J. Embryo}, exp. Morph. Vol. 25, 2, pp. 175-187, 1971 175 Printed in Great Britain Differentiation du trophoblaste au cours du developpement in vitro d'embryon de Souris Par D. HERNANDEZ-VERDUN1 ET C. LEGRAND 1 Faculte des Sciences et Unite de Physiologie Placentaire a VInserm, Hopital Saint Antoine, Paris SUMMARY Differentiation of the trophoblast during in vitro development of the mouse embryo Mouse embryos obtained at the presomitic stage develop in vitro up to 70 h. During the first 24 h development remains comparable in vitro and in utero. Afterwards, the chronology of embryonic development is modified and in our successful prolonged experiments (70 h culture), foetal organogenesis reaches a stage corresponding only to \\ days in utero. In some instances a chorioallantoic circulation has been observed in the umbilical cord. The three trophoblast cell types present in egg-cylinders at 8 days post coitum, develop in the same way in utero or in vitro. After 48 h culture electron microscopy shows that numerous annulate lamellae appear in the nuclei and in the cytoplasm of some of the giant cells. The syncytium does not differentiate between the trophoblast and the allantoic mesoderm. The haemo-trichorial placental barrier does not differentiate in vitro, although foetal capillaries form. In vitro, the endoderm cells (from the splanchnopleure or from the omphalopleure) actively proliferate and form an homogeneous substance located between the giant and the polyhedric trophoblast cells. INTRODUCTION Faisant suite a nos observations morphologiques sur le trophoblaste des Rongeurs (Verdun, 1967; Legrand, 1968; Hernandez-Verdun, 1969; Legrand, 1969), nous avons cultive des embryons de Souris au stade de l'ovo-cylindre (8eme jour de la gestation). Cette technique permet d'observer a ce stade revolution du trophoblaste en relation avec l'organogenese foetale et le developpement de la vascularisation allantoidienne. La culture permettra ulterieurement d'experimenter directement sur revolution du trophoblaste. Les travaux de certains auteurs ont deja abouti au developpement, in vitro, d'embryons de Rongeurs pendant 1, 2 ou 3 jours (Jolly & Lieure, 1938; Nicholas & Rudnick, 1938; New & Stein, 1963, 1964; New, 1966, 1967; Givelber & Di Paolo, 1968; Morelec, Rouer & Haegel, 1968; Clarkson, Doering & Runner, 1969; Le Goascogne & Brun, 1969; New & Daniel, 1969; New & Coppola, 1970#, b). Recemment, New & Coppola (1970a), etudiant l'effet de differentes 1 Adresses des auteurs: Faculte des Sciences et Unite de Physiologie Placentaire a l'lnserm, Hopital Saint Antoine, 184 Rue de Faubourg Saint Antoine, Paris 12°, France: et 105 Boulevard Raspail, Paris 6, France. 176 D. HERNANDEZ-VERDUN ET C. LEGRAND conditions d'oxygenation sur la croissance de l'embryon de Ratte in vitro, emettent l'hypothese que celle-ci ne pourra etre amelioree qu'en utilisant une technique permettant le developpement du placenta allantoidien et de la vesicule ombilicale. Or actuellement une etude sur revolution in vitro du trophoblaste qui formera le placenta allantoidien n'a pas, a notre connaissance, ete publiee. En effet, les auteurs qui ont etudie les cellules trophoblastiques chez les Rongeurs se sont interesses a un type particulier de cellules. 11s ont cultive des cellules geantes de placenta (Dorgan, 1969), des cellules trophoblastiques de nodules formes apres la greffe de blastocystes sous la capsule renale (Schlesinger & Koren, 1967; Koren & Behrman, 1968), et des blastocystes tres jeunes dans lesquels les differentes lignees trophoblastiques n'etaient pas encore individualisees (Cole & Paul, 1965; Gwatkin & Love, 1968). Nous avons etudie, in vitro, le trophoblaste pendant un temps qui correspond a la periode ou, in utero, il prolifere intensement (8 jours a 9,5 jours) et est envahi par les cellules du mesoderme allantoidien (9,5 jours); ce stade represente la premiere etape dans la formation de la vascularisation utero-placentaire. MATERIEL ET METHODES Les ovo-cylindres sont preleves au 8eme jour de la gestation, le ler jour de la gestation etant determine par la detection du bouchon