Chaine respiratoire et phosphorylation oxydative

Dr A GOURI,
Laboratoire de Biochimie Médicale, CHU Annaba.
[email protected]
• Décrire les différentes étapes de transfert des
équivalents réducteurs.
• Comprendre le mécanisme de production d’ATP.
• Connaitre les principaux inhibiteurs de la CRM et les
anomalies associées.
PLAN
Introduction
I. En pratique médicale
II. Les Substrats
III. Les Constituants
IV. Fonctionnement de la CRM
V. La phosphorylation oxydative
VI. Bilan Energétique
VII. Régulation de la CRM
VIII. Dysfonctionnements de la CRM
IX. Anomalies de la CRM
- Près de 90% de l’oxygène consommé par les êtres vivants
est utilisé dans «mitochondries» pour produire de
l’Energie.
- L’énergie emmagasinée dans les glucides, les lipides et
les protéines doit être convertie en ATP (énergie
rapidement utilisable)
- ATP est produit dans les mitochondries grâce à la
chaine respiratoire et la phosphorylation oxydative.
- Les é provenant de différentes réactions intracellulaires
sont pris en charge par des transporteurs (NAD, FAD).
- Les électrons parcourent une suite d’étapes redox en
direction de l’O2 pour le réduire finalement en H2O.
- Abandonnent leur énergie pour constituer un gradient de
protons à travers la membrane interne de la
mitochondrie.
- Ce gradient permet la production d’ATP à partir d’ADP et
de Pi.
 Le but de la CRM est la réoxydation de ces 2 éléments
réduits (FADH2 + NADH), produits du catabolisme.
 La CRM utilise le pouvoir réducteur de ces 2 coenzymes
pour créer une force électrochimique
réaliser la
réaction de condensation d’un Pi sur un ADP pour former
de l’ATP via l’ATP synthase
formation d’ATP
 Toutes ces étapes ont lieu dans la mitochondrie et dans
toutes les cellules sauf le GR.
Glucose
Schéma général
Puruvate
NADH
AcétylCoA
Krebs
NADH, FADH2
O2H2O +
ADP
ATP
H+
 CRM est un ensemble physique et fonctionnel dans la
mitochondrie qui
 produit :
1. l’H20 au terme des réactions d’oxydo-réduction
2. l’ATP : phosphorylation de l’ADP utilisant l’E produite
(fragmentée et graduelle) par la chaîne d’oxyréduction
 à partir de :
1. des H+ transportés par les coENZ réduits
2. l’02 apporté par la respiration, circulation sanguine et
diffusion tissulaire
• Nutrition et besoins énergétiques.
• Maladies neuro-musculaires
• Thérapie substitutive.
II. LES SUBSTRATS
Coenzymes réduits cytosoliques ou mitochondriales
II. LES SUBSTRATS
1. NADH,H+ cytosolique
- Produit par oxydation de divers substrats(PGA,
Glycérol-3P, Lactate…)
- Pas de transporteurs à travers la Mb mitochondriale.
- Passage des équivalents réducteurs uniquement
(H+,è) par des navettes:
 Glycérol.3P :utilise les isoenz de la glycérol.3P DHase
(muscle, cerveau)
 Malate –Aspartate: associe 2 cycles (foie, rein,cœur)
PDHA
gly3PDHase
Glycérol.3P
NADH,H+
NAD+
Cytosol
- PGA
- Glycérol3P
- lactate
Diffusion
PDHA
MB ext
gly3PDHase
Glycérol.3P Espace intMb
MB int
CQ
FADH2
FAD
Navette Glycérol.3P
Matrice
ASAT
2
-Cétoglutarate
NADH,H+
AOA
1
ASP
NAD+
Glu
Glut
ASAT
ASP
Matrice
2
MDH
MALATE
AOA
MDH
Malate
1
NADH,H+
NAD+
-Cétoglutarate
Navette malate- aspartate
cytosol
Navette MAL/ASP
2. NADH,H+ mitochondrial
• Origines :
– Cycle de Krebs ( 3 molécules)
– Oxydation des substrats : PYR, OHacyl-CoA, 3OH
butyrate, glut, glycine, alcool….
• Le NADH,H+ (cyt ou mitoch) est substrat du C.I =
réduit le FMN de la NADH DHase en FMNH2,
cède ses H+ et è au CQ.
