrait, d’une part, de confirmer la participation in vivo des ADFs à la progression tumorale, et
d’autre part d’évaluer le rôle de la protéine FSP-1 dans cet effet.
En conclusion, les travaux effectués lors de mon doctorat ont permis de mettre en évidence
dialogue paracrine entre les cellules tumorales et les adipocytes, à l’origine de profondes
modifications des deux types cellulaires. D’une part, les cellules tumorales deviennent plus
invasives et résistantes aux RI, et d’autre part, les adipocytes acquièrent progressivement un
phénotype fibroblastique, des capacités invasives et migratoires, et l’expression de certains
marqueurs des CAFs. Ce nouveau phénotype adipocytaire serait, au moins en partie, dû à la
86
réactivation de la voie Wnt/β-caténine. Dans l’ensemble, ces travaux suggèrent que les ADFs
pourraient participer à la RD, fréquemment retrouvée dans les tumeurs mammaires humaines. Nos
résultats pourraient permettre d’expliquer le mauvais pronostic retrouvé chez des patientes obèses
atteintes de cancer du sein. Ainsi, l’inhibition de la réorientation des adipocytes pourrait représenter
une nouvelle stratégie anti-tumorale, afin de diminuer l’apparition de la RD dans les tumeurs
mammaires.
87
88
BIBLIOGRAPHIE
89
Agner, J., Falck, J., Lukas, J., and Bartek, J. (2005). Differential impact of diverse anticancer chemotherapeutics on the
Cdc25A-degradation checkpoint pathway. Experimental cell research 302, 162-169.
Ahmed, K.M., and Li, J.J. (2008). NF-kappa B-mediated adaptive resistance to ionizing radiation. Free radical biology
& medicine 44, 1-13.
Allen, M., and Louise Jones, J. (2011). Jekyll and Hyde: the role of the microenvironment on the progression of cancer.
The Journal of pathology 223, 162-176.
Ambartsumian, N.S., Grigorian, M.S., Larsen, I.F., Karlstrom, O., Sidenius, N., Rygaard, J., Georgiev, G., and
Lukanidin, E. (1996). Metastasis of mammary carcinomas in GRS/A hybrid mice transgenic for the mts1 gene.
Oncogene 13, 1621-1630.
Amemori, S., Ootani, A., Aoki, S., Fujise, T., Shimoda, R., Kakimoto, T., Shiraishi, R., Sakata, Y., Tsunada, S.,
Iwakiri, R., et al. (2007). Adipocytes and preadipocytes promote the proliferation of colon cancer cells in vitro.
American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 292, G923-929.
Andarawewa, K.L., Motrescu, E.R., Chenard, M.P., Gansmuller, A., Stoll, I., Tomasetto, C., and Rio, M.C. (2005).
Stromelysin-3 is a potent negative regulator of adipogenesis participating to cancer cell-adipocyte interaction/crosstalk
at the tumor invasive front. Cancer research 65, 10862-10871.
Apte, R.N., Dotan, S., Elkabets, M., White, M.R., Reich, E., Carmi, Y., Song, X., Dvozkin, T., Krelin, Y., and Voronov,
E. (2006). The involvement of IL-1 in tumorigenesis, tumor invasiveness, metastasis and tumor-host interactions.
Cancer metastasis reviews 25, 387-408.
Armstrong, T., Packham, G., Murphy, L.B., Bateman, A.C., Conti, J.A., Fine, D.R., Johnson, C.D., Benyon, R.C., and
Iredale, J.P. (2004). Type I collagen promotes the malignant phenotype of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical
cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 10, 7427-7437.
Assoian, R.K., and Marcantonio, E.E. (1996). The extracellular matrix as a cell cycle control element in atherosclerosis
and restenosis. The Journal of clinical investigation 98, 2436-2439.
Averbeck, D. (2000). [Mechanisms of repair and radiation-induced mutagenesis in higher eukaryotes]. Cancer
radiotherapie : journal de la Societe francaise de radiotherapie oncologique 4, 335-354.
Bachelot, T., Ray-Coquard, I., Menetrier-Caux, C., Rastkha, M., Duc, A., and Blay, J.Y. (2003). Prognostic value of
serum levels of interleukin 6 and of serum and plasma levels of vascular endothelial growth factor in hormonerefractory metastatic breast cancer patients. British journal of cancer 88, 1721-1726.
Baeriswyl, V., and Christofori, G. (2009). The angiogenic switch in carcinogenesis. Seminars in cancer biology 19,
329-337.
Balkwill, F., and Joffroy, C. (2010). TNF: a tumor-suppressing factor or a tumor-promoting factor? Future Oncol 6,
1833-1836.
Balkwill, F., and Mantovani, A. (2001). Inflammation and cancer: back to Virchow? Lancet 357, 539-545.
Barcellos-Hoff, M.H. (2005). Integrative radiation carcinogenesis: interactions between cell and tissue responses to
DNA damage. Seminars in cancer biology 15, 138-148.
Barcellos-Hoff, M.H., and Ravani, S.A. (2000). Irradiated mammary gland stroma promotes the expression of
tumorigenic potential by unirradiated epithelial cells. Cancer research 60, 1254-1260.
Behan, J.W., Yun, J.P., Proektor, M.P., Ehsanipour, E.A., Arutyunyan, A., Moses, A.S., Avramis, V.I., Louie, S.G.,
Butturini, A., Heisterkamp, N., et al. (2009). Adipocytes impair leukemia treatment in mice. Cancer research 69, 78677874.
Bennett, C.N., Ross, S.E., Longo, K.A., Bajnok, L., Hemati, N., Johnson, K.W., Harrison, S.D., and MacDougald, O.A.
(2002). Regulation of Wnt signaling during adipogenesis. The Journal of biological chemistry 277, 30998-31004.
Berclaz, G., Li, S., Price, K.N., Coates, A.S., Castiglione-Gertsch, M., Rudenstam, C.M., Holmberg, S.B., Lindtner, J.,
Erien, D., Collins, J., et al. (2004). Body mass index as a prognostic feature in operable breast cancer: the International
90
Breast Cancer Study Group experience. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical
Oncology / ESMO 15, 875-884.
Bergamaschi, A., Tagliabue, E., Sorlie, T., Naume, B., Triulzi, T., Orlandi, R., Russnes, H.G., Nesland, J.M., Tammi,
R., Auvinen, P., et al. (2008). Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical
outcome. The Journal of pathology 214, 357-367.
Bianchini, F., Kaaks, R., and Vainio, H. (2002). Overweight, obesity, and cancer risk. The lancet oncology 3, 565-574.
Binnerts, M.E., Kim, K.A., Bright, J.M., Patel, S.M., Tran, K., Zhou, M., Leung, J.M., Liu, Y., Lomas, W.E., 3rd,
Dixon, M., et al. (2007). R-Spondin1 regulates Wnt signaling by inhibiting internalization of LRP6. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 104, 14700-14705.
Boucher, J., Castan-Laurell, I., Daviaud, D., Guigne, C., Buleon, M., Carpene, C., Saulnier-Blache, J.S., and Valet, P.
(2005). Adipokine expression profile in adipocytes of different mouse models of obesity. Hormone and metabolic
research = Hormon- und Stoffwechselforschung = Hormones et metabolisme 37, 761-767.
Bouloumie, A., Drexler, H.C., Lafontan, M., and Busse, R. (1998). Leptin, the product of Ob gene, promotes
angiogenesis. Circulation research 83, 1059-1066.
Boyd, N.F., Rommens, J.M., Vogt, K., Lee, V., Hopper, J.L., Yaffe, M.J., and Paterson, A.D. (2005). Mammographic
breast density as an intermediate phenotype for breast cancer. The lancet oncology 6, 798-808.
Braga, V. (2000). The crossroads between cell-cell adhesion and motility. Nature cell biology 2, E182-184.
Brakenhielm, E., Veitonmaki, N., Cao, R., Kihara, S., Matsuzawa, Y., Zhivotovsky, B., Funahashi, T., and Cao, Y.
(2004). Adiponectin-induced antiangiogenesis and antitumor activity involve caspase-mediated endothelial cell
apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 2476-2481.
Bray, G.A. (2002). The underlying basis for obesity: relationship to cancer. The Journal of nutrition 132, 3451S-3455S.
Buzzai, M., Bauer, D.E., Jones, R.G., Deberardinis, R.J., Hatzivassiliou, G., Elstrom, R.L., and Thompson, C.B. (2005).
The glucose dependence of Akt-transformed cells can be reversed by pharmacologic activation of fatty acid betaoxidation. Oncogene 24, 4165-4173.
Calle, E.E., and Kaaks, R. (2004). Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed
mechanisms. Nature reviews Cancer 4, 579-591.
Calle, E.E., and Thun, M.J. (2004). Obesity and cancer. Oncogene 23, 6365-6378.
Campbell, I., Polyak, K., and Haviv, I. (2009). Clonal mutations in the cancer-associated fibroblasts: the case against
genetic coevolution. Cancer research 69, 6765-6768; discussion 6769.
Camps, J.L., Chang, S.M., Hsu, T.C., Freeman, M.R., Hong, S.J., Zhau, H.E., von Eschenbach, A.C., and Chung, L.W.
(1990). Fibroblast-mediated acceleration of human epithelial tumor growth in vivo. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 87, 75-79.
Cao, L., Liu, X., Lin, E.J., Wang, C., Choi, E.Y., Riban, V., Lin, B., and During, M.J. (2010). Environmental and
genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell 142, 52-64.
Cao, Y. (2007). Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity. The Journal of clinical investigation 117, 23622368.
Carmeliet, P., and Jain, R.K. (2011). Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other
angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery 10, 417-427.
Carmichael, A.R. (2006). Obesity and prognosis of breast cancer. Obesity reviews : an official journal of the
International Association for the Study of Obesity 7, 333-340.
Carswell, E.A., Old, L.J., Kassel, R.L., Green, S., Fiore, N., and Williamson, B. (1975). An endotoxin-induced serum
factor that causes necrosis of tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
72, 3666-3670.
91
Castedo, M., Perfettini, J.L., Roumier, T., Andreau, K., Medema, R., and Kroemer, G. (2004). Cell death by mitotic
catastrophe: a molecular definition. Oncogene 23, 2825-2837.