vaginal chez les femelles mises, la veille, en presence de males. Dans quelques gouttes du milieu employe pour la culture, les ovo-cylindres sont extraits des tissus deciduaux qui les entourent, puis debarrasses de leur membrane de Reichert, et des cellules de l'endoderme et du trophoblaste qui y adherent. A ce stade de developpement, il est pratiquement impossible d'enlever la totalite de la membrane de Reichert, car une trop grande traction risque de rompre le faible pedicule qui rattache le cone au reste de l'ovo-cylindre (Fig. 2). Apres plusieurs lavages, les ovo-cylindres sont mis en culture sur le fond d'une saliere contenant 1,5 cm3 d'un milieu compose de liquide de Eagle (B.M.E. modifie, Institut Pasteur) additionne de 25 % de serum de veau foetal, 10 a 30 % de serum de Souris, et de glucose (concentration finale dans la solution 5 g/1). Le serum de Souris provient, soit de la mere, soit d'une autre femelle au meme stade de la gestation, soit d'une femelle non gravide. Nous avons choisi ce milieu car il semble assurer un bon developpement non seulement a l'embryon mais egalement au trophoblaste. Le milieu de Eagle B.M.E. additionne soit de 5 % de serum de veau foetal (Gwatkin & Love, 1967), soit de 15 % de serum de veau foetal (Koren & Behrman, 1968) ne nous a pas donne satisfaction. Toutes ces manipulations sont faites dans des conditions rigoureuses de sterilite, ce qui permet de ne pas utiliser d'antibiotiques. Les salieres sont fermees, lutees a la paraffine et placees dans une etuve a une temperature constante de 37 °C. Au bout de 1, 2 ou 3 jours de culture, les ovo-cylindres sont fixes pendant 1 h dans un melange de glutaraldehyde et d'acide osmique dilues a 2 % dans un Differentiation du trophoblaste in vitro 177 tampon phosphate 0,1 M (pH 7,2), le melange etant maintenu a 4 °C. Apres deshydratation dans la serie montante des alcools, les prelevements sont inclus dans de l'araldite Durcupan. Dans ces prelevements, des coupes semi-fines ont ete faites, selon une epaisseur de 1 a 3 fi puis colorees pendant 1 h a 60 °C dans une solution de Giemsa et observees au microscope photonique. Dans les zones interessantes, nous avons alors effectue des coupes ultrafines, qui ont subi une double coloration par l'acetate d'uranyle en solution alcoolique et le citrate de plomb selon la technique de Reynolds (1963). Les observations ont ete faites au microscope electronique RCA EMU 3H. RESULTATS Aucours de cette experimentation, quarante-cinq embryons se sont developpes dans un delai de 1 a 3 jours de culture. Nous n'avons observe aucune difference dans leur developpement, qu'ils soient cultives dans un milieu additionne de serum maternel, de serum de Souris au meme stade de la gestation, ou de serum de Souris non gravide. Au moment de la mise en culture, les ovo-cylindres sont surmontes d'un cone ectoplacentaire volumineux coiffant la splanchnopleure de la vesicule ombilicale, et sont creuses de trois cavites: amniotique, exocoelomique (ou se distingue deja le bourgeon allantoidien) et ectoplacentaire; ces deux dernieres cavites sont separees par la lame ectoplacentaire. A ce stade pre-somitique, les bourrelets neuraux representent la seule manifestation du futur embryon (stade intermediate entre les stades 13 et 14 de la classification de Witschi (1962)). Le trophoblaste d'un ovo-cylindre de 8 jours, regroupe trois lignees cellulaires distinctes (Figs. 1 A, 2): (1) la partie superieure du cone formee de cellules qui evoluent vers la forme geante (cellules geantes trophoblastiques I), (2) la partie centrale formee de petites cellules polyedriques (cellules II), (3) la lame ectoplacentaire constitute d'une assise de cellules prismatiques (cellules III). Observations en microscopie photonique Quelques heures apres la mise en culture, le cone ectoplacentaire s'implante sur le fond de la saliere et la cavite ectoplacentaire s'oblitere. L'ovo-cylindre s'arrondit, determinant un etirement de la cavite dans le sens horizontal; de plus la multiplication intense tout d'abord des petites cellules polyedriques puis des cellules de la lame ectoplacentaire entraine la