3. FADH2: Substrat de l’ubiquinone (CQ)
• Origine mitochondriale :
1. Glycérol.3P en DHAP (Gly.3P DHase = espace inter-mb)
2. Acyl-CoA (acyl-CoA DHase = matrice) = H+ et è du FADH2
transportés par ETF S/F ETFH2.
(1) et (2) enz à FAD = variantes du C.II
3. Succinate en Fumarate , succinateDHase = Enz du C.II
(mb int) enz à FAD.
• Le FADH2 entre au niv du C.II constitué par la succinate
DHase à FAD. CII va oxydé le succinate par cette ENZ.
Origine FADH2
Espace
1 Glyc.3P Dha se
Glyc .3P
FADH2
1
UQ
3
CII
FADH2
DHAP
Mb int
2
FADH2
Succinate DHase
3
Succinate
FAD
2
ETF
Acyl-CoA DHase Matrice
ETFH2
Acyl-CoA
1. la Chaîne d’oxydo-red: complexes protéiques =
a) 4 complexes prot fixes: transporteurs de GREEN:
Fixes, multiprotéiques, transmembranaires, action
séquentielle.
b) 2 transporteurs mobiles: assurent la continuité de
la chaîne = relient les éléments fixes.
(Green et al, 1966)
a)
CI
C II
CIII
C IV
NADH DHase= Succinate DHase= Ubiquinol- Cytochrome c
cytochrome Oxydase:
NADH -coenz Succinate coenz
c-réductase avec 2 cyt a
Q- Réductase: Q-réductase:
à FMN et prot
fer-S
b)
à FAD et prot
fer-S
à prot fer-S et a3
et 2 cyt b et et Zinc, et
c1-(hème
Cuivre
avec Fe3+
ou Fe2+)
Transporteurs mobiles
Complexe Q = coenz Q=
Ubiquinone (UQ):
lip mobile dans la bicouche PLip
de la Mb int mitoch
Cytochrome c:
Prot soluble mobile,
fonctionne à la face ext
de la Mb int mitoch
2. Phosphorylation oxydative:
• Assure la synthèse de l’ATP = Complexe V ou ATP
synthétase grâce à l’énergie du flux de protons H+.
• Le transport des H+ se fait uniquement dans le
sens espace intermembranaire matrice.
3. Importance de la Mb interne mitochondriale:
• Sépare 2 compartiments : matrice et espace interMb
• Empêche les protons H+ de passer d’1 compartiment à
l’autre.
• Franchissement Des H+ grâce aux complexes
respiratoires transmb:
+ C I, C III, C IV pour: sortir de la matrice
+ C V pour: revenir dans la matrice
•  permet la constitution d’1 gradient
électrochimique dont l’E de dissipation  la
synthèse de l’ATP .
Vidéo explicative
IV. FONCTIONNEMENT
• Utilise les syst redox constitutifs de la CRM.
• Chaque couple = Forme oxydé et F. réduite (céder ou
accepter 1nbre déterminé de protons H+ (0,1, 2) avec 1
ou 2 è.
• 10 syst qui interviennent dans un ordre déterminé par
leur E’°²  Allant des val les plus électro-négatives
les plus électro-positives
• Du plus red NAD+/NADH,H+ vers le plus oxy 02/H20.
10 Couples redox échange de H+et/ou è E’°
(volt)
+red
CI
CII
CIII
CIV
NAD+ NADH,H+
H+ + 2è
-0,32
FMN  FMNH2
2H+ + 2è
-0,30
FAD  FADH2
2H+ + 2è
-0,05
UQ  UQH2
2H+ + 2è
+0,04
Cyt b Fe3+  cyt b Fe2+
1è
+0,07
Cyt c1 Fe3+  cyt c1 Fe2+
1è
+0,22
Cyt c Fe3+  cyt c Fe2+
1è
+0,25
Cyt a Fe3+  cyt a Fe2+
1è
+0,29
Cyt a3 Fe3+  cyt a3 Fe2+
1è
+0,55
½ 02 H20
2H+ + 2è
+0,82+oxy
• La chaîne d’oxydoréduction peut être divisée en 02
phases :
Phase 1: Transfert des Eq réducteurs (H+ et è) à l’UQ
UQ(ubiquinone)  UQH2 (ubiquinol)
Phase 2: Transfert des è de l’ UQH2 à l’02 .
1. Transfert des Eq red à l’ubiquinone (UQ)
• Reçoit les H+ et è des ≠ substrats par l’intermédiaire des
DHases flavoprotéiques à FAD et FMN.