Catalano, S., Mauro, L., Marsico, S., Giordano, C., Rizza, P., Rago, V., Montanaro, D., Maggiolini, M., Panno, M.L.,
and Ando, S. (2004). Leptin induces, via ERK1/ERK2 signal, functional activation of estrogen receptor alpha in MCF-7
cells. The Journal of biological chemistry 279, 19908-19915.
Celis, J.E., Moreira, J.M., Cabezon, T., Gromov, P., Friis, E., Rank, F., and Gromova, I. (2005). Identification of
extracellular and intracellular signaling components of the mammary adipose tissue and its interstitial fluid in high risk
breast cancer patients: toward dissecting the molecular circuitry of epithelial-adipocyte stromal cell interactions.
Molecular & cellular proteomics : MCP 4, 492-522.
Chen, D.C., Chung, Y.F., Yeh, Y.T., Chaung, H.C., Kuo, F.C., Fu, O.Y., Chen, H.Y., Hou, M.F., and Yuan, S.S.
(2006). Serum adiponectin and leptin levels in Taiwanese breast cancer patients. Cancer letters 237, 109-114.
Cheng, J.D., Dunbrack, R.L., Jr., Valianou, M., Rogatko, A., Alpaugh, R.K., and Weiner, L.M. (2002). Promotion of
tumor growth by murine fibroblast activation protein, a serine protease, in an animal model. Cancer research 62, 47674772.
Chlebowski, R.T., Aiello, E., and McTiernan, A. (2002). Weight loss in breast cancer patient management. Journal of
clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 20, 1128-1143.
Choi, J.H., Bellas, E., Gimble, J.M., Vunjak-Novakovic, G., and Kaplan, D.L. (2011). Lipolytic function of
adipocyte/endothelial cocultures. Tissue engineering Part A 17, 1437-1444.
Christodoulides, C., Lagathu, C., Sethi, J.K., and Vidal-Puig, A. (2009). Adipogenesis and WNT signalling. Trends in
endocrinology and metabolism: TEM 20, 16-24.
Christodoulides, C., Laudes, M., Cawthorn, W.P., Schinner, S., Soos, M., O'Rahilly, S., Sethi, J.K., and Vidal-Puig, A.
(2006). The Wnt antagonist Dickkopf-1 and its receptors are coordinately regulated during early human adipogenesis.
Journal of cell science 119, 2613-2620.
Cleary, M.P., Juneja, S.C., Phillips, F.C., Hu, X., Grande, J.P., and Maihle, N.J. (2004). Leptin receptor-deficient
MMTV-TGF-alpha/Lepr(db)Lepr(db) female mice do not develop oncogene-induced mammary tumors. Exp Biol Med
(Maywood) 229, 182-193.
Cleary, M.P., Phillips, F.C., Getzin, S.C., Jacobson, T.L., Jacobson, M.K., Christensen, T.A., Juneja, S.C., Grande, J.P.,
and Maihle, N.J. (2003). Genetically obese MMTV-TGF-alpha/Lep(ob)Lep(ob) female mice do not develop mammary
tumors. Breast cancer research and treatment 77, 205-215.
Clement, K., and Vignes, S. (2009). [Inflammation, adipokines and obesity]. La Revue de medecine interne / fondee
par la Societe nationale francaise de medecine interne 30, 824-832.
Coghlan, M.P., Culbert, A.A., Cross, D.A., Corcoran, S.L., Yates, J.W., Pearce, N.J., Rausch, O.L., Murphy, G.J.,
Carter, P.S., Roxbee Cox, L., et al. (2000). Selective small molecule inhibitors of glycogen synthase kinase-3 modulate
glycogen metabolism and gene transcription. Chemistry & biology 7, 793-803.
Colleoni, M., Li, S., Gelber, R.D., Price, K.N., Coates, A.S., Castiglione-Gertsch, M., and Goldhirsch, A. (2005).
Relation between chemotherapy dose, oestrogen receptor expression, and body-mass index. Lancet 366, 1108-1110.
Conti, J.A., Kendall, T.J., Bateman, A., Armstrong, T.A., Papa-Adams, A., Xu, Q., Packham, G., Primrose, J.N.,
Benyon, R.C., and Iredale, J.P. (2008). The desmoplastic reaction surrounding hepatic colorectal adenocarcinoma
metastases aids tumor growth and survival via alphav integrin ligation. Clinical cancer research : an official journal of
the American Association for Cancer Research 14, 6405-6413.
Conze, D., Weiss, L., Regen, P.S., Bhushan, A., Weaver, D., Johnson, P., and Rincon, M. (2001). Autocrine production
of interleukin 6 causes multidrug resistance in breast cancer cells. Cancer research 61, 8851-8858.
Coppe, J.P., Desprez, P.Y., Krtolica, A., and Campisi, J. (2010). The senescence-associated secretory phenotype: the
dark side of tumor suppression. Annual review of pathology 5, 99-118.
92
Coppe, J.P., Patil, C.K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D.P., Goldstein, J., Nelson, P.S., Desprez, P.Y., and Campisi, J.
(2008). Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the
p53 tumor suppressor. PLoS biology 6, 2853-2868.
Cousin, B., Caspar-Bauguil, S., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Penicaud, L., and Casteilla, L. (2006). [Adipose
tissue: a subtle and complex cell system]. Journal de la Societe de biologie 200, 51-57.
Coussens, L.M., Raymond, W.W., Bergers, G., Laig-Webster, M., Behrendtsen, O., Werb, Z., Caughey, G.H., and
Hanahan, D. (1999). Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis.
Genes & development 13, 1382-1397.
Coussens, L.M., and Werb, Z. (2002). Inflammation and cancer. Nature 420, 860-867.
Crisan, M., Yap, S., Casteilla, L., Chen, C.W., Corselli, M., Park, T.S., Andriolo, G., Sun, B., Zheng, B., Zhang, L., et
al. (2008). A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell 3, 301-313.
Cui, Y., Whiteman, M.K., Flaws, J.A., Langenberg, P., Tkaczuk, K.H., and Bush, T.L. (2002). Body mass and stage of
breast cancer at diagnosis. International journal of cancer Journal international du cancer 98, 279-283.
Dal Maso, L., Zucchetto, A., Talamini, R., Serraino, D., Stocco, C.F., Vercelli, M., Falcini, F., and Franceschi, S.
(2008). Effect of obesity and other lifestyle factors on mortality in women with breast cancer. International journal of
cancer Journal international du cancer 123, 2188-2194.
Dalamaga, M., Migdalis, I., Fargnoli, J.L., Papadavid, E., Bloom, E., Mitsiades, N., Karmaniolas, K., Pelecanos, N.,
Tseleni-Balafouta, S., Dionyssiou-Asteriou, A., et al. (2009). Pancreatic cancer expresses adiponectin receptors and is
associated with hypoleptinemia and hyperadiponectinemia: a case-control study. Cancer causes & control : CCC 20,
625-633.
Daling, J.R., Malone, K.E., Doody, D.R., Johnson, L.G., Gralow, J.R., and Porter, P.L. (2001). Relation of body mass
index to tumor markers and survival among young women with invasive ductal breast carcinoma. Cancer 92, 720-729.
Danforth, D.N., Jr., and Sgagias, M.K. (1993). Interleukin-1 alpha and interleukin-6 act additively to inhibit growth of
MCF-7 breast cancer cells in vitro. Cancer research 53, 1538-1545.
Darby, I.A., Bisucci, T., Hewitson, T.D., and MacLellan, D.G. (1997). Apoptosis is increased in a model of diabetesimpaired wound healing in genetically diabetic mice. The international journal of biochemistry & cell biology 29, 191200.
Davies, G., Jiang, W.G., and Mason, M.D. (2001). Matrilysin mediates extracellular cleavage of E-cadherin from
prostate cancer cells: a key mechanism in hepatocyte growth factor/scatter factor-induced cell-cell dissociation and in
vitro invasion. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 7, 32893297.
de Luca, C., Kowalski, T.J., Zhang, Y., Elmquist, J.K., Lee, C., Kilimann, M.W., Ludwig, T., Liu, S.M., and Chua,
S.C., Jr. (2005). Complete rescue of obesity, diabetes, and infertility in db/db mice by neuron-specific LEPR-B
transgenes. The Journal of clinical investigation 115, 3484-3493.
De Palma, M., Murdoch, C., Venneri, M.A., Naldini, L., and Lewis, C.E. (2007). Tie2-expressing monocytes:
regulation of tumor angiogenesis and therapeutic implications. Trends in immunology 28, 519-524.
De Wever, O., and Mareel, M. (2003). Role of tissue stroma in cancer cell invasion. The Journal of pathology 200, 429447.
DeLano, F.A., and Schmid-Schonbein, G.W. (2008). Proteinase activity and receptor cleavage: mechanism for insulin
resistance in the spontaneously hypertensive rat. Hypertension 52, 415-423.
Denk, P.O., Hoppe, J., Hoppe, V., and Knorr, M. (2003). Effect of growth factors on the activation of human Tenon's
capsule fibroblasts. Current eye research 27, 35-44.
Denzel, M.S., Hebbard, L.W., Shostak, G., Shapiro, L., Cardiff, R.D., and Ranscht, B. (2009). Adiponectin deficiency
limits tumor vascularization in the MMTV-PyV-mT mouse model of mammary cancer. Clinical cancer research : an
official journal of the American Association for Cancer Research 15, 3256-3264.
93
Deorukhkar, A., and Krishnan, S. (2010). Targeting inflammatory pathways for tumor radiosensitization. Biochemical
pharmacology 80, 1904-1914.
Di Carlo, E., Forni, G., Lollini, P., Colombo, M.P., Modesti, A., and Musiani, P. (2001). The intriguing role of
polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood 97, 339-345.
Dieudonne, M.N., Bussiere, M., Dos Santos, E., Leneveu, M.C., Giudicelli, Y., and Pecquery, R. (2006). Adiponectin
mediates antiproliferative and apoptotic responses in human MCF7 breast cancer cells. Biochemical and biophysical
research communications 345, 271-279.
Dignam, J.J., Wieand, K., Johnson, K.A., Raich, P., Anderson, S.J., Somkin, C., and Wickerham, D.L. (2006). Effects
of obesity and race on prognosis in lymph node-negative, estrogen receptor-negative breast cancer. Breast cancer
research and treatment 97, 245-254.
Dirat, B., Bochet, L., Dabek, M., Daviaud, D., Dauvillier, S., Majed, B., Wang, Y.Y., Meulle, A., Salles, B., Le
Gonidec, S., et al. (2011). Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer
invasion. Cancer research 71, 2455-2465.