disparition de cette cavite. Vers la 20eme h de culture, a la peripherie de la zone des cellules trophoblastiques II, se depose une substance anhiste presentant en microscopie optique les memes caracteristiques que la membrane de Reichert (Fig. 1B). Entre la 26eme h, le bourgeon allantoidien a atteint le centre de la lame ectoplacentaire et les ilots sanguins apparaissent a la partie superieure de la splanchnopleure de la vesicule ombilicale. Apres 48 h de culture, les dimensions de l'ovo-cylindre ont double, et l'embryon 178 D. HERNANDEZ-VERDUN ET C. LEGRAND dont le rythme cardiaque est de 100 a 150 pulsations par minute, a atteint un developpement correspondant au stade 16 de la classification de Witschi (1962). A ce stade, les cellules III provenant de la lame ectoplacentaire, et dont l'index mitotique est eleve, sont au contact du mesoderme allantoidien deja partiellement organise en capillaire (Figs. 3, 8). Dans quelques cas favorables, la vas- 0,1 mm Differentiation du trophoblaste in vitro 179 cularisation allantoTdienne est suffisemment differenciee pour permettre une circulation fonctionnelle, pendant quelques heures, dans le cordon ombilical. Tout autour de la masse des cellules polyedriques II, devenues tres nombreuses, on retrouve la substance anhiste qui separe deux formations trophoblastiques: le groupe des cellules I geantes et l'ensemble forme par les cellules II et III (Fig. 1C). 11 se produit assez frequemment une rupture au niveau de ce depot, ce qui entraine alors l'elimination du groupe des cellules I geantes de l'ensemble de l'ovo-cylindre. Dans cet ensemble de cellules expulsees, la substance continue a se deposer, au contact de cellules trophoblastiques geantes et de petites cellules plus sombres (Fig. 1C). On retrouve de telles cellules recouvrant le trophoblaste de l'ovo-cylindre sous forme d'une assise superficielle, dans le prolongement de I'endoderme vitellin (Figs. 1C, C ; 3). Apres 65 a 70 h de culture, l'embryon presente un debut de rotation dans la region des plis cephaliques et de la queue (forme dite en S) (Snell, 1941; Yamamura, 1968). Nous avons observe un cas ou la rotation etait assez avancee, la courbure de l'embryon prenant la forme d'un C. A ce stade de developpement, les ilots sanguins recouvrent toute la surface de la vesicule ombilicale. Les cellules du mesoderme allantoidien s'insinuent entre les cellules trophoblastiques III (Fig. 8), les isolant en petits groupes, tandis que les cellules II situees immediatement sous la membrane anhiste degenerent. Fig. 1. Schema de revolution du trophoblaste au cours du developpement in vitro d'embryons de Souris. (A) Le trophoblaste d'un ovo-cylindre au 8eme jour de la gestation (stade du prelevement). (B) Le trophoblaste apres 24 h de culture. On note la disparition de la cavite ectoplacentaire. (C et C ) Le trophoblaste apres 48 h de culture. II existe toujours une substance anhiste entre les cellules endodermiques et les differents groupes de cellules trophoblastiques. II se produit souvent une rupture au niveau du depot de la substance anhiste (C). On observe aucune ebauche de formation du sinus endodermique. |foV'ij£| groupe des cellules trophoblastiques geantes (cellules I) |frj$££| les cellules trophoblastiques polyedriques (cellules II) | mg | les cellules de la lame ectoplacentaire (cellules III) | TTT | endoderme proximal de la splanchnopleure vitelline | — | endoderme distal |*a.-o. | mesoderme | c substance anhiste | I -*- I mesoderme allantoidien 180 D. HERNANDEZ-VERDUN ET C. LEGRAND Differentiation du trophoblaste in vitro 181 Observations en microscopie electronique Apres 48 h de culture, des observations ultrastructurales nous ont permis de preciser: (i) la differentiation des cellules trophoblastiques dans le groupe des cellules geantes, (ii) 1'evolution du trophoblaste au contact du mesoderme allanto'idien, (iii) le depot de la substance anhiste deja decrite. (i) Le groupe des cellules geantes Dans ce groupe, on peut reunir plusieurs types cellulaires: des cellules volumineuses, des cellules moyennes et des stades intermediaries. Les cellules moyennes se