1.1.NADH,H+: entre dans la chaîne au niveau du CI
Matrice
NADH,H+
H+
FMN
MB
Int
NAD+
FMNH2
Fe-S
C.I
espace
CQ
UQ
UQH2
C.III
H+ (NADH DHase)
Site de pompage H+ = saut d’énergie suffisant
+,H+
H
H+,H+
2Fe 3+
FMNH2
Q
2Fe 2+
QH2 QH2 QH2
FMN
4H+
NADH+H+
NAD+
COMPLEXE I
1.2. FADH2 : entre au niveau du CII
substrat du CII qui oxyde le succinate par la succinate
DHase à FAD.
Matrice
Fumarate
succinate
FADH2
Mb int
espace
FAD
Fe-S
C.II
CQ
UQ
UQH2
C.III
• 02 Variantes du C.II
Glyc.3P
FAD
Glyc.3P DHase
MB EXT
DHAP
FADH2
UQ
UQH2
MB INT
CIII
Matrice
Acyl-CoA
ETFH2
FAD
MB INT
ETF
FADH2
CIII
ETF prot de transfert des eq red provenant de l’oxydation des acylCoA au
FAD de la ETF DHase, le FADH2 formé réduit UQ
Résumé de la première phase
• NADH,H+ cède ses Eq red à UQ par le FMN de la
NADH DHase du CI  FMNH2  UQH2(CQ)
• ETFH2 cède ses Eq red au FAD de l’ETF-DHase
FADH2  UQH2 (CQ)
• Le succinate en réduisant le FAD de la succinate
DHase du CII est oxydé en fumarate. FADH2 formé
 UQH2 (CQ)
• Le glycérol-3P en réduisant le FAD de la glycérol3P DHase est oxydé en PDHA. FADH2 formé 
UQH2 (CQ)
 Par le Conezyme Q transitent tous les Eq
réducteurs issus du catabolisme oxydatif.
Ubiquinone = Carrefour de la CRM
 Occupe une place prépondérante dans le
métabolisme énergétique.
Coenzyme Q10
Rôle d'antioxydant
“Supplementation with CoQ10, which is a natural and
safe substance, corrects a deficiency in the body and
blocks the vicious metabolic cycle in chronic heart
failure. “
2. Transfert des è de l’ubiquinol (UQH2) à l’02
• Rôle du CIII et CIV
• 2H+ (vers la matrice) et 2è (vers 2 cyto C)
2.1.Transfert sur CIII: Ubiquinol cyt-c réductase 
UQH2 + 2 cyt (b+c1) Fe3+  UQ + 2 cyt Fe2+
1 è passe dans le cyt bFe3+  cyt b Fe2+
ensuite dans le cytc1Fe3+  cytc1Fe2+
2
• CIII: site de pompage des protons H+ de la matrice
vers l’espace inter-mb ( saut d’énergie suffisant)
H+,H+
cytc
cytbL
e-,e+
H+,H
+,H+
He-,ee-,e-
cytc1
QH2
QH
QH
22
QH2
cytbH
FeS
COMPLEXE III
H+,H+
H+,H+
cytc cytc cytc cytc cytc cytc
cytbL
cytc1
QH2
cytbH
FeS
H+,H+
COMPLEXE III
2.2. Transfert sur le cyt c (complexe mobile)
2cytc Fe3+  2 cytcFe2+
CIII (ubiquinol Cyt c réductase) reçoit les Eq red de
UQH2 et les transfert au Cyt c  réoxyde l’ubiquinol
et réduit le Cytc
2.3. Transfert sur le Complexe IV:
Catalysé par la cyt c oxydase  formation d’H20
Les 2è sont portés successivement par les 2 cyt du
Complexe IV (a et a3)
2 cyt c
Fe2+
2 cyt c
Fe3+
2 cyt a
Fe3+
2 cyt a3 Fe2+
2 cyt a
Fe2+
2 cyt a3 Fe3+
½ 02 +
2H++2è
H20
 L’02 moléculaire peut être considéré comme une
«décharge» où sont jetés les è une fois vidés de l’énergie.
 Rôle imp du Cu++ pour la synthèse simultanée de 2H20
02 + 4è + 4H+  2H20 (éviter la formation de corps
intermédiaires dangereux pour les ¢ = ions peroxydes)
 Complexe IV : site de pompage de H+
 Au total : 3 sites de pompage : CI, CIII et CIV
H+
cytc cytc cytc
H+
Cyta
cytbH
Cyta3
H+
1/2 O
H+ 1/2
O22
H+
4H+
H+
H
H22O
O
COMPLEXE IV
H+
H+ H+ H+
H+
NADH + H+
I
H+
III
H+ H+
H+ H+
IV
H+
1/2 O2
1. La libération d’énergie:
• Transfert d’eq réducteurs par pallier successif 
libération d’Energie progressive et fragmentée.