Direkze, N.C., Jeffery, R., Hodivala-Dilke, K., Hunt, T., Playford, R.J., Elia, G., Poulsom, R., Wright, N.A., and Alison,
M.R. (2006). Bone marrow-derived stromal cells express lineage-related messenger RNA species. Cancer research 66,
1265-1269.
Du, M., Yin, J., and Zhu, M.J. (2010). Cellular signaling pathways regulating the initial stage of adipogenesis and
marbling of skeletal muscle. Meat science 86, 103-109.
Dunaif, A., Xia, J., Book, C.B., Schenker, E., and Tang, Z. (1995). Excessive insulin receptor serine phosphorylation in
cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary
syndrome. The Journal of clinical investigation 96, 801-810.
Dunn, G.P., Bruce, A.T., Ikeda, H., Old, L.J., and Schreiber, R.D. (2002). Cancer immunoediting: from
immunosurveillance to tumor escape. Nature immunology 3, 991-998.
Dunn, G.P., Old, L.J., and Schreiber, R.D. (2004). The three Es of cancer immunoediting. Annual review of
immunology 22, 329-360.
Ebos, J.M., Lee, C.R., Cruz-Munoz, W., Bjarnason, G.A., Christensen, J.G., and Kerbel, R.S. (2009). Accelerated
metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer cell 15, 232-239.
Egeblad, M., Littlepage, L.E., and Werb, Z. (2005). The fibroblastic coconspirator in cancer progression. Cold Spring
Harbor symposia on quantitative biology 70, 383-388.
Egeblad, M., Rasch, M.G., and Weaver, V.M. (2010). Dynamic interplay between the collagen scaffold and tumor
evolution. Current opinion in cell biology 22, 697-706.
Elliott, B.E., Tam, S.P., Dexter, D., and Chen, Z.Q. (1992). Capacity of adipose tissue to promote growth and metastasis
of a murine mammary carcinoma: effect of estrogen and progesterone. International journal of cancer Journal
international du cancer 51, 416-424.
Fain, J.N., Bahouth, S.W., and Madan, A.K. (2004). TNFalpha release by the nonfat cells of human adipose tissue.
International journal of obesity and related metabolic disorders : journal of the International Association for the Study
of Obesity 28, 616-622.
Fashena, S.J., and Thomas, S.M. (2000). Signalling by adhesion receptors. Nature cell biology 2, E225-229.
Feve, B. (2005). Adipogenesis: cellular and molecular aspects. Best practice & research Clinical endocrinology &
metabolism 19, 483-499.
Folkman, J. (1971). Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine 285, 11821186.
Folkman, J. (2006). Angiogenesis. Annual review of medicine 57, 1-18.
94
Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., and Hanahan, D. (1989). Induction of angiogenesis during the transition from
hyperplasia to neoplasia. Nature 339, 58-61.
Friedman, J.M., and Halaas, J.L. (1998). Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature 395, 763-770.
Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F., Kirilovsky, A., Mlecnik, B., Lagorce-Pages, C., Tosolini, M., Camus, M.,
Berger, A., Wind, P., et al. (2006). Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict
clinical outcome. Science 313, 1960-1964.
Ganzinelli, M., Carrassa, L., Crippa, F., Tavecchio, M., Broggini, M., and Damia, G. (2008). Checkpoint kinase 1
down-regulation by an inducible small interfering RNA expression system sensitized in vivo tumors to treatment with
5-fluorouracil. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 14, 51315141.
Garcia-Barros, M., Paris, F., Cordon-Cardo, C., Lyden, D., Rafii, S., Haimovitz-Friedman, A., Fuks, Z., and Kolesnick,
R. (2003). Tumor response to radiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis. Science 300, 1155-1159.
Garofalo, C., Koda, M., Cascio, S., Sulkowska, M., Kanczuga-Koda, L., Golaszewska, J., Russo, A., Sulkowski, S., and
Surmacz, E. (2006). Increased expression of leptin and the leptin receptor as a marker of breast cancer progression:
possible role of obesity-related stimuli. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for
Cancer Research 12, 1447-1453.
Gasparini, G., Longo, R., Toi, M., and Ferrara, N. (2005). Angiogenic inhibitors: a new therapeutic strategy in
oncology. Nature clinical practice Oncology 2, 562-577.
Ghiringhelli, F., Apetoh, L., Housseau, F., Kroemer, G., and Zitvogel, L. (2007). Links between innate and cognate
tumor immunity. Current opinion in immunology 19, 224-231.
Ghiringhelli, F., Menard, C., Martin, F., and Zitvogel, L. (2006). The role of regulatory T cells in the control of natural
killer cells: relevance during tumor progression. Immunological reviews 214, 229-238.
Giannelli, G., Falk-Marzillier, J., Schiraldi, O., Stetler-Stevenson, W.G., and Quaranta, V. (1997). Induction of cell
migration by matrix metalloprotease-2 cleavage of laminin-5. Science 277, 225-228.
Goldstein, M., Roos, W.P., and Kaina, B. (2008). Apoptotic death induced by the cyclophosphamide analogue
mafosfamide in human lymphoblastoid cells: contribution of DNA replication, transcription inhibition and Chk/p53
signaling. Toxicology and applied pharmacology 229, 20-32.
Grisouard, J., Dembinski, K., Mayer, D., Keller, U., Muller, B., and Christ-Crain, M. (2011). Targeting AMP-activated
protein kinase in adipocytes to modulate obesity-related adipokine production associated with insulin resistance and
breast cancer cell proliferation. Diabetology & metabolic syndrome 3, 16.
Grum-Schwensen, B., Klingelhofer, J., Berg, C.H., El-Naaman, C., Grigorian, M., Lukanidin, E., and Ambartsumian,
N. (2005). Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer
research 65, 3772-3780.
Guilherme, A., Virbasius, J.V., Puri, V., and Czech, M.P. (2008). Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin
resistance and type 2 diabetes. Nature reviews Molecular cell biology 9, 367-377.
Guo, W., Xie, W., and Han, J. (2006). Modulation of adipocyte lipogenesis by octanoate: involvement of reactive
oxygen species. Nutrition & metabolism 3, 30.
Guo, X., Ramirez, A., Waddell, D.S., Li, Z., Liu, X., and Wang, X.F. (2008). Axin and GSK3- control Smad3 protein
stability and modulate TGF- signaling. Genes & development 22, 106-120.
Gustafson, B., and Smith, U. (2006). Cytokines promote Wnt signaling and inflammation and impair the normal
differentiation and lipid accumulation in 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of biological chemistry 281, 9507-9516.
Gustafson, B., and Smith, U. (2010). Activation of canonical wingless-type MMTV integration site family (Wnt)
signaling in mature adipocytes increases beta-catenin levels and leads to cell dedifferentiation and insulin resistance.
The Journal of biological chemistry 285, 14031-14041.
95
Halberg, N., Wernstedt-Asterholm, I., and Scherer, P.E. (2008). The adipocyte as an endocrine cell. Endocrinology and
metabolism clinics of North America 37, 753-768, x-xi.
Hall, H.I., Coates, R.J., Uhler, R.J., Brinton, L.A., Gammon, M.D., Brogan, D., Potischman, N., Malone, K.E., and
Swanson, C.A. (1999). Stage of breast cancer in relation to body mass index and bra cup size. International journal of
cancer Journal international du cancer 82, 23-27.
Hassan, M.I., Waheed, A., Yadav, S., Singh, T.P., and Ahmad, F. (2008). Zinc alpha 2-glycoprotein: a multidisciplinary
protein. Molecular cancer research : MCR 6, 892-906.
Hauner, H. (2004). The new concept of adipose tissue function. Physiology & behavior 83, 653-658.
Haviv, I., Polyak, K., Qiu, W., Hu, M., and Campbell, I. (2009). Origin of carcinoma associated fibroblasts. Cell Cycle
8, 589-595.
Helfman, D.M., Kim, E.J., Lukanidin, E., and Grigorian, M. (2005). The metastasis associated protein S100A4: role in
tumour progression and metastasis. British journal of cancer 92, 1955-1958.
Holland, W.L., Miller, R.A., Wang, Z.V., Sun, K., Barth, B.M., Bui, H.H., Davis, K.E., Bikman, B.T., Halberg, N.,
Rutkowski, J.M., et al. (2011). Receptor-mediated activation of ceramidase activity initiates the pleiotropic actions of
adiponectin. Nature medicine 17, 55-63.
Hoogeboom, D., and Burgering, B.M. (2009). Should I stay or should I go: beta-catenin decides under stress.
Biochimica et biophysica acta 1796, 63-74.
Hosogai, N., Fukuhara, A., Oshima, K., Miyata, Y., Tanaka, S., Segawa, K., Furukawa, S., Tochino, Y., Komuro, R.,
Matsuda, M., et al. (2007). Adipose tissue hypoxia in obesity and its impact on adipocytokine dysregulation. Diabetes
56, 901-911.
Howard, J.M., Pidgeon, G.P., and Reynolds, J.V. (2010). Leptin and gastro-intestinal malignancies. Obesity reviews :
an official journal of the International Association for the Study of Obesity 11, 863-874.
Hunt, K.A., and Sickles, E.A. (2000). Effect of obesity on screening mammography: outcomes analysis of 88,346
consecutive examinations. AJR American journal of roentgenology 174, 1251-1255.
Imai, T., Takakuwa, R., Marchand, S., Dentz, E., Bornert, J.M., Messaddeq, N., Wendling, O., Mark, M., Desvergne,
B., Wahli, W., et al. (2004). Peroxisome proliferator-activated receptor gamma is required in mature white and brown
adipocytes for their survival in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 101, 4543-4547.
Imhoff, B.R., and Hansen, J.M. (2010). Extracellular redox environments regulate adipocyte differentiation.
Differentiation; research in biological diversity 80, 31-39.
Iocca, H.A., and Isom, H.C. (2003). Tumor necrosis factor-alpha acts as a complete mitogen for primary rat
hepatocytes. The American journal of pathology 163, 465-476.
Ishikawa, K., Ishii, H., and Saito, T. (2006). DNA damage-dependent cell cycle checkpoints and genomic stability.
DNA and cell biology 25, 406-411.
Ishikawa, M., Kitayama, J., and Nagawa, H. (2004). Enhanced expression of leptin and leptin receptor (OB-R) in
human breast cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 10,
4325-4331.