trouvent au centre du cone; elles contiennent des amas de glycogene, de nombreux polysomes et peu de lipides. Leur surface plasmique developpe des microvillosites et presentent des signes nets de micropinocytose. Dans ce type cellulaire nous avons observe des empilements de six a huit lamelles annelees cytoplasmiques (Fig. 6) et de rares lamelles annelees intra-nucleaires. Les cellules les plus volumineuses, dont le nombre augmente tout au long de la culture se distinguent, non seulement par leur taille, mais aussi par leurs nombreuses inclusions lipidiques, le faible developpement de leur ergastoplasme, la presence de fibrille a la peripherie du noyau et du cytoplasme et par une nette activite phagocytaire. Ces cellules contiennent egalement des lamelles annelees intra-nucleaires (Fig. 7), souvent en rapport avec le feuillet interne de la membrane nucleaire. Fig. 2. Les Jignees trophoblastiques du blastocyste de Souris au 8eme jour de la gestation: les cellules geantes (I), les cellules polyedriques centrales (II), les cellules prismatiques de la lame ectoplacentaire (III). Les fleches indiquent lateralement des restes de Fomphalopleure. Cavite ectoplacentaire (1), cavite du coelome externe (2). Coupe semi-fine coloree dans la solution de Giemsa. Fig. 3. Les formations trophoblastiques apres 48 h de culture. Le groupe des cellules geantes du cone (1) est separe des cellules trophoblastiques (II) et (III) par une substance anhiste. Le mesoderme allanto'idien (m) est au contact des cellules trophoblastiques (III). Splanchnopleure de la vesicule ombilicale. Coupe semi-fine coloree dans la solution de Giemsa. Fig. 4. Fort grossissement de la coupe precedente, dans la zone de la substance anhiste (fleches). Depot de substance anhiste entre les cellules geantes (I), de petites cellules plus sombres certainement d'origine endodermique (c.s.) et des cellules polyedriques (II). Coupe semi-fine coloree dans la solution de Giemsa. Fig. 5. Presence d'un materiel d'aspect et de densite identiques a la substance anhiste (s.a.), dans Fergastoplasme des petites cellules sombres (c.s.). Fig. 6. Lamelles annelees intracytoplasmiques (l.a.c.) dans une cellule moyenne du groupe I apres 48 h de culture. Noyau (n). Fig. 7. Lamelle annelee intra-nucleaire dans une cellule geante apres 48 h de culture (l.a.n.), appareil de Golgi (G), lipide (/), membrane nucleaire (m.n.). 182 D. HERNANDEZ-VERDUN ET C. LEGRAND Differentiation du trophoblaste in vitro 183 (ii) Le trophoblaste au contact du mesoderme allantoidien Au moment ou les cellules du mesoderme allantoidien entrent en contact avec la membrane basale qui borde les cellules trophoblastiques (Fig. 10), ces dernieres apparaissent indifferenciees (faible developpement de l'ergastoplasme et abondance des ribosomes libres); elles contiennent des particules a et /? de glycogene et quelques inclusions lipidiques (Fig. 11). Les cellules mesodermiques se caracterisent par un ergastoplasme et un appareil de Golgi contenant une substance dense aux electrons, des saccules golgiens d'ou prennent naissance de nombreuses vesicules contenant un materiel plus sombre, et de nombreuses inclusions lipidiques (Fig. 9). Sous cette premiere couche de mesoderme directement au contact des cellules trophoblastiques, des amas de cellules mesodermiques se differencient formant des cellules endotheliales, dont les jonctions sont caracteristiques des capillaires (Fig. 12). A ce stade, nous n'avons pas observe de differentiation syncytiale dans la zone de contact du trophoblaste et du mesoderme allantoidien. En effet, le capillaire est entoure, in utero, d'un manchon d'origine trophoblastique constitue d'une couche interne syncytiale (ou pseudosyncytiale, selon les auteurs), d'une couche mediane egalement syncytiale, et d'une couche externe cellulaire qui baigne dans le sang maternel; ces trois couches constituent la barriere hemotrichoriale (Jollie, 1964; Enders, 1965; Verdun, 1967). (iii) La substance anhiste Cette substance, qui apparait anhiste en microscopie photonique, presente en microscopie electronique les memes caracteres que la membrane de