• Quand cette E est impte (dénivellation),elle 1 flux
de H+ (provient de l’H20 ¢) de la matrice  espace.
• si E insuffisante  transformation en chaleur =
thermogenèse.
1. La libération d’énergie:
•
Du NADH,H+ (-0,32v) H20 (+0,82v) = 3 paliers.
avec E’° redox importante (au moins 0,21v)
pour  1 flux de H+ (générer un gradient de
H+) et libérée une énergie suffisante pour la
synthèse d’1 liaison riche en E de l’ATP (>
0,18v)
NADH,H +: 3 paliers CI (CI CQ), CIII(CQcytc), CIV(cytc 02)
FADH2 : 2 paliers CIII(CQcytc), CIV(cytc 02)
G°’
E°’
-0,4
200
NADH,H+
NAD+
-0,32 v
FADH2
FAD
-0,05v
E’°= 0,36
CI
CII
Cq
E’°=0,21
CIII
cytC
CIV
+0,8
100
E’°=0,57
½ 02 + 2H+
+ 2è
H20
+0,82v
0
2. Complexe V = ATP synthétase
• Permet le retour des H+ vers la matrice
• Complexe multiprotéique intégré dans la Mb interne
• Formé de 2 s/u:

F0 ou canal protonique (transmb) par lequel les
proton H+ entrent dans la matrice.
 F1 = assemblage de plusieurs protéines qui plonge
dans la matrice = Appelée facteur de couplage ou
F1-ATPase.
ESPACE INTERMEMBRANAIRE
3H+
F0
MATRICE
F1
ADPP
i
ATP
Peter Mitchell (1920-1992) a remporté le
prix Nobel de chimie en 1978 pour sa
théorie de la chimiosmose mitochondriale
(le gradient de concentration de protons
formé de part et d’autre de la membrane
interne sert de réservoir d'énergie libre
pour la synthèse d’ATP).
Paul D. Boyer (UCLA) et John E. Walker (Cambridge) ont
remporté (avec Jens C. Skou) le Nobel de chimie 1997
pour leur découverte du fonctionnement de l’ATP
synthétase.
Paul D. Boyer
John E. Walker
 Le passage des ions H+
entraîne la rotation de la sousunité « F0 ».
 C’est ce mouvement qui
permet la formation d’ATP à
partir d’ADP et P dans la sousunité « F1 ».
Vitesse de rotation
= 50 à 100 tours / seconde
Membrane interne
de la mitochondrie
ATP synthétase
100 Å = 10 nm
Une mitochondrie typique de
foie de mammifère contient
environ 15 000 ATP synthétase
Video explicative de l’ATP Synthase
3. Couplage entre transfert d’è et ATPsynthétase:
Théorie chimio-osmotique de Mitchell
2.1. la synthèse pas directe lors des oxyred, liée au
pompage de H+ matrice  espace (gradient de
H+ de part et d’autre de la Mb interne)
2.2. L’arrivée des H+ dans l’espace  du pH par
rapport à la matrice  gradient électrochimique
à 2 composantes.

Gradient de pH = espace inter-Mb + acide.

DDP de mb = par accumulation de (+) face ext (côté
espace) et de (–) face int (côté matrice), de la
membrane interne.
2.3. Les H+ éjectés dans l’espace reviennent dans
la matrice par F0 (Mb int imperméable aux H+) 
arrivent au site de synthèse ATP.
• Le flux de H+ fait activer le Complexe V
ADP + Pi + H+
Matrice
- - - - - - - Mb int
CV
CV
ATP + H20
Trans
locase
+ + + + + + + + +
nH
Espace
Mb ext
Cytosol
ATP
ADP
Pi
 Oxyd du NADH,H+  FLUX DE 9-10 H+ (3-4 CI, 4CIII, 2CIV)
3 ATP
 Oxyd du FADH2  FLUX DE 6 H+ ( 4CIII, 2CIV) 2 ATP
Au total:
- Le gradient életrochimique assure le couplage
oxyred- phosphorylation
- Energie libérée par l’oxydation (R exergonique)
est utilisée pour la phosphorylation (R endergonique)
- Relation directe entre E°’ et G°’’ et (G°’ = -nf E°)
4. Origine de l’ADP et Pi utilisés :
- Cytosol
- ADP et ATP (nucléotides) ne traversent pas la mb interne
 Nécessité d’1 transporteur spécifique (Antiport) = ATP/ADP
translocase = échange 1 ADP contre 1 ATP
 Pi (H2PO4-) entre dans la mitochondrie grâce à Phosphate –
translocase (symport: H+/H2P04-) qui fonctionne avec les H+
du gradient.