Iyengar, P., Combs, T.P., Shah, S.J., Gouon-Evans, V., Pollard, J.W., Albanese, C., Flanagan, L., Tenniswood, M.P.,
Guha, C., Lisanti, M.P., et al. (2003). Adipocyte-secreted factors synergistically promote mammary tumorigenesis
through induction of anti-apoptotic transcriptional programs and proto-oncogene stabilization. Oncogene 22, 64086423.
Iyengar, P., Espina, V., Williams, T.W., Lin, Y., Berry, D., Jelicks, L.A., Lee, H., Temple, K., Graves, R., Pollard, J., et
al. (2005). Adipocyte-derived collagen VI affects early mammary tumor progression in vivo, demonstrating a critical
interaction in the tumor/stroma microenvironment. The Journal of clinical investigation 115, 1163-1176.
96
Jin, Z.H., Kurosu, T., Yamaguchi, M., Arai, A., and Miura, O. (2005). Hematopoietic cytokines enhance Chk1dependent G2/M checkpoint activation by etoposide through the Akt/GSK3 pathway to inhibit apoptosis. Oncogene 24,
1973-1981.
Jones, P.L., and Jones, F.S. (2000). Tenascin-C in development and disease: gene regulation and cell function. Matrix
biology : journal of the International Society for Matrix Biology 19, 581-596.
Jones, R.G., and Thompson, C.B. (2009). Tumor suppressors and cell metabolism: a recipe for cancer growth. Genes &
development 23, 537-548.
Jotzu, C., Alt, E., Welte, G., Li, J., Hennessy, B.T., Devarajan, E., Krishnappa, S., Pinilla, S., Droll, L., and Song, Y.H.
(2011). Adipose tissue derived stem cells differentiate into carcinoma-associated fibroblast-like cells under the
influence of tumor derived factors. Cell Oncol (Dordr) 34, 55-67.
Jumabay, M., Matsumoto, T., Yokoyama, S., Kano, K., Kusumi, Y., Masuko, T., Mitsumata, M., Saito, S., Hirayama,
A., Mugishima, H., et al. (2009). Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted
cardiac tissue in rats. Journal of molecular and cellular cardiology 47, 565-575.
Kaczmarek, J., Castellani, P., Nicolo, G., Spina, B., Allemanni, G., and Zardi, L. (1994). Distribution of oncofetal
fibronectin isoforms in normal, hyperplastic and neoplastic human breast tissues. International journal of cancer Journal
international du cancer 59, 11-16.
Kaiser, G.C., and Polk, D.B. (1997). Tumor necrosis factor alpha regulates proliferation in a mouse intestinal cell line.
Gastroenterology 112, 1231-1240.
Kalluri, R., and Zeisberg, M. (2006). Fibroblasts in cancer. Nature reviews Cancer 6, 392-401.
Kaneko, A., Satoh, Y., Tokuda, Y., Fujiyama, C., Udo, K., and Uozumi, J. (2010). Effects of adipocytes on the
proliferation and differentiation of prostate cancer cells in a 3-D culture model. International journal of urology :
official journal of the Japanese Urological Association 17, 369-376.
Kang, J.H., Lee, Y.Y., Yu, B.Y., Yang, B.S., Cho, K.H., Yoon, D.K., and Roh, Y.K. (2005). Adiponectin induces
growth arrest and apoptosis of MDA-MB-231 breast cancer cell. Archives of pharmacal research 28, 1263-1269.
Kang, N., Gores, G.J., and Shah, V.H. (2011). Hepatic stellate cells: Partners in crime for liver metastases? Hepatology
54, 707-713.
Kaspar, M., Zardi, L., and Neri, D. (2006). Fibronectin as target for tumor therapy. International journal of cancer
Journal international du cancer 118, 1331-1339.
Kawakami, K., Nishida, H., Tatewaki, N., Nakajima, Y., Konishi, T., and Hirayama, M. (2011). Persimmon leaf extract
inhibits the ATM activity during DNA damage response induced by Doxorubicin in A549 lung adenocarcinoma cells.
Bioscience, biotechnology, and biochemistry 75, 650-655.
Keeley, E.C., Mehrad, B., and Strieter, R.M. (2011). Chemokines as mediators of tumor angiogenesis and
neovascularization. Experimental cell research 317, 685-690.
Keffer, J., Probert, L., Cazlaris, H., Georgopoulos, S., Kaslaris, E., Kioussis, D., and Kollias, G. (1991). Transgenic
mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. The EMBO journal 10, 40254031.
Kenny, P.A., Lee, G.Y., and Bissell, M.J. (2007). Targeting the tumor microenvironment. Frontiers in bioscience : a
journal and virtual library 12, 3468-3474.
Keophiphath, M., Achard, V., Henegar, C., Rouault, C., Clement, K., and Lacasa, D. (2009). Macrophage-secreted
factors promote a profibrotic phenotype in human preadipocytes. Mol Endocrinol 23, 11-24.
Kern, P.A., Saghizadeh, M., Ong, J.M., Bosch, R.J., Deem, R., and Simsolo, R.B. (1995). The expression of tumor
necrosis factor in human adipose tissue. Regulation by obesity, weight loss, and relationship to lipoprotein lipase. The
Journal of clinical investigation 95, 2111-2119.
97
Khandwala, H.M., McCutcheon, I.E., Flyvbjerg, A., and Friend, K.E. (2000). The effects of insulin-like growth factors
on tumorigenesis and neoplastic growth. Endocrine reviews 21, 215-244.
Kidd, S., Spaeth, E., Klopp, A., Andreeff, M., Hall, B., and Marini, F.C. (2008). The (in) auspicious role of
mesenchymal stromal cells in cancer: be it friend or foe. Cytotherapy 10, 657-667.
Kim, K.A., Zhao, J., Andarmani, S., Kakitani, M., Oshima, T., Binnerts, M.E., Abo, A., Tomizuka, K., and Funk, W.D.
(2006). R-Spondin proteins: a novel link to beta-catenin activation. Cell Cycle 5, 23-26.
Kirsch, M., Schackert, G., and Black, P.M. (2004). Metastasis and angiogenesis. Cancer treatment and research 117,
285-304.
Kitamura, T., Kitamura, Y., Kuroda, S., Hino, Y., Ando, M., Kotani, K., Konishi, H., Matsuzaki, H., Kikkawa, U.,
Ogawa, W., et al. (1999). Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by
the serine-threonine kinase Akt. Molecular and cellular biology 19, 6286-6296.
Knupfer, H., and Preiss, R. (2010). Serum interleukin-6 levels in colorectal cancer patients--a summary of published
results. International journal of colorectal disease 25, 135-140.
Kojima, Y., Acar, A., Eaton, E.N., Mellody, K.T., Scheel, C., Ben-Porath, I., Onder, T.T., Wang, Z.C., Richardson,
A.L., Weinberg, R.A., et al. (2010). Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the
evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 107, 20009-20014.
Koshikawa, N., Giannelli, G., Cirulli, V., Miyazaki, K., and Quaranta, V. (2000). Role of cell surface metalloprotease
MT1-MMP in epithelial cell migration over laminin-5. The Journal of cell biology 148, 615-624.
Kridel, S.J., Lowther, W.T., and Pemble, C.W.t. (2007). Fatty acid synthase inhibitors: new directions for oncology.
Expert opinion on investigational drugs 16, 1817-1829.
Kroenke, C.H., Chen, W.Y., Rosner, B., and Holmes, M.D. (2005). Weight, weight gain, and survival after breast
cancer diagnosis. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 23, 13701378.
Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P.Y., and Campisi, J. (2001). Senescent fibroblasts promote epithelial
cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 98, 12072-12077.
Kryczek, I., Zou, L., Rodriguez, P., Zhu, G., Wei, S., Mottram, P., Brumlik, M., Cheng, P., Curiel, T., Myers, L., et al.
(2006). B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. The
Journal of experimental medicine 203, 871-881.
Kuo, C.J., LaMontagne, K.R., Jr., Garcia-Cardena, G., Ackley, B.D., Kalman, D., Park, S., Christofferson, R.,
Kamihara, J., Ding, Y.H., Lo, K.M., et al. (2001). Oligomerization-dependent regulation of motility and morphogenesis
by the collagen XVIII NC1/endostatin domain. The Journal of cell biology 152, 1233-1246.
Lahmann, P.H., Hoffmann, K., Allen, N., van Gils, C.H., Khaw, K.T., Tehard, B., Berrino, F., Tjonneland, A., Bigaard,
J., Olsen, A., et al. (2004). Body size and breast cancer risk: findings from the European Prospective Investigation into
Cancer And Nutrition (EPIC). International journal of cancer Journal international du cancer 111, 762-771.
Landskroner-Eiger, S., Qian, B., Muise, E.S., Nawrocki, A.R., Berger, J.P., Fine, E.J., Koba, W., Deng, Y., Pollard,
J.W., and Scherer, P.E. (2009). Proangiogenic contribution of adiponectin toward mammary tumor growth in vivo.
Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 15, 3265-3276.
Langin, D., Dicker, A., Tavernier, G., Hoffstedt, J., Mairal, A., Ryden, M., Arner, E., Sicard, A., Jenkins, C.M.,
Viguerie, N., et al. (2005). Adipocyte lipases and defect of lipolysis in human obesity. Diabetes 54, 3190-3197.
Le, T.T., Huff, T.B., and Cheng, J.X. (2009). Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of lipids in cancer
metastasis. BMC cancer 9, 42.
98
Lee, H.O., Mullins, S.R., Franco-Barraza, J., Valianou, M., Cukierman, E., and Cheng, J.D. (2011). FAPoverexpressing fibroblasts produce an extracellular matrix that enhances invasive velocity and directionality of
pancreatic cancer cells. BMC cancer 11, 245.
Lejeune, F.J., Ruegg, C., and Lienard, D. (1998). Clinical applications of TNF-alpha in cancer. Current opinion in
immunology 10, 573-580.
Lemonnier, D. (1972). Effect of age, sex, and sites on the cellularity of the adipose tissue in mice and rats rendered
obese by a high-fat diet. The Journal of clinical investigation 51, 2907-2915.
Levental, K.R., Yu, H., Kass, L., Lakins, J.N., Egeblad, M., Erler, J.T., Fong, S.F., Csiszar, K., Giaccia, A., Weninger,
W., et al. (2009). Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell 139, 891-906.