Reichert. II ne semble pas qu'elle soit elaboree par les cellules geantes trophoblastiques ni Fig. 8. Rapport des cellules trophoblastiques (III) et des cellules du mesoderme allantoidien (m), en partie organisees en capillaire (c). La fleche indique une infiltration de cellules mesodermiques entre les cellules trophoblastiques III. Coupe semi-fine coloree dans la solution de Giemsa, 48 h de culture. Fig. 9. Detail d'une cellule mesodermique. Ergastoplasme (e.r.) et appareil de Golgi (G), contenant une substance dense aux electrons. Petites vesicules se detachant de Pappareil de Golgi (fleches). Lipide (/). Fig. 10. Cellule trophoblastique (III) au contact d'une cellule du mesoderme allantoidien (m). Membrane basale trophoblastique (m.b.). Fig. 11. Glycogene (gl) et lipide (/) dans une cellule trophoblastique (III) au contact d'une cellule du mesoderme allantoidien (m) dont l'ergastoplasme (e.r.) contient une substance dense aux electrons. Fig. 12. Capillaire foetal (c) en rapport avec les cellules trophoblastiques (III) toujours indifferenciees. Cellules mesodermiques (m) entre le capillaire foetal et le trophoblaste. La fleche indique les jonctions entre les cellules endotheliales (end) du capillaire. Lipide (/). 184 D. HERNANDEZ-VERDUN ET C. LEGRAND par les cellules polyedriques adjacentes mais plutot par les petites cellules sombres qui la bordent (Fig. 4); en effet, ces cellules possedent de nombreux sacs ergastoplasmiques plus ou moins dilates contenant une substance d'aspect et de densite tout a fait comparables a ceux de la substance anhiste (Fig. 5). Ces petites cellules pourraient resulter soit de la proliferation des cellules de l'omphalopleure que Ton ne peut totalement supprimer au moment de la dissection, soit de la proliferation et de la differenciation des cellules de l'endoderme splanchnopleurique. DISCUSSION Dans un milieu de culture non circulant, des embryons de Souris, preleves avant l'apparition des somites, stade critique de l'organogenese et de la differenciation trophoblastique, se sont developpes pendant 70 h. Notre milieu de culture nous assure pendant les 24 premieres h une evolution comparable a celle qui se produit, in utero, pendant un temps equivalent. Au cours des heures suivantes, il se produit un decalage chronologique entre le developpement in vitro et le developpement in utero. Apres 48 h de culture, la croissance embryonnaire est comparable, dans les cas les plus favorables a celle atteinte en 36 a 40 h in utero, et dans 60 % des cas correspond a celle de 30 h in utero. Au bout de 72 h, le developpement embryonnaire, in vitro, ne depasse pas celui obtenu en 48 h in utero. Ces resultats que Ton pourrait peut-etre ameliorer en ajustant l'equilibre des gaz respiratoires dissous dans le milieu de culture (New & Coppola, 19706) sont comparables a ceux obtenus par New & Stein (1964) chez la Souris dans un milieu non circulant et se rapprochent de ceux obtenus en milieu circulant, par Givelber & Di Paolo (1968) chez le Hamster, et New & Daniel (1969), New & Coppola (1910b) chez le Rat. Cette technique nous a done permis d'observer in vitro l'etablissement de la circulation allantoidienne qui, in utero, represente une etape importante dans la differenciation trophoblastique. Nous pouvons egalement suivre, in vitro, conformement a ce que nous avons observe in utero, revolution de trois lignees de cellules trophoblastiques dont les potentialites semblent differentes: le groupe des cellules geantes (I), les cellules polyedriques (II), et les cellules prismatiques (III). (1) Les cellules geantes trophoblastiques, evoluent en 48 h de facon identique in vitro et in utero; les descriptions des cellules geantes a ce stade de la gestation (Jollie, 1965), de meme que la distinction de deux types cellulaires (San Filippo, 1967) sont conformes a celles que nous avons observees. Cependant l'apparition d'un grand nombre de lamelles annelees dans le noyau et le cytoplasme temoigne peut-etre d'une perturbation metabolique ou physiologique de certaines de ces cellules en culture. In utero, ces structures ne sont presentes qu'en plus petit nombre