LA CHAINE RESPIRATOIRE
NADH,H+ + H+ + ½ 02  H20 + NAD+
G°’= - 220 kj / mol (Exergonique)
ADP + Pi + H+  ATP + H20
G°’= + 30,5 kj / mol (Endergonique)
3 ATP par paire d’è du NADH,H+
2 ATP par paire d’è du FADH2
Dépend :
1. Disponibilité de l’ADP :
[ADP] + [ATP] = constante, à l’état basal, ATP>ADP
- Si [ADP]  (utilisation d’ATP)  vitesse de la CRM 
très rapidement = activation des oxydations
- Si [ADP]   oxydation fortement ralentie
2. [02] = donc de la respiration- circulation
3. [NADH,H+] produit dans le cyto par la glycolyse
et la mitoch par l’oxydation des AG et le cycle de
Krebs.
+ les NAD+ / NADH,H+ et ATP/ADP,Pi sont faibles
+ la CRM est stimulée.
• 2 types :
– Inhibition de la CRM
– Découplage de transport d’è et phosphorylation.
1. inhibiteurs:
•  de la consommation de l’02 par les mitochondries
• Inhibition du cycle de Krebs
• Agents inhibiteurs agissent au niveau des 3 sites de
pompage de H+ et de l’ATP ase :
• Complexe I :
- Roténone: insecticide et pesticide naturel
- Amobarbital: sédatif, anxiolytique, anesthésique.
• Complexe III:
- Antimycine A: antibiotique d’origine bactérienne
(Streptomyces)
• Complexe IV:
- Cyanure (Gaz CNH, CNK amande amer, glycoside
cyanogènes, pesticides, insecticides, fumée du Tabac,
bioterrorisme )
- CO (monoxyde de carbone) affinité 200 fois plus
forte que celle de l’O2 pour l'hémoglobine.
• F0 du Complexe V : Oligomycine antibiotique d’origine
bactérienne (Streptomyces)
• ATP translocase: Atractyloside racine sucrée du
Chardon à glu (Atractylis gummifera), herbacé des
régions méditerranéennes (Algérie, Maroc)
2. Les découplants:
• Découplage des 2 fonctions de la CRM 
Accélération de la CRM et du cycle de Krebs 
consommation d’02 par les mitoch sans synthèse
d’ATP.
• Augmentation de la perméabilité mbn Int ramenant les
H+ à la matrice sans passer par Complexe V.
• Dissipation du gradient électrochimique des Protons.
• Transport des è maintenu la CRM continue de
fonctionner  Mais pas de synthèse d’ATP.
consommation d’02 et déficit en ATP
Production de la chaleur = thermogenèse qui
explique l’ du métabolisme de base.
Exemple:
• Thermogénèse : UCP (UnCoupling Protein)
• Hormones thyroïdiennes (T3, T4)
• DNP , Arséniate
• 2.4 Dinitro-phénol :
- Utilisé comme: explosif, pesticides.
- Pilule amaigrissante (Hyperthermie fatale)
• Arséniate : analogue structural de l’ion phosphate,
entre en compétition avec le phosphate pour la
réaction de phosphorylation de l’ADP.
Anomalies secondaires :
• Anoxie des détresses respiratoires ou cardiocirculatoires: (déficit en oxygène)
Bloque le metab oxydatif mitoch mêmes signes
que dans le cycle de Krebs ( PYR  Lactate 
acidose lactique)
• Le CO et le CN (intoxication) bloquent la CRM en
inhibant le C.IV par fixation sur le Fe3+  blocage du
transfert d’è
Diagnostic biochimique :
• Eléments d’orientation :
- Hyperlactacidémie, par inhibition de la CRM et du
cycle de Krebs
- Hypercétonémie, ( 3OH butyrate >
acétoacétate)
- Augmentation de CPK (créatine phosphokinase)
• Confirmation : dosage enz spécifiques sur biopsies.
• Diagnostic Définitif : identification de l’anomalie
génétique.