Liekens, S., Schols, D., and Hatse, S. (2010). CXCL12-CXCR4 axis in angiogenesis, metastasis and stem cell
mobilization. Current pharmaceutical design 16, 3903-3920.
Lin, E.Y., Nguyen, A.V., Russell, R.G., and Pollard, J.W. (2001). Colony-stimulating factor 1 promotes progression of
mammary tumors to malignancy. The Journal of experimental medicine 193, 727-740.
Linhart, H.G., Ishimura-Oka, K., DeMayo, F., Kibe, T., Repka, D., Poindexter, B., Bick, R.J., and Darlington, G.J.
(2001). C/EBPalpha is required for differentiation of white, but not brown, adipose tissue. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 98, 12532-12537.
Lisanti, M.P., Martinez-Outschoorn, U.E., Lin, Z., Pavlides, S., Whitaker-Menezes, D., Pestell, R.G., Howell, A., and
Sotgia, F. (2011). Hydrogen peroxide fuels aging, inflammation, cancer metabolism and metastasis: The seed and soil
also needs "fertilizer". Cell Cycle 10, 2440-2449.
Loi, S., Milne, R.L., Friedlander, M.L., McCredie, M.R., Giles, G.G., Hopper, J.L., and Phillips, K.A. (2005). Obesity
and outcomes in premenopausal and postmenopausal breast cancer. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a
publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive
Oncology 14, 1686-1691.
MacDougald, O.A., and Mandrup, S. (2002). Adipogenesis: forces that tip the scales. Trends in endocrinology and
metabolism: TEM 13, 5-11.
Madigan, M.C., Kingsley, E.A., Cozzi, P.J., Delprado, W.J., Russell, P.J., and Li, Y. (2008). The role of extracellular
matrix metalloproteinase inducer protein in prostate cancer progression. Cancer immunology, immunotherapy : CII 57,
1367-1379.
Maehle, B.O., Tretli, S., Skjaerven, R., and Thorsen, T. (2001). Premorbid body weight and its relations to primary
tumour diameter in breast cancer patients; its dependence on estrogen and progesteron receptor status. Breast cancer
research and treatment 68, 159-169.
Majed, B., Moreau, T., and Asselain, B. (2009). Overweight, obesity and breast cancer prognosis: optimal body size
indicator cut-points. Breast cancer research and treatment 115, 193-203.
Majed, B., Moreau, T., Senouci, K., Salmon, R.J., Fourquet, A., and Asselain, B. (2008). Is obesity an independent
prognosis factor in woman breast cancer? Breast cancer research and treatment 111, 329-342.
Mak, I.W., Cowan, R.W., Popovic, S., Colterjohn, N., Singh, G., and Ghert, M. (2009). Upregulation of MMP-13 via
Runx2 in the stromal cell of Giant Cell Tumor of bone. Bone 45, 377-386.
Mak, I.W., Seidlitz, E.P., Cowan, R.W., Turcotte, R.E., Popovic, S., Wu, W.C., Singh, G., and Ghert, M. (2010).
Evidence for the role of matrix metalloproteinase-13 in bone resorption by giant cell tumor of bone. Human pathology
41, 1320-1329.
Manabe, Y., Toda, S., Miyazaki, K., and Sugihara, H. (2003). Mature adipocytes, but not preadipocytes, promote the
growth of breast carcinoma cells in collagen gel matrix culture through cancer-stromal cell interactions. The Journal of
pathology 201, 221-228.
99
Mano, Y., Shibata, K., Sumigama, S., Hayakawa, H., Ino, K., Yamamoto, E., Kajiyama, H., Nawa, A., and Kikkawa, F.
(2009). Tocilizumab inhibits interleukin-6-mediated matrix metalloproteinase-2 and -9 secretions from human amnion
cells in preterm premature rupture of membranes. Gynecologic and obstetric investigation 68, 145-153.
Mantovani, A., and Sica, A. (2010). Macrophages, innate immunity and cancer: balance, tolerance, and diversity.
Current opinion in immunology 22, 231-237.
Marastoni, S., Ligresti, G., Lorenzon, E., Colombatti, A., and Mongiat, M. (2008). Extracellular matrix: a matter of life
and death. Connective tissue research 49, 203-206.
Martinez-Outschoorn, U.E., Balliet, R.M., Rivadeneira, D.B., Chiavarina, B., Pavlides, S., Wang, C., WhitakerMenezes, D., Daumer, K.M., Lin, Z., Witkiewicz, A.K., et al. (2010a). Oxidative stress in cancer associated fibroblasts
drives tumor-stroma co-evolution: A new paradigm for understanding tumor metabolism, the field effect and genomic
instability in cancer cells. Cell Cycle 9, 3256-3276.
Martinez-Outschoorn, U.E., Pavlides, S., Whitaker-Menezes, D., Daumer, K.M., Milliman, J.N., Chiavarina, B.,
Migneco, G., Witkiewicz, A.K., Martinez-Cantarin, M.P., Flomenberg, N., et al. (2010b). Tumor cells induce the cancer
associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with
autophagy inhibitors. Cell Cycle 9, 2423-2433.
Martinez-Outschoorn, U.E., Whitaker-Menezes, D., Pavlides, S., Chiavarina, B., Bonuccelli, G., Casey, T., Tsirigos, A.,
Migneco, G., Witkiewicz, A., Balliet, R., et al. (2010c). The autophagic tumor stroma model of cancer or "batteryoperated tumor growth": A simple solution to the autophagy paradox. Cell Cycle 9, 4297-4306.
Matsumoto, T., Kano, K., Kondo, D., Fukuda, N., Iribe, Y., Tanaka, N., Matsubara, Y., Sakuma, T., Satomi, A., Otaki,
M., et al. (2008). Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. Journal of cellular
physiology 215, 210-222.
McGee, S.F., Lanigan, F., Gilligan, E., and Groner, B. (2006). Mammary gland biology and breast cancer. Conference
on Common Molecular Mechanisms of Mammary Gland Development and Breast Cancer Progression. EMBO reports
7, 1084-1088.
Meiners, S., Powell, E.M., and Geller, H.M. (1999). Neurite outgrowth promotion by the alternatively spliced region of
tenascin-C is influenced by cell-type specific binding. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix
Biology 18, 75-87.
Meng, L., Zhou, J., Sasano, H., Suzuki, T., Zeitoun, K.M., and Bulun, S.E. (2001). Tumor necrosis factor alpha and
interleukin 11 secreted by malignant breast epithelial cells inhibit adipocyte differentiation by selectively downregulating CCAAT/enhancer binding protein alpha and peroxisome proliferator-activated receptor gamma: mechanism
of desmoplastic reaction. Cancer research 61, 2250-2255.
Meng, Y., Beckett, M.A., Liang, H., Mauceri, H.J., van Rooijen, N., Cohen, K.S., and Weichselbaum, R.R. (2010).
Blockade of tumor necrosis factor alpha signaling in tumor-associated macrophages as a radiosensitizing strategy.
Cancer research 70, 1534-1543.
Meulle, A., Salles, B., Daviaud, D., Valet, P., and Muller, C. (2008). Positive regulation of DNA double strand break
repair activity during differentiation of long life span cells: the example of adipogenesis. PloS one 3, e3345.
Miyoshi, Y., Funahashi, T., Kihara, S., Taguchi, T., Tamaki, Y., Matsuzawa, Y., and Noguchi, S. (2003). Association of
serum adiponectin levels with breast cancer risk. Clinical cancer research : an official journal of the American
Association for Cancer Research 9, 5699-5704.
Montesano, R., Soulie, P., Eble, J.A., and Carrozzino, F. (2005). Tumour necrosis factor alpha confers an invasive,
transformed phenotype on mammary epithelial cells. Journal of cell science 118, 3487-3500.
Moore, R.J., Owens, D.M., Stamp, G., Arnott, C., Burke, F., East, N., Holdsworth, H., Turner, L., Rollins, B.,
Pasparakis, M., et al. (1999). Mice deficient in tumor necrosis factor-alpha are resistant to skin carcinogenesis. Nature
medicine 5, 828-831.
Moreno-Aliaga, M.J., Santos, J.L., Marti, A., and Martinez, J.A. (2005). Does weight loss prognosis depend on genetic
make-up? Obesity reviews : an official journal of the International Association for the Study of Obesity 6, 155-168.
100
Motrescu, E.R., and Rio, M.C. (2008). Cancer cells, adipocytes and matrix metalloproteinase 11: a vicious tumor
progression cycle. Biological chemistry 389, 1037-1041.
Mulholland, D.J., Dedhar, S., Coetzee, G.A., and Nelson, C.C. (2005). Interaction of nuclear receptors with the
Wnt/beta-catenin/Tcf signaling axis: Wnt you like to know? Endocrine reviews 26, 898-915.
Muller, A., Homey, B., Soto, H., Ge, N., Catron, D., Buchanan, M.E., McClanahan, T., Murphy, E., Yuan, W., Wagner,
S.N., et al. (2001). Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 410, 50-56.
Muller, C., Christodoulopoulos, G., Salles, B., and Panasci, L. (1998). DNA-Dependent protein kinase activity
correlates with clinical and in vitro sensitivity of chronic lymphocytic leukemia lymphocytes to nitrogen mustards.
Blood 92, 2213-2219.
Muoio, D.M., and Lynis Dohm, G. (2002). Peripheral metabolic actions of leptin. Best practice & research Clinical
endocrinology & metabolism 16, 653-666.
Niida, H., Katsuno, Y., Banerjee, B., Hande, M.P., and Nakanishi, M. (2007). Specific role of Chk1 phosphorylations in
cell survival and checkpoint activation. Molecular and cellular biology 27, 2572-2581.
Noe, V., Fingleton, B., Jacobs, K., Crawford, H.C., Vermeulen, S., Steelant, W., Bruyneel, E., Matrisian, L.M., and
Mareel, M. (2001). Release of an invasion promoter E-cadherin fragment by matrilysin and stromelysin-1. Journal of
cell science 114, 111-118.
Nomura, D.K., Long, J.Z., Niessen, S., Hoover, H.S., Ng, S.W., and Cravatt, B.F. (2010). Monoacylglycerol lipase
regulates a fatty acid network that promotes cancer pathogenesis. Cell 140, 49-61.
Okamoto, M., and Oyasu, R. (1997). Transformation in vitro of a nontumorigenic rat urothelial cell line by tumor
necrosis factor-alpha. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 77, 139-144.