et a un stade plus avance de la gestation (Jollie, 1969; Ollerich & Carlson, 1969, 1970). Ces observations se rapprochent de celles faites sur les cellules Differenciation du trophoblaste in vitro 185 geantes trophoblastiques apres greffe intra-testiculaire de blastocystes, chez le Rat, au stade equivalent de la gestation. (2) Les cellules polyedriques (egalement appelees 'parenchymateuses', Jollie, 1964) et les cellules prismatiques provenant de la lame ectoplacentaire se differencient de la meme facon in utero (Bridgman, 1948) et pendant les 24 premieres h de culture. L'absence de circulation maternelle laisse ces cellules groupees de facon compacte, tandis que in utero, elles sont separees en petits ilots par la formation d'un reseau de lacunes sanguines maternelles (Duval, 1891). Par la suite, nous n'observons pas in vitro de transformation du cytotrophoblaste en syncytium comme cela se produit in utero, au contact des cellules du mesoderme allantoidien (Davies & Glasser, 1968), et ceci, meme apres la formation des capillaires foetaux. II semble done que le point critique dans 1'evolution du placenta chorio-allantoidien in vitro ne soit pas l'etablissement de la circulation allantoidienne, mais la differentiation de la barriere hemotrichoriale. Cette hypothese est appuyee par le fait que New & Coppola (1970&) parviennent a maintenir une circulation allantoidienne deja etablie lors de la mise en culture, mais ne l'obtiennent jamais quand les embryons cultives sont plus jeunes. Lorsque la barriere hemotrichoriale est deja differenciee, meme en l'absence de circulation maternelle, la circulation allantoidienne continue au niveau du cordon ombilical. Ayant obtenu une circulation allantoidienne, sans differentiation de la barriere placentaire nous envisageons: (1) de prolonger le temps pendant lequel la circulation allantoidienne est effectivement fonctionnelle, (2) de reetablir au niveau du trophoblaste, en reimplantant le blastocyste, une irrigation maternelle jouant peut-etre un role inducteur dans la differentiation de cette barriere. RESUME Des embryons de Souris, preleves au stade presomitique, se sont developpes in vitro pendant 70 h. Au cours des 24 premieres h 1'evolution, in vitro et in utero reste parallele; par la suite la chronologie du developpement n'est pas conservee et nous obtenons au mieux une organogenese fcetale correspondant a un jour et demi in utero. Dans quelques cas, une circulation chorio-allantoidienne a ete observee au niveau du cordon ombilical. En microscopie photonique, il apparait que les trois lignees de cellules trophoblastiques, deja individualists au moment du prelevement des ovo-cylindres (8eme jour post-coitum), evoluent de fac.on comparable in utero et in vitro. Cependant apres 48 h de culture, les observations en microscopie electronique montrent qu'un grand nombre de lamelles annelees apparaissent dans le noyau et dans le cytoplasme de certaines cellules geantes, et que la couche syncytiale, normalement differenciee au contact des cellules trophoblastiques et du mesoderme allantoidien, n'apparait pas. Ainsi, bien que les capillaires foetaux soient deja organises, la barriere hemotrichoriale ne se forme pas, ce que Ton attribue soit a l'absence de circulation maternelle, soit a une circulation chorio-allantoidienne insuffisante ou bien a ces deux facteurs a la fois. In vitro, il semble que les cellules endodermiques (de la splanchnopleure ou de l'omphalopleure) proliferent intensement et elaborent une substance anhiste au contact des cellules geantes et des cellules polyedriques du trophoblaste. 186 D. HERNANDEZ-VERDUN ET C. LEGRAND TRAVAUX CITES J. (1948). A morphological study of the development of the placenta of the rat. /. Morph. 83, 61-86, 195-224. CLARKSON, S. G., DOERING, J. V. & RUNNER, M. N. (1969). Growth of postimplantation mouse embryos cultured in a serum (supplemented, chemically defined medium). Teratology 2, 181-185. COLE, R. J. & PAUL, J. (1965). Properties of cultured preimplantation mouse and rabbit embryos and cell strains derived from them. 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