Old, L.J. (1985). Tumor necrosis factor (TNF). Science 230, 630-632.
Olumi, A.F., Grossfeld, G.D., Hayward, S.W., Carroll, P.R., Tlsty, T.D., and Cunha, G.R. (1999). Carcinomaassociated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer research 59, 5002-5011.
Onuma, M., Bub, J.D., Rummel, T.L., and Iwamoto, Y. (2003). Prostate cancer cell-adipocyte interaction: leptin
mediates androgen-independent prostate cancer cell proliferation through c-Jun NH2-terminal kinase. The Journal of
biological chemistry 278, 42660-42667.
Orimo, A., Gupta, P.B., Sgroi, D.C., Arenzana-Seisdedos, F., Delaunay, T., Naeem, R., Carey, V.J., Richardson, A.L.,
and Weinberg, R.A. (2005). Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth
and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell 121, 335-348.
Orosz, P., Echtenacher, B., Falk, W., Ruschoff, J., Weber, D., and Mannel, D.N. (1993). Enhancement of experimental
metastasis by tumor necrosis factor. The Journal of experimental medicine 177, 1391-1398.
Paez-Ribes, M., Allen, E., Hudock, J., Takeda, T., Okuyama, H., Vinals, F., Inoue, M., Bergers, G., Hanahan, D., and
Casanovas, O. (2009). Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and
distant metastasis. Cancer cell 15, 220-231.
Paget, S. (1989). The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer metastasis reviews 8, 98101.
Paik, S., Shak, S., Tang, G., Kim, C., Baker, J., Cronin, M., Baehner, F.L., Walker, M.G., Watson, D., Park, T., et al.
(2004). A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. The New England
journal of medicine 351, 2817-2826.
Papkoff, J., and Aikawa, M. (1998). WNT-1 and HGF regulate GSK3 beta activity and beta-catenin signaling in
mammary epithelial cells. Biochemical and biophysical research communications 247, 851-858.
Park, C.C., Bissell, M.J., and Barcellos-Hoff, M.H. (2000). The influence of the microenvironment on the malignant
phenotype. Molecular medicine today 6, 324-329.
101
Park, J., Euhus, D.M., and Scherer, P.E. (2011). Paracrine and endocrine effects of adipose tissue on cancer
development and progression. Endocrine reviews 32, 550-570.
Park, J., Kusminski, C.M., Chua, S.C., and Scherer, P.E. (2010). Leptin receptor signaling supports cancer cell
metabolism through suppression of mitochondrial respiration in vivo. The American journal of pathology 177, 31333144.
Park, J.E., Keller, G.A., and Ferrara, N. (1993). The vascular endothelial growth factor (VEGF) isoforms: differential
deposition into the subepithelial extracellular matrix and bioactivity of extracellular matrix-bound VEGF. Molecular
biology of the cell 4, 1317-1326.
Park, J.E., Lenter, M.C., Zimmermann, R.N., Garin-Chesa, P., Old, L.J., and Rettig, W.J. (1999). Fibroblast activation
protein, a dual specificity serine protease expressed in reactive human tumor stromal fibroblasts. The Journal of
biological chemistry 274, 36505-36512.
Parrinello, S., Coppe, J.P., Krtolica, A., and Campisi, J. (2005). Stromal-epithelial interactions in aging and cancer:
senescent fibroblasts alter epithelial cell differentiation. Journal of cell science 118, 485-496.
Parsels, L.A., Parsels, J.D., Tai, D.C., Coughlin, D.J., and Maybaum, J. (2004). 5-fluoro-2'-deoxyuridine-induced
cdc25A accumulation correlates with premature mitotic entry and clonogenic death in human colon cancer cells. Cancer
research 64, 6588-6594.
Paszek, M.J., Zahir, N., Johnson, K.R., Lakins, J.N., Rozenberg, G.I., Gefen, A., Reinhart-King, C.A., Margulies, S.S.,
Dembo, M., Boettiger, D., et al. (2005). Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell 8, 241-254.
Pavlides, S., Whitaker-Menezes, D., Castello-Cros, R., Flomenberg, N., Witkiewicz, A.K., Frank, P.G., Casimiro, M.C.,
Wang, C., Fortina, P., Addya, S., et al. (2009). The reverse Warburg effect: aerobic glycolysis in cancer associated
fibroblasts and the tumor stroma. Cell Cycle 8, 3984-4001.
Petrelli, J.M., Calle, E.E., Rodriguez, C., and Thun, M.J. (2002). Body mass index, height, and postmenopausal breast
cancer mortality in a prospective cohort of US women. Cancer causes & control : CCC 13, 325-332.
Petridou, E.T., Mitsiades, N., Gialamas, S., Angelopoulos, M., Skalkidou, A., Dessypris, N., Hsi, A., Lazaris, N.,
Polyzos, A., Syrigos, C., et al. (2007). Circulating adiponectin levels and expression of adiponectin receptors in relation
to lung cancer: two case-control studies. Oncology 73, 261-269.
Picard, O., Rolland, Y., and Poupon, M.F. (1986). Fibroblast-dependent tumorigenicity of cells in nude mice:
implication for implantation of metastases. Cancer research 46, 3290-3294.
Pierce, J.P., Stefanick, M.L., Flatt, S.W., Natarajan, L., Sternfeld, B., Madlensky, L., Al-Delaimy, W.K., Thomson,
C.A., Kealey, S., Hajek, R., et al. (2007). Greater survival after breast cancer in physically active women with high
vegetable-fruit intake regardless of obesity. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of
Clinical Oncology 25, 2345-2351.
Pollard, J.W. (2009). Trophic macrophages in development and disease. Nature reviews Immunology 9, 259-270.
Polyak, K., Haviv, I., and Campbell, I.G. (2009). Co-evolution of tumor cells and their microenvironment. Trends in
genetics : TIG 25, 30-38.
Porter, G.A., Inglis, K.M., Wood, L.A., and Veugelers, P.J. (2006). Effect of obesity on presentation of breast cancer.
Annals of surgical oncology 13, 327-332.
Potenta, S., Zeisberg, E., and Kalluri, R. (2008). The role of endothelial-to-mesenchymal transition in cancer
progression. British journal of cancer 99, 1375-1379.
Prieto-Hontoria, P.L., Perez-Matute, P., Fernandez-Galilea, M., Bustos, M., Martinez, J.A., and Moreno-Aliaga, M.J.
(2011). Role of obesity-associated dysfunctional adipose tissue in cancer: a molecular nutrition approach. Biochimica et
biophysica acta 1807, 664-678.
Provenzano, P.P., Eliceiri, K.W., Campbell, J.M., Inman, D.R., White, J.G., and Keely, P.J. (2006). Collagen
reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC medicine 4, 38.
102
Pupa, S.M., Menard, S., Forti, S., and Tagliabue, E. (2002). New insights into the role of extracellular matrix during
tumor onset and progression. Journal of cellular physiology 192, 259-267.
Radisky, E.S., and Radisky, D.C. (2007). Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Reviews in
endocrine & metabolic disorders 8, 279-287.
Rayner, D.V., and Trayhurn, P. (2001). Regulation of leptin production: sympathetic nervous system interactions. J Mol
Med (Berl) 79, 8-20.
Ren, J., Xiao, Y.J., Singh, L.S., Zhao, X., Zhao, Z., Feng, L., Rose, T.M., Prestwich, G.D., and Xu, Y. (2006).
Lysophosphatidic acid is constitutively produced by human peritoneal mesothelial cells and enhances adhesion,
migration, and invasion of ovarian cancer cells. Cancer research 66, 3006-3014.
Renehan, A.G., Tyson, M., Egger, M., Heller, R.F., and Zwahlen, M. (2008). Body-mass index and incidence of cancer:
a systematic review and meta-analysis of prospective observational studies. Lancet 371, 569-578.
Reynolds, C.P., Maurer, B.J., and Kolesnick, R.N. (2004). Ceramide synthesis and metabolism as a target for cancer
therapy. Cancer letters 206, 169-180.
Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E., Roccaro, A.M., and Vacca, A. (2007). The history of the angiogenic switch concept.
Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, UK 21, 44-52.
Righi, E., Kashiwagi, S., Yuan, J., Santosuosso, M., Leblanc, P., Ingraham, R., Forbes, B., Edelblute, B., Collette, B.,
Xing, D., et al. (2011). CXCL12/CXCR4 blockade induces multimodal anti-tumor effects and prolongs survival of
immunocompetent mice with ovarian cancer. Cancer research.
Ronnov-Jessen, L., and Petersen, O.W. (1993). Induction of alpha-smooth muscle actin by transforming growth factorbeta 1 in quiescent human breast gland fibroblasts. Implications for myofibroblast generation in breast neoplasia.
Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 68, 696-707.
Ronti, T., Lupattelli, G., and Mannarino, E. (2006). The endocrine function of adipose tissue: an update. Clinical
endocrinology 64, 355-365.
Roos, W.P., and Kaina, B. (2006). DNA damage-induced cell death by apoptosis. Trends in molecular medicine 12,
440-450.
Rosas, M., Birkenkamp, K.U., Lammers, J.W., Koenderman, L., and Coffer, P.J. (2005). Cytokine mediated
suppression of TF-1 apoptosis requires PI3K activation and inhibition of Bim expression. FEBS letters 579, 191-198.
Rosen, E.D., and MacDougald, O.A. (2006). Adipocyte differentiation from the inside out. Nature reviews Molecular
cell biology 7, 885-896.
Rosen, E.D., Walkey, C.J., Puigserver, P., and Spiegelman, B.M. (2000). Transcriptional regulation of adipogenesis.
Genes & development 14, 1293-1307.
Ross, G.M. (1999). Induction of cell death by radiotherapy. Endocrine-related cancer 6, 41-44.
Ross, S.E., Hemati, N., Longo, K.A., Bennett, C.N., Lucas, P.C., Erickson, R.L., and MacDougald, O.A. (2000).
Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science 289, 950-953.
Sakakura, T., Nishizuka, Y., and Dawe, C.J. (1976). Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific
cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science 194, 1439-1441.
Saren, P., Welgus, H.G., and Kovanen, P.T. (1996). TNF-alpha and IL-1beta selectively induce expression of 92-kDa
gelatinase by human macrophages. J Immunol 157, 4159-4165.
Sarkar, S., Nuttall, R.K., Liu, S., Edwards, D.R., and Yong, V.W. (2006). Tenascin-C stimulates glioma cell invasion
through matrix metalloproteinase-12. Cancer research 66, 11771-11780.
Sasser, A.K., Sullivan, N.J., Studebaker, A.W., Hendey, L.F., Axel, A.E., and Hall, B.M. (2007). Interleukin-6 is a
potent growth factor for ER-alpha-positive human breast cancer. The FASEB journal : official publication of the
Federation of American Societies for Experimental Biology 21, 3763-3770.
103
Satterwhite, D.J., and Neufeld, K.L. (2004). TGF-beta targets the Wnt pathway components, APC and beta-catenin, as
Mv1Lu cells undergo cell cycle arrest. Cell Cycle 3, 1069-1073.
Saxton, J.M., Daley, A., Woodroofe, N., Coleman, R., Powers, H., Mutrie, N., Siddall, V., and Crank, H. (2006). Study
protocol to investigate the effect of a lifestyle intervention on body weight, psychological health status and risk factors
associated with disease recurrence in women recovering from breast cancer treatment [ISRCTN08045231]. BMC
cancer 6, 35.
Schafer, Z.T., and Brugge, J.S. (2007). IL-6 involvement in epithelial cancers. The Journal of clinical investigation 117,
3660-3663.
Schafer, Z.T., Grassian, A.R., Song, L., Jiang, Z., Gerhart-Hines, Z., Irie, H.Y., Gao, S., Puigserver, P., and Brugge, J.S.
(2009). Antioxidant and oncogene rescue of metabolic defects caused by loss of matrix attachment. Nature 461, 109113.
Schaffler, A., Scholmerich, J., and Buechler, C. (2007). Mechanisms of disease: adipokines and breast cancer endocrine and paracrine mechanisms that connect adiposity and breast cancer. Nature clinical practice Endocrinology &
metabolism 3, 345-354.
Schultz, G.S., and Wysocki, A. (2009). Interactions between extracellular matrix and growth factors in wound healing.
Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair
Society 17, 153-162.
Schurch, W., Seemayer, T.A., and Gabbiani, G. (1998). The myofibroblast: a quarter century after its discovery. The
American journal of surgical pathology 22, 141-147.
Schutze, S., Machleidt, T., and Kronke, M. (1994). The role of diacylglycerol and ceramide in tumor necrosis factor and
interleukin-1 signal transduction. Journal of leukocyte biology 56, 533-541.
Selander, K.S., Li, L., Watson, L., Merrell, M., Dahmen, H., Heinrich, P.C., Muller-Newen, G., and Harris, K.W.
(2004). Inhibition of gp130 signaling in breast cancer blocks constitutive activation of Stat3 and inhibits in vivo
malignancy. Cancer research 64, 6924-6933.
Sengenes, C., Moro, C., Galitzky, J., Berlan, M., and Lafontan, M. (2005). [Natriuretic peptides: a new lipolytic
pathway in human fat cells]. Medecine sciences : M/S 21 Spec No, 29-33.
Serini, G., Bochaton-Piallat, M.L., Ropraz, P., Geinoz, A., Borsi, L., Zardi, L., and Gabbiani, G. (1998). The fibronectin
domain ED-A is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factor-beta1. The Journal of
cell biology 142, 873-881.
Sethi, T., Rintoul, R.C., Moore, S.M., MacKinnon, A.C., Salter, D., Choo, C., Chilvers, E.R., Dransfield, I., Donnelly,
S.C., Strieter, R., et al. (1999). Extracellular matrix proteins protect small cell lung cancer cells against apoptosis: a
mechanism for small cell lung cancer growth and drug resistance in vivo. Nature medicine 5, 662-668.
Shafie, S.M., and Grantham, F.H. (1981). Role of hormones in the growth and regression of human breast cancer cells
(MCF-7) transplanted into athymic nude mice. Journal of the National Cancer Institute 67, 51-56.
Shao, M.Y., Cheng, R., Wang, F.M., Yang, H., Cheng, L., and Hu, T. (2011). beta-Catenin and Rho GTPases as
downstream targets of TGF-beta1 during pulp repair. Cell biology international 35, 105-109.
Shchors, K., and Evan, G. (2007). Tumor angiogenesis: cause or consequence of cancer? Cancer research 67, 70597061.
Shen, W.H., Zhou, J.H., Broussard, S.R., Freund, G.G., Dantzer, R., and Kelley, K.W. (2002). Proinflammatory
cytokines block growth of breast cancer cells by impairing signals from a growth factor receptor. Cancer research 62,
4746-4756.
Shi, Y., and Massague, J. (2003). Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell 113, 685700.
104
Sierra-Honigmann, M.R., Nath, A.K., Murakami, C., Garcia-Cardena, G., Papapetropoulos, A., Sessa, W.C., Madge,
L.A., Schechner, J.S., Schwabb, M.B., Polverini, P.J., et al. (1998). Biological action of leptin as an angiogenic factor.
Science 281, 1683-1686.
Simpson, E.R., Misso, M., Hewitt, K.N., Hill, R.A., Boon, W.C., Jones, M.E., Kovacic, A., Zhou, J., and Clyne, C.D.
(2005). Estrogen--the good, the bad, and the unexpected. Endocrine reviews 26, 322-330.
Singh, A., Purohit, A., Ghilchik, M.W., and Reed, M.J. (1999). The regulation of aromatase activity in breast
fibroblasts: the role of interleukin-6 and prostaglandin E2. Endocrine-related cancer 6, 139-147.
Sis, B., Sarioglu, S., Sokmen, S., Sakar, M., Kupelioglu, A., and Fuzun, M. (2005). Desmoplasia measured by computer
assisted image analysis: an independent prognostic marker in colorectal carcinoma. Journal of clinical pathology 58, 3238.
Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., and Allavena, P. (2009). Tumor-associated macrophages (TAM) as major
players of the cancer-related inflammation. Journal of leukocyte biology 86, 1065-1073.
Solinas, G., Marchesi, F., Garlanda, C., Mantovani, A., and Allavena, P. (2010). Inflammation-mediated promotion of
invasion and metastasis. Cancer metastasis reviews 29, 243-248.
Spalding, K.L., Arner, E., Westermark, P.O., Bernard, S., Buchholz, B.A., Bergmann, O., Blomqvist, L., Hoffstedt, J.,
Naslund, E., Britton, T., et al. (2008). Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature 453, 783-787.
Spencer, V.A., Xu, R., and Bissell, M.J. (2007). Extracellular matrix, nuclear and chromatin structure, and gene
expression in normal tissues and malignant tumors: a work in progress. Advances in cancer research 97, 275-294.
Stacker, S.A., Achen, M.G., Jussila, L., Baldwin, M.E., and Alitalo, K. (2002). Lymphangiogenesis and cancer
metastasis. Nature reviews Cancer 2, 573-583.
Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., and Yun, K. (1986). Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics
of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation; research in biological diversity 31, 42-49.
Sugimoto, H., Mundel, T.M., Kieran, M.W., and Kalluri, R. (2006). Identification of fibroblast heterogeneity in the
tumor microenvironment. Cancer biology & therapy 5, 1640-1646.
Sullivan, N.J., Sasser, A.K., Axel, A.E., Vesuna, F., Raman, V., Ramirez, N., Oberyszyn, T.M., and Hall, B.M. (2009).
Interleukin-6 induces an epithelial-mesenchymal transition phenotype in human breast cancer cells. Oncogene 28, 29402947.
Takabe, K., Paugh, S.W., Milstien, S., and Spiegel, S. (2008). "Inside-out" signaling of sphingosine-1-phosphate:
therapeutic targets. Pharmacological reviews 60, 181-195.
Takahata, C., Miyoshi, Y., Irahara, N., Taguchi, T., Tamaki, Y., and Noguchi, S. (2007). Demonstration of adiponectin
receptors 1 and 2 mRNA expression in human breast cancer cells. Cancer letters 250, 229-236.
Takemura, Y., Osuga, Y., Yamauchi, T., Kobayashi, M., Harada, M., Hirata, T., Morimoto, C., Hirota, Y., Yoshino, O.,
Koga, K., et al. (2006). Expression of adiponectin receptors and its possible implication in the human endometrium.
Endocrinology 147, 3203-3210.
Tamori, Y., Masugi, J., Nishino, N., and Kasuga, M. (2002). Role of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
in maintenance of the characteristics of mature 3T3-L1 adipocytes. Diabetes 51, 2045-2055.
Tao, Y., Leteur, C., Yang, C., Zhang, P., Castedo, M., Pierre, A., Golsteyn, R.M., Bourhis, J., Kroemer, G., and
Deutsch, E. (2009). Radiosensitization by Chir-124, a selective CHK1 inhibitor: effects of p53 and cell cycle
checkpoints. Cell Cycle 8, 1196-1205.
Tejerina, S., De Pauw, A., Vankoningsloo, S., Houbion, A., Renard, P., De Longueville, F., Raes, M., and Arnould, T.
(2009). Mild mitochondrial uncoupling induces 3T3-L1 adipocyte de-differentiation by a PPARgamma-independent
mechanism, whereas TNFalpha-induced de-differentiation is PPARgamma dependent. Journal of cell science 122, 145155.
105
Tlsty, T.D., and Coussens, L.M. (2006). Tumor stroma and regulation of cancer development. Annual review of
pathology 1, 119-150.
Tokuda, Y., Satoh, Y., Fujiyama, C., Toda, S., Sugihara, H., and Masaki, Z. (2003). Prostate cancer cell growth is
modulated by adipocyte-cancer cell interaction. BJU international 91, 716-720.
Tomasek, J.J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., and Brown, R.A. (2002). Myofibroblasts and mechanoregulation of connective tissue remodelling. Nature reviews Molecular cell biology 3, 349-363.
Tong, Q., Dalgin, G., Xu, H., Ting, C.N., Leiden, J.M., and Hotamisligil, G.S. (2000). Function of GATA transcription
factors in preadipocyte-adipocyte transition. Science 290, 134-138.
Tontonoz, P., Hu, E., and Spiegelman, B.M. (1994). Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a
lipid-activated transcription factor. Cell 79, 1147-1156.
Toullec, A., Gerald, D., Despouy, G., Bourachot, B., Cardon, M., Lefort, S., Richardson, M., Rigaill, G., Parrini, M.C.,
Lucchesi, C., et al. (2010). Oxidative stress promotes myofibroblast differentiation and tumour spreading. EMBO
molecular medicine 2, 211-230.
Trentham-Dietz, A., Newcomb, P.A., Egan, K.M., Titus-Ernstoff, L., Baron, J.A., Storer, B.E., Stampfer, M., and
Willett, W.C. (2000). Weight change and risk of postmenopausal breast cancer (United States). Cancer causes & control
: CCC 11, 533-542.
Trentham-Dietz, A., Newcomb, P.A., Nichols, H.B., and Hampton, J.M. (2007). Breast cancer risk factors and second
primary malignancies among women with breast cancer. Breast cancer research and treatment 105, 195-207.
Ulrich, C.M., Bigler, J., and Potter, J.D. (2006). Non-steroidal anti-inflammatory drugs for cancer prevention: promise,
perils and pharmacogenetics. Nature reviews Cancer 6, 130-140.
Van den Eynden, G.G., Colpaert, C.G., Couvelard, A., Pezzella, F., Dirix, L.Y., Vermeulen, P.B., Van Marck, E.A., and
Hasebe, T. (2007). A fibrotic focus is a prognostic factor and a surrogate marker for hypoxia and (lymph)angiogenesis
in breast cancer: review of the literature and proposal on the criteria of evaluation. Histopathology 51, 440-451.
van Tienen, F.H., Laeremans, H., van der Kallen, C.J., and Smeets, H.J. (2009). Wnt5b stimulates adipogenesis by
activating PPARgamma, and inhibiting the beta-catenin dependent Wnt signaling pathway together with Wnt5a.
Biochemical and biophysical research communications 387, 207-211.
Vander Heiden, M.G., Cantley, L.C., and Thompson, C.B. (2009). Understanding the Warburg effect: the metabolic
requirements of cell proliferation. Science 324, 1029-1033.
Vazquez-Vela, M.E., Torres, N., and Tovar, A.R. (2008). White adipose tissue as endocrine organ and its role in
obesity. Archives of medical research 39, 715-728.
Walter, M., Liang, S., Ghosh, S., Hornsby, P.J., and Li, R. (2009). Interleukin 6 secreted from adipose stromal cells
promotes migration and invasion of breast cancer cells. Oncogene 28, 2745-2755.
Wang, G., Matsuura, I., He, D., and Liu, F. (2009). Transforming growth factor-{beta}-inducible phosphorylation of
Smad3. The Journal of biological chemistry 284, 9663-9673.
Wang, P., Mariman, E., Renes, J., and Keijer, J. (2008). The secretory function of adipocytes in the physiology of white
adipose tissue. Journal of cellular physiology 216, 3-13.
Weisberg, S.P., McCann, D., Desai, M., Rosenbaum, M., Leibel, R.L., and Ferrante, A.W., Jr. (2003). Obesity is
associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of clinical investigation 112, 1796-1808.
White, P.B., True, E.M., Ziegler, K.M., Wang, S.S., Swartz-Basile, D.A., Pitt, H.A., and Zyromski, N.J. (2010). Insulin,
leptin, and tumoral adipocytes promote murine pancreatic cancer growth. Journal of gastrointestinal surgery : official
journal of the Society for Surgery of the Alimentary Tract 14, 1888-1893; discussion 1893-1884.
Whiteside, T.L. (2008). The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene 27, 59045912.
106
Winkler, F., Kozin, S.V., Tong, R.T., Chae, S.S., Booth, M.F., Garkavtsev, I., Xu, L., Hicklin, D.J., Fukumura, D., di
Tomaso, E., et al. (2004). Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to
radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer cell 6, 553-563.
Wiseman, B.S., and Werb, Z. (2002). Stromal effects on mammary gland development and breast cancer. Science 296,
1046-1049.
Witkiewicz, A.K., Dasgupta, A., Sotgia, F., Mercier, I., Pestell, R.G., Sabel, M., Kleer, C.G., Brody, J.R., and Lisanti,
M.P. (2009). An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in
human breast cancers. The American journal of pathology 174, 2023-2034.
Witz, I.P. (2008). Tumor-microenvironment interactions: dangerous liaisons. Advances in cancer research 100, 203229.
Witz, I.P. (2009). The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer microenvironment : official journal
of the International Cancer Microenvironment Society 2 Suppl 1, 9-17.
Wood, I.S., de Heredia, F.P., Wang, B., and Trayhurn, P. (2009). Cellular hypoxia and adipose tissue dysfunction in
obesity. The Proceedings of the Nutrition Society 68, 370-377.
Wright, K.M., and Friedland, J.S. (2004). Regulation of monocyte chemokine and MMP-9 secretion by
proinflammatory cytokines in tuberculous osteomyelitis. Journal of leukocyte biology 75, 1086-1092.
Wu, Z., Rosen, E.D., Brun, R., Hauser, S., Adelmant, G., Troy, A.E., McKeon, C., Darlington, G.J., and Spiegelman,
B.M. (1999). Cross-regulation of C/EBP alpha and PPAR gamma controls the transcriptional pathway of adipogenesis
and insulin sensitivity. Molecular cell 3, 151-158.
Xia, F., and Powell, S.N. (2002). The molecular basis of radiosensitivity and chemosensitivity in the treatment of breast
cancer. Seminars in radiation oncology 12, 296-304.
Xouri, G., and Christian, S. (2010). Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental
biology 21, 40-46.
Yang, F., Tuxhorn, J.A., Ressler, S.J., McAlhany, S.J., Dang, T.D., and Rowley, D.R. (2005). Stromal expression of
connective tissue growth factor promotes angiogenesis and prostate cancer tumorigenesis. Cancer research 65, 88878895.
Yeh, H.H., Lai, W.W., Chen, H.H., Liu, H.S., and Su, W.C. (2006). Autocrine IL-6-induced Stat3 activation contributes
to the pathogenesis of lung adenocarcinoma and malignant pleural effusion. Oncogene 25, 4300-4309.
Yoneda, K., Tomimoto, A., Endo, H., Iida, H., Sugiyama, M., Takahashi, H., Mawatari, H., Nozaki, Y., Fujita, K.,
Yoneda, M., et al. (2008). Expression of adiponectin receptors, AdipoR1 and AdipoR2, in normal colon epithelium and
colon cancer tissue. Oncology reports 20, 479-483.
Zeisberg, E.M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., and Kalluri, R. (2007). Discovery of endothelial to mesenchymal
transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer research 67, 10123-10128.
Zhang, Y., Proenca, R., Maffei, M., Barone, M., Leopold, L., and Friedman, J.M. (1994). Positional cloning of the
mouse obese gene and its human homologue. Nature 372, 425-432.
Zhou, S., Eid, K., and Glowacki, J. (2004). Cooperation between TGF-beta and Wnt pathways during chondrocyte and
adipocyte differentiation of human marrow stromal cells. Journal of bone and mineral research : the official journal of
the American Society for Bone and Mineral Research 19, 463-470.
Zuo, Y., Qiang, L., and Farmer, S.R. (2006). Activation of CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) alpha expression
by C/EBP beta during adipogenesis requires a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-associated repression
of HDAC1 at the C/ebp alpha gene promoter. The Journal of biological chemistry 281, 7960-7967.
107
Rôle des adipocytes péri-tumoraux dans la progression tumorale mammaire
De nombreux arguments suggèrent que la progression tumorale est non seulement dépendante des
cellules cancéreuses mais aussi des cellules normales qui entourent la tumeur. Ces cellules « saines »
sont appelées cellules du stroma tumoral ou encore cellules du microenvironnement tumoral. Parmi les
cellules du stroma tumoral, le rôle des adipocytes a été très peu étudié alors qu’ils représentent un des
types cellulaires les plus représentés du microenvironnement de certaines tumeurs comme le cancer du
sein. De plus, les adipocytes sécrètent de nombreux facteurs de croissance, cytokines et chimiokines –
regroupés sous le terme adipocytokines- susceptibles d’influencer profondément le comportement de
la tumeur.
L’objectif de mon projet a été de caractérisé le dialogue entre les adipocytes et les cellules tumorales
mammaires, et d’évaluer son effet sur la progression tumorale. Dans un premier temps, nous avons
montré que les adipocytes cocultivés avec les cellules tumorales mammaires pendant 3 jours
acquièrent un phénotype original (diminution des marqueurs adipocytaires, augmentation des
sécrétions proinflammatoires). Ces adipocytes modifiés, appelés CAA pour Cancer-Associated
Adipocyte, sont retrouvés au front invasif des tumeurs mammaires et participent à la progression
tumorale en favorisant l’acquisition d’un potentiel métastatique in vitro et in vivo. Nous avons ensuite
montré que les CAAs ont également un rôle dans la réponse des cellules tumorales aux radiations
ionisantes. En effet, après 3 jours de coculture avec les adipocytes, les cellules tumorales deviennent
radiorésistantes et sont protégées de la mort post-mitotique radio-induite. Enfin, nous nous sommes
intéressés au phénotype des adipocytes cocultivés pendant une période prolongée (5 à 8 jours) avec les
cellules tumorales. Dans ces conditions, les adipocytes perdent leur contenu lipidique ainsi que
l’expression des marqueurs adipocytaires. Ce processus s’accompagne de profonds changements
morphologiques conduisant à l’acquisition d’un phénotype fibroblastique « activé ». Nous avons donc
appelé cette population des fibroblastes dérivés des adipocytes (ADF pour « Adipocyte-Derived
Fibroblast »). Les ADFs sont capables de migrer, d’envahir une matrice et secrètent de nombreuses
molécules profibrotiques (fibronectine, collagène 1). Enfin, dans un modèle 3D de sphéroïdes cultivés
dans une matrice de collagène, les ADFs induisent une augmentation significative de l’invasion des
cellules tumorales. Ces résultats ont été confirmés in vivo ce qui suggère que les ADFs pourraient
contribuer à la réaction desmoplastique fréquemment observée dans le cancer du sein (cette réaction
est caractérisée par la prolifération localisée de fibroblastes au sein d’une matrice riche en fibres de
collagène et participe la progression tumorale).
En conclusion, nos résultats mettent en évidence un dialogue entre les cellules tumorales mammaires
et les adipocytes, à l’origine de profondes modifications du phénotype adipocytaire d’une part, et des
capacités invasives des cellules tumorales d’autre part. Ces travaux pourraient permettre d’expliquer le
mauvais pronostic des cancers du sein retrouvé chez des sujets obèses.